CN110742072A - 一种害虫引诱剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种害虫引诱剂及其制备方法与应用，所述的害虫引诱剂包括乙酸苯丙酯和芳樟醇。乙酸苯丙酯和芳樟醇作为一种甜菜夜蛾用于识别寄主植物的信息化合物，用来代替化学农药对甜菜夜蛾进行防治，不会对月季植株产生不良影响、不会导致该虫产生抗药性。同时，乙酸苯丙酯和芳樟醇来自寄主植物，在自然界中有着天然的完整的降解途径，不会对环境产生不良影响，是一种环境友好型的引诱剂，具有广阔的应用前景。

Description

一种害虫引诱剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种害虫引诱剂及其制备方法与应用。

背景技术

截止目前，化学农药是控制植物虫害的主要手段之一，然而化学农药，尤其是化学杀虫剂在消灭虫害的同时，会带来环境污染和害虫抗性、农产品农残超标等问题。随着现代农业和生态环境对化学农药品种性能的要求日益提高，化学农药新品种的研制开发风险也在增加。而植物源农药具有生物活性多样(杀虫、杀菌、除草且作用方式多种多样)、高选择性、无残留、对环境安全、对高等动物及天敌安全、害虫不易产生抗药性等优点，目前已成为人们研究的热点。

甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)属鳞翅目、夜蛾科，是一种世界性顽固害虫，特别是中国月季（即玫瑰）大棚生产过程中，甜菜夜蛾危害十分严重。前期研究发现，采用顶空动态吸附法将中国月季挥发性成分混合物提取出来，用于测试该混合物对甜菜夜蛾成虫嗅觉行为的影响，结果表明其对甜菜夜蛾嗅觉行为有明显的调控作用，对甜菜夜蛾未交配雌、已交配雌和雄蛾均有引诱活性。因此，这些挥发性化合物有可能是甜菜夜蛾用于识别寄主植物的重要信息化合物。这些化合物作为植物的次生代谢产物，在自然界有着完整降解途径，如能通过研究证实这类化合物对某种有害生物有较强的活性，则在有害生物无公害防治中将发挥重要作用。

另外，通过GC-MS鉴定分析发现，该混合物中含有乙酸苯丙酯和芳樟醇，只是还不清楚该化合物对甜菜夜蛾是否有活性。

目前甜菜夜蛾防治方法除化学防治外，主要是使用性信息素诱捕雄蛾以杀灭。但是存在两个问题，一是甜菜夜蛾存在孤雌生殖现象；二是即使仅有很少部分的雄蛾未被杀灭也能满足交配需要、导致无法有效减少虫口密度。因此针对雌蛾本身进行防治显得十分重要。为此，研制开发一种利用寄主植物合成的信息化合物为主要成分的害虫引诱剂，用于调控雌蛾本身的寄主搜寻行为和产卵行为，或用于甜菜夜蛾雌蛾的诱集、以方便杀灭，从而更加有效地对该虫进行防治。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种害虫引诱剂；第二目的在于提供所述的害虫引诱剂的制备方法；第三目的在于提供所述的害虫引诱剂的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的害虫引诱剂包括乙酸苯丙酯和芳樟醇。

本发明的第二目的是这样实现的，包括母液A的配制、辅助液B的配制和制备步骤，具体包括：

A、母液A的配制：分别准确称取配方配比的乙酸苯丙酯和芳樟醇，加入溶剂溶解制备得到母液A；

B、辅助液B的配制：用去离子水配制吐温-80溶液得到辅助液B；

C、制备：将母液A和辅助液B混合后超声处理后定容得到目标物害虫引诱剂。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的害虫引诱剂在制备防治有害生物产品中的应用，所述的害虫引诱剂的使用方法是将所述的害虫引诱剂用乙醇或水稀释0~125倍后，直接均匀配洒在植株的花蕾或枝叶上。

