CN110721185B - 罗沙司他用于心肌保护的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及罗沙司他用于心肌保护的用途。具体而言是涉及罗沙司他用于治疗阿霉素化疗引起的心肌功能损伤的用途。

Description

罗沙司他用于心肌保护的用途
技术领域：
本发明属于药物新用途领域，具体涉及罗沙司他用于心肌保护的用途，再具体讲是，涉及罗沙司他在阿霉素化疗过程中的心肌保护的药物中的应用。
背景技术：
阿霉素(Doxorubicin,DOX)是目前临床上最为有效的抗肿瘤药物之一，但其心脏毒性严重限制了它在临床的应用。左心室功能障碍和心力衰竭是阿霉素心脏毒性最严重的症状。已有研究显示，阿霉素心脏毒性涉及众多作用因素，如引起细胞凋亡、自噬、氧自由基损伤、线粒体损伤与能量代谢异常等。体内、体外研究表明阿霉素诱发的心肌细胞凋亡是心肌损伤的最直接原因，而胞内ROS的积累和氧化应激系统的激活是触发和加速DOX所致心肌毒性的基本因素。
Dexrazoxane是美国食品和药物管理局(FDA)批准的唯一一种在临床上用于保护心脏免受阿霉素引起的心脏毒性的药物，但研究发现，Dexrazoxane可能会干扰阿霉素的抗癌活性，并增强阿霉素的骨髓抑制作用。因此急需研发用于治疗阿霉素心肌病的临床药物。
Roxadustat(FG-4592/ASP1517/罗沙司他，国内商品名为爱瑞卓)，结构式如下：
Figure BDA0002270573290000011
是一种活性强、小分子的低氧诱导因子脯氨酰羟化酶的新型口服抑制剂，能够上调内源性EPO的产生，从而促进红细胞生成，目前已经在国内上市用于慢性肾病贫血治疗。
发明内容
针对目前阿霉素治疗肿瘤患者引起心脏毒性的治疗药物缺乏的问题，本发明提供了罗沙司他用于心肌保护的新用途，用于开发治疗阿霉素心肌病产品上，且不会影响阿霉素的抗癌效果。目前尚无罗沙司他用于治疗阿霉素心肌病的任何报道。
本发明通过每天给予小鼠腹腔注射罗沙司他(10mg/kg/day)，48小时后，给予小鼠腹腔注射阿霉素(12.5mg/kg/day)构建阿霉素急性心肌病模型，7天后，心脏超声检测小鼠心脏功能，结果发现，罗沙司他可以显著改善阿霉素导致的心脏功能降低。
研究结果也发现罗沙司他不影正常小鼠的心脏功能。小鼠左心室组织切片 TUNEL染色结果表明罗沙司他可以减轻心肌细胞凋亡。通过检测小鼠心脏组织中的MDA，发现罗沙司他减轻心肌细胞氧化应激损伤。体外培养大鼠心肌细胞系H9c2，给予罗沙司他(5μM)预处理24小时，之后给予阿霉素(1μM)处理制备心肌细胞损伤模型。结果表明罗沙司他可显著减少阿霉素诱导的H9c2细胞凋亡和ROS产生。最后在阿霉素敏感的两种肿瘤细胞系中(人肝癌细胞系HepG2 和人乳腺癌细胞系MCF7)检测罗沙司他是否干扰阿霉素抗癌效果。结果表明罗沙司他不干扰阿霉素抗癌效果。
因此，罗沙司他应用于阿霉素心肌保护具有显著效果，且不干扰阿霉素抗癌效果。
附图说明
图1是罗沙司他对正常小鼠心功能安全性评价图；
图2是罗沙司他缓解阿霉素心功能损伤的心超结果图；
图3是罗沙司他减轻阿霉素引起的小鼠心肌细胞凋亡图；
图4是罗沙司他减轻阿霉素引起的小鼠心肌细胞氧化应激图；
图5是罗沙司他减轻阿霉素引起的大鼠心肌细胞系H9c2凋亡图；
图6是罗沙司他减轻阿霉素引起的大鼠心肌细胞系H9c2ROS产生图；
图7是罗沙司他不干扰阿霉素杀死癌细胞的效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，对发明方法进行详细阐明。其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。
实施例1罗沙司他对正常小鼠心功能的安全性评估
1实验材料
本发明使用的C57BL/6j小鼠购自江苏省集萃药康生物科技有限公司。本发明使用的罗沙司他购自Selleck公司。
2实验方法
2.1小鼠给药方法
雄性C57BL/6j小鼠14只(8周龄，体重22-25g)饲养于SPF级动物房，适应性饲养1周后随机分为对照组(n＝7)和罗沙司他组(n＝7)。罗沙司他组小鼠腹腔注射罗沙司他(10mg/kg/day)，对照组小鼠腹腔注射PBS。连续注射9天。
