CN110721183A - Met和axl双靶点抑制剂在制备防治胃癌的药物中的用途 - Google Patents

Met和axl双靶点抑制剂在制备防治胃癌的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及MET和AXL双靶点抑制剂在制备防治胃癌的药物中的用途，属于医药领域。本发明提供了MET和AXL双靶点抑制剂在制备防治胃癌的药物中的用途。通过利用MET与AXL高表达细胞株MKN45，以及MET与AXL中等表达细胞株SNU719进行体外实验，并建立裸鼠移植瘤模型，本发明证实了MET和AXL双靶点抑制剂对胃癌能够发挥显著的治疗作用，为临床防治胃癌提供的新的策略。

Description

MET和AXL双靶点抑制剂在制备防治胃癌的药物中的用途
技术领域
本发明涉及MET和AXL双靶点抑制剂在制备防治胃癌的药物中的用途，属于医药领域。
背景技术
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。虽然近年来全世界范围的胃癌发生率在逐渐下降，但是在我国胃癌仍然是高发的肿瘤之一，每年平均每10万人中就有新发胃癌病例29.9人，造成了巨大的社会负担。早期胃癌的五年生存率可大于95％，但是由于多数病人常常忽略早期胃癌的症状，在确诊之时已进入晚期阶段，错过了最佳手术时期。晚期胃癌的治疗手段更复杂，需要结合新辅助放化疗、分子靶向治疗和免疫治疗等，而且中位生存时间不到一年。胃癌的标准化疗方案以顺铂作为基础，联合其他细胞毒性药物如紫杉类、氟尿嘧啶、蒽环类、VP-16等。但是，这些方案常常因为耐药性并没有从根本上提高化疗有效率，病人常因肿瘤复发和转移而死亡。
近年来，分子靶向治疗成为了癌症的研究热点。一些靶向EGFR、VEGF、细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)、基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)的抑制剂在许多恶性肿瘤中显示了抗肿瘤效果，比如针对HER-2的曲妥珠单抗和拉帕替尼在HER-2阳性的乳腺癌的应用、EGFR抑制剂厄洛替尼和吉非替尼在非小细胞肺癌的应用，其他包括胃肠道间质瘤(Gastrointestinal Stromal Tumors，GIST)、血液系统肿瘤、结直肠癌和肾癌等也有许多分子靶向药物作为治疗手段。
MET也叫酪氨酸蛋白激酶MET(C-MET)，是一种由MET原癌基因编码的蛋白产物，该异二聚体具有酪氨酸激酶活性，配体为肝细胞生长因子(HGF)。肝细胞生长因子与MET结合导致了MET磷酸化，并且激活了下游的级联信号通路，介导细胞增殖、迁移、侵袭、存活和分枝化形态发生。荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)分析显示大约8％的肿瘤病人中有MET基因扩增，PCR分析显示大概20％的病人有MET基因拷贝数增加。
AXL(也称为UFO，Ark，Tyro7)是TAM家族中的一员，由位于人类的染色体19q13.1上的AXL基因编码，也属于受体酪氨酸激酶大家族。TAM有3个成员：TYRO-3、AXL和MER，它们均由胞外区、跨膜区和胞内区组成，且有共同的配体生长阻抑特异性蛋白6(GrowthArrestSpecific Protein 6，Gas6)和蛋白S(protein S)。Gas6可以结合TAM家族的所有三个成员，TAM家族的三个成员与Gas6的亲和力为AXL>Tyro3>Mer。在非小细胞肺癌(Non-Small CellLung Cancer，NSCLC)中，AXL的活化引起了NSCLC细胞系对第一代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)的获得性耐药，而抑制AXL可以保留细胞系和肿瘤移植物对厄洛替尼(erlotinib，EGFR-TKI的一种)的敏感性。AXL也在干细胞表型中起着重要作用，与CD44、ALDH1等干细胞标志的表达有关。比如，AXL的表达在脑胶质瘤细胞中受到EZH2的正向调控，EZH2对于干细胞形态维持有着重要意义，敲除AXL能够模拟EZH2的抑制。
迄今，尚未见将MET/AXL双靶点抑制剂用于制备胃癌防治药物的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供MET和AXL双靶点抑制剂在制备防治胃癌的药物中的用途。
本发明提供了MET和AXL双靶点抑制剂在制备防治胃癌的药物中的用途。
进一步地，所述的胃癌过度表达MET和AXL。
进一步地，所述的胃癌为胃腺癌。本发明实施例中具体检测了7种人胃癌细胞系：SNU719、MGC803、SNU16、MKN28、MKN45、AZ521和GT39，均为胃腺癌细胞。
进一步地，所述的药物抑制胃癌转移。
进一步地，所述的药物抑制胃癌组织中微血管生成。
进一步地，所述的药物抑制胃癌细胞增殖，促进胃癌细胞凋亡。
进一步地，所述的药物抑制胃癌组织中M2型巨噬细胞生成。
