CN110709112B - 噬菌体的等离子体固定及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种医疗装置，所述医疗装置包括：基底，其限定表面；等离子体聚合物层，其结合至所述表面并涂覆所述表面；以及杀菌剂层，其结合至所述等离子体聚合物层，所述等离子体聚合物层介于所述基底与所述杀菌剂层之间。另外，一种用于用杀菌剂层涂覆医疗装置的基底的表面的方法，所述方法包括：将所述表面暴露于等离子体以形成结合至所述表面的等离子体聚合物层；以及将杀菌剂层结合至所述等离子体聚合物层。
Description
发明领域
本发明涉及噬菌体的一般领域，并且更具体地涉及噬菌体的等离子体固定及其应用。
背景技术
噬菌体是特异性地感染细菌的病毒。它们是环境中最主要的生物控制剂，并且可以在多种医疗、工业和生态学应用中利用它们仅感染有限数量的细菌宿主的能力。
全球越来越多地发生多药物抗性感染令人担忧，由此产生的保健成本仅在美国达200亿美元。虽然已做出巨大努力来生产抗生素和非抗生素衍生物，诸如抗菌疫苗、免疫刺激剂、佐剂和益生菌；但是正在开发的药物并不多。此外，再引入作为伤口的治疗替代物的银产品使得开始开发针对银的细菌抗性基因。这些因素在世界范围内引发了对噬菌体疗法的新的关注，其中早期临床研究证实了噬菌体使用的安全性。
假体周围关节感染的微生物和抗性流行病学显示，大部分所存在的生物体是甲氧西林抗性和甲氧西林敏感性的金色葡萄球菌(Saureus)以及甲氧西林抗性和甲氧西林敏感性的表皮葡萄球菌(Staph.epidermidis)。事实上，4分之3的植入物相关感染由葡萄球菌菌种导致，其中金黄色葡萄球菌在整形外科中是主要的致病物。由葡萄球菌以外的所有存在的病源微生物物种导致的感染总共仅占植入物感染的一小部分，仅约22％。因此，葡萄球菌属在植入物相关感染中具有极大的重要性。
抗生素抗性目前是主要问题，需要首要的临床关注。长久以来已认识到，许多重要的病原体(其中金黄色葡萄球菌是最重要的)总是表现出更令人担忧的抗生素抗性水平。此外，假体表面上细菌形成的生物膜对于抗微生物剂是特别具有抗性的，并且往往能够在极具攻击性的化疗中存活，即使在特异性抗生素抗性因子不存在的情况下也是如此。考虑到这种情况，需要找到有效治疗植入物相关感染的替代性手段。
因此，存在赋予生物材料抗菌特性的方式的需要。
发明内容
假体周围感染对于患者和卫生保健系统造成了显著的负担。中间放置抗生素胶接剂间隔物的二期翻修是慢性假体周围感染的标准护理。我们提出了在间隔物植入物中使用此技术作为以延长的时间段将噬菌体直接递送到受感染组织的手段，并且维持软组织张力，以有利于通过噬菌体涂覆的间隔物植入物进行的再植入程序。
过去十年还见证了从生物稳定到可生物降解的植入物和敷料的转变。值得注意的是，组织工程化的领域关注于开发不仅维持、还恢复并改善组织功能的生物替代物。此外，抗菌特性对于大部分生物材料是希望的，因为它们易于被形成生物膜的细菌定殖。
植入物的设计需要一种界面，其对于噬菌体具有活性，并且可以提供有利的物理和化学环境，以便调控微生物的行为和生物功能。就这一点而言，用等离子体对表面进行改性被认为是最有效的方法之一，通过所述方法我们可以通过新功能层的官能团接枝或沉积来触发并增强表面固定。
本发明提出了一种用等离子体处理基底并且随后将噬菌体或噬菌体衍生的蛋白质固定在表面上的方法。
在一些实施方案中，所述基底由合适的聚合物诸如聚酯酰胺脲(PEAU)、基于亮氨酸的聚酯酰胺聚合物或基于另一种氨基酸的共聚物制成。由于两种基团，酯和酰胺，此类聚合物是可生物降解的(酯基团)，并且具有良好的热稳定性和机械强度(具有强分子间相互作用的酰胺基团)。并入亮氨酸或其他合适的氨基酸改善聚合物的生物相容性。
在一些实施方案中，这种聚合物通过用水/二氯甲烷系统进行单体L6，双-(L-亮氨酸)-1,6-己烯二酯的二-对磺酸盐与三光气/癸二酰氯的界面缩聚合成。使用二氯甲烷允许对于噬菌体并入直接利用生物复合物，因此用于微球制造。此方法是快速的，不可逆的，涉及室温下的两个不可混溶相，并且产生高分子量聚合物。单体L6的合成在对甲苯磺酸的存在下通过在回流环己烷中L-亮氨酸与1,6-己二醇的缩合进行，因为环己烷比诸如苯的溶剂毒性更低。纯化包括从水中再结晶、过滤和在真空下干燥。
其他可用作本发明中的底物的聚合物包括：
选自以下的聚合物：
(1)聚(酯酰胺脲)，其中至少一种二醇、至少一种二酸和至少一种氨基酸通过酯键、酰胺键和脲键连接在一起，
(2)聚(酯氨基甲酸酯脲)，其中至少一种二醇和至少一种氨基酸通过酯键、氨基甲酸酯键和脲键连接在一起，
(3)聚(酯酰胺氨基甲酸酯脲)，其中至少一种二醇、至少一种二酸和至少一种氨基酸通过酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键和脲键连接在一起，
(4)聚(酯酰胺氨基甲酸酯)，其中至少一种二醇、至少一种二酸和至少一种氨基酸通过酯键、酰胺键和氨基甲酸酯键连接在一起，
(5)聚(酯脲)，其中至少一种二醇和至少一种氨基酸通过酯键和脲键连接在一起，以及
(6)聚(酯氨基甲酸酯)，其中至少一种二醇和至少一种氨基酸通过酯键和氨基甲酸酯键连接在一起，
另外，其中
至少一种二醇是下式的化合物：
HO-R1-OH，R1选自任选地插入有至少一个氧的C2-C12亚烷基、C3-C8环亚烷基、C3-C10环烷基亚烷基，
至少一种二酸是下式的化合物：
HO-(CO)-R3-(CO)-OH，R3是C2-C12亚烷基，
至少一种氨基酸选自天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。
在一些实施方案中，聚合物选自：
(1)聚(酯酰胺脲)，其中至少一种二醇、至少一种二酸和至少一种氨基酸通过酯键、酰胺键和脲键连接在一起，
(2)聚(酯氨基甲酸酯脲)，其中至少一种二醇和至少一种氨基酸通过酯键、氨基甲酸酯键和脲键连接在一起，
(3)聚(酯酰胺氨基甲酸酯脲)，其中至少一种二醇、至少一种二酸和至少一种氨基酸通过酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键和脲键连接在一起，以及
(4)聚(酯酰胺氨基甲酸酯)，其中至少一种二醇、至少一种二酸和至少一种氨基酸通过酯键、酰胺键和氨基甲酸酯键连接在一起，
其中至少一种二醇、至少一种二酸和至少一种氨基酸如上所定义。
在本发明的一些更具体的实施方案中，聚合物是聚(酯酰胺脲)，其包含以下两个具有随机分布的嵌段：
其中
l:m的比率范围是0.05:0.95至0.95:0.05，l+m＝1，
R1选自任选地插入有至少一个氧的C2-C12亚烷基、C3-C8环亚烷基、C3-C10环烷基亚烷基，
R3是C2-C12亚烷基，
R2和R4独立地选自L-氨基酸和D-氨基酸的侧链，使得R2或R4所连接的碳具有L或D手性。
在本发明的一些更具体的实施方案中，聚合物是聚(酯氨基甲酸酯脲)，其包含以下两个具有随机分布的嵌段：
其中
l:m的比率范围是0.05:0.95至0.95:0.05，l+m＝1，
R1和R5独立地选自任选地插入有至少一个氧的C2-C12亚烷基、C3-C8环亚烷基、C3-C10环烷基亚烷基，
并且
R2和R4独立地选自L-氨基酸和D-氨基酸的侧链，使得R2或R4所连接的碳具有L或D手性。
在本发明的一些更具体的实施方案中，聚合物是聚(酯酰胺氨基甲酸酯脲)，其包含以下三个具有随机分布的嵌段：
其中
l:m:k的比率范围是0.05:0.05:0.90至0.90:0.05:0.05，l+m+k＝1，
R1和R5独立地选自任选地插入有至少一个氧的C2-C12亚烷基、C3-C8环亚烷基、C3-C10环烷基亚烷基，
R3是C2-C12亚烷基，并且
R2和R4独立地选自L-氨基酸和D-氨基酸的侧链，使得R2或R4所连接的碳具有L或D手性。
在本发明的一些更具体的实施方案中，聚合物是(酯酰胺氨基甲酸酯)，其包含以下两个具有随机分布的嵌段：
其中
l:m的比率范围是0.05:0.95至0.95:0.05，l+m＝1，
R1和R5独立地选自任选地插入有至少一个氧的C2-C12亚烷基、C3-C8环亚烷基、C3-C10环烷基亚烷基，
R3是C2-C12亚烷基，并且
R2和R4是相同的并且选自L-氨基酸和D-氨基酸的侧链，使得R2或R4所连接的碳具有L或D手性。
在以上聚合物中，在本发明的一些非常具体的实施方案中，以下中的一个或多个成立：R1是-(CH2)6-，R3是-(CH2)8-，或者R2和R4二者均是L-亮氨酸的侧链。
以上提及的聚合物的共混物也可用于制备本发明的基底。
关于此类聚合物和其他可用作本发明中的基底的聚合物的更多细节在2016年6月21日提交的PCT申请PCT/IB2016/001006中提供，所述申请的内容特此以引用的方式整体并入。
在一个广泛的方面，提供了一种用于将噬菌体固定在基底上的方法，所述方法包括：用等离子体处理所述基底以形成经处理的基底；以及用噬菌体涂覆经处理的基底。还可以提供一种其中等离子体是冷等离子体的方法。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括氮。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括N2和NH3中的至少一种。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括N2和H2。
还可以提供一种方法，其中处理表面包括在基底的表面上形成反应性基团，所述反应性基团选自由以下组成的组：伯胺、仲胺、叔胺、酰胺及其组合。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括氧。
还可以提供一种方法，其中处理表面包括在基底的表面上形成反应性基团，所述反应性基团选自由以下组成的组：羧基、羟基、酮、醛和酯。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括CO和CO2中的至少一种。
还可以提供一种方法，其中处理表面包括在基底的表面上形成反应性基团，所述反应性基团选自由COOH、过氧化物和OH组成的组。
本发明还可以提供一种方法，其中等离子体包括Ar。在进一步的实施方式中，还可以提供一种方法，其中处理表面包括在基底的表面上形成自由基。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括Ar、He、O2、N2、NH3和CF4中的至少一种。在进一步的实施方式中，还可以提供一种方法，其中处理表面包括在基底的表面上形成自由基。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括Ar和He中的至少一种，处理表面包括在基底的表面上形成自由基，所述方法还包括将自由基暴露于包括氧的气体以引发聚合反应。