2.2小鼠心超检测心脏功能
使用小动物超声设备(Vevo 2100)检测小鼠心脏功能。
3实验结果
对照组和罗沙司他组小鼠心脏超声代表图(图1A)，小鼠左心室射血分数统计图(图1B)和小鼠左心室缩短率(图1C)均无显著性差异。说明10mg/kg/day 罗沙司他注射剂量对小鼠心脏功能没有影响，具有安全性。
实施例2罗沙司他缓解阿霉素引起的心功能损伤
1实验材料
本发明使用的C57BL/6j小鼠购自江苏省集萃药康生物科技有限公司。本发明使用的阿霉素购自Sigma-Aldrich公司。阿霉素使用生理盐水溶解，现用现配。
2实验方法
2.1阿霉素心肌病小鼠模型的建立以及给药方法
雄性C57BL/6j小鼠23只(8周龄，体重22-25g)饲养于SPF级动物房，适应性饲养1周后随机分为对照组(n＝7)、阿霉素组(n＝9)和罗沙司他+阿霉素组(n＝7)。罗沙司他+阿霉素组小鼠腹腔注射罗沙司他(10mg/kg/day)，对照组小鼠腹腔注射PBS。连续注射2天，之后阿霉素组和罗沙司他+阿霉素组腹腔注射阿霉素(12.5mg/kg)1次。7天后小鼠心脏超声。
2.2小鼠心超检测心脏功能
使用小动物超声设备(Vevo 2100)检测三组小鼠心脏功能。
3实验结果
对照组、阿霉素组和罗沙司他+阿霉素组小鼠心脏超声代表图(图2A)，小鼠左心室射血分数统计图(图2B)和小鼠左心室缩短率(图2C)统计结果表明阿霉素可显著诱导心脏功能的下降，而罗沙司他可以缓解阿霉素引起的小鼠心脏功能的下降。图中**P<0.01阿霉素组与对照组比较，*P<0.05阿霉素组与罗沙司他+阿霉素组比较。
实施例3罗沙司他减轻阿霉素引起的小鼠心肌细胞凋亡
1实验材料
本发明使用的C57BL/6j小鼠购自江苏省集萃药康生物科技有限公司。本发明使用的TUNEL凋亡检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
2实验方法
2.1阿霉素心肌病小鼠模型的建立以及给药方法
雄性C57BL/6j小鼠23只(8周龄，体重22-25g)饲养于SPF级动物房，适应性饲养1周后随机分为对照组(n＝7)、阿霉素组(n＝9)和罗沙司他+阿霉素组(n＝7)。罗沙司他+阿霉素组小鼠腹腔注射罗沙司他(10mg/kg/day)，对照组小鼠腹腔注射PBS。连续注射2天，之后阿霉素组和罗沙司他+阿霉素组腹腔注射阿霉素(12.5mg/kg)1次。7天后小鼠心脏超声结束后取小鼠左心室组织，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片。
2.2 TUNEL染色
小鼠心脏组织切片脱蜡后，按照TUNEL凋亡检测试剂盒操作步骤进行操作，实验结束后使用激光共聚焦显微镜观察拍照。
3实验结果
对照组、阿霉素组和罗沙司他+阿霉素组小鼠心脏切片TUNEL染色代表图(图3A)，统计TUNEL染色阳性(绿色是凋亡阳性细胞，蓝色是细胞核)细胞比例，结果表明阿霉素可导致心肌细胞凋亡，罗沙司他可以缓解阿霉素引起的小鼠心肌细胞凋亡(图3B)。
实施例4罗沙司他减轻阿霉素引起的小鼠心肌细胞氧化应激
1实验材料
本发明使用的C57BL/6j小鼠购自江苏省集萃药康生物科技有限公司。本发明使用的丙二醛(MDA)检测试剂盒购自Cayman公司。
2实验方法
2.1阿霉素心肌病小鼠模型的建立以及给药方法
雄性C57BL/6j小鼠23只(8周龄，体重22-25g)饲养于SPF级动物房，适应性饲养1周后随机分为对照组(n＝7)、阿霉素组(n＝9)和罗沙司他+阿霉素组(n＝7)。罗沙司他+阿霉素组小鼠腹腔注射罗沙司他(10mg/kg/day)，对照组小鼠腹腔注射PBS。连续注射2天，之后阿霉素组和罗沙司他+阿霉素组腹腔注射阿霉素(12.5mg/kg)1次。7天后小鼠心脏超声结束后取小鼠左心室组织，迅速冻于液氮，保存于-80℃。
2.2 MDA检测
称取小鼠心脏组织20mg左右，加入预冷的PBS进行研磨，12000rpm 4℃离心15min，收集心脏组织裂解上清，取少量上清用于蛋白浓度检测(BCA方法)，其余上清按照MDA检测试剂盒操作步骤进行MDA含量的检测，使用酶标仪读数，根据蛋白浓度计算出小鼠心脏组织中MDA的含量。
3实验结果
