CN110699453A - 一种胆管癌检测、治疗和预后靶点及应用 - Google Patents

Abstract

一种胆管癌细胞药物靶点，所述药物靶点为泛素特异性蛋白酶8，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。本发明首次提出，敲低USP8可显著抑制胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，降低在细胞黏附、肿瘤侵袭和转移中起着重要作用的MMP9活性，提示USP8在胆管癌的生长和转移能力中起致癌基因的作用。为胆管癌药物研制以及胆管癌预防、治疗和预后提供了新的可能性。

Description

一种胆管癌检测、治疗和预后靶点及应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种胆管癌检测、治疗和预后靶点及应用。

背景技术

胆管癌是第二常见的原发性肝胆肿瘤，发病率高，复发率高。全球范围内，胆管癌是仅次于肝细胞癌的第二大原发性肝胆肿瘤，占肝胆肿瘤发病率的10%-15%。据报道, 在最近的几十年里全世界总胆管癌的发生率逐渐增加,特别是在东南亚发病率最高。胆管癌是一种恶性的肿瘤早期没有明显的临床表现。此外,很难进入胆管癌的解剖位置, 这给胆管癌的治疗构成巨大的挑战。胆管癌手术治疗是首选治疗方案,但它只有在疾病早期阶段是有效的，而且胆管癌对化疗不敏感。更糟糕的是，胆管癌患者在手术后2年的复发率是50%。此外，超过三分之二的患者无法接受手术，胆管癌的5年生存率约为5-15%。胆管癌的侵袭转移严重影响患者的生存。因此，研究胆管癌的具体发病机制，寻找新的治疗靶点，对胆管癌的治疗具有重要意义。

发明内容

本发明针对传统胆管癌治疗过程中存在的问题提出一种新型的胆管癌检测、治疗和预后靶点及应用。

细胞内蛋白质的降解是一个极其复杂、高度有序的过程，主要由泛素系统完成。促进蛋白质降解的泛素化在控制蛋白质丰度以维持正常细胞过程(包括细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、信号转导和炎症免疫)方面发挥着关键作用。泛素代谢途径异常会导致许多疾病，包括癌症。通常知道泛素化是一个可逆的翻译修饰,这是由泛素连接酶和去泛素化酶调控。泛素特异性蛋白酶(USPs)被认为是人类最大的DUBs亚家族。Ubiquitin-specific蛋白酶8 (USP8),也被称为UBPY,属于endosomal排序的USPs家族的功能蛋白质。

本发明提供的siRNA（序列为5’-CCACAGATTGATCGTACTA-3’）可以干扰胆管癌肿瘤细胞中USP8互补的核苷酸序列的转录后降解的mRNA，从而防止USP8翻译，进而降低USP8的蛋白表达，减少USP8蛋白表达所发挥的生物学功能。

逃避程序性死亡是肿瘤细胞的主要特征之一，本发明是基于促进肿瘤细胞凋亡的原理，来抑制肿瘤生长。

USP8可以调节胞内运输的表皮生长因子受体(EGFR) ，通过去泛素化调控其循环，调控EGFR的稳定。

Akt信号通路在调控多种细胞生理学、肿瘤发生、肿瘤发展等方面发挥着重要作用。Akt信号通路被认为是癌症研究的主要靶点。本发明中，沉默USP8可以通过降低Akt在胆管癌细胞中的磷酸化水平，显著抑制Akt信号通路的激活。

本发明提出USP8在胆管癌的发展过程中发挥致癌作用，降低USP8表达可显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭，促进胆管癌细胞凋亡。