本发明所述的乙酸苯丙酯和芳樟醇均为中国月季植物自身合成的挥发性次生代谢产物，本发明从中国月季顶空挥发物中分离得到这两种活性成分，经嗅觉行为、产卵行为生物测试和田间产卵试验，乙酸苯丙酯和芳樟醇对害虫、特别是甜菜夜蛾雌蛾具有很好的引诱效果。并且由于乙酸苯丙酯和芳樟醇是天然次生代谢产物，在自然界有着完整降解途径，因此，以乙酸苯丙酯和芳樟醇作为主要成分制成害虫引诱剂，从而实现害虫的无公害防治。

附图说明

图1为甜菜夜蛾抱卵雌蛾对健康中国月季挥发性成分的GC-EAD反应；

图2为甜菜夜蛾抱卵雌蛾对乙酸苯丙酯－芳樟醇的EAG反应；

图3为甜菜夜蛾抱卵雌蛾对乙酸苯丙酯－芳樟醇的嗅觉行为反应；

图中，嗅觉行为生物测试中引诱率的计算公式为

AP(%)＝(N _T－N _CK)/( N _T + N _CK)×100%，

其中，AP为引诱率(attractive percent)， N _T为乙酸苯丙酯－芳樟醇一侧的雌蛾数，N _CK为乙醇对照一侧的雌蛾数，N _N为未反应虫数；采用χ²检验进行统计分析，P < 0.05表示差异显著；

图4为乙酸苯丙酯－芳樟醇对甜菜夜蛾产卵行为的影响；

图中，不同小写字母表示乙酸苯丙酯－芳樟醇与对照(CK)相比差异显著(P ≤ 0.05)。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的害虫引诱剂包括乙酸苯丙酯和芳樟醇。

所述的乙酸苯丙酯和芳樟醇的质量配比为1:1。

所述的乙酸苯丙酯和芳樟醇在害虫引诱剂中的有效总浓度为0.4~50.0g/L。

所述的害虫为甜菜夜蛾。

所述的害虫为甜菜夜蛾雌蛾。

本发明所述的害虫引诱剂的制备方法包括母液A的配制、辅助液B的配制和制备步骤，具体包括：

A、母液A的配制：分别准确称取配方配比的乙酸苯丙酯和芳樟醇，加入溶剂溶解制备得到母液A；

B、辅助液B的配制：用去离子水配制吐温-80溶液得到辅助液B；

C、制备：将母液A和辅助液B混合后超声处理后定容得到目标物害虫引诱剂。

A步骤中所述的溶剂为乙醇、正己烷、甲醇和二氯甲烷中的一种或几种。

B步骤中所述的吐温-80溶液的质量百分浓度为0.1%。

C步骤中所述的超声处理是在超声频率40~60KHz下超声处理4~6min。

本发明所述的害虫引诱剂的应用为所述的害虫引诱剂在制备防治有害生物产品中的应用，所述的害虫引诱剂的使用方法是将所述的害虫引诱剂用乙醇或水稀释0~125倍后，直接均匀配洒在植株的花蕾或枝叶上。

本发明所述的害虫引诱剂对甜菜夜蛾，特别是对其雌蛾的引诱效果最佳。

本发明的工作原理：

中国月季（Rosa chinensis Jacq.，俗称玫瑰）是世界四大鲜切花之一，深受人们喜爱，在全世界广为栽培。但是中国月季上的病虫害发生也十分严重，主要包括月季白粉菌(Sphaerotheca pannosa（Wallr. ：Ex Fr.）Lév.)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua (Hübner))等。甜菜夜蛾属鳞翅目、夜蛾科，是一种世界性顽固害虫，特别是中国月季（即玫瑰）大棚生产过程中，甜菜夜蛾危害十分严重。众所周知，植物挥发性成分对昆虫寄主选择起着至关重要的作用。前期研究发现，采用顶空动态吸附法将中国月季挥发性成分混合物提取出来，用于测试该混合物对甜菜夜蛾成虫嗅觉行为的影响，结果表明其对嗅觉行为有明显的调控作用，对甜菜夜蛾未交配雌、已交配雌和雄蛾均有引诱活性。因此，这些挥发性化合物有可能是甜菜夜蛾用于识别寄主植物的重要信息化合物。这些化合物作为植物的次生代谢产物，在自然界有着完整降解途径，如能通过研究证实这类化合物对某种有害生物有较强的活性，则在有害生物无公害防治中将发挥重要作用。因此，进一步对月季挥发性成分进行GC-MS分离鉴定，并结合GC-EAD、EAG、嗅觉行为测试、产卵行为生物测试等进行分析，发现其中的乙酸苯丙酯和芳樟醇是产生引诱作用的两种重要活性成分。

