CN102191304A

CN102191304A - 一种猪血浆抗氧化肽

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Publication number: CN102191304A
Application number: CN2011100716126A
Authority: CN
Inventors: 李景军; 任发政; 王金枝; 闫文杰; 胡向丽; 孙友珍; 俞明
Original assignee: LIANYUNGANG FURUN FOOD CO Ltd YURUN GROUP
Current assignee: LIANYUNGANG FURUN FOOD CO Ltd YURUN GROUP
Priority date: 2011-03-23
Filing date: 2011-03-23
Publication date: 2011-09-21

Abstract

本发明属于食品加工领域，公开了一种猪血浆抗氧化肽。它是通过如下方法制得的：(1)猪血浆白蛋白水解物的制备；(2)猪血浆蛋白抗氧化肽段的膜分离：将步骤(1)所得上清液通过分子量为3kDa的平板膜，过滤过程中用高纯氮加压，压力为0.03-0.04MPa，并用磁力搅拌器连续低速搅拌，分离得到分子量小于3kDa的肽段即为所述的猪血浆抗氧化肽A5。本发明猪血浆抗氧化肽A5较之其他分子量段的水解产物具有最强的还原能力，以及更加优异的抑制脂质过氧化的能力、清除自由基、超氧自由基和羟基自由基的能力。

Description

一种猪血浆抗氧化肽

技术领域

本发明属于食品加工领域，涉及一种猪血浆抗氧化肽。

背景技术

现代肉类工业屠宰过程中产生的动物血液是一种珍贵的蛋白质资源。它可以广泛的用在食品、饲料、实验室、制药、工业以及肥料等领域(Ockerman & Hanson，2000)。但是，只有一小部血液用于这些方面，大量的废弃血液被排放到环境中，引起严重的环境污染(Park & Hynn，2002)。在中国，每年产生约有150万吨猪血，其蛋白质含量相当于250万吨全蛋，但是真正利用起来的部分却很少(余奕珂等，2004)。因此，为了减少环境的污染和阻止宝贵蛋白质资源的流失，发展新的蛋白质资源利用的方法是非常有必要的。

近年来，自由基是现代食品工业以及加工食品的消费者很关心的一个问题。自由基调节脂肪的氧化。已经有研究证实，循环过程中膜蛋白和脂蛋白的氧化与关节炎、糖尿病和高血压、高血脂等疾病有很密切的关系(Halliwell，1994；Keaney，2000)。在过去的几年中，大量的研究开始集中于没有危害作用的、天然的抗氧化剂的开发和结构鉴定方面。这些抗氧化剂在对调节氧化反应的自由基清除的机理各不相同。他们可以作为脂质氧化的抑制剂，自由基清除剂以及催化自由基产生的金属离子的螯合剂(Vaya & Aviram，2001)。这些天然的抗氧化剂很多来源于植物。也有几个肽段序列来自于分离的动物蛋白中，如胶原蛋白、鸡蛋黄、乳清蛋白、酪蛋白、阿拉斯加鱼骨蛋白等中，研究也已经证明他们具有抗氧化作用(Je et al，2005；

et al，2004；Rajapakse et al，2005；Wu et al，2003)。

研究认为，血浆白蛋白是血液循环中主要的抗氧化剂(Halliwell，1988；Peter，1996)。Bishop(1985)报道说血清白蛋白可以保护培养的细胞使其免受氧自由基的伤害。Bourdon，Loreau和Blache(1999)的体外研究则表明，白蛋白具有保护人的低密度脂蛋白(LDL)使其免受氧化和防止红细胞的溶血作用。另有研究利用动物血液蛋白生产功能性肽，包括TCA沉淀法得到的ACE抑制肽(Park et al，1996)，胃蛋白酶水解的ACE活性肽(Suetsuna，1995；Hynn & Shin2000)，牛血浆蛋白中的免疫活性肽(Park & Hyun，2002)，牛血清白蛋白中分离的血管舒缓肽以及牛血红素分离得到的opioid肽(Chiba & Yoshikawa，1991；Zhao et al，1994)。Faraii和Decker(1991)的研究表明猪血浆能抑制铁离子催化的脂质氧化。