进一步地，所述的MET和AXL双靶点抑制剂为LY2801653或其药学上可接受的盐。其中，LY2801653是一种同时针对MET和AXL双靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂，其CAS No.:1206799-15-6，化学结构如下所示：
进一步地，所述的药物是以MET和AXL双靶点抑制剂为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
进一步地，所述的制剂为口服制剂或注射制剂。
本发明利用MET与AXL高表达细胞株MKN45，以及MET与AXL中等表达细胞株SNU719进行体外实验，并建立裸鼠移植瘤模型，证实了MET和AXL双靶点抑制剂对胃癌能够发挥显著的治疗作用，为临床防治胃癌提供的新的策略。
附图说明
图1为实施例1中实时荧光定量PCR法检测7种人胃癌细胞系MET和AXL基因的表达结果图；
图2为实施例1中蛋白质免疫印迹法检测7种人胃癌细胞系MET和AXL蛋白的表达结果图；
图3为实施例1中选取的具有代表性的高/低表达的MET和AXL图；
图4为实施例1中胃癌病人的生存曲线图；
图5为实施例2中CCK8法检测LY2801653对胃癌细胞增殖的影响结果图；
图6为实施例2中蛋白质免疫印迹法检测LY2801653处理后MKN45细胞凋亡相关蛋白水平的变化结果图；
图7为实施例2中流式细胞术检测LY2801653处理MKN45细胞24h后凋亡细胞数量的变化结果图；
图8为实施例2中流式细胞术检测LY2801653处理SNU719细胞72h后凋亡细胞数量的变化结果图；
图9为实施例2中TUNEL法检测MKN45细胞凋亡情况图；
图10为实施例2中LY2801653诱导MKN45细胞周期停滞情况图；
图11为实施例2中SNU719细胞经LY2801653和溶剂处理后的流式细胞术分析结果图；
图12为实施例2中蛋白质免疫印迹法检测LY2801653作用于MKN45细胞后周期相关蛋白CyclinA2和Cyclin D1水平的变化结果图；
图13为实施例2中SNU719细胞经LY2801653和溶剂处理后的划痕实验结果图；
图14为实施例2中蛋白质免疫印迹法检测LY2801653处理SNU719细胞后上皮-间充质转化相关的蛋白质水平变化结果图；
图15为实施例2中蛋白质免疫印迹法检测LY2801653处理MKN45细胞24小时后下游通路相关的蛋白质水平的变化结果图；
图16为实施例2中蛋白质免疫印迹法检测LY2801653处理SNU719细胞株72小时后下游通路相关的蛋白质水平的变化结果图；
图17为实施例3中LY2801653体内抑制MKN45细胞生长情况图；
图18为实施例3中对照组及实验组皮下瘤图；
图19为实施例3中各组裸鼠所有皮下瘤结节的重量统计结果图；
图20为实施例3中对照组及实验组裸鼠平均体重变化曲线图；
图21为实施例3中HE染色检测对照组和LY2801653药物处理组裸鼠重要脏器的病理切片染色图；
图22为实施例3中肝、脾、肾脏器的HE病理切片染色图；
图23为实施例3中对照组和实验组各项反应肝功能、肾功能、心功能的指标统计结果图；
图24为实施例3中实验组以及对照组肿瘤移植物形态HE染色图；
图25为实施例3中LY2801653抑制细胞株MKN45裸鼠移植瘤模型中肿瘤细胞MET和AXL的磷酸化的免疫组化图；
图26为实施例3中对照组和实验组皮下瘤的Ki67免疫组化结果图；
图27为实施例3中TUNEL法检测对照组和实验组皮下瘤的组织细胞凋亡结果图；
图28为实施例3中CD31免疫组化染色检测对照组和实验组皮下瘤的微血管生成结果图；
图29为实施例3中LY2801653体内抑制细胞株SNU719生长情况图；
图30为实施例3中对照组及实验组裸鼠体重变化曲线图；
图31为实施例3中LY2801653抑制肿瘤细胞SNU719体内生长情况图；
图32为实施例3中CD31免疫荧光染色检测对照组和实验组皮下瘤的微血管生成结果图；
图33为实施例3中流式分析实验组和对照组裸鼠皮下瘤M2型巨噬细胞比例结果图；
图34为实施例3中qRT-PCR测定裸鼠皮下瘤M2型巨噬细胞相关基因的表达情况图。
具体实施方式
本发明用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)检测了七种人胃癌细胞系总体MET和AXL基因及蛋白质表达情况；收集胃癌病人临床数据，分析了包含90例胃癌病人信息的组织芯片以探讨MET、AXL与病人预后的关系。细胞增殖/毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)用来观察LY2801653药物作用后细胞增殖状况。流式细胞术检测了药物对细胞凋亡和细胞周期的影响，WB反映了凋亡、周期以及MET和AXL下游通路相关蛋白水平的变化。此外，在6-8周、体重18-20g的雌性Balb/c裸鼠中构建了MET和AXL高表达细胞株MKN45，以及中等表达细胞株SNU719的人胃癌移植瘤模型，观察LY2801653的体内抗肿瘤效果。取裸鼠移植瘤做组织病理切片，苏木素-伊红(H&E)染色观察给药后肿瘤形态病理学改变；免疫组化测定药物作用后MET与AXL的活化形式(即磷酸化MET与AXL蛋白)和细胞增殖标志Ki67的表达变化；免疫荧光法测定对照组与实验组的微血管密度(CD31)、细胞凋亡(TUNEL)的改变，流式细胞术检测肿瘤微环境中巨噬细胞的标志。
