CN110655567A

CN110655567A - 食品蛋白的磷酸化方法及其磷酸化蛋白

Info

Publication number: CN110655567A
Application number: CN201911102097.6A
Authority: CN
Inventors: 李灿鹏; 赵宇婷
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2020-01-07
Anticipated expiration: 2039-11-12
Also published as: CN110655567B

Abstract

本申请公开了一种食品蛋白的磷酸化方法及其磷酸化蛋白，至少包括以下步骤：将含食品蛋白的溶液与含植酸的溶液混合后调pH值为3～7后定容，冷冻干燥所得溶液后在干燥加热条件下进行磷酸化反应，得到磷酸化蛋清蛋白。该方法利用来源广泛的蛋清蛋白作为原料，选择本身可作为食品添加剂或食品中常见成分——植酸作为磷酸化试剂，并采用干燥加热的方式，在完全不使用有机溶剂的条件下，制备磷酸化蛋清蛋白。避免有机溶剂的使用，简化后续纯化步骤，环境友好。

Description

食品蛋白的磷酸化方法及其磷酸化蛋白

技术领域

本申请涉及一种食品蛋白的磷酸化方法及其磷酸化蛋白，属于食品蛋白改性领域。

背景技术

为改善食品蛋白质的功能特性，通过磷酸化在食品蛋白中引入了大量带有负电荷的磷酸基团，增加了蛋白质分子间的静电斥力，使其在溶液中更易分散，从而增加了食品蛋白的溶解度；降低了乳化液的表面张力，增加乳化性和乳化稳定性；改变了溶液等电点，有效拓宽了其在食品中的应用范围。国内外的研究结果也表明磷酸化后的蛋白质在表面疏水性、乳化性、热稳定性、起泡性、凝胶形成性等性质都有明显改善，另外，磷酸基的导入能增加磷酸钙的可溶能力，有利于钙的吸收；酪蛋白磷酸肽还能起到免疫调节和抗脂肪氧化的作用。综上所述，磷酸化是改善食品蛋白功能特性的有效方法。

食品蛋白磷酸化现有主要方法为化学磷酸化法、酶法磷酸化法，化学磷酸化法存在反应剧烈易引起蛋白变性、副反应多、反应不易控制等缺点；酶法磷酸化效率不高、用于磷酸化的酶种类少，再加上湿热条件下蛋白的理化性质易发生改变。

因此，开发出一种简单、经济且适用的磷酸化的方法是食品蛋白质的磷酸化改性研究的一个课题。

发明内容

根据本申请的一个方面，提供了一种食品蛋白的磷酸化方法及其磷酸化蛋白，该方法用于解决现有化学磷酸化法存在的反应剧烈易引起蛋白变性、副反应多、反应不易控制、磷酸化试剂毒性大、易残留；酶法磷酸化方法磷酸化效率低、成本高；美拉德反应中蛋白质易褐变的技术问题。

本申请的一方面还提供了一种食品蛋白的磷酸化方法，至少包括以下步骤：将含食品蛋白的溶液与含植酸的溶液混合后调pH值为3～7后定容，冷冻干燥所得溶液后在干燥加热条件下进行磷酸化反应，得到磷酸化蛋清蛋白。通过将食品蛋白与植酸在干燥加热条件下进行磷酸化反应，反应柔和蛋白不变性、副反应少，产物纯度高，反应易控制，所用磷酸化试剂为植酸无毒可食用，即使残留也不影响正常食用。

磷酸化效率高，5天内即可完成磷酸化，原料反应设备无特殊要求，磷酸化成本低，蛋白质不易变性，无褐变情况发生。所得磷酸化蛋白的磷含量为0.64％～2.22％；热稳定温度在80～100℃以上；优选地，磷酸化食品蛋白的³¹P-NMR测定峰值范围为4.21～0.43ppm；优选地，对ABTS自由基的清除率为73.72％；优选地，对二价铁离子的螯合率为98.75％；优选地，超氧阴离子清除率为9.91％。溶液pH值还可以为3、4、5、6、7。