还可以提供一种方法，其中所述基底选自由以下组成的组：包括可生物降解的基于氨基酸的聚合物、商业纱布、生物材料和金属植入物的基底。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括NH3、N2/H2、He、O2、Ar、N2、O2、CO、CO2、NO、NO2、SO2、Ne、H2和空气中的至少一种。
在另一个广泛的方面，提供了一种用如上所述的等离子体处理的基底和一种用如上所述的等离子体处理的其上固定有噬菌体的基底。
在一个广泛的方面，提供了一种用于将噬菌体固定在基底上的方法，所述方法包括：用等离子体处理所述基底以形成经处理的基底；以及用噬菌体涂覆经处理的基底。所述表面还包含钛。还可以提供一种方法，其中等离子体是羧基等离子体或氮等离子体，但是其他类型的等离子体也在本发明的范围内。
在另一个广泛的方面，提供了一种用如所述的等离子体处理的基底，噬菌体固定在所述基底上。
本发明还可以提供一种方法，其中噬菌体共价固定在具有可调节特性的薄等离子体聚合物层上。
在另一个广泛的方面，提供了一种策略，其由以下组成：在等离子体表面活化之后，在含有噬菌体的嵌段共聚物中浸涂植入物。显示此涂层具有许多微通道，所述微通道允许噬菌体容易地运输到立即需要一部分噬菌体的顶部(外)表面。这些微通道可以通过浸出并入的盐晶体和其他可能的方法来产生。
另一种策略由以下组成：用含有微胶囊化的噬菌体的两种不同制剂中的一种喷涂基底。此方法的一个主要优点将是保护下面的噬菌体和微球免于在处理、包装、通过手术植入等期间可能去除或其他损害。
在另一个广泛的方面，提供了一种医疗装置，所述医疗装置包括：基底，其限定表面；等离子体聚合物层，其结合至所述表面并涂覆所述表面；以及杀菌剂层，其结合至所述等离子体聚合物层，所述等离子体聚合物层介于所述基底与所述杀菌剂层之间。
还可以提供一种医疗装置，其中所述杀菌剂层包括生物活性噬菌体。
还可以提供一种医疗装置，其中所述杀菌剂层包括选自由以下组成的组的噬菌体相关产品：内溶素、溶葡球菌酶、噬菌体蛋白、噬菌体酶制剂及其组合。
还可以提供一种医疗装置，其中所述杀菌剂层还包括选自由以下组成的组的生物活性剂：抗生素、细胞粘附促进剂、抗血栓因子、防腐剂、抗感染药物、抗生素、止痛药、抗菌药物、抗原生动物剂、抗病毒剂、镇痛剂、抗炎剂、避孕药、CNS活性药物、激素、酶、止血药和疫苗。
还可以提供一种医疗装置，其中所述基底包括金属或金属合金。
还可以提供一种医疗装置，其中所述基底包括钛。
还可以提供一种医疗装置，其中所述基底基本上由钛制成。
还可以提供一种金属装置，其中所述基底包括以下中的至少一种：聚合物、铁、铜、锌、铅、铝、钛、金、铂、银、钴、铬、钒、钽、镍、镁、锰、钴铬、镍钛、钛钒铝和不锈钢。
还可以提供一种医疗装置，其中所述等离子体聚合物层的厚度介于10nm与1000nm之间。
还可以提供一种医疗装置，其中所述等离子体聚合物层的厚度介于100nm与500nm之间。
还可以提供一种医疗装置，其中所述杀菌剂层包括共价结合至等离子体聚合物层的生物活性噬菌体，任选地在同一杀菌剂层中短尾噬菌体科和肌尾噬菌体科二者的组合。
还可以提供一种医疗装置，其中所述杀菌剂层包括共价结合至等离子体聚合物层的噬菌体相关产品。
还可以提供一种医疗装置，其中所述杀菌剂层包括共价结合至等离子体聚合物层的涂层材料。
还可以提供一种医疗装置，其中所述杀菌剂层包括静电结合至等离子体聚合物层的涂层材料。
还可以提供一种医疗装置，其中所述杀菌剂层包括分散在涂层材料中的生物活性噬菌体，所述涂层材料结合至等离子体聚合物。
还可以提供一种医疗装置，其中所述杀菌剂层包括分散在涂层材料中的噬菌体相关产品，所述涂层材料结合至等离子体聚合物。
还可以提供一种医疗装置，其中所述涂层材料是限定暴露表面的聚合物，所述杀菌剂层限定从暴露表面在涂层材料中延伸的微通道。
还可以提供一种医疗装置，其中所述微通道具有约5nm至约5μm的直径。
还可以提供一种医疗装置，其还包含包埋在涂层材料中的盐晶体。
还可以提供一种医疗装置，其中所述噬菌体被吸附在盐晶体上。
还可以提供一种医疗装置，其中所述盐晶体包括钙盐晶体、镁盐晶体、锶盐晶体和钡盐晶体中的至少一种。
还可以提供一种医疗装置，其中所述盐晶体的大小介于约5nm与约5μm之间。
还可以提供一种医疗装置，其中所述涂层材料是嵌段共聚物。
还可以提供一种医疗装置，其中所述杀菌剂层包括结合至等离子体聚合物的含有噬菌体的可生物降解微胶囊。
还可以提供一种医疗装置，其中所述杀菌剂层包括包埋在涂层材料中的含有噬菌体的可生物降解微胶囊，所述涂层材料结合至等离子体聚合物，所述杀菌剂层任选地包括分散在其中的在微胶囊外部的噬菌体。
还可以提供一种医疗装置，其中所述可生物降解微胶囊由共聚物制成。
还可以提供一种医疗装置，其中所述涂层材料包括泊洛沙姆407。
还可以提供一种医疗装置，其中所述涂层材料包括聚乙烯醇(PVA)。
还可以提供一种医疗装置，其中所述医疗装置选自由以下组成的组：矫形植入物、支架、导管和除颤器。
在又一个广泛的方面，提供了一种用于用杀菌剂层涂覆医疗装置的基底的表面的方法，所述方法包括：将所述表面暴露于等离子体以形成结合至所述表面的等离子体聚合物层；以及将杀菌剂层结合至所述等离子体聚合物层。
还可以提供一种方法，其中所述杀菌剂层包括生物活性噬菌体。
还可以提供一种方法，其中所述杀菌剂层包括选自由以下组成的组的噬菌体相关产品：内溶素、溶葡球菌酶、噬菌体蛋白、噬菌体酶制剂及其组合。
还可以提供一种方法，其中等离子体是冷等离子体。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括氮。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括N2和NH3中的至少一种。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括N2和H2。
还可以提供一种方法，其中将表面暴露于等离子体以形成等离子体聚合物层包括在基底的表面上形成反应性基团，所述反应性基团选自由以下组成的组：伯胺、仲胺、叔胺、酰胺及其组合。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括氧。
还可以提供一种方法，其中将表面暴露于等离子体以形成等离子体聚合物层包括在基底的表面上形成反应性基团，所述反应性基团选自由以下组成的组：羧基、羟基、酮、醛和酯。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括CO和CO2中的至少一种。
还可以提供一种方法，其中将表面暴露于等离子体以形成等离子体聚合物层包括在基底的表面上形成反应性基团，所述反应性基团选自由COOH、过氧化物和OH组成的组。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括Ar。在进一步的实施方式中，还可以提供一种方法，其中将表面暴露于等离子体以形成等离子体聚合物层包括在基底的表面上形成自由基。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括NH3、N2/H2、He、O2、Ar、N2、O2、CO、CO2、NO、NO2、SO2、Ne、H2、空气和CF4中的至少一种。在进一步的实施方式中，还可以提供一种方法，其中将表面暴露于等离子体以形成等离子体聚合物层包括在基底的表面上形成自由基。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括Ar和He中的至少一种，并且其中将表面暴露于等离子体以形成等离子体聚合物层包括在基底的表面上形成自由基，所述方法还包括将自由基暴露于包括氧的气体以引发聚合反应。
还可以提供一种方法，其中所述基底选自由以下组成的组：包括聚合物、可生物降解的基于氨基酸的聚合物、商业纱布、金属和合金的基底。
还可以提供一种方法，其中等离子体包括以下中的至少一种：乙酸、4-乙烯基吡啶、1-乙烯基咪唑、丙烯酸酯、乳酸乙酯、乙烯(ethyhlene)、乳酸、e-己内酯、甲醇、水、烯丙胺、乙二胺、丙烯酸、羟基甲基丙烯酸酯、丙二醇、六甲基二硅氧烷(hexamethyldisyloxane)、氨基硅烷、羧基硅烷、羟基硅烷和巯基硅烷。
还可以提供一种方法，其中等离子体是大气压等离子体。
还可以提供一种方法，其中等离子体是低压等离子体。
还可以提供一种方法，其中将表面暴露于等离子体以形成等离子体聚合物层包括使等离子体聚合物层生长，直至等离子体聚合物层的厚度介于10nm与1000nm之间。
还可以提供一种方法，其中将表面暴露于等离子体以形成等离子体聚合物层包括使等离子体聚合物层生长，直至等离子体聚合物层的厚度介于100nm与500nm之间。
还可以提供一种方法，其中将杀菌剂层结合至等离子体聚合物层包括将生物活性噬菌体共价结合至等离子体聚合物层。
还可以提供一种方法，其中将杀菌剂层结合至等离子体聚合物层包括将用等离子体聚合物层涂覆的基底与包含生物活性噬菌体的悬浮液接触。
还可以提供一种方法，其中将杀菌剂层结合至等离子体聚合物层包括在包含生物活性噬菌体的悬浮液中浸涂用等离子体聚合物层涂覆的基底。
还可以提供一种方法，其中将杀菌剂层结合至等离子体聚合物层包括将包含生物活性噬菌体的悬浮液溶剂浇铸在等离子体聚合物层上。
还可以提供一种方法，其中将杀菌剂层结合至等离子体聚合物层包括将噬菌体相关产品共价结合至等离子体聚合物层。
还可以提供一种方法，其中将杀菌剂层结合至等离子体聚合物层包括将用等离子体聚合物层涂覆的基底与包含噬菌体相关产品的悬浮液或溶液接触。
还可以提供一种方法，其中将杀菌剂层结合至等离子体聚合物层包括将涂层材料结合至等离子体聚合物层，生物活性噬菌体分散在所述涂层材料中。
还可以提供一种方法，其中将杀菌剂层结合至等离子体聚合物层包括将涂层材料结合至等离子体聚合物层，噬菌体相关产品分散在所述涂层材料中。
还可以提供一种方法，其中将杀菌剂层结合至等离子体聚合物层包括将在溶剂中的包含涂层材料的溶液与等离子体聚合物层接触，并且随后蒸发溶剂。
还可以提供一种方法，其中所述涂层材料是限定暴露表面的聚合物，所述方法还包括形成从暴露表面在涂层材料中延伸的微通道。
还可以提供一种方法，其中形成微通道包括用等离子体蚀刻暴露表面。
还可以提供一种方法，其中盐晶体分散在涂层材料中，形成微通道包括从涂层材料浸出盐晶体。
还可以提供一种方法，其中当医疗装置在受试者中使用时，使涂层材料与生物组织接触的同时进行浸出盐晶体。
还可以提供一种方法，其中所述涂层材料是嵌段共聚物。
还可以提供一种方法，其中将杀菌剂层结合至等离子体聚合物层包括将涂层材料结合至等离子体聚合物层，含有噬菌体的可生物降解微胶囊包埋在所述涂层材料中。