本发明提出的USP8可以作为胆管癌早期诊断标志物、药物治疗有效性判断标志物或患者预后标志物。

本发明提出USP8是治疗胆管癌的靶点。其序列如下：

atgcc tgctgtggct tcagttccta aagaactcta cctcagttct tcactaaaag accttaataagaagacagaa gttaaaccag agaaaataag cactaagagt tatgtgcaca gtgccctgaa gatctttaagacagcagaag aatgcagatt agatcgtgat gaggaaaggg cctatgtact atatatgaaa tacgtgactgtttataatct tatcaaaaaa agacctgatt tcaagcaaca gcaggattat ttccattcaa tacttggacctggaaacatc aaaaaagctg tcgaagaagc tgaaagactc tctgaaagcc ttaaattaag atatgaagaagctgaagtcc ggaaaaaact tgaggaaaaa gacaggcagg aggaagcaca gcggctacaa caaaaaaggcaggaaacagg aagagaggat ggtggcacat tggctaaagg ctctttggag aatgttttgg attccaaagacaaaacccaa aagagcaatg gtgaaaagaa tgaaaaatgt gagaccaaag agaaaggagc aatcacagcaaaggaactat acacaatgat gacggataaa aacatcagct tgattataat ggatgctcga agaatgcaggattatcagga ttcctgtatt ttacattctc tcagtgttcc tgaagaagcc atcagtccag gagtcactgctagttggatt gaagcacacc tgccagatga ttctaaagac acatggaaga agagggggaa tgtggagtatgtggtacttc ttgactggtt tagttctgcc aaagatttac agattggaac aactctccgg agtctgaaagatgcactttt caagtgggaa agtaaaactg tcctgcgcaa tgagcctttg gttttagagg gaggctatgaaaactggctc ctttgttatc cccagtatac aacaaatgct aaggtcactc cacccccacg acgccagaatgaagaggtgt ctatctcatt ggattttact tatccctcat tggaagaatc aattccttct aaacctgctgcccagacgcc acctgcatct atagaagtag atgaaaatat agaattgata agtggtcaaa atgagagaatgggaccactg aatatatcaa ctccagttga accagttgct gcttctaaat ctgatgtttcacccataattcagccagtgc ctagtataaa gaatgttcca cagattgatc gtactaaaaa accagcagtcaaattgcctg aagagcatag aataaaatct gaaagtacaa accatgagca acaatctcct cagagtggaaaagttattcc tgatcgttcc accaagccag tagttttttc tccaactctc atgttaacag atgaagaaaaggctcgtatt catgcagaaa ctgctcttct aatggaaaaa aacaaacaag aaaaagaact tcgggaaaggcagcaagagg aacagaaaga gaaactgagg aaggaagaac aagaacaaaa agccaaaaag aaacaagaagctgaagaaaa tgaaattaca gagaagcaac aaaaagcaaa agaagaaatg gagaagaaag aaagtgaacaggccaagaaa gaagataaag aaacctcagc aaagaggggc aaagaaataa caggagtaaa aagacaaagtaaaagtgaac atgaaacttc tgatgccaag aaatctgtag aagatagggg gaaaaggtgt ccaaccccagaaatacagaa aaagtcaaca ggagatgtgc cccatacatc tgtgacaggg gattcaggtt caggcaagccatttaagatt aaaggacaac cagaaagtgg aattctaagg acaggaactt ttagagagga tacagacgataccgaaagaa ataaagctca acgagaacct ttgacaagag cacgaagtga agaaatgggg aggatcgtaccaggactgcc ttcaggctgg gccaagtttc ttgacccaat cactggaacc tttcgttatt atcattcacccaccaacact gttcatatgt acccaccgga aatggctcct tcatctgcac ctccttccac ccctccaactcataaagcca agccacagat tcctgctgag cgggataggg aaccttccaa actgaagcgc tcctactcctccccagatat aacccaggct attcaagagg aagagaagag gaagccaaca gtaactccaa cagttaatcgggaaaacaag ccaacatgtt atcctaaagc tgagatctca aggctttctg cttctcagat tcggaacctcaatcctgttt ttggaggttc tggaccagct cttactggac ttcgtaactt aggaaatact tgttatatgaactcaatatt gcagtgccta tgtaacgctc cacatttggc tgattatttc aaccgaaact gttatcaggatgatattaac aggtcaaatt tgttggggca taaaggtgaa gtggcagaag aatttggtat aatcatgaaagccctgtgga caggacagta tagatatatc agtccaaagg actttaaaat caccattggg aagatcaatgaccagtttgc aggatacagt cagcaagatt cacaagaatt gcttctgttc ctaatggatg gtctccatgaagatctaaat aaagctgata atcggaagag atataaagaa gaaaataatg atcatctcga tgactttaaagctgcagaac atgcctggca gaaacacaag cagctcaatg agtctattat tgttgcactt tttcagggtcaattcaaatc tacagtacag tgcctcacat gtcacaaaaa gtctaggaca tttgaggcct tcatgtatttgtctctacca ctagcatcca caagtaaatg tacattacag gattgcctta gattattttc caaagaagaaaaactcacag ataacaacag attttactgc agtcattgca gagctcgacg ggattctcta aaaaagatagaaatctggaa gttaccacct gtgcttttag tgcatctgaa acgtttttcc tacgatggca ggtggaaacaaaaattacag acatctgtgg acttcccgtt agaaaatctt gacttgtcac agtatgttat tggtccaaagaacaatttga agaaatataa tttgttttct gtttcaaatc actacggtgg gctggatgga ggccactacacagcctattg taaaaatgca gcaagacaac ggtggtttaa gtttgatgat catgaagttt ctgatatctccgtttcttct gtgaaatctt cagcagctta tatcctcttt tatacttcat tgggaccacg agtaactgatgtagccacat aa。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