优选地，食品蛋白为蛋清蛋白或乳清蛋白。

优选地，还包括：对磷酸化蛋清蛋白依序进行透析和冷冻干燥的步骤。通过提纯能进一步提高产物的纯度。

优选地，食品蛋白为蛋清蛋白。

优选地，蛋清蛋白的获取至少包括以下步骤：搅碎鸡蛋清后用1M HCl溶液调节pH为5.5，离心后取上清液，在上清液中加入上清液等体积的水后，透析2天经冷冻干燥得到蛋清蛋白。采用该步骤获得蛋白蛋清，操作简单，提取效率高。

优选地，干燥加热温度为50～100℃；更优选地，干燥加热温度为 90～100℃。干燥加热温度还可以为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃。

优选地，磷酸化反应时间为1～5天。优选地，磷酸化反应时间为4～5天。磷酸化反应时间还可以为1、2、3、4、5天。

优选地，具体为：

取100mg蛋清蛋白溶解于超纯水中，配置成质量分数1％的溶液，搅拌均匀，并在此溶液中加入浓度为0.57mol/l的植酸溶液2 60μl，调节溶液 pH为3.0～7.0后定容，在-50℃下冷冻干燥处理24小时后得到混合溶液；

混合溶液在50～100℃的干燥加热条件下进行磷酸化反应1～5天，所得反应产物在超纯水中透析2天，再将透析液在-50℃下冷冻干燥24小时，得到磷酸化蛋清蛋白。

通过对比例可知，上述参数范围外的磷酸化效果较差，所得磷酸化蛋白各项性能较差。

优选地，磷酸化食品蛋白的磷酸化位点为磷酸丝氨酸。

本申请的另一方面还提供了一种上述方法制备得到的磷酸化食品蛋白，磷酸化食品蛋白的磷含量为0.64％～2.22％；热稳定温度在80～100℃以上；优选地，磷酸化食品蛋白的³¹P-NMR测定峰值范围为4.21～0.43ppm；优选地，对ABTS自由基的清除率为73.72％；优选地，对二价铁离子的螯合率为98.75％；优选地，超氧阴离子清除率为9.91％。

优选地，磷酸化食品蛋白的磷酸化位点为磷酸丝氨酸。

本申请能产生的有益效果包括：

(1)本发明提供的食品蛋白的磷酸化方法，利用来源广泛的蛋清蛋白作为原料，选择本身可作为食品添加剂或食品中常见成分--植酸作为磷酸化试剂，并采用干燥加热的方式，在完全不使用有机溶剂的条件下，制备磷酸化蛋清蛋白。避免有机溶剂的使用，简化后续纯化步骤，环境友好。

(2)本发明提供的食品蛋白的磷酸化方法，采用植酸作为磷酸化试剂，能够在较为温和的条件下完成，适应酸碱环境，而且副反应少，磷酸化效率高，蛋白质变性程度小；工艺流程简单、生产成本低、容易实现工业化生产，整个方法对环境无污染。

(3)本发明提供的食品蛋白的磷酸化方法，反应后的植酸可以通过透析除去，磷酸化的产物安全且可避免环境污染；并且植酸本身就是对人体有益的功能性成分，产品安全性较高。

(4)本发明所制备的磷酸化蛋白，稳定性高，不易变性，实现了改善食品蛋白理化特性和功能特性目的，其在表面疏水性、乳化性、热稳定性、被消化性、抗氧化性等性质都有明显改善，可有效扩大食品蛋白质在食品工业中的应用。磷酸化食品蛋白的磷含量为0.64％～2.22％；热稳定温度在80～100℃以上，磷酸化食品蛋白的³¹P-NMR测定峰值范围为4.21～0.43ppm，对ABTS自由基的清除率为73.72％，对二价铁离子的螯合率为98.75％，超氧阴离子清除率为9.91％。