还可以提供一种方法，其中所述可生物降解微胶囊由共聚物制成。
还可以提供一种方法，其中所述涂层材料包括泊洛沙姆407。
还可以提供一种方法，其中所述涂层材料包括聚乙烯醇(PVA)。
还可以提供一种方法，其中将杀菌剂层结合至等离子体聚合物层包括将包含微胶囊悬浮液的涂层材料喷涂在等离子体聚合物层上，生物活性噬菌体分散在所述涂层材料中。
如权利要求30至71中任一项所述的方法，其中所述医疗装置选自由以下组成的组：矫形植入物、支架、导管和除颤器。
本发明的文献是指许多文献，所述文献的内容特此以引用的方式整体并入。本专利申请要求2017年4月26日提交的美国临时专利申请号62/490,291的优先权，所述专利的内容特此以引用的方式整体并入。
本发明的其他目的、优点和特征将在阅读其优选实施方案的以下非限制性描述后变得更加明显，所述优选实施方案仅以举例方式参考附图而给出。
附图说明
在附图中：
图1以照片的形式示出包括在SaX(左)和SaA12(右)上测试的PEAU TMN样品的孵育之后根据本发明处理的样品和对照的培养皿。3：用等离子体LP COOH气体处理，4：用等离子体LP COOH气体+噬菌体处理，对照：未处理；
图2以照片的形式示出包括在SaX(左)和SaA12(右)上测试的PEAU TMN样品的孵育之后根据本发明处理的样品和对照的培养皿。3：用等离子体LP NH3处理，4：用等离子体LPNH3+噬菌体处理，对照：未处理；
图3以照片的形式示出包括在SaX(左)和SaA12(右)上测试的PEAU TMN样品的孵育之后根据本发明处理的样品和对照的培养皿。3：用等离子体AP室内空气处理，4：用等离子体AP室内空气+噬菌体处理，对照：未处理；
图4以照片的形式示出包括在SaX(左)和SaA12(右)上测试的医用纱布样品的孵育之后根据本发明处理的样品和对照的培养皿。11：用等离子体LP NH3处理，12：用等离子体LP NH3+噬菌体处理，对照：未处理；
图5A以示意图的形式示出根据本发明的一个实施方案的医疗装置；
图5B以示意图的形式示出根据本发明的另一个实施方案的医疗装置；
图5C以示意图的形式示出根据本发明的又一个实施方案的医疗装置；
图5D以示意图的形式示出根据本发明的又一个实施方案的医疗装置；
图5E以示意图的形式示出根据本发明的又一个实施方案的医疗装置；
图5F以示意图的形式示出根据本发明的又一个实施方案的医疗装置；
图6：用金黄色葡萄球菌噬菌体处理的微型膝关节植入物的物理化学分析。a)微型膝关节植入物。b)植入物的FEG-SEM图像。c)AFM粘附显微图，箭头指向共价固定的噬菌体。d)AFM高度传感器3D重构，箭头指向共价固定的噬菌体。
图7：钛棒的AFM显微图。a)对照(未处理)钛棒的高度传感器AFM 3D重构。b)对照棒的粘附显微照片。c)具有共价固定的噬菌体的棒的高度传感器AFM 3D重构。d)AFM粘附显微照片，其示出共价固定的噬菌体。
图8：细菌菌苔测定。“未处理”、“等离子体处理”、“等离子体处理+TMN缓冲液”和“等离子体处理+PBS缓冲液”的对照培养皿显示金黄色葡萄球菌细菌菌苔上没有裂解。处理组“等离子体处理+噬菌体BP39”和“等离子体处理+葡萄球菌内溶素”组显示处理植入物的外周上金黄色葡萄球菌细菌菌苔的裂解。
图9：附着测定。黑色(左)：对照(未处理)；红色(中)：等离子体对照(无噬菌体)；蓝色(右)：钛棒上等离子体固定的噬菌体。
图10：液体增殖测定。黑色(左)：对照(未处理)；红色(中)：等离子体对照(无噬菌体)；蓝色(右)：钛棒上等离子体固定的噬菌体。
图11：细菌菌苔测定。上面两个培养皿是PPE:N和PPE:O等离子体处理的对照组，未施加噬菌体。下面两个培养皿：在噬菌体的随后固定之后，用PPE:N(左)或PPE:O(右)处理钛棒。在经处理的钛棒周围出现细菌菌苔的清晰裂解。
图12：液体增殖测定。蓝色(左边两个条)：PPE:N等离子体处理组。红色(右边两个条)PPE:O等离子体处理组。随后的噬菌体固定分别引起细菌增殖的2.76和2.40log减少。
图13：软琼脂增殖测定。黑色(第一条)：未处理样品。蓝色(第二条和第三条)：PPE:N等离子体处理组。随后的噬菌体固定引起细菌增殖的1.87log减少。
图14：PPE:N和J21-P1的附着测定。左培养皿：没有等离子体处理的对照组钛棒。中间培养皿显示用PPE:N等离子体和TMN缓冲液处理的对照钛棒。右培养皿显示用PPE:N等离子体和噬菌体J21-P1处理的钛棒。在噬菌体处理的钛棒周围出现细菌菌苔的清晰裂解。
图15：未处理Ti棒(左)和噬菌体固定之后用等离子体处理的棒(右)的原子力显微图。箭头指向固定的噬菌体。
图16：处理后2周的涂层稳定性。用PPE:N等离子体和TMN缓冲液处理的左培养皿对照组钛棒。右培养皿显示用PPE:N等离子体和噬菌体J21-P1处理的钛棒。处理后2周在噬菌体处理的钛棒周围出现细菌菌苔的清晰裂解。
图17：处理后2周的固体增殖测定。黑色：未处理的样品。红色：PPE:N等离子体+TMN缓冲液对照组。蓝色：PPE:N等离子体+噬菌体处理组。处理后2周随后的噬菌体固定引起细菌增殖的0.74log减少。
图18：钛试样的处理后的生物膜光学密度。(1)对照组是阴性对照；(2)对照组用等离子体+TMN缓冲液处理；(3)F11/R＝2用等离子体R＝2和F11微胶囊化喷涂制剂处理；(4)Ckt#3/R＝2组用等离子体处理R＝2和噬菌体混合物处理；(5)F11/R＝2用等离子体R＝8和F11微胶囊化喷涂制剂处理；4)Ckt#3/R＝8组用等离子体处理R＝8和噬菌体混合物处理；并且
图19：316L不锈钢试样的处理后的生物膜光学密度。(1)对照组是阴性对照；(2)对照组用等离子体+TMN缓冲液处理；(3)F11/R＝2用等离子体R＝2和F11微胶囊化喷涂制剂处理；(4)Ckt#3/R＝2组用等离子体处理R＝2和噬菌体混合物处理；(5)F11/R＝2用等离子体R＝8和F11微胶囊化喷涂制剂处理；4)Ckt#3/R＝8组用等离子体处理R＝8和噬菌体混合物处理。
具体实施方式
噬菌体(bacteriophage)和噬菌体(phage)产品的表面固定可用于一些生物医疗应用。具体地，初始物理化学表面改性可以显著地改善基底-噬菌体相互作用，同时维持噬菌体的活力和感染并杀死其细菌宿主的能力。在一些情况下，有利的是，避免使用可能使噬菌体失活并产生关于细胞活力的问题的有害有机溶剂，或者至少最小化暴露于此类溶剂。此外，在一些应用中，希望在厚度和化学组成方面维持对改性表面的良好控制。
等离子体是部分离子化气体，其含有游离电子、离子和基团以及中性颗粒，诸如原子和分子。这些颗粒中的一些处于激发状态，并且可以通过光子发射返回其基态。在等离子体中，某些电子是游离的，从而允许正电荷和负电荷在一定程度上彼此独立地移动。等离子体是通过射频(RF)、微波(MW)或来自热丝放电的电子等原因激发为能态的气体产生的。
等离子体通常分为非平衡(低温/冷)和平衡(高温/热的/热)等离子体。热等离子体中使用的高温对于聚合物是破坏性的，并且通常生物聚合物表面改性的应用将利用冷等离子体。然而，在一些实施方案中，可以使用热等离子体。低压和大气压等离子体是不含溶剂的技术，其为深入研究的对象。冷等离子体允许在大阵列的表面(包括相对化学惰性的基底)上并入一系列所需的化学功能。调节能量、所使用的气体性质和处理时间允许控制所沉积的化学物质的密度并控制最终表面能量，而不改变本体材料的机械特性。另一个优点是等离子体允许均匀地涂覆3D表面，无论其几何形状如何。
大气压等离子体技术具有更便宜、易于扩大至工业规模和并入在线工艺中的优点。然而，其具有导致热放电的放电不稳定性的问题，所述热放电限于窄流通道并且增加气体温度。脉冲方案，诸如介质阻挡放电(DBD)、脉冲电晕和MW放电可以防止此转变。在10-3-1000Pa之间操作的低压等离子体比大气压等离子体技术更易于控制，因为放电更稳定，但是更昂贵。
本发明涉及将噬菌体固定在不同基底上的多种生物缀合技术，所述不同基底包括可生物降解的基于氨基酸的聚合物、商业纱布、金属植入物等。为了达到此目的，本发明使用低压等离子体、大气压等离子体或者顺序使用低压等离子体和大气压等离子体。低压等离子体和大气压等离子体处理可用于直接和间接将不同官能团引入在惰性表面上并且随后固定噬菌体。
在特定实例中，冷氮等离子体处理用于将反应性伯胺等物质并入在不同的表面上，并且随后固定噬菌体、内溶素和微胶囊化噬菌体制剂。氮、氨和N2/H2-等离子体可以用于引入伯胺、仲胺和叔胺以及酰胺以用于固定噬菌体。
氧等离子体用于将含氧官能团诸如COOH、过氧化物和OH官能团引入在不同表面上并且随后固定噬菌体。
CO2或CO-噬菌体还可以用于引入羧基，并且CO2-等离子体处理还可以产生可以用于固定噬菌体的羟基、酮、醛和酯。
氩等离子体可以用于引入自由基并且随后附着噬菌体。
不同的气体诸如Ar、He、O2、N2、NH3和CF4可以用于在表面上产生、取代官能团，或产生基团。引入的官能团随后用于将噬菌体结合在表面上。
He和Ar等离子体可以用于将自由基引入在表面上，其可以在暴露于大气或O2时在表面上产生过氧化物和氢过氧化物，并且可以用于引发聚合反应。
等离子体处理可以用NH3、N2/H2、He、O2、Ar、N2、O2、CO、CO2、NO、NO2、SO2、Ne、H2、空气或其组合等进行，并且随后用噬菌体涂覆。
使用异型双官能臂的接枝方法可用于将噬菌体附着在表面上，包括在表面上产生的羧基与噬菌体衣壳上的伯胺进行碳二亚胺耦联。这可以例如通过以下来进行：使用1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以活化交联反应，并且使用N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)以使反应稳定。
接枝聚合可以通过离子机制、配位机制和自由基机制等实现。
通过低压等离子体接枝丙烯酸(AA)可用于固定噬菌体。可以实现AA的照射后接枝以及随后噬菌体的碳二亚胺介导的固定。
气相中的单体诸如AA、4-乙烯基吡啶和1-乙烯基咪唑可以沉积在基底上，以便在表面上产生可以用于随后附着噬菌体的涂层。
使用前体单体(实例：丙烯酸酯化学物、乳酸乙酯、乳酸、e-己内酯；或者烃与其他气体NH3、O2和CO2等的混合物)进行的等离子聚合可以用于形成薄有机膜覆盖层，所述薄有机膜覆盖层可以被调整以用于噬菌体的受控释放。
大气压等离子体中的活性和远程处理可以用于固定噬菌体。
远程等离子体处理可用于可生物降解聚合物的表面改性，以便增强基团反应并限制电子和离子蚀刻。
电晕放电、介质阻挡放电、RF放电、电子回旋共振(ECR)等离子体反应器、微等离子体和等离子体射流(诸如等离子体针、等离子体羽流、等离子体铅笔和等离子体火炬)可以用于对表面进行改性并且随后固定噬菌体。等离子体射流还可以用于制备伤口以便随后施加噬菌体。