但是迄今为止，尚没有报道对猪血浆分离白蛋白和球蛋白进行酶解生产肽及其抗氧化作用的研究。本身具有很好抗氧化作用的血浆蛋白酶解后到底发生了怎样的变化？本发明对这一问题进行了研究，期望为抗氧化肽的生产找到新的原料和方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种猪血浆抗氧化肽。

本发明的目的通过如下方案实现：

一种猪血浆抗氧化肽，它是通过如下方法制得的：

(1)猪血浆白蛋白水解物的制备：用碱性蛋白酶酶解浓度为40mg/mL的猪血浆白蛋白溶液，反应条件为pH 8.0～9.0，温度55～60℃，酶的添加量为0.8～1.0mg/mL蛋白溶液，取水解8～12小时的样品，90℃加热10min使酶灭活后，离心，取上清液；

(2)猪血浆蛋白抗氧化肽段的膜分离：将步骤(1)所得上清液通过分子量为3kDa的平板膜，过滤过程中用高纯氮加压，压力为0.03-0.04MPa，并用磁力搅拌器连续低速搅拌，分离得到分子量小于3kDa的肽段即为所述的猪血浆抗氧化肽A5。

其中，步骤(1)所述的反应条件优选pH 8.0，温度55℃；所述的酶的添加量优选0.8mg/mL蛋白溶液；水解时间优选12h。

所述的猪血浆白蛋白优选利用Heide K，Haupt H，Schwick HG.1984.Plasma proteinfractionation.In：Putnam FW，editors.The Plasma Proteins.New York：Academic Press.p545-597.中记载的冷乙醇沉淀法分离，具体工艺路线见图1。

一种猪血浆抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：

(2)猪血浆蛋白抗氧化肽的膜分离：将步骤(1)所得上清液通过分子量为3kDa的平板膜，过滤过程中用高纯氮加压，压力为0.03-0.04MPa，并用磁力搅拌器连续低速搅拌，分离得到分子量小于3kDa的肽段即为所述的猪血浆抗氧化肽A5。

有益效果：

本发明通过研究了血浆蛋白水解过程中水解度(DH)和还原能力(RP)的变化关系，筛选出最具活性的水解物。按照分子量不同对肽段进行膜分离，研究了不同分子量白蛋白和球蛋白肽段还原能力(RP)、抗脂质氧化能力以及清除DPPH自由基、超氧自由基和羟基自由基的能力，从而筛选出最具有抗氧化潜能的肽A5。本发明猪血浆抗氧化肽段A5较之其他分子量段的水解产物具有最强的还原能力，以及更加优异的抑制脂质过氧化的能力、清除自由基、超氧自由基和羟基自由基的能力。体内实验证明猪血浆白蛋白多肽A5在体内有较好的抗氧化作用，可能有效改善机体自由基代谢紊乱，能明显对抗免疫器官的退化、萎缩，提高免疫功能，从而达到延缓衰老的作用。本发明猪血浆抗氧化肽段A5还能够提高细胞中的SOD，CAT和GSH-Px三种酶活力，且对MDA均有明显的清除作用。

附图说明

图1冷乙醇沉淀法工艺路线图。

图2五种蛋白酶水解猪血浆白蛋白的水解产物的还原能力。

图3五种蛋白酶水解猪血浆球蛋白的水解产物的还原能力。

图4四种条件下碱性蛋白酶水解猪血浆白蛋白的水解产物的还原能力。

图5四种条件下碱性蛋白酶水解猪血浆球蛋白的水解产物的还原能力。

图6Alcalase水解猪血浆白蛋白和球蛋白过程中RP的变化。

图7猪血浆白蛋白和球蛋白不同分子量肽段的RP值。

图8猪血浆白蛋白不同分子量肽段的抗脂质氧化能力。

图9猪血浆球蛋白不同分子量肽段的抗脂质氧化能力。

图10猪血浆白蛋白和球蛋白不同分子量肽段清除DPPH自由基的能力。

图11ESR技术测定的猪血浆白蛋白和球蛋白小分子量肽段清除羟基和超氧自由基的能力。

图12饲喂不同剂量A5大鼠肝脏的CAT酶活力。

具体实施方式

以下实施例中还原能力的测定参考Oyaizu(1986)的方法，该方法的原理是被测物质还原三价铁离子为二价铁离子的能力。在700nm处测定二价铁离子的含量来判断还原能力。取待测液1mL，加入2.5mL 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH＝6.6)和2.5mL 1％的铁氰化钾溶液，混匀，50℃水浴20min，然后加入2.5mL 10％三氯乙酸，充分混合后，3000×g离心10min。取上清液2.5mL和0.5mL的三氯化铁混合，室温反应10min，于700nm波长处测定吸光度值。吸光度越大，表明被测物质的还原能力越强。