附图说明

图1为本发明实施例20中磷含量测定结果示意图，其中图(A)对比了 pH3.0～7.0下时样品2～6的磷含量；图(B)加热天数1～5天下时样品7～11 的磷含量；图(C)对比了加热温度50～100℃下样品12～17的磷含量；

图2为本发明实施例21中溶解性测定结果示意图，其中，图(A)对比了N-EWP与样品2～6的溶解性；图(B)对比了N-EWP与样品7～11的溶解性；图(C)对比了N-EWP与样品12～17的溶解性；

图3为本发明实施例22中热稳定测定结果示意图，其中，A图为热稳定处理1～6和对照处理结果照片；B图为分别对热稳定处理1～6和对照处理所得物质的上清液，再次梯度加热后，测定各物质中可溶性蛋白质含量结果曲线图；

图4为本发明实施例23中样品9(PA-EWP)、对比样品1(EWP)、对比样品2(DH-EWP)的表面疏水性比较结果图；

图5为本发明实施例24中样品2～17(PA-EWP)、对比样品3～4和N- EWP的Native-PAGE测定结果图，其中A)图为样品2～6和N-EWP的电泳结果图；B)图为样品7～11和N-EWP的电泳结果图；C)图为样品12～17、对比样品3～4和N-EWP的电泳结果图；

图6为本发明实施例25中样品2～17和对比样品1的(A)的SDS-PAGE 结果示意图，其中；A)图为样品2～6和N-EWP的SDS-PAGE结果图；B) 图为样品7～11和N-EWP的SDS-PAGE结果图；C)图为样品12～17和N- EWP的SDS-PAGE结果图；

图7为本发明实施例26中样品9的³¹P-NMR结果图；

图8为本发明实施例27中取样品9(PA-EWP)、对比样品1 (EWP)、对比样品2(DH-EWP)乳化后紫外吸光度值性结果图；

图9为本发明实施例28中取样品9(PA-EWP)、对比样品1 (EWP)、对比样品2(DH-EWP)进行被消化性测定的结果图；

图10为本发明实施例31中取样品9(PA-EWP)、N-EWP、对比样品2(DH-EWP)的抗氧化性结果图，其中A)图为自由基清除率结果图； (B)图为螯合率结果图；(C)图为Fe²⁺螯合能力结果图；(D)图为超氧阴离子清除能力结果图。

本文英文缩略语：

EWP Egg white protein 蛋清蛋白；

DH-EWP Dry-Heating Egg white protein 干热卵清蛋白；

PA-EWP Phytic acid Egg white protein 植酸卵清蛋白；

ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

实施例

如无特别说明，本申请实施例中的实验仪器、原料和试剂均通过商业途径购买，不经任何特殊处理直接使用。

实施例1 蛋清蛋白的制备

用组织匀浆机搅碎鸡蛋蛋清后，加入1M HCl溶液调节溶液pH为 5.5，在离心机上3000rpm、4℃离心10min后，取离心上清液加入等体积的水，室温常压下透析2天后，经冷冻干燥(-50℃下冷冻24h)后获得蛋清蛋白样品1。

实施例2～19：磷酸化蛋清蛋白样品1～19的制备

取100mg蛋清蛋白样品1溶解于超纯水中，配置为质量分数1％的溶液，搅拌均匀，并在此溶液中加入0.47～0.67mol/l的植酸溶液2 60μl，调节pH为3.0～7.0后定容，冷冻干燥(-50℃下冷冻24h)得到混合溶液；

混合溶液在50～100℃的在干燥加热条件下进行磷酸化反应1～5天，所得反应产物在超纯水中室温常压下透析2天，再将透析液冷冻干燥(- 50℃下冷冻24h)得到磷酸化蛋清蛋白，记为样品2～19。