噬菌体可以通过类似的方法固定在医疗装置、医疗植入物诸如髋和膝关节植入物和生物材料等上。
用于低压等离子体固定的其他化学物可以是氧、氩、氦、氮、氨、氢、氧化亚氮、二氧化碳、空气、乙烯、六氟丙烯等。
低压等离子体可以具有任何合适的压力，例如约100mTor。在其他实例中，压力介于10与1000mTor之间，或介于1与1000mTor之间等。
低压等离子体的液体化学物可以是甲醇、水、烯丙胺、乙二胺、丙烯酸、羟基甲基丙烯酸酯、丙二醇、六甲基二硅氧烷、氨基硅烷、羧基硅烷、羟基硅烷、巯基硅烷等。
我们已经考虑使用等离子体聚合将噬菌体附着到钛和不锈钢表面等，以用于预防和治疗假体周围关节感染。我们的结果表明，可能以允许噬菌体保留其活性和感染性的方式将噬菌体附着到Ti植入物。噬菌体处理的钛棒显示比PPE:N处理对照的未处理对照更高的裂解金黄色葡萄球菌细菌的效率。据信，可以在其他金属的情况下获得类似的结果。
为了改善骨形成方法的生物相容性和动力学，我们努力改善Ti棒的表面特性。文献报告了，金属离子从材料的过量释放可能对于骨生长和一体化产生潜在的抑制作用。从生物学的角度看，TiN涂层在体内植入时减少Ti离子从本体金属扩散，优化表面特性，并且减少副作用，这可以是潜在的关注点。
文献还报告了TiN表面处的生物反应，包括骨、软组织、血液、血小板、人间充质干细胞和成骨细胞的应答。这些研究中的若干指示，TiN表面与其他当前和通常使用的材料相比具有有益或相当的特性。
我们假设，Ti-PPE:N+噬菌体将改善骨生长和一体化，并且抑制通常相关联的感染，诸如由多药物抗性葡萄球菌、假单胞菌和克雷伯氏菌菌种导致的感染。
已经开发了本文讨论的方法中的许多种并且在小分子负载材料的情况下使用，然而，噬菌体产生了某些目前尚未解决的挑战。作为生物体，噬菌体表现出这些系统的许多内在缺陷，最主要的是较低的稳定性和短有效期。包括冻干和微胶囊化在内的许多方法可以用于延长并保护其寿命和功效。因为这些材料将用于治疗可能的感染区域，所以产品本身也必须是无菌的，这再次由于噬菌体的生物性质而产生了挑战。
聚合物诸如聚(酯氨基甲酸酯脲)(PEUR)和在以上参考的PCT申请中提及的其他嵌段共聚物可以在矫形植入物和其他医疗装置的表面上以许多方式配制，例如固体聚合物层、多孔聚合物层和承载微胶囊的层，以便防止或至少减少细菌生物膜的表面形成。
在一些实施方案中，我们提出了沉积薄的(通常，多达数百纳米)强粘附的等离子体聚合涂层，其应用于矫形植入物。在一些实施方案中，根据以下事实获得了强粘附：通过等离子体方法的性质，涂层共价结合至基底表面。
经验显示，等离子体聚合物涂层可以一种方式制备，使得展示出非常大的有效表面积，在这种情况下这是明显的优点：显而易见的原因是然后每单位面积(例如，每平方厘米)的基底表面可以并入大量的噬菌体。
针对此计划，测试不同气体混合物(富碳、富氮等)和百分比。
等离子体处理的矫形植入物上含有微胶囊的制剂的三个示例性实施方案在图5中示出，1)噬菌体在薄等离子体聚合物层上的直接固定；2)第二策略由以下组成：在等离子体表面活化之后在含有噬菌体的嵌段共聚物中浸涂植入物。显示此涂层具有许多微通道，所述微通道允许噬菌体容易地运输到立即需要一部分噬菌体的顶部外表面。这些微通道可以通过浸出并入的盐晶体和其他可能的方法来产生；3)第三策略由以下组成：用喷雾贴片制剂(微胶囊化的噬菌体)喷涂植入物。此方法的主要优点是保护下面的噬菌体和微球避免在处理、包装、通过手术植入等期间可能被去除或其他损害。
两种方法可以用于将聚合物附着到植入物的表面：共价附着和非共价附着。
在第一实例中，使用水包油包水双重乳液制造微球，接着进行溶剂蒸发。第一水包油乳液通过以下制备：使用具有10mm分散元件的高速均化器将1％聚(乙烯醇)(PVA)溶液与溶解在有机溶剂或溶剂混合物中的新合成的聚合物均化。将此第一乳液逐滴添加到含有2％PVA的噬菌体混合物中，从而形成水包油包水乳液。留下溶剂进行蒸发。然后添加PVA或普兰尼克(pluronics)以获得喷雾贴片制剂。可以在将其插入人体中之前或插入植入物之后将喷雾喷涂在植入物上。也可以在植入物固定之前或之后将喷雾用于(喷涂)与植入物相邻的组织上。
例如，对于与表面的共价聚合物附着，可以使用聚合物(包括由烷基二酯胺与侧链羧基组成的单体)。这些可以使用受保护的谷氨酸作为氨基酸试剂来进行。然后使用合适的聚合、使用三光气和二胺，我们可以生成具有侧链羧基的聚合物，所述侧链羧基可以用标准偶联剂(DCC或HOBt)活化以易于将它们附着到表面结合的胺基团或等离子体聚合物层的其他基团。另外，不使用聚合物作为亲电子试剂(在羧酸的情况下)，聚合物还可以例如通过使用半胱氨酸充当二酯单体的亲核试剂。在聚合之后，侧链硫醇然后可以用于参与硫醇-烯光化学反应以共价附着到表面结合的烯基团。
对于静电表面附着，存在两种可能性：正表面-负聚合物，或者负表面-正聚合物。例如，可以用含氮等离子体处理表面以产生由于伯胺、仲胺和叔胺以及亚胺基团而具有正电荷的表面。为了与这些正电荷相互作用，可以在不活化的情况下使用诸如含有谷氨酸的聚合物的聚合物，使得它们在生理pH下带负电荷，并且因此可以与等离子体聚合物的正电荷相互作用。在另一个实例中，还可以使用含有半胱氨酸的聚合物，其中在过氧化物介导的氧化之后，它们转化为带强负电荷的磺酸基团，其可以与等离子体聚合物上的正表面电荷强相互作用。例如，由于分别所得的羧酸和硫醇，带负电荷的等离子体聚合物表面可以使用含氧或硫的等离子体聚合物产生。为了与这些负电荷反应，可以使用(带正电荷的)含有精氨酸的单体和聚合物等。在本发明的发明内容中提供包含适用于静电结合的氨基酸的聚合物的非限制性实例。
以上提出了一种医疗装置，其包括：基底，其限定表面；等离子体聚合物层，其结合至所述表面并涂覆所述表面；以及杀菌剂层，其结合至所述等离子体聚合物层，所述等离子体聚合物层介于所述基底与所述杀菌剂层之间。所述基底是医疗装置的用等离子体聚合物覆盖的一部分，并且可以表示整个医疗装置的一部分。医疗装置可以具有或可以不具有移动部件。
医疗装置是旨在接触受试者的人或动物组织或体液的任何装置。医疗装置可以具有或可以不具有药物特性。例如，医疗装置旨在永久性地或暂时性地植入在人或动物中。这种医疗装置的非限制性实例是矫形植入物。基底是医疗装置的一部分，等离子体聚合物沉积在其上。通常，这种部分暴露于受试者的细胞和/或体液。
杀菌剂层是具有一些杀菌剂特性的层。杀菌剂层帮助减少或防止与杀菌剂层相邻和在杀菌剂层上的细菌生长。杀菌剂层至少部分通过并入生物活性噬菌体、噬菌体相关产品或者生物活性噬菌体和噬菌体相关产品二者来实现其杀菌剂特性。噬菌体相关产品的实例包括内溶素、溶葡球菌酶、噬菌体蛋白、噬菌体酶制剂及其组合。还可以将抗菌素添加到杀菌剂层中。
一般来讲，医疗装置的基底的表面通过以下来用杀菌剂层涂覆：首先将所述表面暴露于等离子体以形成结合至所述表面的等离子体聚合物层，并且然后将杀菌剂层结合至等离子体聚合物层。因此，本发明的上下文中的等离子体聚合物是通过等离子体聚合形成的聚合物。
等离子体是例如冷等离子体，在低于大气压的压力下，或大气压等离子体。等离子体可以包括以下中的一种或多种：NH3、N2/H2、He、O2、Ar、N2、O2、CO、CO2、NO、NO2、SO2、Ne、H2、空气和CF4，这取决于附着杀菌剂层所需的精确化学。在一些实施方案中，等离子体还可以包括单体，例如乙酸、4-乙烯基吡啶、1-乙烯基咪唑、丙烯酸酯、乳酸乙酯、乙烯、乳酸、e-己内酯、甲醇、水、烯丙胺、乙二胺、丙烯酸、羟基甲基丙烯酸酯、丙二醇、六甲基二硅氧烷、氨基硅烷、羧基硅烷、羟基硅烷和巯基硅烷。在一些实施方案中，等离子体方法在等离子体层的表面处形成反应性基团。此类反应性基团的实例包括：自由基、COOH、过氧化物、OH、伯胺、仲胺、叔胺、酰胺、羧基、羟基、酮、醛、酯及其组合。
基底的合适组成的实例包括金属和金属合金，诸如非限制性铁、铜、锌、铅、钛、铝、钛、金、铂、银、钴、铬、钒、钽、镍、镁、锰、钴铬、镍钛、钛钒铝和不锈钢。基底的其他合适组成包括聚合物。
等离子体聚合物层可以具有任何合适的厚度。在一些实施方案中，等离子体聚合物层的厚度介于10nm与1000nm之间。在其他实施方案中，等离子体聚合物层的厚度介于100nm与500nm之间。
杀菌剂层可以具有任何合适的组成。等离子体聚合方法形成等离子体聚合物层，并且使等离子体聚合物层活化。在其中此活化例如通过与环境空气的反应逐渐丧失的实施方案中，添加杀菌剂层可以足够快地进行，使得此活化不丧失。在其他实施方案中，等离子体聚合物层的活化不丧失，或者此活化的丧失不是至关重要的。如果杀菌剂层包括可以与灭活的等离子体聚合物反应的反应性基团，此后者可能发生。
在第一实例中，参考图5A，杀菌剂层包括生物活性噬菌体，其例如通过共价键直接结合至等离子体聚合物层。在此实施方案中，噬菌体不包埋在任何材料中。噬菌体提供在等离子体聚合物层的外部，并且暴露于环境。图5A示出了根据本发明的呈作为本发明的示意图形式的医疗装置可用于广泛种类的具有不同形状和尺寸的医疗装置。
为了将噬菌体附着至等离子体聚合物，可以将包含噬菌体的悬浮液与等离子体聚合物层接触。在一些实施方案中，还提供了促进噬菌体与等离子体聚合物之间的共价结合的连接剂。
在第二实例中，参考图5B，杀菌剂层包括涂层材料，噬菌体分散在所述涂层材料中。在此第二实例的变体中，噬菌体被分散在涂层材料中的噬菌体相关产品替换或补充。选择涂层材料来在植入医疗装置时释放噬菌体。如果涂层材料易于在受试者中溶解，则此释放可以是相对快的，或者如果涂层材料在受试者中仅缓慢降解，则此释放可以是相对慢的。
应指出，在一些实施方案中，未在附图中示出，噬菌体和/或噬菌体相关产品还可以例如使用涂层材料的等离子体处理结合至涂层材料的表面。在此类实施方案中，一旦植入物被植入，表面噬菌体就可以提供第一相对高的存在的杀菌剂活性，而涂层材料中所含的更深的噬菌体在数天、数月或数年的时间段内缓慢释放以维持较小的杀菌剂活性。
涂层材料可以共价或静电结合至等离子体聚合物层。合适的涂层材料的实例非限制性地包括发明内容中所述的聚合物。然而，可以使用任何其他合适的聚合物，其可以与等离子体聚合物结合并且可以维持噬菌体和/或噬菌体相关产品的生物活性。
实现此实例中的杀菌剂层的一种方法包括在聚合物溶液中浸涂等离子体聚合物，噬菌体和/或噬菌体相关产品悬浮在所述聚合物溶液中。在蒸发溶剂之后，然后形成相对持久的聚合物层，噬菌体和/或噬菌体相关产品包埋在聚合物层中。然而，将聚合物溶液与等离子体聚合物接触的任何其他合适的方法(诸如喷涂等)在本发明的范围内。
在一些实施方案中，涂层材料是限定暴露表面的聚合物，并且杀菌剂层限定从暴露表面在涂层材料中延伸的微通道。此类微通道可以促进噬菌体和/或噬菌体相关产品的释放。它们可以任何合适的方式形成，例如通过浸出包埋在涂层材料中的盐晶体(其存在于含有涂层材料的溶液中)或者通过在涂层材料涂覆等离子体聚合物之后等离子体蚀刻涂层材料。盐晶体可以在植入物植入之后在体内浸出。