在本发明中，我们首次提出，敲低USP8可显著抑制胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，降低在细胞黏附、肿瘤侵袭和转移中起着重要作用的MMP9活性，提示USP8在胆管癌的生长和转移能力中起致癌基因的作用。为胆管癌药物研制以及胆管癌预防、治疗和预后提供了新的可能性。

附图说明

图1显示敲除USP8抑制胆管癌细胞生长情况。将QBC939和RBE转染siRNA- usp8下调其表达，以siRNA阴性作为阴性对照组(si-NC)。A:采用RT-PCR检测转染sirna 24h后QBC939和RBE细胞中USP8 mRNA的相对表达情况。B. Western blot检测USP8蛋白表达情况。C和D:采用CCK8法检测USP8沉默时QBC939 (C)和RBE (D)细胞增殖情况。E:采用菌落形成法检测胆管癌细胞克隆能力。n = 3, * * * P < 0.05, P < 0.01。

图2显示沉默USP8降低了胆管癌细胞的迁移和侵袭能力。A和B:转染24小时后，进行Transwell检测，评估QBC939和RBE细胞的迁移(A)和侵袭(B)。C:敲除USP8后，用明胶酶谱法检测MMP9活性。n = 3 * P < 0.05。

图3显示沉默USP8促进胆管癌细胞凋亡。A:采用流式细胞术检测转染siRNAs的QBC939和RBE细胞的凋亡情况。B:转染sirna 48h后，凋亡相关蛋白Bcl-2表达。采用Westernblot检测Bax、裂解的Caspase 3和裂解的Caspase 9。n = 3 * P < 0.05。

图4显示下调USP8抑制胆管癌细胞Akt信号通路的激活。转染48 h后，Westernblot检测Akt信号通路关键组分的表达情况。B、C:定量分析QBC939 (B)和RBE细胞(C)Western blot检测结果，n=3， *P<0.05。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1

细胞培养和转染

采用中国科学院(上海)型培养细胞库获得的人胆管癌细胞株QBC939和RBE，在37℃、5%CO₂条件下，以添加10%胎牛血清(Hyclone, Logan, UT, USA)和青霉素/链霉素的1640培养基(Hyclone, Logan, UT, USA)培养。进入对数生长期后，PBS洗涤细胞3次，胰酶消化细胞，植入6孔板。当6孔板细胞密度达到50-60%融合时，使用Lipofectamine 2000转染sirna(Invitrogen, USA)。由OriGene(中国北京)合成了靶向USP8 (si-USP8)的siRNA，并以siRNA阴性对照(OriGene)作为阴性对照(si-NC)。

qRT-PCR分析

转染sirna 24小时后，用超纯性RNA试剂盒(CWBIO，北京，中国)从细胞中提取总RNA，用HiFiScript cDNA合成试剂盒(CWBIO)逆转录成cDNA。采用FastSYBR合剂(CWBIO)进行qRT-PCR检测USP8的表达。反应如下: 95°C 5分钟, 95°C 30秒,40个循环,60°C 45 s, 72°C 30分钟。2^-ΔΔCt方法被用来计算USP8的相对表达量。在这项研究中使用的引物由GENEWIZ(中国苏州)合成，名称为β-actin，引物序列为正向：5’-CCCGAGCCGTGTTTCCT-3’,反向:5‘-GTCCCAGTTGGTGACGATGC-3’。

免疫印迹分析

转染sirna 48 h后，用RIPA裂解液(CWBIO)裂解细胞提取蛋白，用BCA法(CWBIO)测定蛋白浓度。分离出20μg蛋白质用10% SDS PAGE凝胶和electrotransferred聚偏二氟乙烯膜(PVDF)进行WB检测。5%脱脂牛奶室温封膜1 h，一抗孵育(1:1000;) 4℃过夜。用TBST冲洗后，然后用hrp偶联的二抗(1:5000)室温孵育1h;使用ECL试剂盒(Millipore)对蛋白条带进行可视化，并使用Image Lab软件(Bio-Rad，美国)对其进行定量。