本发明的特点：

乙酸苯丙酯和芳樟醇作为一种甜菜夜蛾用于识别寄主植物的信息化合物，用来代替化学农药对甜菜夜蛾进行防治，不会对月季植株产生不良影响、不会导致该虫产生抗药性。同时，乙酸苯丙酯和芳樟醇来自寄主植物，在自然界中有着天然的完整的降解途径，不会对环境产生不良影响，是一种环境友好型的引诱剂，具有广阔的应用前景。

实施例1

害虫引诱物质的发现

（1）挥发性成分的提取和鉴定

采用顶空动态吸附法收集健康无病虫害的中国月季叶片挥发性成分，将收集到的挥发性成分在-20℃冰箱中保存，并进行GC-MS分析。收集过程中所用的吸附剂为Tenax TA，收集时间为24小时，以消除日节率变化对挥发性成分种类和含量的影响。

（2）甜菜夜蛾饲养方法

将采回的甜菜夜蛾老熟幼虫放入垫有潮湿沙土的250 mL烧杯中，用纱布封口，待化蛹、羽化后，将成虫转入另一个250 mL烧杯中。用10%的蜂蜜水补充营养，使其在健康中国月季叶片上产卵、孵化，并饲养至老熟幼虫(饲养条件：27℃、70% RH、12 h光周期)。同法让其化蛹，将蛹取出在体视镜下区分雌雄，雌雄蛹分开饲养，羽化后用于生物测试。

（3）甜菜夜蛾成虫GC-EAD测试

气相色谱仪的升温程序与GC-MS一致；不分流进样，进样量2.0 µL。记录的信号经放大器（Syntech CS-55）连接到转换器IDAC (Syntech IDAC-2)，再接到计算机的硬件采集卡上，通过计算机软件(GC-EAD，版本4.6)采集和分析数据。将甜菜夜蛾成虫的触角由基部剪下，去除端部2个鞭节后用导电胶与触角电位仪探针连接。色谱柱为HP-5毛细管柱(30 m ×0.25 mm × 0.25 μm)，出口端接分流器，分流比1: 1，其中之一导入FID氢火焰离子化检测器，而另一部分经过加热套（Syntech MP-3）吹向触角(EAD)，用GC-EAD软件同步记录气相色谱和触角电位图。测试虫态为甜菜夜蛾已交配雌蛾。用过的触角不再重复使用。

（4）结果

GC-MS鉴定结果如表1所示。结果表明，从健康中国月季植株收集的天然化合物中含有乙酸苯丙酯和芳樟醇（表1，No. 1、15）。同时，GC-EAD结果（附图1）表明，附图1中的1号峰产生了明显的触角电生理（EAG）信号。根据GC-EAD中1号峰的保留时间等FID信息，结合其它所有峰，与GC-MS综合、进行比对分析，可知1号峰是乙酸苯丙酯。该化合物能产生EAG信号，表明该化合物可能是甜菜夜蛾雌蛾用于识别寄主、搜寻产卵地的重要信息化合物之一，故将对其活性进行进一步研究。

至于芳樟醇，尽管在GC-MS检测中检测到中国月季植株能产生该化合物，但是在GC-EAD中没有发现其对应的触角电生理信号，这可能是由于该化合物在当次测试中含量较小所致。但由于根据文献资料，芳樟醇往往对一些昆虫有引诱作用，因此推测它对甜菜夜蛾雌蛾也可能有引诱作用，故本发明也对该化合物进行了研究。