在第三实例中，如图5C所见，杀菌剂层包括包埋在涂层材料(在此表示为PVA)中的含有噬菌体的可生物降解的微胶囊，所述涂层材料结合至等离子体聚合物。此类微胶囊的实例在2017年6月22日提交的PCT申请PCT/IB2017/053744中描述，但是其他微胶囊也在本发明的范围内。这些实施方案中合适的涂层材料的实例包括泊洛沙姆407和聚乙烯醇(PVA)等。这种杀菌剂层可以通过用涂层材料中的微胶囊的悬浮液喷涂等离子体聚合物或通过在微胶囊的悬浮液中浸渍等离子体聚合物来制备。
在第四实例中，如图5D所见，杀菌剂层包括结合至等离子体聚合物的噬菌体和/或噬菌体相关产品二者，如以上第一实例中所述，并且含有噬菌体的可生物降解微胶囊包埋在涂层材料中，在此表示为P-407的涂层材料结合至等离子体聚合物，如以上第三实例中所述。此类微胶囊的实例在2017年6月22日提交的PCT申请PCT/IB2017/053744中描述，但是其他微胶囊也在本发明的范围内。这些实施方案中合适的涂层材料的实例包括泊洛沙姆407和聚乙烯醇(PVA)等。这种杀菌剂层可以通过用涂层材料中的微胶囊的悬浮液喷涂等离子体聚合物来制备。在又其他实施方案中，微胶囊的悬浮液还包含悬浮的噬菌体，不含在微胶囊中。
在第五实例中，如图5E所见，杀菌剂层包括含有噬菌体的可生物降解微胶囊，其共价或静电结合至等离子体聚合物。制造这种杀菌剂层需要可生物降解微胶囊与等离子体聚合物接触。这可以通过以下实现：将包含可生物降解微胶囊的粉末与等离子体聚合物接触，或者将可生物降解微胶囊的液体悬浮液与等离子体聚合物接触。在一些实施方案中，可以使用促进微胶囊与等离子体聚合物的反应的连接剂。
在第六实例中，如图5F所见，杀菌剂层包括盐晶体，噬菌体吸附在所述盐晶体上。此实例与以上第二实例的变体类似。具有吸附的噬菌体的此类盐晶体在以上参考的PCT/IB2016/001006申请中描述。在此实例中，另外的的噬菌体可以或可以不存在于涂层材料中。
合适的盐的实例包括钙盐、镁盐、锶盐和钡盐，例如碳酸钙、磷酸钙、碳酸镁和磷酸镁。在一些实施方案中，所述盐是MgCO3和CaCO3的混合物。在一些实施方案中，MaCO3与CaCO3的重量比的范围是5:95至95:5，诸如所述比率是5:95。至少一种无机盐诸如钙盐和镁盐可以通过稳定并活化噬菌体来积极地影响伤口愈合。
简而言之，具有吸附的噬菌体的盐晶体的制备包括：将至少一种无机盐和至少一种噬菌体混合并保持在一起(孵育)，过滤所获得的悬浮液以产生至少一种噬菌体吸附的(固定的)湿固体产物，任选地用盐溶液洗涤所获得的湿固体产物；以及通过真空干燥、冷冻干燥或喷涂干燥来干燥所获得的湿固体产物以获得第一组合物。
在一些实施方案中，在涂层材料中并入盐如下进行，但是其他制造方法也在本发明的范围内。杀菌剂层如下制备：a.将以上所述的第一组合物与包含有机溶剂和至少一种聚合物(诸如本文以上公开的聚合物)的混合物混合；b.将来自步骤(a)的所得混合物浇铸在等离子体聚合物上；以及c.蒸发有机溶剂以获得杀菌剂层。
可替代地，提供了一种用于制备杀菌剂层的方法，其包括：a.将包含至少一种噬菌体的液体与包含有机溶剂和至少一种聚合物(诸如本文以上公开的聚合物)的混合物混合；任选地添加选自以上公开的无机盐和至少另一种生物活性剂的至少一种填料；b.将来自步骤a的所得混合物浇铸到等离子体聚合物上；以及c.蒸发有机溶剂以获得杀菌剂层。
在一些实施方案中，有机溶剂是氯仿。在一些实施方案中，包含有机溶剂和至少一种聚合物的混合物还包含选自以下的另外的生物活性剂：防腐剂、抗感染药诸如噬菌体、抗生素、抗菌药物、抗原生动物剂和抗病毒剂、镇痛剂、抗炎剂包括类固醇和非类固醇抗炎剂(包括COX-2抑制剂)、抗肿瘤剂、避孕药、CNS活性药物、激素、止血药和疫苗。
在一些实施方案中，涂层材料包含聚(酯酰胺脲)、至少一种或多种噬菌体、碳酸钙、碳酸镁、苯佐卡因、环丙沙星和胰凝乳蛋白酶
在一些实施方案中，至少一种盐选自如本文公开的无机盐。在一些实施方案中，至少一种盐和至少一种呈液体形式的噬菌体以适当的w/v(g/mL)比率诸如1:10的比率混合。在一些实施方案中，用于制备第一组合物的方法在室温下且在无菌条件下进行。
在涂层材料的一些实施方案中，至少一种聚合物选自如在发明内容部分中所述的聚(酯酰胺脲)、聚(酯氨基甲酸酯脲)、聚(酯酰胺氨基甲酸酯脲)和聚(酯酰胺氨基甲酸酯)。
在所有以上实例中，杀菌剂层还可以包含以下生物活性剂中的一种或多种：防腐剂；抗感染药诸如噬菌体、抗生素、止痛药、抗菌药物、抗原生动物剂和抗病毒剂；镇痛剂；抗炎剂包括类固醇和非类固醇抗炎剂(包括COX-2抑制剂)以及抗肿瘤剂；避孕药；CNS活性药物；激素；酶；止血药；和疫苗。酶的非限制性实例包括可以催化本文公开的聚合物的水解(腐蚀)的那些。本文公开的聚合物的水解(腐蚀)对于至少一种生物活性剂释放到周围组织中可以是重要的。作为非限制性实例，还可以使用至少一种酶，以通过从损伤部位去除死亡或感染皮肤来治疗伤口和腐蚀。至少一种酶的非限制性实例包括木瓜蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、溶纤维蛋白酶(fibrinoylsine)、透明质酸酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶和脂肪酶。在一些实施方案中，至少一种酶选自胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶和脂肪酶。此类抗生素的非限制性实例包括氟喹诺酮(例如，四环素、环丙沙星和左氧氟沙星)、单羧酸抗生素(例如，莫匹罗星)、氨基糖甙(例如，新霉素)、大环内酯抗生素(例如，红霉素)、杆菌肽、多粘菌素及其混合物。示例性止痛药包括但不限于苯佐卡因、利多卡因、丁卡因、普莫卡因、狄布卡因及其混合物。
本发明的各种实施方案包括杀菌剂层，其包含噬菌体或噬菌体相关产品或二者，在本段落中称为“杀菌剂”。杀菌剂可以直接结合至等离子体聚合物层，分散在结合至等离子体聚合物层的涂层材料中，包埋在微胶囊中，所述微胶囊可以直接结合至等离子体聚合物层或分散在涂层材料中，直接结合至涂层材料，在涂层材料外部，或吸附在包埋在涂层材料中或以其他方式结合至涂层材料的盐晶体。杀菌剂的这些结合方式的所有合适的组合也在本发明的范围内。在一些实施方案中，杀菌剂层可以具有根据与等离子体聚合物层的距离而改变的组成或其他特性。
应指出，等离子体聚合物可以或可以不被杀菌剂层完全覆盖，这通过制造缺陷产生或通过设计产生。
实施例
实施例1：噬菌体在共聚物表面上的固定
使用4种不同的化学物(COOH气体、NH3气体、NH3蒸汽和COOH蒸汽)测试低压等离子体，并使用2种化学物(室内空气，N2气体)测试大气压等离子体。对于人类应用，我们测试了固定的噬菌体在基于氨基酸的可生物降解的共聚物上的固定和活性。结果对于所有化学物是阳性的。我们还测试了噬菌体在商业纱布上的固定。所进行的实验总结在表1中。
表1：等离子体处理后噬菌体在聚合物和纱布试样上的固定。
每个样品类型经过全部7个以下提及的等离子体条件：(1)低压COOH气体；(2)低压NH3气体；(3)低压NH3蒸汽；(4)低压COOH气体；(5)低压丙烯酸酯蒸汽；(6)大气压室内空气；和(7)大气压N2气体。
在13.56MHz下，低压等离子体设定为100mTor。NH3蒸汽是指烯丙胺的蒸发。如下进行通过等离子体处理进行的表面改性。对于低压等离子体，将PEAU(聚酯酰胺脲(PEAU)，一种基于亮氨酸的聚酯酰胺聚合物)聚合物膜和商业纱布切割为2cm x 2cm正方形。等离子体处理在3.5ft3正方形腔室中进行，在1.5英寸中心和侧壁电极构型上具有9个可拆卸搁板。使均匀的辉光放电连接到射频发生器。将样品在100W的功率和100mTorr的真空下处理1分钟。用在3atm的压力和100L/h的流速下供应的压缩空气产生大气压等离子体，并且距离样品的工作距离为10mm。将共聚物和纱布样品侧固定在显微镜玻璃载片上；这使得产生自由基，所述自由基与来自等离子体环境的活性物质偶联在基底表面上形成极性基团诸如–(C–O)–、–(CO)–和–(C)–O–，从而允许随后的噬菌体粘附。
用液体噬菌体进行的处理由以下组成：在等离子体处理之后，将样品浸没在葡萄球菌噬菌体的液体溶液(109PFU/mL)中过夜，并且然后用PBS洗涤3次。还使用每个样品类型的非处理对照。因此，用每种单个条件加噬菌体处理的每个样品具有两个对照：一个未处理的并且一个仅用等离子体处理的。
在具有葡萄球菌特异性琼脂的培养皿上，在非病原性细菌(木糖葡萄球菌)和病原性细菌(金黄色葡萄球菌)上测试样品。在分析之前，使样品在生物罩下干燥。
将样品置于培养皿上，初始用葡萄球菌特异性琼脂和细菌打顶，并且在37℃下孵育过夜。测量每种条件的每个样品的裂解和样品直径。对每个板拍摄照片。
图1至图3是用于确定过夜孵育之后固定成功或失败的培养皿的代表性图片。表1总结了这些培养皿的样品和裂解尺寸。“无裂解”表示没有显著的裂解，并且因此噬菌体未成功附着，并且“裂解”表示噬菌体成功附着，如试样周围的裂解区域所示。LP＝低压，并且AP＝大气压。所有研究等离子体处理之后噬菌体附着对于PEAU试样是成功的。
PEAU是基于专有氨基酸的共聚物，在发明内容中进一步详细描述。PEAU用作聚合物涂覆的医疗装置上通过等离子体固定噬菌体的实例。PEAU+TMN是基于氨基酸的共聚物，向其添加不含噬菌体的缓冲液(TMN)以提供真阴性对照。含有噬菌体的PEAU是在等离子体处理之前并入噬菌体的共聚物。这构成对照，以确定等离子体处理是否可以影响共聚物中含有的噬菌体，即，是否使其失活。结果证明，等离子体处理不影响噬菌体的活性。PEAU仅是可用于本发明的聚合物的一个实例，并且本发明的方法可以与许多其他类型的聚合物涂覆的医疗装置一起使用。
实施例2：噬菌体在商业纱布上的固定
研究等离子体聚合和随后的噬菌体固定对商业纱布的影响。方案和处理如在先前部分“实施例1”中所述。纱布1是Johnson and Johnson非粘附创可贴纱布，纱布2是具有Quiltvent技术的Johnson and Johnson创可贴纱布垫，并且纱布3是由70％人造丝和30％聚酯制成的Fomedica纱布。
结果总结在表1中，其中“裂解”表示如通过金黄色葡萄球菌菌株和木糖葡萄球菌菌株的裂解所证明的成功噬菌体固定，并且“无裂解”表示未成功固定。图4是在其上评估噬菌体的活性的培养皿的示意图。
实施例3：噬菌体在微型矫形植入物上的固定
通过场发射扫描电子显微镜(FEG-SEM，在5kV下操作)监测噬菌体固定之前和之后的表面。使用Scan Asyst-Air尖端进行峰值力轻敲模式AFM测量。