以上实验以LY2801653作为典型试验药物，揭示了MET/AXL双靶点抑制剂在胃癌中的抗肿瘤作用。LY2801653体外抑制MET和AXL高表达细胞株的增殖、促进肿瘤细胞凋亡、诱导细胞周期停滞、抑制MET、AXL以及下游通路中AKT、ERK、STAT3等相关蛋白的磷酸化、阻止细胞迁移和EMT。
在人胃癌裸鼠移植瘤模型中，低剂量的LY2801653能够抑制MET和AXL高表达的MKN45细胞的体内生长，增大药物剂量后也能够抑制MET和AXL中等表达的SNU719细胞移植物的生长。对于MET和AXL高表达的肿瘤细胞，LY2801653起着直接抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用；对于MET和AXL中等表达的肿瘤细胞，LY2801653可能作用于肿瘤微环境，减少了M2型巨噬细胞和微血管的生成，从而起到了体内抗肿瘤作用。本发明通过上述实验提供了MET和AXL作为胃癌治疗新靶点的证据。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 MET和AXL在胃癌细胞系和胃癌病人组织中的表达
用实时荧光定量PCR方法检测了7种人胃癌细胞系的MET和AXL基因的表达。这7种细胞系包括：SNU719、MGC803、SNU16、MKN28、MKN45、AZ521、GT39。实验结果见图1，结果以均数±标准差表示。从图1可以看出，三种细胞(MKN45、SNU16、GT39)存在MET mRNA表达增加，尤其在MKN45细胞中，MET基因显著过表达，MKN28和GT39细胞AXL表达较其他细胞株少。
另一方面，通过蛋白质免疫印迹法(WB)检测这七种人胃癌细胞系MET和AXL蛋白表达情况。实验结果见图2，以GAPDH作为内参。从图2可以看出，蛋白质免疫印迹法检测结果与qRT-PCR基本一致。MKN45细胞MET蛋白表达明显高于其他细胞株，AXL蛋白表达水平较高；SNU719细胞MET和AXL蛋白中等表达。
进一步地，本实验分析了90例胃癌病人组织的MET和AXL表达情况，将每个组织切片的阳性细胞数量及阳性强度进行打分，阳性细胞数量评分如下：0-25％＝1分，26-50％＝2分，51-75％＝3分，>75％＝4分；阳性强度评分如下：阴性＝0分,弱阳性＝1分,中阳性＝2分,强阳性＝3分。并将两个数值进行相乘(范围0-12分)，规定乘积≥6分为高表达，<6分为低表达。有代表性的高表达及低表达的MET和AXL见图3，该图放大倍数为20x。结果发现，90例病人中，有52人MET高表达(57.8％)，38人MET低表达(42.2％)；49人AXL高表达(54.4％)，41人AXL低表达(45.6％)。
同时，本实验搜集这些胃癌病人的临床数据，根据病人的生存状况绘制出生存曲线，探讨MET和AXL的高/低表达与病人预后的关系，结果见图4。生存曲线显示，MET高表达降低了病人的总体生存(Overall survival，OS)(log-rank P＝0.0012；危险比hazard ratio(HR)＝2.37；95％置信区间confidence interval(CI),1.41-3.89)；同样，AXL高表达的病人预后也明显差于AXL低表达的病人，且差异有统计学意义(log-rank P＝0.0158；HR＝1.88；95％CI＝1.14-3.13)。
实施例2 MET/AXL双靶点抑制剂LY2801653体外抗肿瘤作用机制研究
1、LY2801653体外抑制MET和AXL高表达的细胞的增殖
将七种人胃癌细胞用一系列浓度梯度(0nM，1nM，10nM，20nM，50nM，100nM，500nM，1μM，10μM)的LY2801653处理48小时和72小时后，探究MET/AXL双靶点小分子抑制剂LY2801653对细胞增殖的作用，结果如图5所示。从图5可以看出，LY2801653仅对MET高表达细胞株的抑制增殖的作用十分明显，CCK8细胞活力曲线显示，48小时LY2801653对MKN45细胞作用的半数抑制浓度(halfmaximal inhibitory concentration，IC50)仅为24.83nM(范围20.85-29.56nM)，72小时为23.35nM(范围21.14-25.8nM)；相反，中等或者低MET表达的细胞的增殖均不受LY2801653影响，比如MET低表达但AXL高表达的AZ521细胞，48小时或者72小时LY2801653作用的IC50均>10μM。