实施例1

1.1分离猪血浆白蛋白和球蛋白

当天取自北京资源肉类集团的新鲜猪血，加入浓度1.0mg/mL的草酸钾抗凝，冷藏条件下运送到实验室，途中避免剧烈振荡以免溶血。3000×g离心15min，上清即为血浆。

利用Heide K，Haupt H，Schwick HG.1984.Plasma protein fractionation.In：PutnamFW，editors.The Plasma Proteins.New York：Academic Press.p545-597.中记载的冷乙醇沉淀法分离血浆中的白蛋白和球蛋白，具体工艺路线见图1。

1.2水解猪血浆制备抗氧化肽蛋白酶的确定

分别用木瓜蛋白酶(papain)，风味蛋白酶(flavorzyme)，胰蛋白酶(trypsin)，碱性蛋白酶(Alcalase)和中性蛋白酶(neutrase)水解猪血浆白蛋白和球蛋白，测定的12h内两种蛋白水解物的还原能力。结果如图2和图3所示。由图2和图3可见，碱性蛋白酶水解白蛋白和球蛋白的水解产物的还原能力均最强，因此选择碱性蛋白酶作为水解猪血浆制备抗氧化肽的蛋白酶。

1.3水解条件的确定

依据碱性蛋白酶水解的最优条件作为参考，血浆白蛋白和球蛋白的底物浓度均为40mg/mL，将温度，pH和酶添加量做为三个因素，组合为A，B，C，D四组不同的实验，各组反应条件如表1。分别于水解0、1、2、4、6、8、10、12、14、16h取样，90℃水浴10min灭活酶，迅速冷却后，15000×g离心15min，取上清测定水解物的还原能力。

表1碱性蛋白酶水解猪血浆蛋白的条件

组别	pH	温度(℃)	酶添加量(mg/mL)
				A	8.5	55	1.0
B	8.5	60	0.8

C	9.0	60	1.0
				D	8.0	55	0.8

四种不同水解条件下碱性蛋白酶水解猪血浆蛋白的还原能力测定结果见图4和5。由图中可以看出，Alcalase在D条件下水解血浆白蛋白和球蛋白的水解产物的还原能力在16h内逐渐升高，且4h后还原能力显著高于其他条件下同时间水解物的还原能力(P＞0.05)。因此确定碱性蛋白酶酶解血浆白蛋白和球蛋白的条件是D条件，即pH8.0，温度55℃，酶的添加量0.8mg/mL蛋白溶液，白蛋白和球蛋白溶液的浓度均为40mg/mL。

1.4水解时间的确定

用Alcalase酶解血浆白蛋白和球蛋白，反应条件为pH 8.0，温度55℃，酶的添加量0.8mg/mL蛋白溶液，白蛋白和球蛋白溶液的浓度均为40mg/mL，球蛋白溶液80℃处理12h后进行酶解。分别于水解0、1、2、4、8、12、16、20和24h取样，90℃水浴10min灭活酶。迅速冷却后，15000×g离心15min，取上清，部分用于测定水解度，结果见图6，其余真空冷冻干燥后，贮存于-20℃待分析用。

由图6可看出：白蛋白和球蛋白水解物的还原能力分别在12h和16h时最大，选定这两个时间的水解物进行抗氧化肽分离。

1.5猪血浆蛋白抗氧化肽段的膜分离

猪血浆白蛋白和球蛋白水解物的制备同1.4。选取还原能力最高时候的水解物，90℃加热10min，使酶灭活。15000×g离心15min后，取上清300mL，低温下依次通过分子量为30kDa，10kDa，6k Da和3kDa的平板膜。过滤过程中用高纯氮加压，压力为0.03-0.04MPa，并用磁力搅拌器连续低速搅拌。白蛋白各分子量范围的肽段分别命名为A1(MW＞30kDa)，A2(MW 30-10kDa)，A3(MW 10-6kDa)，A4(MW 6-3kDa)和A5(MW＜3kDa)。球蛋白相应的分子量范围的肽段则命名为G1，G2，G3，G4和G5。分离的肽段真空冷冻干燥后，贮存于-20℃备分析用。