表1 健康中国月季挥发性成分的GC-MS分析

Table 1 GC-MS analysis for volatiles collected from healthy rose plants

实施例2

甜菜夜蛾成虫对乙酸苯丙酯和芳樟醇的EAG反应

将甜菜夜蛾抱卵雌蛾的触角剪下，去除端部2个鞭节后用导电胶与触角电位仪探针连接，进行触角电生理（EAG）测试。取20.0 μL待测样品溶液（乙酸苯丙酯-正己烷溶液）均匀涂于滤纸条（l × w = 6.0 × 0.5 cm），放入巴斯德管，连接在刺激气流上。刺激气流的流量为1150 mL/min，连续气流的流量为850 mL/min。待基线稳定后用脚踏板人为给予刺激，单次刺激时间持续0.2s，每次间隔60s以上。同一根触角中待测样品的顺序为正己烷（1次）、反式-2-己烯醛（3次）、待测样品（3次）、正己烷（1次）。其中正己烷为对照；反式-2-己烯醛为标准化合物，待测样品和标准化合物的浓度均为50.0g/L。每测试1根触角后互换标准化合物和样品的检测顺序。每个样品重复4根触角。EAG信号经放大器（Syntech CS-55）放大，显示于示波器上，并通过Syntech公司提供的软件对各样品的EAG反应值进行标准化校正，EAG相对反应相对值=（样品的反应值－对照的反应值）/（标准化合物的反应值－对照的反应值）×100%。对芳樟醇同法测试。对乙酸苯丙酯－芳樟醇混合溶液的四种不同浓度（0.4、2.0、10.0、50.0 g/L，均为总浓度，按活性成分质量比1: 1配制）的溶液也同法进行了测试，所得结果如附图2所示。

从附图2A中可以看出，乙酸苯丙酯(A 50.0 g/L)和芳樟醇(B 50.0 g/L)分别都引起了明显的EAG反应，分别为标准化合物反式-2-己烯醛的94.9%和85.4%，表明二者对甜菜夜蛾雌蛾均有明显的活性。并且，二者的混合溶液(A 25.0 g/L+ B 25.0 g/L)引起的EAG相对反应值为115.2%，大于94.9%和85.4%，表明两种化合物间存在协同效应。因此，在进一步的研究中，把两种活性成分配制成混合溶液，测试该混合溶液对甜菜夜蛾成虫嗅觉和产卵行为的影响。

从附图2B中则可以看出，在用甜菜夜蛾抱卵雌蛾进行测试时，EAG相对反应值可达100%以上(两种活性成分的总浓度为50.0 g/L时)，表明甜菜夜蛾对乙酸苯丙酯－芳樟醇的反应能力比标准化合物反式-2-己烯醛更强。但是，随着乙酸苯丙酯－芳樟醇浓度升高，EAG相对反应值虽然增大却并没有按比例升高，在10.0和50.0 g/L两种浓度下比较，差别不大，分别为99.5%和108.3%。

本实施案例通过购买标准品乙酸苯丙酯和芳樟醇，对两种化合物进行测试，确认了该化合物对甜菜夜蛾有活性，在甜菜夜蛾抱卵雌蛾产卵地选择过程中起到重要作用。但仍不清楚该化合物对甜菜夜蛾成虫是起到引诱作用还是起到驱避作用。

实施例3

甜菜夜蛾雌蛾对乙酸苯丙酯－芳樟醇的嗅觉行为

所用的主要仪器为Y型嗅觉仪。其中的Y型管主枝22 cm、两侧枝均为17 cm，内径均为5cm，两臂夹角75度。将Y型管洗净，用无水乙醇消毒后烘干。将Y型嗅觉仪按空气泵、活性炭、蒸馏水、LZB-II玻璃转子流量计、三通管、Y型管顺序用硅胶管连接，水平放置，黑布遮光，调节气流量为300 mL/min。气流交汇于Y型管主枝，从基部口流出。实验开始前先通入洁净空气10分钟。