接着，本实验探究LY2801653影响细胞活力的原因究竟是与凋亡还是细胞周期改变相关。由于LY2801653仅对MET和AXL高表达的MKN45细胞增殖有作用，因此以MKN45细胞为例，将细胞用不同浓度的LY2801653(0nM，10nM，20nM，50nM，100nM，500nM)处理24h，WB检测凋亡相关蛋白水平的变化，结果见图6，以β-Actin作为内参。从图6可以看出，LY2801653处理细胞后，凋亡蛋白Cleaved Caspase 3表达增加，MCL-1蛋白随着药物浓度增加而减少，Procaspase-3、BCL-2和BAX蛋白表达基本不变。
另一方面，用流式细胞术验证LY2801653(0nM，10nM，20nM，50nM)处理MKN45细胞24h后凋亡及坏死细胞的数量变化。MKN45细胞经溶剂(DMSO)或10nM、20nM、50nM的LY2801653处理24小时后，收集细胞，经FITC标记的AnnexinV及碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)染色，流式细胞术统计分析，结果见图7。早期凋亡细胞在右下象限(Annexin V+/PI-)，晚期凋亡/坏死细胞在右上/左上象限(AnnexinV/PI+)。统计右下+右上+左上三个象限细胞比例总数，即所有凋亡细胞的比例。结果发现，随着药物浓度增加，MKN45凋亡细胞的比例明显增加：DMSO组(4.95±0.26)vs.10nM组(6.38±0.36)vs.20nM组(10.44±0.54)vs.50nM组(13.69±0.87)，且不同浓度组间差异有统计学意义(p<0.05)。下面柱状图为三次独立实验统计结果图。结果以均数±标准差表示。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
同时，检测中等MET和AXL表达的SNU719细胞在药物处理后凋亡状况。SNU719细胞经溶剂(DMSO)或0.5μM、1μM、10μM、20μM的LY2801653处理72小时后，收集细胞，结果如图8所示。Annexin V-PI染色统计结果显示药物作用后，细胞凋亡数目基本不变。药物作用72h后：DMSO组(4.70±0.30)vs.0.5μM组(4.22±0.23)vs.1μM组(4.41±0.31)vs.10μM组(4.48±0.54)vs.20μM组(5.51±0.85)(p>0.05)，这个结果与CCK8结果也相一致。下面柱状图为三次独立实验统计结果图。结果以均数±标准差表示。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001；ns:差异没有统计学意义。
进一步的，用TUNEL免疫荧光法观察药物处理后的凋亡细胞。MKN45细胞在经过溶剂(1‰DMSO)或20nM LY2801653处理24h后，收集细胞于流式管中，经多聚甲醛固定、蛋白酶K打孔、平衡液孵育、rdTd标记后，滴片置于正置荧光显微镜下观察，结果见图9，比例尺为100μm。如图9所示，LY2801653作用后，绿色FITC标记的TUNEL阳性的细胞数明显多于对照组，表明药物能作用于MKN45细胞使其凋亡。
2、对细胞周期的影响
用低渗的PI染液对不同浓度的LY2801653(0nM，10nM，20nM，50nM)作用于MKN45细胞周期的变化进行了测定，结果见图10。下面的柱状图为三次独立实验统计结果图。结果以均数±标准差表示。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。发现随着药物浓度的增加，MKN45细胞除了反映凋亡的处于sub-G1期的细胞比例增加，还可观察到S期明显减少，G1合成期增加。
同时，用相同方法验证了0.5μM、1μM、10μM、20μM的LY2801653处理72小时后对SNU719细胞周期影响，结果如下图11所示。下面的柱状图为三次独立实验统计结果图。结果以均数±标准差表示。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001；ns:差异没有统计学意义。结果发现SNU719细胞周期几乎没有变化。
接着，用WB对周期相关的蛋白进行了验证，如图12所示，以β-Actin作为内参。结果发现MKN45细胞在药物作用下呈现剂量相关的CyclinA2和Cyclin D1明显减少。研究表明细胞周期蛋白(Cyclins)家族在肿瘤发生和进展中起着多种作用。Cyclin D1作为调节亚基与Cyclin依赖激酶CDK4/CDK6结合后，Cyclin D1/CDK4/6复合物能够磷酸化Rb蛋白，从而推动细胞周期由G1向S期的转化。乳腺癌中就存在Cyclin D1基因的过表达。CyclinA2也是细胞周期蛋白家族中重要的一员，参与Gl/S期以及G2/M期调控，在DNA复制、转录和肿瘤转化和发展过程中有非常重要的作用。这与本实验上述的结论相同。发现药物作用后，MKN45细胞周期S期明显减少，停滞在G1期的细胞增加。说明LY2801653抑制剂可阻止细胞由G1期进入S期，从而影响细胞增殖。
3、对细胞迁移和EMT的影响