实施例2

2.1还原能力

用于测定还原能力的各肽段浓度为5mg/mL，测定方法参见Oyaizu(1986)的方法，结果见图7。图7表示了猪血浆白蛋白和球蛋白不同分子量肽段的RP值。由图中可以看出，白蛋白和球蛋白的不同分子量肽段的RP值随分子量的减小而增加。在所有肽段中，A5的还原能力最强(P＜0.01)。我们的结果表明低分子量肽段有较高的还原能力，这可能是因为蛋白质水解过程中天然肽键的断裂，使一些活性氨基酸打开和暴露出来，从而和氧化剂反应而起到抗氧化作用。关于这点也有不同的结果报道，有人认为小分子量的肽段还原能力较强(Kong &Xiong，2006)，而另一部分研究则表明大分子量肽段或蛋白质的还原能力更强。

2.2抗脂质氧化能力

脂肪氧化是影响食品货架期的主要因素，也是消费者最关心的问题之一。氧化产生的哈味不仅严重影响消费者的购买欲望，氧化过程中产生的低分子量的降解产物对人体也存在潜在的毒性(Je et al，2005)。脂质过氧化反应是由活性氧自由基诱发的自由基链式反应，反应所产生的过氧化物和醛类等降解产物具有很强的亲电子特性。人摄入这些食物后，能与生物体内的蛋白质和DNA等大分子物质发生共价结合，从而导致这些物质的结构和功能发生改变，引起衰老、动脉粥样硬化、肝病和癌症等多种损害(Vaya & Aviram，2001)。亚油酸氧化体系是检测抗氧化剂抗脂肪氧化能力最常用的方法。本发明用这一反应体系对血浆白蛋白和球蛋白的肽段的抗脂质氧化能力进行评价。

采用Osawa和Namiki(1985)的测定方法。样品2.0mg溶解于2.5mL，50mMPBS(pH7.0)中，并与5mL含50mM亚油酸的99.5％乙醇溶液混合均匀，密封，铝箔包裹，置于40℃烘箱恒温贮藏。每24h取样一次，用硫氰酸铵法检测8d内其氧化程度(Mitsuda，Yasumoto& Iwami，1966)。具体测定方法为：取100μL反应液，分别加入4.7mL质量分数为75％的乙醇、100μL质量分数为30％的硫氰酸铵、100μL FeCl2(浓度为20μM，溶于3.5％HCl溶液)。室温反应3min，500nm比色。以同浓度的α-生育酚作阳性对照。

图8和图9分别显示了猪血浆白蛋白和球蛋白不同分子量肽段在亚油酸系统中的抗脂质氧化能力。由图中可以看出，浓度为0.2mg/mL的肽段有很强的抑制脂质过氧化的能力，抑制能力略高于同浓度的维生素E。在猪血浆白蛋白的各分子量肽段中，A4(3-6kDa)和A5(＜3kDa)抑制脂质氧化的能力最强。两组肽段的抑制能力之间没有差异(P＞0.05)。自第三天起，A4和A5抑制亚油酸氧化的能力显著高于同浓度的维生素E(P＜0.05)，一种公认的、天然的、安全的抗氧化剂。A1和A2的抑制能力也高于维生素E，但统计学上没有显著差异(P＞0.05)。球蛋白水解物分离到的最小肽段G5的抑制脂质氧化能力几乎和A5相同。但和白蛋白不同的是，球蛋白水解物分离到的最小分子量范围的G5(＜3kDa)和最大分子量(＞30kDa)的肽段抑制脂质氧化的能力几乎是相同的。很重要的一点发现是，添加了小分子量肽段的亚油酸体系中，其吸光度是基本不变化的，而其他组包括维生素E的吸光度都是逐渐上升的，说明它们抑制脂质氧化的能力是逐渐减弱的，而小分子肽段可以保持较高的抑制脂质氧化能力。开始时候小分子量肽段的吸收也略有升高，可能是反应体系启动后，肽段不能马上阻断全部自由基的产生，但却可以长期的抑制住自由基的增加，切断其链式反应。