为了气体缓慢溢出，将装有总浓度0.4 g/L 乙酸苯丙酯－芳樟醇(1: 1, w/w)溶液（正己烷配制）的带有小孔的小玻璃瓶放入Y型嗅觉仪的一侧枝中，另一侧枝同法用正己烷作对照。并将已交配雌蛾从Y型管基部口放入，每次10只，用具2 mm小孔的黑纱封口防成虫逃出。飞蛾可逆风爬向或飞向气味源，识别气味源并做出反应。分别记录30 min时Y型管两侧枝中和仍处于基部中未做出反应的虫数，从两侧枝交叉口处前进3 cm及以上记作阳性反应。2.0、5.0、10.0 g/L溶液同法测试。重复5次生测，取平均值，SPSS 17.0做统计分析。

每做完一次生测后，交换Y型管和气味源的方向。做完两次测试后，将Y型管和味源瓶取下，洗净、消毒、烘干，再做下一次生测。用过的雌蛾不再重复使用。生测在无风、室温25℃、遮光、空气湿度75%条件下、晚上7: 00 ~ 12: 00之间成虫活动频繁的时段进行。从基部入口处到气味源，乙酸苯丙酯－芳樟醇形成由小到大的浓度梯度，甜菜夜蛾交配雌蛾能识别信息化合物种类及其浓度梯度，并做出相应的反应，即与在自然界中甜菜夜蛾识别寄主植物的原理一致。

测试结果如附图3所示。由图3可知，在嗅觉行为测试中，乙酸苯丙酯－芳樟醇对甜菜夜蛾雌蛾显示出明显的引诱作用，质量浓度越大引诱效果越好。当质量浓度为50.0 g/L时引诱率最大，达37.7%。与EAG测试结果类似的是，在浓度为10.0和50.0 g/L条件下测试，差别并不明显（P = 0.362），引诱率基本一致。而10.0和2.0 g/L两种浓度相比较，则有明显差距，并且差异达到显著水平（P = 0.029）。

实施例4

乙酸苯丙酯－芳樟醇的引诱活性试验

在2支500 mL烧杯内垫约5 cm厚灭菌土，适量无菌水湿润。将两束各5支长约20 cm、叶数基本相同的健康无病虫害的新鲜中国月季枝条，分别插入2支烧杯内的土壤中，将两烧杯分别标记为1、2号。用乙醇作溶剂将乙酸苯丙酯－芳樟醇配制成0.4 g/L溶液，取5 mL该溶液均匀喷施1号烧杯中的枝叶，另用5 mL乙醇同法喷施2号烧杯中的枝叶作对照。将两烧杯放入细铁丝网制成的产卵笼中，相距约50 cm。

人工饲养甜菜夜蛾至化蛹，将蛹取出在体视镜下区分雌雄，雌雄蛹分开单独饲养至羽化。挑选10对同一天羽化、发育正常、雌雄配对的甜菜夜蛾成虫放入笼中产卵，在枝条上悬挂蘸有适量蜂蜜水(10%)的棉花，作为成虫营养源。每日记录两种枝条上的总产卵量至所有雌蛾不再产卵。每次检查产卵数量后，更换新鲜枝条并喷洒乙酸苯丙酯－芳樟醇溶液和无水乙醇。室温、遮光、空气湿度75%。统计总卵块数和总产卵量。重复5次，SPSS 17.0做统计分析。另三种浓度(2.0、10.0、50.0 g/L)的乙酸苯丙酯－芳樟醇溶液同法测试。结果如附图4所示。

图4结果表明，无论是从总产卵量（图4A）还是从总卵块数（图4B）来看，乙酸苯丙酯－芳樟醇对甜菜夜蛾产卵地选择均有着十分明显的引诱作用。当质量浓度为50.0 g/L时引诱效果最好。按图4中产卵量总值计算，最大引诱率为41.4%。从图4中可以看出，10.0和50.0 g/L两种浓度下测试结果差别不大。综合EAG、Y型嗅觉仪测试结果分析，乙酸苯丙酯－芳樟醇作为甜菜夜蛾成虫引诱剂时，最佳使用浓度为10.0 g/L，即可达到经济实用的效果。