所制备样品2～19的定容溶液pH值、干燥加热温度和磷酸化反应时间如表1所示。

表1

对比例1

将实施例1中所得蛋清蛋白样品1，未进行任何处理，作为对比样品1 (EWP)。

对比例2

与实施例2的区别在于不在蛋清蛋白溶液加入植酸，所得产物记为对比样品2(DH-EWP)。

对比例3

与实施例2的全部在于，加热温度为37℃，得到对比样品3。

对比例4

与实施例2的全部在于，加热温度为室温，得到对比样品4。

实施例20 磷含量测定

采用磷含量测定法测定样品2～17、对比样品1～2的磷含量，样品2～17 磷含量结果参见图1，从图1A)中可见，样品2～7的磷含量分别为1.89％、 1.48％、1.19％、0.99％、0.79％。

从图1B)中可见，样品8～13的磷含量分别为0.64％、1.08％、1.18％、 1.38％、1.49％。

图1C)中可见，样品13～17的磷含量分别为1.12％、1.41％、1.69％、 1.72％、2.01％、2.22％。

对比样品1～2的磷含量分别为0.06％、0.06％。

结果分析：

样品2～17的磷含量高于对比样品1天然蛋清蛋白的磷含量，采用本申请提供丰富，能有效改善天然食品蛋白的磷含量，增强其功能特性。

实施例21 溶解性测定

采用Lowry蛋白质浓度测定法测定样品2～17、N-EWP的溶解性，样品2～17溶解性结果参见图2，从图2A)中可见，样品2～7的溶解性分别为97.69％、94.85％、93.74％、93.06％、89.85％。

从2B)中可见，样品8～13的溶解性分别为97.63％、96.13％、94.65％、 86.78％、83.63％。

从2C)中可见，样品8～13的溶解性分别为98.36％、95.09％、96.55％、 92.71％、84.65％。

对比样品1～2的溶解性分别为100％、97.89％。

结果分析：

样品2～17的溶解性略低于对比样品1天然蛋清蛋白的溶解性，说明采用本申请方法制备得到的蛋白质磷酸化后，能有效增强天然食品蛋白的功能特性。

实施例22 热稳定性测定

本实施例中对所选样品进行热稳定性测定，热稳定性测定包括以下步骤：

取磷酸化蛋清蛋白样品溶于50mM pH＝7.0Tris-HCl后，配制浓度为 1mg/ml的样品溶液，混匀，4℃、3000rpm离心20min，取上清液每份4ml，在50～100℃的条件下水浴保温10min，冷却后拍照。

各热稳定性处理条件及所用样品参见下表：

表2

热稳定性处理编号	保温温度(℃)	所用样品编号
			1	50℃	12
2	60℃	13
			3	70℃	14
4	80℃	15
			5	90℃	16
6	100℃	17

以N-EWP为样品按上述方法分别在50、60、70、80、90、100℃下进行热处理，并对结果进行拍照结果利于图3A中。

结果分析：

从图3A中可见对比例3中N-EWP组在60℃时出现浑浊，80℃时明显出现沉淀，随着温度的升高沉淀量明显增加；

热稳定性处理1～6，均在80℃时明显出现沉淀，随着温度的升高沉淀量明显增加；处理4PA-EWP(80℃)在90℃时明显出现沉淀，随着温度的升高沉淀量增加；处理5PA-EWP(90℃)在100℃时明显出现沉淀，但都没有N-EWP增加的量多，处理6PA-EWP(100℃)在50～100℃均未出现沉淀，说明磷酸化后相对未磷酸化的EWP，蛋白的热稳定性得到改善；

将经热稳定性处理1～6处理后的样品，以及未经处理的N-EWP在 4℃、5000rpm下离心30min，对各样品上清液分别依序加热至50℃、60℃、 70℃、80℃、90℃、100℃后，采用Lowry法分别测上清液中蛋白质的含量，所得结果如图3B所示。

从图3B中可以看出，N-EWP和热稳定处理1～6，随着温度的升高，溶液中可溶性蛋白质含量变化比较明显，PA-EWP与N-EWP相比，在较高温度时可溶性蛋白含量有所提高，进一步说明EWP通过干燥加热磷酸化后，其热稳定性得到了一定的提高。