本实验拟探究MET/AXL双靶点抑制剂可否抑制AXL介导的细胞迁移作用。因为MKN45是半悬浮细胞，而SNU719细胞为AXL蛋白表达水平较高的贴壁细胞株，因此选用SNU719细胞进行划痕实验，用100nM、500nM的LY2801653和溶剂(DMSO)分别处理密度达90％汇合度的SNU719细胞后，在0小时、12小时和24小时分别观察细胞的迁移情况，分别对三个组同一位置的划痕进行拍照(x4)，痕的宽度用image J进行测量分析，如图13所示。结果发现，100nM的LY2801653在12小时就可抑制细胞迁移(p<0.001)，在500nM的LY2801653作用下，细胞的迁移受到明显抑制，几乎没有迁移的细胞。下面的柱状图为三次独立实验统计结果图。结果以均数±标准差表示。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
肿瘤转移一个很关键的事件就是EMT，AXL在其中扮演着重要角色。激活AXL能够驱使EMT程序，并维持细胞的间质形态。文献显示敲除AXL导致EMT转录因子如Slug、Zeb1、Twist等基因下调以及上皮性钙粘附蛋白(E-cadherin)表达上调。AXL缺失增加了细胞与细胞间的粘附，使细胞重新具有上皮细胞的表型。在EMT进程中，一些特殊标志物起着重要作用，比如E-cadherin是上皮细胞状态的一个重要标记，波形蛋白(Vimentin)是调控EMT以及间质细胞迁移的不可或缺的成分，Snail蛋白是关键的诱导转录的分子。本实验发现，用一系列浓度梯度(0μM、0.1μM、0.5μM、1μM、10μM)的LY2801653作用于胃癌细胞SNU71972小时后，上皮性钙粘附蛋白E-cadherin表达增加，而Snail表达水平略减少，α-SMA和vimentin蛋白表达基本不变，如图14所示，以β-Actin作为内参。由此可见，AXL与EMT具有密切的关系。AXL可以促进细胞迁移及介导EMT，针对AXL的靶向抑制剂可以阻止向间充质细胞的转化，减少胃癌转移的可能性。
4、对下游信号通路的影响
研究显示AXL和MET通过一系列共同的抗凋亡途径调控肿瘤细胞的存活。MET诱导细胞增殖、扩散、迁移、侵袭等，在肿瘤侵袭性生长和肿瘤细胞播散中起着关键作用。HGF/MET轴也参与了肿瘤血管生成。MET激活了许多下游通路，如PI3K/AKT、MAPK/ERK及STAT3等。同样的，AXL也参与了这些信号通路。为此，本实验探讨抑制MET和AXL是否会对其下游信号通路产生影响。
首先，用一系列较低浓度的LY2801653(0nM，10nM，20nM，50nM，100nM，500nM)处理MET和AXL高表达细胞株MKN45细胞24小时，WB检测下游信号通路蛋白表达水平的变化，结果如图15所示，以GAPDH作为内参。结果发现，MET和AXL磷酸化活性被抑制，p-AKT/AKT、p-ERK/ERK和p-STAT3/STAT3比例随着药物浓度升高均逐渐下降，而总MET、AXL、AKT、ERK和STAT3表达水平不受影响。因此推断，LY2801653可能通过抑制MET及AXL磷酸化，以及抑制下游STAT3，PI3K/AKT和MAPK/ERK途径调控MKN45肿瘤细胞代谢、生长、增殖。
接着，用同样方法探讨LY2801653抑制剂对MET和AXL中等表达细胞株SNU719的作用。在相同浓度梯度(0nM，10nM，20nM，50nM，100nM，500nM)的LY2801653作用下，WB检测下游信号通路蛋白表达水平的变化，发现p-AKT/AKT、p-ERK/ERK和p-STAT3/STAT3蛋白表达几乎没有改变。而当加大了药物浓度(0μM、0.1μM、0.5μM、1μM、10μM、20μM)，并延长了药物作用时间(72小时)后，WB检测结果发现，与MET和AXL高表达细胞株MKN45相似，随着药物浓度增加，SNU719细胞的p-AKT/AKT、p-ERK/ERK和p-STAT3/STAT3比例也逐渐下降，且这种趋势与药物浓度相关，如图16所示，以GAPDH作为内参。因此得出结论，MET/AXL抑制剂LY2801653可能通过抑制磷酸化的AKT、ERK及STAT3调控下游信号通路，低浓度下就可明显抑制MET和AXL高表达细胞株的下游通路，而增大浓度、延长药物作用时间后也可以抑制MET和AXL中等表达细胞株的下游通路，从而在肿瘤细胞生长、增殖、播散等方面起着关键作用。
实施例3 MET/AXL双靶点抑制剂LY2801653在人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型中的研究
1、LY2801653抑制MET和AXL高表达的细胞株MKN45细胞移植物的生长1.1药物体内抗肿瘤效应的研究
为了进一步探究MET/AXL抑制剂的抗肿瘤效果，本实验建立了人胃癌的裸鼠皮下移植瘤模型，观察LY2801653的体内抗肿瘤作用。
首先，选取MET和AXL高表达细胞株MKN45，该细胞为悬浮细胞，在含有20％灭活的胎牛血清、100U/ml青霉素及100U/ml链霉素的RPMI 1640培养基中生长，细胞置于37℃含5％CO2培养箱中培养，待其处于对数生长期时，收集细胞并计数。以每只裸鼠1×107个细胞数量接种。裸鼠选取6-8周龄，体重为18-20g的雌性Balb/c nude mice。周龄过大不易成瘤，周龄过小、体重过轻可能会因为药物毒副作用导致死亡。共接种45只裸鼠，每只裸鼠皮下接种部位为右侧背部。