实施例5

田间实验

乙酸苯丙酯－芳樟醇对甜菜夜蛾产卵的引诱活性的田间验证实验在云南省昆明市呈贡区玫瑰种植基地的大棚中进行。实验开始前14 d之内不使用任何农药，进行正常水肥管理。实验开始时中国月季平均株高20 cm，处理小区与对照小区面积各4 m²，间隔2 m。其中，处理小区每株用10.0 g/L的乙酸苯丙酯－芳樟醇-乙醇溶液1 mL喷施中国月季全株，对照小区仅用同体积的乙醇同法喷施。在大棚中放入15对人工饲养的雌雄配对的甜菜夜蛾成虫，每天收集、统计虫卵量和卵块数，5 d后统计总产卵量和总卵块数。设3次重复。同法测试含吐温-80的溶液（乙酸苯丙酯－芳樟醇-乙醇-吐温80溶液(the mixture ofbenzenepropyl acetate and linalool-ethanol-Tween 80)，用蒸馏水稀释）。大棚中湿度75%～95%，温度18～40℃，其它方法和条件与室内产卵量测试实验相同。无需进行土壤和植株的消毒等工作，结果如表2所示。

表2 乙酸苯丙酯－芳樟醇的田间实验

Table 2 Field experiment for the mixture of benzenepropyl acetate andlinalool

^a四种数据均为根据乙醇对照计算所得结果。

从表2中卵块数和产卵量的总值可以看出，在大棚中玫瑰种植实际生产条件下，乙酸苯丙酯－芳樟醇同样显示出对甜菜夜蛾产卵的明显的引诱作用。从产卵量来看，引诱率可达39.8%。乙酸苯丙酯－芳樟醇对引诱甜菜夜蛾雌蛾的作用在田间实验中得到验证。在引诱剂中加入吐温-80，从诱虫效果来看并没有发现明显影响，但是它增加了乙酸苯丙酯－芳樟醇在水中的溶解度，这样，在实际使用过程中可将乙醇用水代替。

综上所述，乙酸苯丙酯－芳樟醇能够有效地对甜菜夜蛾产卵地选择行为起到调控作用，在甜菜夜蛾产卵地选择过程中起到关键作用，可以将该信息化合物用于甜菜夜蛾等害虫的无公害防治、应用前景广阔。

Claims (10)

1.一种害虫引诱剂，其特征在于所述的害虫引诱剂包括乙酸苯丙酯和芳樟醇。

2.根据权利要求1所述的害虫引诱剂，其特征在于所述的乙酸苯丙酯和芳樟醇的质量配比为1:1。

3.根据权利要求1所述的害虫引诱剂，其特征在于所述的乙酸苯丙酯和芳樟醇在害虫引诱剂中的有效总浓度为0.4~50.0g/L。

4.根据权利要求1所述的害虫引诱剂，其特征在于所述的害虫为甜菜夜蛾。

5.根据权利要求1或4所述的害虫引诱剂，其特征在于所述的害虫为甜菜夜蛾雌蛾。

6.一种权利要求1~5任一所述的害虫引诱剂的制备方法，其特征在于包括母液A的配制、辅助液B的配制和制备步骤，具体包括：

A、母液A的配制：分别准确称取配方配比的乙酸苯丙酯和芳樟醇，加入溶剂溶解制备得到母液A；

B、辅助液B的配制：用去离子水配制吐温-80溶液得到辅助液B；

C、制备：将母液A和辅助液B混合后超声处理后定容得到目标物害虫引诱剂。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于A步骤中所述的溶剂为乙醇、正己烷、甲醇和二氯甲烷中的一种或几种。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于B步骤中所述的吐温-80溶液的质量百分浓度为0.1%。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于C步骤中所述的超声处理是在超声频率40~60KHz下超声处理4~6min。

10.一种权利要求1~5任一所述的害虫引诱剂的应用，其特征在于所述的害虫引诱剂在制备防治有害生物产品中的应用，所述的害虫引诱剂的使用方法是将所述的害虫引诱剂用乙醇或水稀释0~125倍后，直接均匀配洒在植株的花蕾或枝叶上。

Images