实施例23：表面疏水性测定

取磷酸化蛋清蛋白样品9(PA-EWP)、对比样品1(EWP)、对比样品2(DH-EWP)分别进行表面疏水性测定，包括以下步骤：

样品溶于20mM pH＝7.4磷酸缓冲液(含0.1M EDTA)配制浓度为 1mg/ml的样品溶液，用Lowry法测定蛋白液浓度，把该溶液稀释成0.05 mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.3mg/ml，再分别取2ml稀释液加100μl 0.3mg/ml的ANS溶液，在25℃水浴中加热1h，通过在荧光光谱仪上测定其荧光强度(激发波长为370nm，发射波长为470nm)得到样品9、对比样品1、对比样品2的表面疏水性，结果参见图4。

结果分析：

以荧光强度为纵坐标，蛋白浓度为横坐标绘制曲线，从图4中可见，干燥加热提高了EWP的表面疏水性，干燥加热磷酸化进一步增强EWP的表面疏水性，说明采用本申请的方法进行磷酸化使EWP的结构展开，使包埋在分子内部的疏水基团外露，导致表面疏水性增大。

实施例24 Native-PAGE测定

取样品2～6(PA-EWP制备中pH不同)、样品7～11(PA-EWP制备中加热天数不同)、样品12～17(PA-EWP制备中加热温度不同)、对比样品3～4、N-EWP作为处理对象，分别进行以下步骤：

首先根据文献(Laemmli,U.K.Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4.Nature 1970,227,680-685.)配制一系列电泳所需溶液，取电泳溶液25ml,再制备浓度为10％的分离胶和4％浓缩胶，再分别取蛋白样品配制浓度为2mg/ml的蛋白液，使用2X Loading Buffer样品液与蛋白液体积比为1：1混匀上样，进样量为20μl，通过电泳仪(浓缩胶电压为60V，电流15mA；分离胶电压为100V，电流为30mA) 进行跑胶。

结果分析：

结果列于图5中，从Native-PAGE电泳图可以清晰地看出PA-EWP迁移速率随着pH7.0向pH3.0减小而加快(图5A)，PA-EWP迁移速率随着加热天数的增加而加快(图5B)，随着磷酸化加热温度的升高而增加 (图5C)，说明EWP已经成功地引入了带负电荷的磷酸根，同时在图5C 中可见，磷酸化加热温度在室温和37℃时，产物的性质与天然蛋白差不大，说明该温度下蛋白磷酸化效果较差。

实施例25 SDS-PAGE测定

取磷酸化蛋清蛋白样品2～17(PA-EWP)、对比样品1(EWP)按以下步骤SDS-PAGE测定：

首先根据文献(Laemmli,U.K.Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4.Nature 1970,227,680-685.)配制一系列电泳所需溶液，取电泳溶液25ml,再制备浓度为10％的分离胶和4％浓缩胶，再分别取蛋白样品配制浓度为2mg/ml的蛋白液，其中2X Loading Buffer样品液中配制含有/不含有β-Me溶液两份，分别与蛋白液体积比为1： 1混匀，并在沸水浴上加热3～5min，冷却后上样，进样量为20μl，通过电泳仪(浓缩胶电压为60V，电流15mA；分离胶电压为100V，电流为30mA) 进行跑胶。

结果分析：

结果列于图6中，从图6A可见，不同pH下制得的样品2～6与N-EWP 相比，迁移色带几乎在同一水平线上，说明磷酸化没有使OVA分解；参见图6B样品7～11为不同加热温度下所得PA-EWP和N-EWP的迁移色带几乎在同一水平线上，样品16(PA-EWP(90℃))发生了部分聚合而未被分解，而样品17(PA-EWP(100℃))发生了分解，说明在加热温度90℃下进行蛋白质磷酸化，效果较好。这些进一步说明PA-EWP在Native-PAGE 电泳图中的迁移速率加快是由引入的磷酸根负电荷引起的。