CCK8实验

采用CCK8实验方法检测USP8敲除后的细胞增殖情况。转染sirna 24小时后，胰蛋白酶消化细胞，以3000个细胞/孔的密度接种于96孔板中。分别在0、24、48、72 h测定细胞活力。在检测之前,10μl CCK8试剂(Solarbio,北京)添加到每个孔,并在37°C细胞孵化1 h。在450nm的吸光度处检测。

集落形成实验

采用集落形成实验对USP8沉默后的QBC939和RBE细胞克隆能力进行了评价。转染24 h后，细胞被消化并植入35mm培养皿中(300个细胞/培养皿)。细胞在37℃条件下，用1640培养基培养1-2周后，4%聚甲醛固定30 min, 0.1%结晶紫染色30 min，计数并捕获可见集落。

Transwell实验

Transwell (8μm孔隙大小)实验，细胞迁移和侵袭性试验采用微孔法，侵袭性试验采用包被基质凝胶的小室。细胞(1×105)转染24 h后种植到上层小室，下层小室加入500μl含有10%血清的培养液，37℃孵育24 h后，用4%多聚甲醛固定侵袭细胞30 min, 0.1%结晶紫染色20 min。

明胶酶谱分析

将转染sirna的胆管癌细胞QBC939和RBE在37℃条件下，用无血清培养基中培养24h，取上清液，用含0.5mg/ml明胶的10% SDS-PAGE凝胶分离。电泳后洗脱凝胶，室温下用0.25% 考马斯亮蓝R250染色4 h。凝胶脱色后用图像扫描仪(Ahmad Sohm, USA)扫描，用IMAGISOANTTL V2003软件分析。

流式细胞术

转染24 h后，在无血清培养基中培养24 h, PBS洗涤细胞，4℃离心。用结合缓冲液重悬细胞，调整细胞密度至1-5×106 /ml。100μl细胞悬液用5μl Annexin V/FITC (Beyotime,北京)和 10 μl PI (Beyotime)室温避光染色5分钟。流式细胞分析仪进行检测细胞凋亡,用Flowjo软件分析结果。

统计分析

数据以三次独立实验的平均值±标准差表示，并使用GraphPad软件7.0 (GraphPadInc.，美国)进行分析。采用t检验或单因素方差分析比较各组间的差异。P <0.05为差异有统计学意义。

结果

沉默USP8可抑制胆管癌细胞的增殖

为探讨USP8在胆管癌进展中的生物学功能，将以USP8为靶点的siRNA转染QBC939和QBE细胞(si-USP8)，以siRNA-control为阴性对照(si-NC)。如图1A和图B所示，转染si-USP8的细胞在mRNA和蛋白水平上的表达均明显低于对照组细胞。采用CCK8法检测si-USP8对细胞增殖的影响。结果表明，与对照组相比，沉默USP8可显著抑制QBC939细胞的增殖(图1C)。si-USP8对RBE细胞增殖也有类似的抑制作用(图1D)。与CCK8结果一致，菌落形成结果也明显减少。如图1E所示，USP8的下调导致QBC939和QBE细胞中形成的菌落数量显著减少，说明下调USP8抑制了胆管癌细胞的克隆能力。

下调USP8可抑制胆管癌细胞的迁移和侵袭能力

为了初步了解USP8对胆管癌转移的影响，我们进行了transwell实验。如图2A所示，si-USP8显著减少了迁移的QBC939和QBE细胞的数量。此外，侵袭实验表明，USP8表达的降低抑制了QBC939和QBE细胞的侵袭能力(图2B)。

MMP9在细胞黏附、肿瘤侵袭和转移中起着重要作用。因此，我们检测了USP8沉默后胆管癌细胞中MMP9的活性。明胶酶谱分析显示，敲除USP8可显著抑制QBC939和QBE细胞的MMP9活性(图2C)。总之，下调USP8可能通过降低MMP9活性抑制胆管癌细胞的迁移和侵袭。