用不锈钢电极生成等离子体。在到达之前清理腔室。用由10sccm氨和10sccm乙烯组成的处理1进行预沉积。压力为80Pa，在20W下。通过腔室将样品、培养皿、无菌镊子插入箱中。将微型植入物置于培养皿上，所以它们彼此不接触。将培养皿安置在电极上。施加如上所述的处理1，进行10分钟，以便在表面上实现100nm的等离子体聚合物沉积。随后在室温下将样品浸没在噬菌体溶液中，进行一小时。然后用去离子水洗涤样品3次，并且在罩下干燥。图6a示出以这种方式处理的微型膝关节植入物。SEM图像示出高孔隙率的样品(图6b)。AFM分析用于研究表面拓扑与生物相互作用之间的关系。图6d示出等离子体处理后噬菌体在植入物的表面上的共价固定。
实施例4：噬菌体在钛棒上的固定(原子力显微镜)
用不锈钢电极生成等离子体。在到达之前清理腔室。用由5sccm乙烯和20sccm二氧化碳组成的处理1进行预沉积。压力为80Pa，功率为20W。通过腔室将样品、培养皿、无菌镊子插入箱中。将微型植入物置于培养皿上，所以它们彼此不接触。将培养皿安置在电极上。施加如上所述的处理1，进行10分钟，以便在表面上实现100nm厚的等离子体聚合物沉积
拓扑图像示出对应于噬菌体头部的从植入物表面(图7，小图d)突出的30至50nm的球形粘附(图7，小图c)。未处理棒的高度传感器AFM图像示出大量空位岛(图7，小图a)，这与处理样品形成鲜明对比，在处理样品中，空位岛似乎均匀地填充有噬菌体(图7，小图c)。此外，未处理样品(图6，小图b)和处理样品(图7，小图d)具有明显不同的拓扑图像，其中直径为大约50nm的致密球形体(对应于噬菌体)精细分布在钛棒上，几乎完全覆盖基底表面。
实施例5：噬菌体在钛棒上的固定(活性和功效的微生物学测定)
实施例5a：噬斑测定
用不锈钢电极生成等离子体。在到达之前清理腔室。用由10sccm氨和10sccm乙烯组成的处理1进行预沉积。压力为80Pa，在20W下。通过腔室将棒、培养皿、无菌镊子插入箱中。将棒置于培养皿上，所以它们彼此不接触。将培养皿安置在电极上。施加如上所述的处理1，进行10分钟，以便在表面上实现100nm厚等离子体聚合物沉积。在处理之后，将棒放回在2mL玻璃小瓶中，所述玻璃小瓶含有在TMN缓冲液中的噬菌体溶液或在PBS缓冲液中的内溶素溶液。将对照组在没有抗菌药物的TMN或PBS中孵育，并且密封在袋中以防止O2污染。将样品用SuperQ水冲洗3次，在罩下干燥2小时，随后进行进一步测试。
我们进行噬斑测定以评估噬菌体对宿主细胞的捕获，并且评估噬菌体颗粒是否保留其活性构象。将棒直接与细菌(SaA29)顶部琼脂接触以评估直接裂解。SaA29是甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌并且是噬菌体BP39(短尾噬菌体科)的天然宿主。噬斑测定(图8)清楚地示出，仅用BP39噬菌体和金黄色葡萄球菌内溶素处理的钛棒能够裂解细菌菌苔。共价固定的噬菌体和内溶素因此保留它们的感染性。
实施例5b：附着测定
定殖附着测定提供一种定量在接种细菌后粘附到试样的细菌数量的方法。此方法描述定量粘附到测试试样的金黄色葡萄球菌的量所需的步骤。将测试试样用如实施例5a中所述的等离子体处理，并且用初始接种物浓度孵育以用于在标准液体测定中的附着。在1小时时间段之后，洗涤试样并用于随后测定CFU/针的步骤以及用于增殖测定。制备在20mL商业TSB中108CFU/mL浓度的金黄色葡萄球菌的过夜细菌接种物。使用0.3％TSB将细菌浓度调节至104CFU/mL。针在6孔培养板中。清理在无菌/超纯去离子水中的对照针，并且然后在121℃下高压釜灭菌15min。将5mL接种物添加到每个孔中，并且置于37℃和60RPM的摇动器-培养箱中1小时。从孔中抽吸接种物并用5mL的1X PBS更换。洗涤样品4次。将针转移到装有3mL中和缓冲液的15mL离心翻转管中，并涡旋10s。将管在设置为4℃的冷水浴中以9.4W的频率超声处理15min，并在最高速度设置下再次涡旋10s。从小瓶中取出针，并用2mL中和缓冲液冲洗到管中。通过用镊子在一个方向上向下压来使洗涤的针滚到TSA-L板的表面上。将小瓶在3000RPM下在4℃下离心5min。将100–200uL上清液和沉淀移液到管中以混合，并且铺板到TSA-L板的表面上。将板孵育18-24小时，并且计数板上菌落的数量。
在与未处理组相比时，等离子体处理对细菌粘附没有显著影响。然而，我们看到在与两个对照相比时，噬菌体处理组的细菌计数明显减少(图9)，其中细菌计数具有0.8log减少。
实施例5c：液体增殖测定
此方法描述定量在附着测定后增殖到测试试样上的金黄色葡萄球菌的量所需的步骤。将测试试样用附着测定中所述的初始接种物浓度孵育。在1小时时间段之后，洗涤试样并使其增殖，并且用于随后测定CFU/针的步骤以及用于增殖测定。将初始接种物用于附着。将针摇晃并孵育一小时。然后，将针轻轻洗涤并使其在作为软组织的模拟物的软琼脂中再增殖18-24小时，并且用于标准液体测定，进行额外18-24小时，随后测定CFU/针。
用于滴定的板不是TSA-L，而是葡萄球菌特异性琼脂。细菌是SaA3(金黄色葡萄球菌ATCC 25923)。将对照样品在121℃下高压釜灭菌15min。在孵育之前以0,7.104CFU/mL滴定细菌接种物，并且在1h孵育之后以1,1.105CFU/mL滴定。
在此测定中，我们发现，在未处理对照组与等离子体处理组之间存在显著差异。我们假设，等离子体处理影响棒的疏水性，从而影响细菌在其表面上生长的能力(图10)。
此外，我们发现，在对照组与噬菌体处理组两者之间存在显著差异，噬菌体处理组在与等离子体处理相比时具有1.65log减少，并且噬菌体处理组在与未处理对照相比时具有2.24log减少。
我们已经成功使用等离子体技术将噬菌体固定在钛棒上，如AFM所示。噬斑测定显示，在处理后，固定的噬菌体保留其活性和感染性。附着和增殖测定显示，在与噬菌体固定的钛棒相比时，对照棒上的细菌粘附之间存在显著差异，其中对于两个测定具有0.8的log减少，并且在1.7与2.2log减少之间变化。
实施例6：调节富氧和富氮聚合物的表面特性
在此工作中，产生一组由乙烯(C2H4)/氨(NH3)和乙烯/二氧化碳(CO2)的二元气体混合物制备的低压等离子体共聚合膜，以便沉积具有可调整化学组成和表面电荷的富氮或富氧涂层。
使用含有碳源和杂原子源的其他混合物中低压的电容耦合的射频辉光放电产生等离子体聚合涂层。将膜沉积在钛涂覆的k线材基底上。首先将基底在异丙醇(99.9％,Fischer Scientific)中超声处理，并且然后在super-Q水中超声处理，随后在层流罩下干燥并高压釜灭菌。将钛棒安装在等离子体腔室内的自制支撑物上。
在圆柱形不锈钢真空腔室(直径为20cm并且高度为50cm)中进行沉积，所述真空腔室具有圆盘形状的供电电极(
)，样品放置在所述供电电极上(图16)。
安置在高于供电电极4cm处的喷头气体分配器还充当接地电极。使用旋片和涡轮分子(泵将腔室排空至高真空。通过质量流控制器引入工艺混合物。气体流比率定义为R＝(杂原子源气体的流量)/(烃源气体的流量)。
表2列出用于本发明的研究的各种实验参数的描述。在沉积进行期间通过节流闸阀将压力维持在80Pa。使用自动阻抗匹配网络生成20W功率的电容耦合的射频(RF，13.56MHz，Cesar)放电。典型的沉积运行持续约10min以沉积约100nm厚的涂层。
表2：用于沉积等离子体聚合物涂层的气体流比率
将棒在不同溶液中孵育过夜(总计20h)。然后将棒用1mL f无菌superQ水冲洗，并且静置以在生物罩下干燥几小时。
实施例6a：噬斑测定
我们进行噬斑测定以评估噬菌体对宿主细胞的捕获，并且评估噬菌体颗粒是否保留其活性构象。将棒直接与细菌(SaA29)顶部琼脂接触以评估直接裂解。噬斑测定清楚地显示，与等离子体聚合物和TMN缓冲液处理的对应物相反，仅用氧或氮等离子体聚合和BP39噬菌体处理的钛棒能够裂解细菌菌苔(图11)。共价固定的噬菌体因此在两种类型的处理的情况下保留它们的感染性。
实施例6b：液体增殖测定
此方法描述定量在附着测定后增殖到测试试样上的金黄色葡萄球菌的量所需的步骤。将测试试样用附着测定中所述的初始接种物浓度孵育。在1小时时间段之后，洗涤试样并使其增殖，并且用于随后测定CFU/针的步骤以及用于增殖测定。将初始接种物用于附着。将针摇晃并孵育一小时。然后，将针轻轻洗涤并使其在作为软组织的模拟物的软琼脂中再增殖18-24小时，并且用于标准液体测定，进行额外18-24小时，随后测定CFU/针。
在与TMN处理相比时，PPE:N和PPE:O+噬菌体处理两者似乎在2.76和2.40细菌log减少方面是非常有效的(图12)。
实施例6c：软琼脂增殖测定
此方法描述定量在附着测定后增殖到测试试样上的金黄色葡萄球菌的量所需的步骤。将测试试样用附着测定中所述的初始接种物浓度孵育。在1小时时间段之后，洗涤试样并使其增殖，并且用于随后测定CFU/针的步骤以及用于增殖测定。将初始接种物用于附着。将针摇晃并孵育一小时。然后，将针轻轻洗涤并使其在作为软组织的模拟物的软琼脂中再增殖18-24小时，并且用于标准液体测定，进行额外18-24小时，随后测定CFU/针。在与未处理组和PPE:N+TMN缓冲液组相比时，PPE:N+噬菌体显示1.98和1.87log减少(图13)。
根据先前的实验组，似乎所述处理允许噬菌体的共价结合，或者允许噬菌体保留它们的感染性。
实施例6d：噬菌体-钛棒复合物的X射线光电子光谱表征
在沉积之后22–24h，使用单色Al Ka辐射在Thermo Scientific K-AlphaTM仪器中进行XPS分析。在160eV的通能下获取观测光谱，并且通过在285.0eV的结合能下相对于碳(C1)峰参考所有的峰进行校准。使用2.3.16PR 1.6Avantage软件计算的原子浓度用于评估表面组成。碳、氮和氧的相对灵敏度系数(RSF)值分别为1、1.8和2.93。通过首先应用Shirley背景来进行高分辨率XPS峰分析。使用1.2eV的半最大值全宽(FWHM)将C1光谱与四组分峰(C1–C4)拟合。
使用PPE:N沉积将噬菌体与Ti棒联接。通过XPS研究引起噬菌体与Ti棒之间的共价键形成的样品表面的化学改变。样品的元素观测显示由噬菌体的存在贡献的碳(69.35％)、氧(15.93％)和氮(14.09％)的存在。未检测到的钛原子百分比指示，Ti棒被噬菌体致密地覆盖。因此，我们预期在与噬菌体相比时，噬菌体-NP杂交体的相似碳、氮和氧百分比。
除通过XPS测量原子浓度之外，还进行高分辨率XPS来确定化学结合状态。通过限制峰位置组分来将高分辨率碳(C1)峰曲线与具有不同R值的样品的四个子峰组分(C1-C4)拟合。选择的样品是Ti棒，并且两个Ti棒涂覆有浸渍在溶液中的富氮等离子体聚合物，一个含有噬菌体(Ti:PPE:N+Bac)并且另一个没有噬菌体(Ti-PPE:N)。还分析Si薄片和Si薄片上的噬菌体溶液的小滴(Si+Bac)。与液体接触的所有样品必须在分析之前完全干燥。