实施例26 ³¹P-NMR测定

取样品9(PA-EWP)按以下步骤进行³¹P-NMR测定：

取25mg样品9溶于pH＝8.0(用1M NaOD调节)的D2O溶液500μl中，使用600-NMR测定³¹P，所得³¹P-NMR如图7所示。

结果分析：

样品9的峰值范围为4.21～0.43ppm，在pH 8.0下的化学位移接近 3.6～4.6ppm代表磷酸丝氨酸。化学位移出现在4.21ppm附近，说明该物质为磷酸丝氨酸的磷酸酯。

实施例27 乳化性测定

取样品9(PA-EWP)、对比样品1(EWP)、对比样品2(DH- EWP)按以下步骤进行处理：

将样品溶于20mM pH＝7.4磷酸缓冲液中配制浓度为1mg/ml的样品溶液，取30ml样品液加入10ml食用调和油，在FA25型实验室高剪切分散乳化机上，转速为13000rpm，冰水浴中搅拌1min，分别在上机0、1、 2、3、4、5、10、20、40(min)时，从试管底部吸取100μl乳化液注入到3ml 0.1％的SDS溶液中混匀，在紫外分光仪上波长为500nm时测定吸光度值(见图8)；

结果分析：

从图8中可以看出，磷酸化能显著改善蛋清蛋白的乳化性，在相同处理条件下，样品9乳化后，被消化率最高。

实施例28 被消化性测定

分别取样品9(PA-EWP)、对比样品1(EWP)、对比样品2(DH- EWP)分别进行以下步骤：

取5mg样品溶于50mM pH＝7.0Tris-HCl配制浓度为1mg/ml的样品溶液，取10mg的胰凝乳蛋白酶溶于50mM pH＝7.0Tris-HCl配制浓度为 10mg/ml的溶液，在37℃下进行酶解，分别在酶解处理0、2、4、6、8、 10、20、40(min)和2h时移取2ml酶解液加到含有2ml 10％TCA的溶液中，立即混匀静止，然后在4℃、5000rpm离心30min，经采用Lowry法测定上清液中蛋白质的含量，绘制被消化性比较图(见图9)；

结果分析：

从图9中可以看出，本申请提供方法制得样品9被消化性明显优于N- EWP和DH-EWP，DH-EWP的被消化性优于N-EWP，这可能是因为EWP 在干燥加热磷酸化和干燥加热的过程中结构展开，暴露出更多的酶切位点，有利于酶的消化，而干燥加热磷酸化使EWP结构更加疏散，故其被消化性明显高于N-EWP和DH-EWP；磷酸化后的蛋白质被消化性高，被人体吸收利用的可能性越大，蛋白质利用率越高，其营养价值也越高。

实施例29 抗氧化性测定

分别取样品9(PA-EWP)、N-EWP、对比样品2(DH-EWP)按以下步骤进行抗氧化性测定：

(1)配制7mM ABTS溶液：称取38.41mg ABTS溶解在5ml超纯水中；

(2)配制2.45mM过硫酸钾：称取6.61mg过硫酸钾溶解在5ml超纯水中；

(3)将上述两溶液混匀，避光条件下放置24h(让其充分氧化)。使用时用100mM pH＝7.40的PBS溶液按1:70稀释使用(现配现用)。

(4)取稀释好的ABTS溶液4ml，加入80μl用PBS溶解的N-EWP、 DH-EWP和PA-EWP后，配置得到浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0mg/ml 的蛋白溶液，混匀在37℃水浴放置10min；

(5)在紫外可见分光光度仪上测定734nm下的吸光度。平行测定3次，空白不加样品，以等量的磷酸缓冲液代替。

蛋白抗氧化率按下式计算：

抗氧化率＝(A-As)/A*100％，

其中，As代表样品的吸光度，A代表空白的吸光度。

结果分析：

从图10A中可以看出，N-EWP、DH-EWP和PA-EWP对ABTS自由基的清除率，随蛋白溶液浓度的增加而逐渐增加，在相同浓度下，PA-EWP 对ABTS自由基的清除能力显著高于N-EWP和DH-EWP。