2.3清除DPPH自由基的能力

肽段对稳定的自由基的清除能力，按照Nanio等人(1996)的方法测定。0.2mg/mL肽段溶液0.1mL，加入超纯水0.2mL，然后加入3.0mL DPPH溶液(浓度为0.004％的95％乙醇溶液，w/v)。室温反应30min后于517nm测定OD值。各肽段对DPPH的百分抑制率用下式计算：[(Ao-Ae)/Ao×100]，其中Ao＝没有肽段的反应管的OD值，Ae是含有肽段的反应管的OD值。

如图10所示，在白蛋白的各组肽段中，A5(MW＜3kDa)清除DPPH自由基的能力最强，其次是A4和A3，这一结果和白蛋白肽段抑制脂质过氧化的结果相似。球蛋白的最大分子量的G1和G5肽段清除DPPH自由基的能力也没有统计学上的差别(P＞0.05)，这一结果也同其肽段抑制脂质过氧化的结果一致。

对肽段的RP，抗脂质氧化，DPPH自由基清除能力的研究表明，白蛋白肽段中A5在各系统中均表现处最强的抗氧化能力，球蛋白的G5和G1抗氧化能力几乎相同，都略低于A5。据此，为了确定抗氧化肽进一步纯化的原料，我们利用ESR波谱技术，测定了A5和G5清除羟基和超氧自由基的能力。

2.4清除羟基自由基和超氧自由基能力

羟基自由基由Fenton反应产生(Rosen & Rauckman，1984)。肽段溶液(50μL，0.2mg/mL)，或作为对照的等体积的PBS(pH 7.4)，加入到0.3M DMPO(50μL)和10mM硫酸亚铁(50μL)。转入反应体系到密封的毛细管中，加入50μL 10mM H2O2启动反应。2.5min后用JES-FAESR光谱仪记录DMPO-OH加和物的值。测试条件如下：x波段，调制频率100kHz；微波功率10mW；微波频率9442MHz；磁场范围(336.5±10)mT，调制幅度0.2mT，响应时间30s。该测试在北京师范大学完成，结果见图11。

超氧自由基利用紫外照射的核黄素/EDTA系统产生(Guo et al，1999)。反应体系中含有0.3mM核黄素、5mM的EDTA、0.10mL的DMPO及各种不同浓度的待测化合物，混匀。紫外灯下365nm处照射1min，吸入石英毛细管放入谐振腔，光照30s(氙灯，光源功率1kW，腔距70cm)后立即测ESR谱，测试条件同2.4。该测试在北京师范大学完成，结果见图11。

浓度为0.2mg/mL的肽段A5和G5存在条件下，核黄素系统产生的超氧自由基分别为对照的60.86和72.51％。Fenton反应体系用于产生羟基自由基，典型的DMPO-OH的1∶2∶2∶1ESR信号分别降低为对照的33.8和53.1％。高的羟基自由基清除能力可能是因为几乎所有的有机分子包括肽很容易被非常活泼的羟基自由基氧化。此外，高活性的另一个原因可能是肽可以螯合Fe²⁺，从而减慢Fenton反应中羟基自由基产生的速度(Rajapakse et al，2005)。因此，同羟基自由基相比，抗氧化肽清除超氧自由基的能力可以更好的反应肽清除自由基的能力。

很多蛋白质改性产生的具有疏水性的肽和抗氧化能力有密切的关系。肽清除自由基的能力可能是水解过程中产生的肽的物理特性所决定的(Chenet et al，1995)。A5清除羟基和超氧自由基的能力显著高于G5(P＜0.05)。

不同抗氧化系统的测定结果表明，这几个方面的测定结果基本是一致的，即白蛋白小分子量的肽段A5(＜3kDa)在所选的抗氧化体系中均表现出最高的抗氧化能力。

实施例3体内实验

3.1实验动物

SPF级SD(Sprague Dawley)大鼠，雄性，购自维通利华实验动物公司(北京)，年龄为三个月，体重为350-400g，在中国科学院遗传发育研究所SPF级实验动物房内喂养。大鼠购买后于所饲养的环境中饲养一周，使其适应环境。A5的制备见实施例1。