沉默USP8可促进胆管癌细胞的凋亡

为了研究下调USP8是否会影响胆管癌细胞的凋亡，采用流式细胞术进行检测。如图3A所示，与对照组相比，转染si-USP8的QBC939和QBE细胞凋亡率明显升高。western blot进一步检测凋亡相关蛋白的表达，了解诱导凋亡的机制。如图3B所示，si-USP8显著下调QBC939和QBE细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，而与对照组相比，下调USP8可上调促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase 3和cleaved-Caspase 9的表达。总之，这些结果表明USP8可能通过调控Bcl-2/Bax轴和Caspase级联反应调控胆管癌细胞的凋亡。

下调USP8抑制胆管癌细胞Akt信号通路的激活

为了确定UPS8下调是否影响Akt信号通路，western blot分析Akt信号通路在细胞生理功能和肿瘤进展中发挥重要作用。如图4A-C所示，UPS8的下调导致QBC939和RBE细胞中Akt(p-Akt)磷酸化水平显著降低，而总Akt的表达未受影响。因此，在胆管癌细胞中，USP8的缺失显著下调了下游蛋白Cyclin D1和p70S6k的表达(图4 A-C)。因此，这些数据表明Akt信号通路可能参与了USP8在胆管癌进展中的作用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> 一种胆管癌检测、治疗和预后靶点及应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcctgctg tggcttcagt tcctaaagaa ctctacctca gttcttcact aaaagacctt 60