裸鼠接种完毕后，置于独立通气笼具系统(Individual Ventilated Cages,IVC)中，20～26℃恒温、40％～70％恒湿、SPF级动物房内饲养，定期更换垫料、食物、水，并注意观察裸鼠精神，饮食和排便情况。肿瘤结节大小用游标卡尺测量，肿瘤体积(Tumor volume,TV)计算公式为[TV＝(L×W2)/2]，L为肿瘤的长径，W为肿瘤的短径。待肿瘤体积长至150-200mm3，选取肿瘤大小基本一致的裸鼠随机分成5组：1)空白组(数据未显示)；2)对照组；3)12mg/kg LY2801653组；4)6mg/kg LY2801653组；5)3mg/kg LY2801653组。每组9只。根据相应的药物剂量进行每只裸鼠每天灌胃给药，并每三天测量、记录肿瘤体积，见图17，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。待肿瘤增长到一定大小，或者肉眼可见裸鼠背上部分肿瘤组织中心有坏死并开始破溃，或者出现对照组裸鼠体重明显下降时，便对裸鼠进行断颈处理，小心剥离取出皮下瘤进行拍照、称重、统计实验结果，如图18和图19所示，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。可以发现，实验组与对照组裸鼠皮下瘤的大小有明显差异，不同实验组间肿瘤大小也存在差异。在给药第21天，对照组裸鼠的肿瘤平均体积为(670±88.6)mm3，12mg/kg LY2801653组肿瘤平均体积为(84.27±22.3)mm3，6mg/kgLY2801653组肿瘤平均体积为(225.8±35.57)mm3，3mg/kg LY2801653组肿瘤平均体积为(349.5±41.43)mm3。对照组肿瘤体积大于所有不同剂量的给药组，与3mg/kg LY2801653组之间肿瘤大小也有明显差异(p<0.001)。说明LY2801653药物对MET和AXL高表达细胞株有体内抗肿瘤效果，仅在3mg/kg的低剂量下就有明显的抑制肿瘤生长的作用。
1.2毒性和副反应
本实验监测裸鼠的体重，以评估药物的毒副作用，结果见图20。随着肿瘤生长，每只裸鼠的体重没有明显的变化。给药第21天，对照组裸鼠平均体重为17.80±0.74g；12mg/kg LY2801653组裸鼠平均体重为17.08±0.73g；6mg/kg LY2801653组裸鼠平均体重为16.74±0.86g；3mg/kg LY2801653组裸鼠平均体重为19.53±1.09g。不同组间裸鼠体重差异没有统计学意义(p>0.05)。此外，本实验过程中所有裸鼠均未表现出明显异常的临床症状。
同时，每组取5-6只裸鼠的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，于福尔马林固定液中固定>24小时，用于HE染色，从形态上对各重要脏器进行毒副作用的评估，如图21和图22所示，心切片的比例尺为200μm，肺切片的比例尺为100μm，肾比例尺为200μm，肝、脾中的比例尺为100μm。LY2801653实验组与对照组的裸鼠心肌和肺中均有少许散在出血点，可能是处死裸鼠或解剖手法所致，余重要脏器无明显异常的形态病理学改变。
本实验也采取裸鼠眼球血，检测血清中各项生化指标，包括TBIL、DBIL、ALT、AST、TP、ALB、GLU、BUN、S-Cr、UA、TG、T-CHO、HDL、LDL、ALP、CKMB、LDH、AMY等，结果见图23。结果显示，对照组与3mg/kg,、6mg/kg实验组各项反应肝功能、肾功能、心功能的指标均无统计学差异。而12mg/kg LY2801653的肝功能、心功能指标(TBIL、DBIL、ALT、ALP、LDH和CKMB)有所升高。
1.3抗肿瘤疗效的机制
1.3.1抑制MET和AXL的磷酸化
将剥离下来的肿瘤组织一部分用OCT胶包埋、冰冻切片，用于免疫荧光和免疫组化；一部分固定于福尔马林(4％多聚甲醛溶液)中，石蜡包埋并切片，用于常规HE染色。剩余的肿瘤组织冻存于-80℃可保存半年。
光镜下，发现对照组移植物肿瘤组织特点为：肿瘤细胞排列紊乱，核大而畸形，染色质丰富且深染，分裂相多见，核质比例失常，有的甚至占据了大部分细胞质体积。间质中结缔组织增生。而LY2801653药物处理后，肿瘤细胞坏死增多。代表性图片如图24所示(×20)。
同时，选取对照组和6mg/kg LY2801653实验组的肿瘤组织，采用免疫组化的方法检测皮下瘤组织中MET、AXL、P-MET和P-AXL蛋白的表达，结果如图25所示，图中比例尺为25μm。MET及AXL均为跨膜蛋白(Transmembrane protein)，阳性细胞应在胞膜表达。免疫组化结果显示，裸鼠经6mg/kg LY2801653口服给药后，肿瘤组织的磷酸化的MET及AXL明显减少(表达阳性的棕色细胞的比例明显降低)，总MET和AXL蛋白表达水平基本不变。