3.2大鼠的分组和饲喂

SD大鼠随机分为阴性对照组10只、阳性对照组10只和白蛋白肽A5低、中、高剂量组各10只，分笼饲养，每笼5只。大鼠的饲料组成(％)：标准面粉74，脱脂奶粉15，植物油5，粗纤维2，混合无机盐3，混合微量元素0.5，混合维生素0.5。白蛋白肽A5分别以50，100，200mg/kg体重的量灌胃(配制成1mL的溶液)，阴性对照组给予等体积的生理盐水，阳性对照组采用维生素E，灌胃量为10mg/kg体重，配制成1mL灌胃。每日称量体重。

3.3大鼠的处死灌胃

28d后，大鼠一般活动、行为、食量和体重增长均正常。摘除眼球取血后，断颈处死后，立即解剖取心、肝、脾、肺、肾等脏器和胰腺。取出的脏器去处脂肪和筋膜后，于冷的生理盐水漂洗后，滤纸吸干，称重，记录。脏器贮存于液氮中，待匀浆用。脏器指数的计算如下：(脏器重/体重)×100％。血浆白蛋白肽A5对大鼠体重及脾脏指数的影响见表2：

表2白蛋白肽对大鼠体重及脾脏指数的影响

组别	阴性对照	阳性对照	A5低剂量组	A5中剂量组	A5高剂量组
						初始体重(g)	385.60±24.3	356.6±17.3	365.9±21.3	379.9±24.8	388.1±24.8
终体重(g)	420.6±39.4	406.4±41.1	406.1±24.7	427.6±32.9	428.65±34.6
						体重增长量(g/30d)	35.07±5.12	49.71±4.98	40.29±3.96	47.65±4.43	40.57±3.75
脾脏重量(g)	0.74±0.12	0.74±0.10	0.77±0.12	0.71±0.14	0.75±0.17
						脾脏指数(mg/g bw)	1.66±0.09	1.83±0.11	1.87±0.13	1.76±0.08	1.76±0.11

研究结果显示，灌胃处理一个月后，阴性对照组大鼠的体重增长明显低于阳性对照组和高、中、低三个剂量组。阴性对照组的脾脏指数显著低于阳性对照组和低剂量组(P＜0.05)，也低于中剂量组和高剂量，低剂量组的作用和维生素E(阳性对照组)相当。揭示显示猪血浆白蛋白多肽在体内有较好的抗氧化作用，可能有效改善机体自由基代谢紊乱，能明显对抗免疫器官的退化、萎缩，提高免疫功能，从而达到延缓衰老的作用。

3.4血脂水平的测定

血清和组织匀浆的制备：大鼠血样于4℃冰箱放置12h，以3000×g4℃，离心10min，取上清，即为血清。液氮中取出大鼠心、肝、脾、肺、肾组织，4℃解冻后，取0.5g，置于5mL小烧杯中，量取4.5mL的生理盐水，将1/3的生理盐水倒入烧杯中，以眼科剪迅速剪碎组织块，再将剪碎的组织连同生理盐水一起倒入玻璃匀浆器中，然后用剩余的生理盐水冲洗烧杯和眼科剪，并倒入匀浆器，冰浴匀浆，使组织匀浆化。匀浆完全后，将匀浆液以4000×g离心10min，上清液即为10％组织匀浆液。

以大鼠血清为材料，分析测定血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，其中TC采用CHOD-PAP酶法，TG采用EPO-PAP酶法，HDL-C和LDL-C采用直接法(金宗濂等1995)。利用生化自动分析仪测定，在北京大学医学测定分析中心完成，结果见表3。

表3饲喂不同剂量A5实验大鼠血脂水平(mmol/L)

组别	TG	T-CHO	LDL-C	HDL-C	HDL-C/LDL-C
						阴性对照	0.63^b±0.03	1.57^b±0.06	0.24^b±0.01	1.17^a±0.08	5.61^a±0.34
阳性对照	0.54^a±0.07	1.29^a±0.07	0.22^b±0.02	1.41^b±0.06	5.22^a±0.49
						A5低剂量组	0.50^a±0.02	1.33^b±0.10	0.24^b±0.02	1.16^a±0.05	4.79^a±0.22
A5中剂量组	0.46^a±0.03	1.28^a±0.07	0.17^a±0.03	1.33^a±0.07	7.24^b±0.59
						A5高剂量组	0.46^a±0.01	1.50^b±0.14	0.22^b±0.02	1.31^b±0.09	6.70^b±0.63