对照组、阿霉素组和罗沙司他+阿霉素组小鼠心脏组织中MDA的含量(图4)，结果表明阿霉素可增加心脏组织MDA含量，罗沙司他可以缓解阿霉素引起的小鼠心脏组织MDA水平。
实施例5罗沙司他减轻阿霉素引起的大鼠心肌细胞系H9c2凋亡
1实验材料
细胞活性CCK8检测试剂盒购自凯基生物公司；大鼠心肌细胞系H9c2购自 ATCC；培养H9c2细胞系所需的高糖DMEM、胎牛血清购自Gibco公司；
2实验方法
体外培养大鼠心肌细胞系H9c2，使用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃，含5％CO2的培养箱中培养。实验时将H9c2细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞密度为2×103/孔，1、评价罗沙司他对H9c2细胞毒性：细胞铺板过夜后进行实验分组分为对照组，罗沙司他组(5，10μM)组，48h后向各孔加入 10μL CCK8检测溶液，于培养箱孵育30min，使用酶标仪于450nm波长处检测细胞吸光度。2、评价罗沙司他对阿霉素引起的H9c2细胞活性下降的影响：细胞铺板过夜后进行实验分组分为对照组，阿霉素组(1μM)和罗沙司他(5μM) +阿霉素组。罗沙司他(5μM)预处理H9c2细胞24h，之后给予阿霉素(1μM) 处理，24h后向各孔加入10μL CCK8检测溶液，于培养箱孵育30min，使用酶标仪于450nm波长处检测细胞吸光度。
体外培养大鼠心肌细胞系H9c2，实验时将H9c2细胞接种于激光共聚焦专用培养细胞的小皿中。细胞铺板过夜后进行分组分为对照组，阿霉素组和罗沙司他 +阿霉素组。罗沙司他(5μM)预处理H9c2细胞24h，之后给予阿霉素(1μM) 处理，24h后按照TUNEL染色试剂盒操作进行TUNEL染色，实验结束后使用激光共聚焦显微镜观察拍照。
3实验结果
CCK8检测结果显示5，10μM的罗沙司他对大鼠心肌细胞H9c2活性无影响 (图5A)，5μM的罗沙司他可显著缓解1μM阿霉素诱导的H9c2细胞活性的下降(图5B)。TUNEL染色结果表明5μM的罗沙司他可显著缓解1μM阿霉素诱导的H9c2细胞的凋亡(图5C- D)。
实施例6罗沙司他减轻阿霉素引起的大鼠心肌细胞系H9c2中ROS产生
1实验材料
线粒体ROS检测试剂盒购于ThermoFisher Scientific公司。
2实验方法
体外培养大鼠心肌细胞系H9c2，实验时将H9c2细胞接种于12孔板，细胞铺板过夜后进行分组分为对照组，罗沙司他组，阿霉素组和罗沙司他+阿霉素组。罗沙司他(5μM)预处理H9c2细胞24h，之后给予阿霉素(1μM)处理，24h 后使用MitoSOXTMRed MitochondrialSuperoxide Indicator孵育20min，流式细胞仪检测平均荧光强度。
3实验结果
对照组、罗沙司他组、阿霉素组和罗沙司他+阿霉素组细胞流式ROS检测结果代表图(图6A)。平均荧光强度统计结果表明罗沙司他可显著缓解阿霉素引起 H9c2细胞中ROS的产生(图6B)。
实施例7罗沙司他不干扰阿霉素杀死癌细胞的效果
1实验材料
人肝癌细胞系HepG2和人乳腺癌细胞系MCF-7购自ATCC；这两株细胞系均对阿霉素敏感。
2实验方法
体外培养HepG2和MCF-7细胞，实验时将细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞密度为2×103/孔，过夜后进行实验分组分为对照组，罗沙司他组，阿霉素组和罗沙司他+阿霉素组，罗沙司他(5μM)预处理细胞24h，之后给予阿霉素(1μM 或2μM)处理，24h后向各孔加入10μL CCK8检测溶液，于培养箱孵育30min，使用酶标仪于450nm波长处检测细胞吸光度。
3实验结果
CCK8检测结果显示5μM的罗沙司他可降低HepG2和MCF-7细胞的活性，但不影响阿霉素对HepG2和MCF-7细胞的杀伤作用。表明罗沙司他不干扰阿霉素杀死癌细胞的效果(图7)。

Claims (1)

1.罗沙司他用于制备心肌保护药物的用途，所述的心肌保护药物是治疗阿霉素化疗引起的心肌功能损伤药物。
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