1.3.2影响MKN45肿瘤细胞增殖
Ki67(也称为MKI67)是许多肿瘤增殖的重要分子标志，它存在于核内，在增殖活跃的细胞的G1期、S期和G2期均有表达。Ki67高表达常常和不良预后相关。近年来Ki67指数(Ki67 labeling index，LI)作为不可或缺的预后和疗效评估指标逐渐被使用。Ki67指数统计了免疫组化视野中所有阳性细胞，不管染色强度或核的染色形态如何，即使核是斑点状或者弥漫着色也应纳入阳性细胞计数。Ki67指数在乳腺癌、胃癌、胰腺癌中的预后价值已被报道。该指数也可以与肿瘤分期、肿瘤大小和有丝分裂指数(Mitotic Index，MI)等一起作为预后因素。但有丝分裂指数只能识别处于M期有丝分裂状态的细胞，而Ki67可以帮助识别除G0期外的所有细胞周期中增殖活跃的细胞。高Ki67指数也可以预测肿瘤转移和复发。
通过对照组和6mg/kg LY2801653实验组皮下瘤的Ki67免疫组化结果，统计了在×40放大倍数下五个任意选择的区域阳性细胞计数，分析两组的Ki67指数，结果如图26所示。上图中比例尺为25um。下面柱状图统计了×40放大倍数下五个任意选择的区域阳性细胞计数。阳性细胞占比为Ki67指数(Ki67 labeling index,LI)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。结果发现，实验组Ki67指数(51.38±2.87)明显比对照组(86.84±2.75)减少，差异有统计学意义(p<0.001)。
1.3.3促进MKN45肿瘤细胞凋亡
进一步的，通过TUNEL法(Promega试剂盒)检测肿瘤组织细胞凋亡。凋亡的一个重要的生物学标记就是细胞基因组DNA在内切酶作用下发生断裂，产生双链DNA小片段，在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，TdT)的催化下，暴露的3’-OH端可被加上绿色荧光素FITC标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜、共聚焦显微镜或流式细胞仪检测。该方法敏感性、特异性较高，且快速便捷。
图27为选取的对照组和6mg/kg LY2801653实验组皮下瘤的TUNEL代表性图片。上图中比例尺为20um。下面柱状图统计了×40放大倍数下五个任意选择的区域阳性细胞计数。统计了在×40放大倍数下五个任意选择的区域阳性细胞计数，分析两组的阳性细胞的数量占所有细胞的比例，即凋亡指数(apoptotic index，AI)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。结果发现，实验组凋亡指数(52.89±1.6)明显比对照组(7.22±2.76)增加，差异有统计学意义(p<0.001)。
1.3.4抑制肿瘤血管生成
肿瘤生长和远处转移与血管因素有关。肿瘤细胞分泌促血管生成的因子，形成紊乱、不成熟的异常血管网。肿瘤血管灌注受损导致了缺氧的微环境，有利于选择侵袭性更强的肿瘤细胞进行远处扩散转移，也妨碍了免疫细胞进入坚实的肿瘤组织内部杀伤肿瘤细胞团。异常的血管网也不利于化疗药物的渗透并减弱了放疗的有效性。CD31、VEGF、CD105、CD34等抗原可以标记血管内皮细胞，是重要的血管标志物。
进行CD31免疫组化染色，见图28，CD31阳性的细胞以黄色显示，图中比例尺为25um。结果发现，对照组肿瘤组织有十分密集的血管生成，而实验组肿瘤的微血管密度(Microvessel density，MVD)明显较对照组低，随着LY2801653给药浓度增加，肿瘤血管减少。这说明药物LY2801653可以通过靶向MET和AXL，减少微血管的形成，达到抗肿瘤活性。
2、LY2801653抑制MET和AXL中等表达的细胞株SNU719细胞移植物的生长
2.1药物体内抗肿瘤效应的研究
前述LY2801653对MET和AXL高表达的细胞株有体内抗肿瘤作用，进一步的，本实验拟探究LY2801653是否对MET和AXL中等表达的细胞株也有体内抗肿瘤作用。选取SNU719细胞株，该细胞为贴壁细胞，在含有20％灭活的胎牛血清、100U/ml青霉素及100U/ml链霉素的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培养基中生长，待其处于对数生长期时，收集细胞并计数。以每只裸鼠1×107个细胞数量接种。共接种12只裸鼠。肿瘤结节大小用游标卡尺测量，待肿瘤体积长至150-200mm3，选取肿瘤大小基本一致的裸鼠随机分成2组：1)对照组；2)12mg/kg LY2801653实验组。根据相应的药物剂量进行每只裸鼠每天灌胃给药，并每三天测量、记录肿瘤体积，见图29。待肿瘤增长到一定大小，或者出现对照组裸鼠体重明显下降时，便对裸鼠进行断颈处理，小心剥离取出皮下瘤进行拍照、统计实验结果。
结果发现，给药第21天，对照组裸鼠的肿瘤平均体积为(389±72.0)mm3，12mg/kgLY2801653组肿瘤平均体积为(253±31.7)mm3，差异具有统计学意义(p<0.05)，说明了LY2801653药物对MET和AXL中等表达的细胞株也有体内抗肿瘤效果。