表3表明，中剂量的血浆白蛋白肽能够显著降低大鼠血清TC水平和TG水平，它使血清LDL-C浓度降低，HDL-C浓度及HDL-C/LDL-C比值升高，这一生理变化趋势对健康无疑是有益的。说明血浆白蛋白肽降低TG水平和促血清HDL-C生成有效，而HDL-C能运载周围组织中的胆固醇到肝脏中代谢，使胆固醇不容易沉积在血管上面而造成动脉粥样硬化，表明血浆白蛋白肽对实验大鼠脂代谢具有调节作用。

3.5血清和组织总抗氧化能力(TAOC)的测定

TAOC的测定按照Benzie和Stain(1996)的测定方法。测定原理是肌体中的抗氧化物质，能使Fe3+还原成Fe2+，后者可和菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色测定其抗氧化能力的高低，具体操作和结果计算按照试剂盒操作说明进行。

大鼠血清和各器官的TAOC结果见表4。由表中可以看出，低剂量组和中剂量组与阴性对照相比有显著增高(P＜0.05)，但高剂量组与阴性对照组并无显著差异。脾脏和心脏的中剂量组则明显高于阴性对照组(P＜0.05)，其中心脏的低剂量和中剂量组的TAOC高于阳性对照组，但无统计学差异(P＞0.05)。各处理组肺部的TAOC均无显著差异(P＞0.05)，而肾脏TAOC三个剂量组较对照组略低。由我们的分析结果可以看出，中剂量和低剂量的白蛋白肽可以提高血清、脾脏和心脏部分的总的抗氧化能力，但对肺部无明显的作用，对肾脏有一定的损伤作用。

表4饲喂不同剂量A5大鼠血清和各器官的总抗氧化能力

组别

血清

肝

脾

心

肺

肾

阳性对照

12.59^ab±0.47

2.79^b±0.30

4.04^a±0.22

2.86^b±0.13

3.43^a±0.29

5.87^c±0.27

阴型对照

11.56±0.28

2.23^a±0.16

3.56^a±0.05

2.30^a±0.19

3.09^a±0.36

5.08^c±0.18

A5低剂量组

13.41±0.58

2.58^b±0.23

3.70^a±0.11

3.08^b±0.18

3.67^a±0.36

4.38^b±0.18

A5中剂量组

12.87±0.25

2.25^ab±0.19

4.52^b±0.31

3.22^b±0.18

3.48^a±0.28

4.28^ab±0.07

A5高剂量组

11.88±0.74

1.76^a±0.12

4.92^b±0.17

2.24^a±0.11

2.91^a±0.08

3.83^a±0.09

3.6血清和组织中抗氧化酶系和MDA的测定

主要包括超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)含量的测定。

3.6.1超氧化物歧化酶(SOD)

SOD酶活测定采用氯化硝基氮蓝四唑光还原法(NBT法)(Beauchamp & Fridovich，1971).SOD试剂盒购自南京建成生物公司，结果见表5。

表5饲喂不同剂量A5大鼠血清和各器官的SOD酶活力

3.6.2谷光甘肽过氧化物酶(GSH-Px)

GSH-Px用DTNB显色法测定(Hafemen，1974)。反应溶液由如下部分组成：0.1M PBS(pH 7.0)，1mM EDTA，10mM谷胱甘肽，1mM NaN3，1单位谷胱甘肽还原酶，1.5mMNADPH和0.1mL细胞裂解液。37℃水浴10min，加入H2O2使之浓度为1mM。340nm处测定OD值，NADPH氧化的速率表示GSH-Px活性，结果见表6。

表6饲喂不同剂量A5大鼠血清和各器官的GSH-Px酶活力

3.6.3过氧化氢酶(CAT)

过氧化氢是化学性质最活泼的活性氧，破坏性极强，可被CAT分解。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化物的产生(吴璟等，2007)。因此过氧化氢酶的含量反应了肌体清除活性氧的能力。

反应体系含有12μL of 3％(v/v)H2O2和100μL肝匀浆，888μL 50mM PBS(pH7.0)。样品于37℃水浴2min。240nm处测定5min内OD的变化。其变化和H2O2的变化成比例(Carrillo et al，1991)。