aataagaaga cagaagttaa accagagaaa ataagcacta agagttatgt gcacagtgcc 120

ctgaagatct ttaagacagc agaagaatgc agattagatc gtgatgagga aagggcctat 180

gtactatata tgaaatacgt gactgtttat aatcttatca aaaaaagacc tgatttcaag 240

caacagcagg attatttcca ttcaatactt ggacctggaa acatcaaaaa agctgtcgaa 300

gaagctgaaa gactctctga aagccttaaa ttaagatatg aagaagctga agtccggaaa 360

aaacttgagg aaaaagacag gcaggaggaa gcacagcggc tacaacaaaa aaggcaggaa 420

acaggaagag aggatggtgg cacattggct aaaggctctt tggagaatgt tttggattcc 480

aaagacaaaa cccaaaagag caatggtgaa aagaatgaaa aatgtgagac caaagagaaa 540

ggagcaatca cagcaaagga actatacaca atgatgacgg ataaaaacat cagcttgatt 600

ataatggatg ctcgaagaat gcaggattat caggattcct gtattttaca ttctctcagt 660

gttcctgaag aagccatcag tccaggagtc actgctagtt ggattgaagc acacctgcca 720

gatgattcta aagacacatg gaagaagagg gggaatgtgg agtatgtggt acttcttgac 780

tggtttagtt ctgccaaaga tttacagatt ggaacaactc tccggagtct gaaagatgca 840

cttttcaagt gggaaagtaa aactgtcctg cgcaatgagc ctttggtttt agagggaggc 900

tatgaaaact ggctcctttg ttatccccag tatacaacaa atgctaaggt cactccaccc 960

ccacgacgcc agaatgaaga ggtgtctatc tcattggatt ttacttatcc ctcattggaa 1020

gaatcaattc cttctaaacc tgctgcccag acgccacctg catctataga agtagatgaa 1080

aatatagaat tgataagtgg tcaaaatgag agaatgggac cactgaatat atcaactcca 1140

gttgaaccag ttgctgcttc taaatctgat gtttcaccca taattcagcc agtgcctagt 1200

ataaagaatg ttccacagat tgatcgtact aaaaaaccag cagtcaaatt gcctgaagag 1260

catagaataa aatctgaaag tacaaaccat gagcaacaat ctcctcagag tggaaaagtt 1320

attcctgatc gttccaccaa gccagtagtt ttttctccaa ctctcatgtt aacagatgaa 1380

gaaaaggctc gtattcatgc agaaactgct cttctaatgg aaaaaaacaa acaagaaaaa 1440

gaacttcggg aaaggcagca agaggaacag aaagagaaac tgaggaagga agaacaagaa 1500

caaaaagcca aaaagaaaca agaagctgaa gaaaatgaaa ttacagagaa gcaacaaaaa 1560

gcaaaagaag aaatggagaa gaaagaaagt gaacaggcca agaaagaaga taaagaaacc 1620

tcagcaaaga ggggcaaaga aataacagga gtaaaaagac aaagtaaaag tgaacatgaa 1680

acttctgatg ccaagaaatc tgtagaagat agggggaaaa ggtgtccaac cccagaaata 1740

cagaaaaagt caacaggaga tgtgccccat acatctgtga caggggattc aggttcaggc 1800

aagccattta agattaaagg acaaccagaa agtggaattc taaggacagg aacttttaga 1860

gaggatacag acgataccga aagaaataaa gctcaacgag aacctttgac aagagcacga 1920

agtgaagaaa tggggaggat cgtaccagga ctgccttcag gctgggccaa gtttcttgac 1980

ccaatcactg gaacctttcg ttattatcat tcacccacca acactgttca tatgtaccca 2040

ccggaaatgg ctccttcatc tgcacctcct tccacccctc caactcataa agccaagcca 2100

cagattcctg ctgagcggga tagggaacct tccaaactga agcgctccta ctcctcccca 2160

gatataaccc aggctattca agaggaagag aagaggaagc caacagtaac tccaacagtt 2220

aatcgggaaa acaagccaac atgttatcct aaagctgaga tctcaaggct ttctgcttct 2280

cagattcgga acctcaatcc tgtttttgga ggttctggac cagctcttac tggacttcgt 2340

aacttaggaa atacttgtta tatgaactca atattgcagt gcctatgtaa cgctccacat 2400

ttggctgatt atttcaaccg aaactgttat caggatgata ttaacaggtc aaatttgttg 2460

gggcataaag gtgaagtggc agaagaattt ggtataatca tgaaagccct gtggacagga 2520

cagtatagat atatcagtcc aaaggacttt aaaatcacca ttgggaagat caatgaccag 2580

tttgcaggat acagtcagca agattcacaa gaattgcttc tgttcctaat ggatggtctc 2640

catgaagatc taaataaagc tgataatcgg aagagatata aagaagaaaa taatgatcat 2700

ctcgatgact ttaaagctgc agaacatgcc tggcagaaac acaagcagct caatgagtct 2760

attattgttg cactttttca gggtcaattc aaatctacag tacagtgcct cacatgtcac 2820

aaaaagtcta ggacatttga ggccttcatg tatttgtctc taccactagc atccacaagt 2880

aaatgtacat tacaggattg ccttagatta ttttccaaag aagaaaaact cacagataac 2940

aacagatttt actgcagtca ttgcagagct cgacgggatt ctctaaaaaa gatagaaatc 3000

tggaagttac cacctgtgct tttagtgcat ctgaaacgtt tttcctacga tggcaggtgg 3060

aaacaaaaat tacagacatc tgtggacttc ccgttagaaa atcttgactt gtcacagtat 3120

gttattggtc caaagaacaa tttgaagaaa tataatttgt tttctgtttc aaatcactac 3180

ggtgggctgg atggaggcca ctacacagcc tattgtaaaa atgcagcaag acaacggtgg 3240

tttaagtttg atgatcatga agtttctgat atctccgttt cttctgtgaa atcttcagca 3300

gcttatatcc tcttttatac ttcattggga ccacgagtaa ctgatgtagc cacataa 3357

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccacagattg atcgtacta 19

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccgagccgt gtttcctgtc ccagttggtg acgatgc 37

Claims (7)

1.一种胆管癌细胞药物靶点，其特征在于，所述药物靶点为泛素特异性蛋白酶8，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的胆管癌细胞药物靶点，其特征在于，所述特异性蛋白酶8能被siRNA抑制，所述siRNA序列为5’-CCACAGATTGATCGTACTA-3’ 。

3.根据权利要求2所述的胆管癌细胞药物靶点，其特征在于，所述siRNA抑制特异性蛋白酶8的过程中使用的扩增引物序列为：

正向：5’- CTGCTGTGGCTTCAGTTCCT-3’，

反向：5’-GGAAATAATCCTGCTGTTGCTTGA-3’。

4.泛素特异性蛋白酶8的抑制剂在制备治疗胆管癌的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂为干扰RNA，序列为5’-CCACAGATTGATCGTACTA-3’。

5.泛素特异性蛋白酶8的抑制剂在制备抑制胆管癌细胞株QBC939和RBE的增殖、迁移和/或侵袭的试剂中的应用，其特征在于，所述抑制剂为干扰RNA，序列为5’-CCACAGATTGATCGTACTA-3’。

6.用于检测个体泛素特异性蛋白酶8分泌量的试剂在制备诊断试剂或试剂盒中的用途,其特征在于,所述诊断试剂或试剂盒用于诊断待测个体是否患有胆管癌。

7.siRNA基因或蛋白或它们的增效剂在制备药物中的应用，其特征在于，所述药物用于防治胆管癌。

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