在Thermo ScientificTM K-AlphaTM+XPS上分析样品。在1eV的分辨率下记录观测光谱，并且在0.1eV的分辨率下记录C1、N1和O1峰的光谱。
使用Avantage(Tm)软件(5.956版本)进行数据分析。对于每个样品的一般比较分析，使用自动识别功能。然后对来自每个样品上不同点的结果进行平均化。误差条代表一个标准偏差。对于峰拟合，首先对每个峰进行电荷校准以在285eV下具有C1峰，并且应用Shirley背景。无论何时对于样品Ti-PPE:N和Ti-PPE:N+Bac是可能的，将FWHM和组分位置固定在Tawil等人的文章中报告的值处。[1]然而，使用这些参数不可能获得Si+Bac的良好拟合。因此，对于Si+Bac的峰分析，不对组分位置和FWHM两者施加约束。
表3呈现样品Ti-PPE:N9、Ti-PPE:N+Bac和Si+Bac上碳、氮和氧的拟合组分的结合能、FWHM和面积百分比。
表3：样品Ti-PPE:N、Ti-PPE:N+Bac和Si+Bac上碳、氮和氧的拟合组分的结合能、FWHM和面积百分比。
C1和C2组分被指定为Ti对于氨和乙烯键的贡献，而C3代表脂族碳，C4包括胺C–N、C＝N和腈，C5包括腈、羟基和醚基团(C–O–C＝O)。最后，C6组分被指定为来自羰基即C＝O和N–C＝O的贡献，以及来自N–C–O的贡献。考虑到等离子体聚合物膜的复杂性，这些指定应被认为是建议，并且其他官能团可能是所观察到的化学位移的原因。
实施例7：用于固定形态上相异的噬菌体的等离子体方法的合适性
每个噬菌体颗粒由封闭在蛋白质或脂蛋白包衣(称为衣壳)中的基因组材料构成。噬菌体基于其形态、核酸同源性和血清学而细分为多个属，并且基于其生命周期、复制和增殖而细分为两个组。裂解噬菌体是毒性噬菌体，其特异性识别并感染它们的宿主细菌，使用细菌机器复制它们的基因组，产生并组装它们的结构组件，并且最后裂解并杀死细菌以释放新组装的病毒粒子。目前，噬菌体被分组为19个科。有尾噬菌体目的有尾噬菌体占当前分离的噬菌体的大约95％。病毒粒子具有二十面体头部。
短尾噬菌体科诸如BP39是具有短的非收缩尾部的噬菌体类型，而其他诸如J21-P1是具有较长收缩尾部的肌尾噬菌体科。固定条件与这些吸附的噬菌体的所得取向及其生物活性之间的关系的系统性研究是重要的，因为更好地理解不同类型的噬菌体的固定过程将提高设计更好涂覆的植入物的可能性。我们研究了相同的PPE:N方法是否可以用于将短尾噬菌体科和肌尾噬菌体科二者固定在钛植入物的表面上。
实施例7a：噬斑测定
噬斑测定清楚地显示，与等离子体聚合物和TMN缓冲液处理的对应物相反，仅用氮等离子体聚合(处理1)和J21-P1噬菌体处理的钛棒能够裂解细菌菌苔。与BP39相同，J21-P1共价固定的噬菌体因此保留它们的感染性(图14)。
实施例7b：原子力显微镜
用分子力探针3D控制器ACTA(AppNano)，使用Asylum MPF3D在k:37N/m和fo:300kHz下进行峰值力轻敲模式AFM测量。未处理的Ti棒示出具有一些颗粒料的光滑表面，与关于机器加工的Ti棒的先前公布的报告一致。
多个等离子体处理的样品具有定性相似的表面形貌，然而，所述表面形貌与未处理的Ti棒和Ti-PPE:N+噬菌体处理的棒明显不同。表面具有相对光滑的外观，具有清晰可见的晶粒和晶粒边界。虽然晶粒具有光滑表面，但是它们在亚微米水平上示出波纹形貌。AFM揭示精细分布致密线性体的存在，几乎完全覆盖基底表面。在Ti-PPE:N+Bac样品的AFM图像上可以清楚地看到J21P1噬菌体，尺寸对应于J21P1噬菌体(图15)。
实施例8：涂层的稳定性
进行此测定来建立通过处理1固定的噬菌体随时间推移的活性。滴定细菌SaA1接种物(10^4，在SOP中询问)。对于增殖测定中的滴定，每个培养皿铺板150uL的适当稀释液(一种稀释液/培养皿)。将洗涤并干燥的Ti棒在4℃下保持在玻璃小瓶中，直至测定活性。
实施例8a：2周稳定性时间点的噬斑测定
第二周结果与前一周的结果一致，并且我们得出结论，在与未用噬菌体处理的样品(无活性)相比时，固定的噬菌体保持活性(图16)。
实施例8b：2周稳定性时间点的固体增殖测定
进行固体增殖测定(如先前部分中所述)以建立在等离子体处理1后在处理后2周时固定噬菌体的活性。结果显示，在等离子体处理和噬菌体固定后维持的活性具有0.74至0.9log减少(图17)。
实施例9：等离子体处理后封装噬菌体的固定。
如先前所述，向钛k线材施加等离子体处理1：(10sccm氨，10sccm乙烯，P＝80Pa，20W，10min，ca 100nm沉积)。在等离子体处理后，通过以下处理棒：(1)通过滴涂(液体贴片制剂)嵌段共聚物(PEAU)；(2)在液体缓冲液中的含有微胶囊化噬菌体的制剂(制剂9)，(3)具有添加浓度的聚乙烯醇(PVA)的微胶囊化噬菌体，其在喷涂在植入物上时能够形成薄膜(制剂10)；(4)以及含有普兰尼克的制剂中微胶囊化噬菌体，其具有在喷涂在植入物上时形成凝胶的特性(制剂11)。所有这些制剂含有15种不同的靶向金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的裂解噬菌体的混合物(表4)。
清理棒并以以下方式灭菌：在超声浴中，在15mL Falcon管中，将棒在3mL异丙醇中超声处理15min。此外，在新的15mL Falcon管中，将棒在3mL无菌superQ水中超声处理15min。在生物罩下，将棒在新的15mL无菌superQ水中冲洗2X并干燥。将所有棒单独地在2mL玻璃小瓶中在121℃(grav15)下高压釜灭菌15min。用不锈钢电极生成等离子体。用处理1进行预沉积(无样品)。通过腔室将棒、培养皿、支撑物、无菌镊子插入箱中。将棒竖直地置于自制支撑物上，所以它们彼此不接触。将支撑物安置在电极上。施加处理1。
在等离子体处理之后，将棒插入到对应的制剂(液体贴片，或制剂9)(在15mLfalcon管中的3mL溶液)中，或者在生物罩下喷涂15mL制剂10或制剂11。将棒从制剂轻轻地取出，并放回在小的无菌GC小瓶中(处理区域不接触玻璃)。将棒在层流罩下干燥过夜。在37℃下在EMEM培养基(补充有10％FBS)中监测噬菌体的释放，并且通过滴定在金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌上进行4周评定。
滴涂策略以及喷涂微胶囊化策略均显示在672小时内(在28天内)噬菌体的受控释放，钛基底上直接固定的噬菌体未显示此结果(表4)。
表4：噬菌体从固定制剂的释放。
实施例10：预防生物膜感染。
在生物膜测定中使用SaA3金黄色葡萄球菌菌株。使用靶向金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的噬菌体混合物。对于所述测试还使用其中噬菌体封装在微球中的制剂，其含有相同的噬菌体混合物。这些是F11(凝胶形成喷雾)。使用Exakt切割工具切割钛和不锈钢k线材，以便得到可以用于96孔微板的圆盘。将圆盘在水中超声处理15分钟，接着再次在乙醇和水中超声处理，然后对圆盘进行高压釜灭菌。圆盘经历等离子体聚合(处理R＝2(10sccm氨，20sccm乙烯，P＝80Pa，20W，10min，ca 100nm沉积)或者R＝8(10sccm氨，80sccm乙烯，P＝80Pa，20W，10min，ca 100nm沉积)。在处理后，将圆盘与制剂11或噬菌体混合物一起孵育1小时。然后将圆盘洗涤3次，在层流罩下干燥并且转移到新的96孔板。通过将1％葡萄糖(1g/100ml)添加到TSB培养基中来获得插入到孔中的生物膜的培养基。将圆盘置于微板的在它们的平坦表面上的孔底部。对于阴性对照，将100μl培养基置于孔中。阳性对照是90μl培养基和10μl细菌悬浮液溶液。将板在37℃下孵育24小时。
使用真空泵和pastoral移液管，通过避免接触圆盘的表面来注意不破坏可能形成的生物膜，来抽吸孔的内容物。在室温下将孔填充100μL PBS，并且再次抽吸。重复此步骤3次将生物膜在60℃下在烘箱中固定。将孔填充100μl甲醇，并且孵育20分钟，随后抽吸内容物。使板过夜干燥。将可能形成的生物膜用2％结晶紫染色，并且然后将圆盘用95％甲醇处理并且孵育30分钟。在570nm处读取光学密度(图17和图18)。
研究噬菌体的预处理及它们解决生物膜形成的问题的能力。结果证明，在等离子体聚合后用制剂F11进行预处理提供显著减少与完全防止植入物上生物膜形成的有效方式。直接固定噬菌体对于防止生物膜形成是无效的。
虽然上文已经通过本发明的优选实施方案描述了本发明，但是它可在不背离如所附权利要求中所定义的本发明的精神和本质下进行修改。另外，虽然上文已经通过其示例性实施方案描述了本发明，但是易于理解，可以在本质上不背离本发明的新型教义和优点的情况下在示例性实施方案中进行许多修改。因此，权利要求书的范围不应受到示例性实施方案的限制，而是应给予与说明书整体相一致的最广泛的解释。
Claims (77)
1.一种医疗装置，所述医疗装置包括：
-基底，其限定表面；
-等离子体聚合物层，其结合至所述表面并涂覆所述表面，其中所述等离子体聚合物层通过将所述表面暴露于等离子体而结合至所述表面，所述等离子体是冷等离子体；以及
-杀菌剂层，其结合至所述等离子体聚合物层，所述等离子体聚合物层介于所述基底与所述杀菌剂层之间，其中所述杀菌剂层包括生物活性噬菌体。
2.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层包括选自由以下组成的组的噬菌体相关产品：内溶素、溶葡球菌酶、噬菌体蛋白、噬菌体酶制剂及其组合。
3.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层还包括选自由以下组成的组的生物活性剂：细胞粘附促进剂、抗血栓因子、防腐剂、抗感染药物、止痛药、抗原生动物剂、抗病毒剂、抗炎剂、避孕药、CNS活性药物、激素、酶、止血药和疫苗。
4.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层还包括生物活性剂，所述生物活性剂是抗菌药物。
5.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层还包括选自由以下组成的组的生物活性剂：抗生素和镇痛剂。
6.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述基底包括金属或金属合金。
7.根据权利要求6所限定的医疗装置，其中所述基底包括钛。
8.根据权利要求6所限定的医疗装置，其中所述基底由钛制成。
9.根据权利要求6所限定的医疗装置，其中所述基底包括以下中的至少一种：聚合物、铁、铜、锌、铅、铝、钛、金、铂、银、钴、铬、钒、钽、镍、镁、锰、钴铬、镍钛、钛钒铝和不锈钢。