由图12可以看出，A5的高剂量组和阳性对照组无显著差异，说明这个剂量的A5作用和维生素E的作用效果几乎相同。中、低剂量的CAT酶力虽然高于阴性对照组，但统计学上无显著差异，而高剂量组显著高于阴性对照组(P＜0.05)。

3.6.4丙二醛(MDA)

用硫代巴比妥酸(TBARS)方法测定(Placer et al，1966)。于试管中加入10％的小鼠肝组织匀浆液0.20mL及不同浓度的样品0.10mL，对照加等体积生理盐水。37℃温育1小时后取出，冰浴冷却，按MDA测定试剂盒中方法操作，由于MDA与硫代巴比妥酸缩合形成的红色产物在532nm处有最大吸收，因此在该波长下测定吸光度，计算其MDA含量，公式如下。其中匀浆液蛋白含量测定以牛血清白蛋白为标准，采用Lowry法。另取两组试管，一组先加入10mmol/L的H2O2 0.1mL，另一组先加入1mmol/L的FeSO₄0.1mL，然后再按前述方法，向这两组试管加入组织匀浆和样品液，温育，冷却，测定MDA含量。

表7饲喂不同剂量A5大鼠血清和各器官的MDA含量

组别

血清

肝

脾

心

肺

肾

阳性对照

9.95^a±0.58

2.34^a±0.11

8.42^a±0.65

2.55^a±0.52

3.49^a±0.13

1.28^b±0.15

阴性对照

11.45^b±0.24

2.87^b±0.08

9.32^ab±0.34

2.73^a±0.16

3.50^a±0.15

2.11^a±0.06

A5低剂量组

10.91^a±0.32

2.48^ab±0.09

9.64^ab±0.32

3.02^a±0.58

4.31^b±0.18

1.48^b±0.11

A5中剂量组

8.67^a±0.24

2.53^ab±0.25

9.20^ab±0.42

3.20^a±0.12

4.76^b±0.48

1.52^b±0.10

A5高剂量组

11.86^b±0.57

2.83^b±0.20

10.49^b±0.50

4.18^b±0.15

5.76^c±0.14

1.55^b±0.06

血清和组织中抗氧化酶系和MDA的测定实验结果表明，中、低剂量白蛋白肽灌胃均可明显提高血清GSH-Px及肝脏SOD、GSH-Px的活性，并显著降低血清和肝脏MDA的含量，提示白蛋白肽作为外源性的抗氧化物质，能够提高机体内源性抗氧化酶活性，清除自由基，抑制脂质过氧化损伤。但不同的器官其SOD、GSH-Px和MDA含量差异很大，不同剂量表现的作用也不尽相同，说明A5对不同的器官的抗氧化作用不完全一致。

本发明参考文献

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Claims

1.一种猪血浆抗氧化肽，其特征在于通过如下方法制备：

(1)猪血浆白蛋白水解物的制备：用碱性蛋白酶酶解浓度为40mg/mL的猪血浆白蛋白溶液，反应条件为pH 8.0～9.0，温度55～60℃，酶的添加量为0.8～1.0mg/mL蛋白溶液，取水解8～12小时的样品，90℃加热10～15min使酶灭活后，离心，取上清液；

2.根据权利要求1所述的猪血浆抗氧化肽，其特征在于步骤(1)所述的反应条件为pH 8.0，温度55℃。

3.根据权利要求1所述的猪血浆抗氧化肽，其特征在于步骤(1)所述的酶的添加量为0.8mg/mL蛋白溶液。

4.根据权利要求1所述的猪血浆抗氧化肽，其特征在于取水解12小时的样品，90℃加热10min使酶灭活后，15000×g离心15min，取上清液。

5.一种猪血浆抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的猪血浆抗氧化肽的制备方法，其特征在于步骤(1)所述的反应条件为pH 8.0，温度55℃。

7.根据权利要求5所述的猪血浆抗氧化肽的制备方法，其特征在于步骤(1)所述的酶的添加量为0.8mg/mL蛋白溶液。

8.根据权利要求5所述的猪血浆抗氧化肽的制备方法，其特征在于取水解12小时的样品，90℃加热10min使酶灭活后，15000×g离心15min，取上清液。