2.2毒性和副反应
同样监测裸鼠的体重，以评估药物的毒副作用，见图30。随着肿瘤生长，每只裸鼠的体重没有明显的变化。给药第21天对照组裸鼠平均体重为19.81±0.11g，实验组裸鼠平均体重为19.59±0.16g，对照组和实验组间裸鼠体重差异没有统计学意义(p＝0.26)。此外，本实验过程中所有裸鼠均未表现出明显异常的临床症状。
2.3抗肿瘤疗效的机制
将剥离下来的肿瘤组织一部分用OCT胶包埋冻存于-80℃进行冰冻切片，用于免疫组化；剩下的固定于福尔马林(4％多聚甲醛溶液)中。免疫组化结果显示，SNU719移植瘤裸鼠经12mg/kg LY2801653口服给药后，肿瘤组织的磷酸化的MET及AXL明显减少，总MET和AXL蛋白表达水平基本不变。与MET和AXL高表达的细胞株MKN45移植瘤的免疫组化结果一致。如图31所示选取的每组具有代表性的图片，其中棕色代表阳性表达的区域，图中比例尺为25μm。
本实验进一步研究了实验组和对照组TUNEL和KI67染色结果，发现与体外实验结果一致，LY2801653体内也并不是直接杀伤MET/AXL中等表达的SNU719肿瘤细胞。
将对照组与试验组皮下瘤标本的冰冻切片进行CD31免疫荧光染色，结果显示，对照组肿瘤组织有十分密集的血管生成，而实验组肿瘤的微血管密度明显较对照组低，见图32，CD31阳性的细胞以绿色FITC荧光标记，核DAPI以蓝色荧光标记，图中比例尺为20um。
进一步进行了裸鼠肿瘤免疫微环境的相关研究。取实验组与对照组裸鼠的皮下瘤，利用流式细胞术观察肿瘤微环境中巨噬细胞、MDSC、DC、中性粒细胞、单核细胞的表达变化。结果发现，在LY2801653处理后的裸鼠皮下瘤中，F4/80+CD206+阳性的M2型巨噬细胞的比例(％)(8.89±2.380)低于溶剂对照组(32.60±6.448)，差异有统计学意义(p<0.01)。MDSC、DC、中性粒细胞、单核细胞的表达变化无统计学差异。结果如图33所示，数据以均数±标准差表示，采用Student’s t检验进行两两比较；ns,差异无统计学意义，**p<0.01。
此外，在测定M2型巨噬细胞相关的基因表达中发现，LY2801653处理后，裸鼠皮下瘤的IL-1β、CD206、Arg-1基因表达明显低于对照组，而其他基因的变化无统计学差异。结果如图34所示，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
综上所述，MET/AXL抑制剂LY2801653不仅可以在低浓度下抑制MET和AXL高表达MKN45细胞株裸鼠移植瘤的生长，提高药物剂量后也可以抑制中等表达的SNU719细胞株裸鼠移植瘤的生长。其机制可能是：LY2801653阻碍了MET和AXL的磷酸化、抑制微血管生成，对于MET和AXL高表达的肿瘤细胞，LY2801653起直接抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用；对于中等表达的肿瘤细胞，LY2801653可能作用于肿瘤微环境，减少了M2型巨噬细胞的生成，从而在体内起到了抗肿瘤作用。
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

Claims (10)

1.MET和AXL双靶点抑制剂在制备防治胃癌的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的胃癌过度表达MET和AXL。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征是：所述的胃癌为胃腺癌。
4.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的药物抑制胃癌转移。
5.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的药物抑制胃癌组织中微血管生成。
6.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的药物抑制胃癌细胞增殖，促进胃癌细胞凋亡。
7.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的药物抑制胃癌组织中M2型巨噬细胞生成。
8.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的MET和AXL双靶点抑制剂为LY2801653或其药学上可接受的盐。
9.如权利要求1～8任意一项所述的用途，其特征是：所述的药物是以MET和AXL双靶点抑制剂为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
10.如权利要求9所述的用途，其特征是：所述的制剂为口服制剂或注射制剂。
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