10.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述等离子体聚合物层的厚度介于10nm与1000nm之间。
11.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述等离子体聚合物层的厚度介于100nm与500nm之间。
12.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层包括共价结合至所述等离子体聚合物层的生物活性噬菌体。
13.根据权利要求12所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层包括在同一杀菌剂层中短尾噬菌体科和肌尾噬菌体科二者的组合。
14.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层包括共价结合至所述等离子体聚合物层的噬菌体相关产品。
15.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层包括共价结合至所述等离子体聚合物层的涂层材料。
16.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层包括静电结合至所述等离子体聚合物层的涂层材料。
17.根据权利要求15所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层包括静电结合至所述等离子体聚合物层的涂层材料。
18.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层包括分散在涂层材料中的生物活性噬菌体，所述涂层材料结合至所述等离子体聚合物。
19.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层包括分散在涂层材料中的噬菌体相关产品，所述涂层材料结合至所述等离子体聚合物。
20.根据权利要求18所限定的医疗装置，其中所述涂层材料是限定暴露表面的聚合物，所述杀菌剂层限定从所述暴露表面在所述涂层材料中延伸的微通道。
21.根据权利要求20所限定的医疗装置，其中所述微通道具有5nm至5μm的直径。
22.根据权利要求20所限定的医疗装置，其还包含包埋在所述涂层材料中的盐晶体。
23.根据权利要求22所限定的医疗装置，其中所述噬菌体被吸附在所述盐晶体上。
24.根据权利要求22所限定的医疗装置，其中所述盐晶体包括钙盐晶体、镁盐晶体、锶盐晶体和钡盐晶体中的至少一种。
25.根据权利要求22所限定的医疗装置，其中所述盐晶体的大小介于5nm与5μm之间。
26.根据权利要求18所限定的医疗装置，其中所述涂层材料是嵌段共聚物。
27.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层包括结合至所述等离子体聚合物的含有噬菌体的可生物降解微胶囊。
28.根据权利要求1所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层包括包埋在涂层材料中的含有噬菌体的可生物降解微胶囊，所述涂层材料结合至所述等离子体聚合物。
29.根据权利要求28所限定的医疗装置，其中所述杀菌剂层包括分散在其中的在所述微胶囊外部的噬菌体。
30.根据权利要求28所限定的医疗装置，其中所述可生物降解微胶囊由共聚物制成。
31.根据权利要求28所限定的医疗装置，其中所述涂层材料包括泊洛沙姆407。
32.根据权利要求28所限定的医疗装置，其中所述涂层材料包括聚乙烯醇(PVA)。
33.根据权利要求1至32任一项所限定的医疗装置，其中所述医疗装置选自由以下组成的组：矫形植入物、导管和除颤器。
34.根据权利要求1至32任一项所限定的医疗装置，其中所述医疗装置是支架。
35.一种用杀菌剂层涂覆医疗装置的基底的表面的方法，所述方法包括：
-将所述表面暴露于等离子体以形成结合至所述表面的等离子体聚合物层，其中所述等离子体是冷等离子体；以及
-将杀菌剂层结合至所述等离子体聚合物层，其中所述杀菌剂层包括生物活性噬菌体。
36.根据权利要求35所限定的方法，其中所述杀菌剂层包括选自由以下组成的组的噬菌体相关产品：内溶素、溶葡球菌酶、噬菌体蛋白、噬菌体酶制剂及其组合。
37.根据权利要求35所限定的方法，其中所述等离子体包括氮。
38.根据权利要求37所限定的方法，其中所述等离子体包括N2和NH3中的至少一种。
39.根据权利要求37所限定的方法，其中所述等离子体包括N2和H2。
40.根据权利要求37所限定的方法，其中将所述表面暴露于所述等离子体以形成所述等离子体聚合物层包括在所述基底的表面上形成反应性基团，所述反应性基团选自由以下组成的组：伯胺、仲胺、叔胺、酰胺及其组合。
41.根据权利要求35所限定的方法，其中所述等离子体包括氧。
42.根据权利要求41所限定的方法，其中将所述表面暴露于所述等离子体以形成所述等离子体聚合物层包括在所述基底的表面上形成反应性基团，所述反应性基团选自由以下组成的组：羧基、羟基、酮、醛和酯。
43.根据权利要求35所限定的方法，其中所述等离子体包括CO和CO2中的至少一种。
44.根据权利要求43所限定的方法，其中将所述表面暴露于所述等离子体以形成所述等离子体聚合物层包括在所述基底的表面上形成反应性基团，所述反应性基团选自由COOH、过氧化物和OH组成的组。
45.根据权利要求35所限定的方法，其中所述等离子体包括Ar。
46.根据权利要求45所限定的方法，其中将所述表面暴露于所述等离子体以形成所述等离子体聚合物层包括在所述基底的表面上形成自由基。
47.根据权利要求35所限定的方法，其中所述等离子体包括NH3、N2/H2、He、O2、Ar、N2、CO、CO2、NO、NO2、SO2、Ne、H2、空气和CF4中的至少一种。
48.根据权利要求47所限定的方法，其中将所述表面暴露于所述等离子体以形成所述等离子体聚合物层包括在所述基底的表面上形成自由基。
49.根据权利要求35所限定的方法，其中所述等离子体包括Ar和He中的至少一种，并且其中将所述表面暴露于所述等离子体以形成所述等离子体聚合物层包括在所述基底的表面上形成自由基，所述方法还包括将所述自由基暴露于包括氧的气体以引发聚合反应。
50.根据权利要求35所限定的方法，其中所述基底选自由以下组成的组：包括聚合物、商业纱布、金属和合金的基底。
51.根据权利要求35所限定的方法，其中所述基底是包括可生物降解的基于氨基酸的聚合物的基底。
52.根据权利要求35所限定的方法，其中所述等离子体包括以下中的至少一种：乙酸、4-乙烯基吡啶、1-乙烯基咪唑、丙烯酸酯、乳酸乙酯、乙烯、乳酸、e-己内酯、甲醇、水、烯丙胺、乙二胺、丙烯酸、羟基甲基丙烯酸酯、丙二醇、六甲基二硅氧烷、氨基硅烷、羧基硅烷、羟基硅烷和巯基硅烷。
53.根据权利要求35所限定的方法，其中所述等离子体是大气压等离子体。
54.根据权利要求35所限定的方法，其中所述等离子体是低压等离子体。
55.根据权利要求35所限定的方法，其中将所述表面暴露于所述等离子体以形成所述等离子体聚合物层包括使所述等离子体聚合物层生长，直至所述等离子体聚合物层的厚度介于10nm与1000nm之间。
56.根据权利要求35所限定的方法，其中将所述表面暴露于所述等离子体以形成所述等离子体聚合物层包括使所述等离子体聚合物层生长，直至所述等离子体聚合物层的厚度介于100nm与500nm之间。
57.根据权利要求35所限定的方法，其中将所述杀菌剂层结合至所述等离子体聚合物层包括将生物活性噬菌体共价结合至所述等离子体聚合物层。
58.根据权利要求35所限定的方法，其中将所述杀菌剂层结合至所述等离子体聚合物层包括将用所述等离子体聚合物层涂覆的基底与包含生物活性噬菌体的悬浮液接触。
59.根据权利要求35所限定的方法，其中将所述杀菌剂层结合至所述等离子体聚合物层包括在包含生物活性噬菌体的悬浮液中浸涂用所述等离子体聚合物层涂覆的基底。
60.根据权利要求35所限定的方法，其中将所述杀菌剂层结合至所述等离子体聚合物层包括将包含生物活性噬菌体的悬浮液溶剂浇铸在所述等离子体聚合物层上。
61.根据权利要求35所限定的方法，其中将所述杀菌剂层结合至所述等离子体聚合物层包括将噬菌体相关产品共价结合至所述等离子体聚合物层。
62.根据权利要求35所限定的方法，其中将所述杀菌剂层结合至所述等离子体聚合物层包括将用所述等离子体聚合物层涂覆的基底在包含噬菌体相关产品的悬浮液或溶液中接触。
63.根据权利要求35所限定的方法，其中将所述杀菌剂层结合至所述等离子体聚合物层包括将涂层材料结合至所述等离子体聚合物层，生物活性噬菌体分散在所述涂层材料中。
64.根据权利要求35所限定的方法，其中将所述杀菌剂层结合至所述等离子体聚合物层包括将涂层材料结合至所述等离子体聚合物层，噬菌体相关产品分散在所述涂层材料中。
65.根据权利要求63所限定的方法，其中将所述杀菌剂层结合至所述等离子体聚合物层包括将在溶剂中的包含所述涂层材料的溶液与所述等离子体聚合物层接触，并且随后蒸发所述溶剂。
66.根据权利要求63所限定的方法，其中所述涂层材料是限定暴露表面的聚合物，所述方法还包括形成从所述暴露表面在所述涂层材料中延伸的微通道。
67.根据权利要求66所限定的方法，其中形成所述微通道包括用等离子体蚀刻所述暴露表面。
68.根据权利要求66所限定的方法，其中盐晶体分散在所述涂层材料中，形成所述微通道包括从所述涂层材料浸出所述盐晶体。
69.根据权利要求68所限定的方法，其中当所述医疗装置在受试者中使用时，在使所述涂层材料与生物组织接触的同时进行浸出所述盐晶体。
70.根据权利要求63所限定的方法，其中所述涂层材料是嵌段共聚物。
71.根据权利要求35所限定的方法，其中将所述杀菌剂层结合至所述等离子体聚合物层包括将涂层材料结合至所述等离子体聚合物层，含有噬菌体的可生物降解微胶囊包埋在所述涂层材料中。
72.根据权利要求71所限定的方法，其中所述可生物降解微胶囊由共聚物制成。
73.根据权利要求71所限定的方法，其中所述涂层材料包括泊洛沙姆407。
74.根据权利要求71所限定的方法，其中所述涂层材料包括聚乙烯醇(PVA)。
75.根据权利要求35所限定的方法，其中将所述杀菌剂层结合至所述等离子体聚合物层包括将包含微胶囊悬浮液的涂层材料喷涂在所述等离子体聚合物层上，生物活性噬菌体分散在所述涂层材料中。
76.根据权利要求35至75中任一项所限定的方法，其中所述医疗装置选自由以下组成的组：矫形植入物、导管和除颤器。
77.根据权利要求35至75中任一项所限定的方法，其中所述医疗装置是支架。
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