在10mg/ml蛋白浓度时，N-EWP和DH-EWP对ABTS自由基的清除率分别为44.26％和55.48％，而PA-EWP对ABTS自由基的清除率达 73.72％，这表明干燥加热磷酸化显著提高了EWP对ABTS自由基的清除能力。

实施例30 对金属离子的螯合率测定

分别取样品9(PA-EWP)、N-EWP、对比样品2(DH-EWP)按以下步骤进行螯合率测定：

(1)配制0.1、0.2、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、5.0mg/ml的N-EWP、 DH-EWP和PA-EWP溶液，各取2ml蛋白溶液，加入0.1ml 1mM的 FeCl₂·4H₂O，混匀，室温下放置30min，加入0.2ml0.5mM的亚铁嗪；

(2)25℃下水浴中育温10min，在紫外可见分光光度仪上测定562nm 处的吸光度。

(3)各处理样平行测定3次，空白样以等量的去离子水代替样品，对照组不加亚铁嗪。

按下式计算螯合率：

其中，A空白为去离子水代替样品溶液进行相同操作后所得吸光度值， A样品为样品溶液的吸光度值，A对照为不加亚铁嗪时各样品溶液的吸光度值。

结果分析：

从图10B中可以看出，随着蛋白浓度的增加，N-EWP、DH-EWP和PA- EWP对二价铁离子的螯合能力逐渐增加，在相同浓度下，PA-EWP对二价铁离子的螯合能力显著高于N-EWP和DH-EWP。在蛋白液浓度为 5mg/ml时，N-EWP和DH-EWP对二价铁离子的螯合能力分别为6.0％和 10.23％，而PA-EWP对ABTS自由基的清除能力为98.75％，这表明干燥加热磷酸化显著提高了EWP对二价铁离子的螯合能力。

实施例31 对金属离子的螯合能力测定

分别取样品9(PA-EWP)、N-EWP、对比样品2(DH-EWP)按以下步骤进行螯合能力测定：

(1)配制浓度为0.1、1.0、2.0、3.0、5.0mg/ml的N-EWP、DH-EWP 和PA-EWP溶液，各取1ml样品蛋白溶液，加入200mM pH 6.60的PBS 缓冲液1ml，加入1％铁氰化钾溶液1ml，混匀，50℃恒温加热20min，加入10％TCA溶液1ml，混匀；

(2)25℃，5000rpm离心10min，取上清液1ml加入1ml去离子水，加入0.1％的三氯化铁溶液0.2ml混匀，室温下放置5min；

(3)在紫外可见分光光度仪上测定700nm处的吸光度，平行测定3次。

空白对照按上述步骤进行，以等量的去离子水代替样品。以吸光度值为纵坐标，溶液浓度为横坐标绘制折线图，所得结果见图10C。

结果分析：

从图10C中可以看出，随着蛋白溶液浓度的增加，N-EWP、DH-EWP 的吸光度变化不大，PA-EWP吸光度随溶液浓度急剧增加，在相同浓度下， PA-EWP对二价铁离子的螯合能力比N-EWP和DH-EWP显著提高。

在蛋白浓度5mg/ml时，N-EWP和DH-EWP对二价铁离子的螯合能力分别为0.056和0.061，而PA-EWP的吸光度为0.093，这表明干燥加热磷酸化显著提高了EWP的还原能力。

实施例31 超氧阴离子清除率测定

分别取样品9(PA-EWP)、N-EWP、对比样品2(DH-EWP)按以下步骤进行超氧阴离子清除率测定：

(1)用50mM pH 8.20Tris-HCl缓冲液配制N-EWP、DH-EWP和PA- EWP溶液，溶液浓度为1mg/ml；

(2)各取3ml各样品蛋白溶液，加入0.14ml 5mM的邻苯三酚(10 mM HCl配制，25℃育温)，混匀后，快速倒入比色皿中；

(3)在325nm处每隔30s测定一次吸光度，测到4min为止；

(4)空白样以等量的10mM HCl溶液代替邻苯三酚溶液，对照组以等量的去离子水代替样品。

绘制吸光度随时间变化的曲线方程，斜率即为样品对邻苯三酚的氧化速率和邻苯三酚的自氧化速率。所得结果如图10D所示。

结果分析：

从图10D中可以看出，随着蛋白浓度的增加，N-EWP、DH-EWP和PA- EWP对超氧阴离子都有一定的清除率，N-EWP的超氧阴离子清除率为 5.5％，N-EWP的超氧阴离子清除率为7.05％，PA-EWP的超氧阴离子清除率为9.91％。说明本发明提供的方法制得的磷酸化蛋白的超氧阴离子清除能力得到较大的提高。

在本说明书中所谈到的“一个实施例”、“另一个实施例”、“实施例”、“优选实施例”等，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点包括在本申请概括性描述的至少一个实施例中。在说明书中多个地方出现同种表述不是一定指的是同一个实施例。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。

尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

Claims

1.一种食品蛋白的磷酸化方法，其特征在于，至少包括以下步骤：将含食品蛋白的溶液与含植酸的溶液混合后调pH值为3～7后定容，冷冻干燥所得溶液后在干燥加热条件下进行磷酸化反应，得到磷酸化蛋清蛋白。

2.根据权利要求1所述的食品蛋白的磷酸化方法，其特征在于，所述食品蛋白为蛋清蛋白或乳清蛋白。

3.根据权利要求1所述的食品蛋白的磷酸化方法，其特征在于，还包括：对所述磷酸化蛋清蛋白依序进行透析和冷冻干燥的步骤。

4.根据权利要求1所述的食品蛋白的磷酸化方法，其特征在于，所述食品蛋白为蛋清蛋白；

优选地，所述蛋清蛋白的获取至少包括以下步骤：搅碎鸡蛋清后用1M HCl溶液调节pH为5.5，离心后取上清液，在所述上清液中加入所述上清液等体积的水后，透析2天经冷冻干燥得到所述蛋清蛋白。

5.根据权利要求1所述的食品蛋白的磷酸化方法，其特征在于，所述干燥加热温度为50～100℃；更优选地，所述干燥加热温度为90～100℃。

6.根据权利要求1所述的食品蛋白的磷酸化方法，其特征在于，所述磷酸化反应时间为1～5天。

7.根据权利要求6所述的食品蛋白的磷酸化方法，其特征在于，所述磷酸化反应时间为4～5天。

8.根据权利要求1所述的食品蛋白的磷酸化方法，其特征在于，具体为：

取100mg蛋清蛋白溶解于超纯水中，配置成质量分数1％的溶液，搅拌均匀，并在此溶液中加入浓度为0.47～0.67mol/l的植酸溶液2 60μl，调节溶液pH为3.0～7.0后定容，在-50℃下冷冻干燥处理24小时后得到混合溶液；

所述混合溶液在50～100℃的干燥加热条件下进行磷酸化反应1～5天，所得反应产物在超纯水中透析2天，再将透析液在-50℃下冷冻干燥24小时，得到磷酸化蛋清蛋白；

优选地，所述磷酸化食品蛋白的磷酸化位点为磷酸丝氨酸。

9.一种如权利要求1～8中任一项所述方法制备得到的磷酸化食品蛋白，其特征在于，所述磷酸化食品蛋白的磷含量为0.64％～2.22％；热稳定温度在80～100℃以上；

优选地，所述磷酸化食品蛋白的³¹P-NMR测定峰值范围为4.21～0.43ppm；

优选地，对ABTS自由基的清除率为73.72％；优选地，对二价铁离子的螯合率为98.75％；

优选地，超氧阴离子清除率为9.91％。

10.根据权利要求9所述的食品蛋白的磷酸化食品蛋白，其特征在于，所述磷酸化食品蛋白的磷酸化位点为磷酸丝氨酸。