CN110651899A - 一种磷脂包封纳米氧化锌及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磷脂包封纳米氧化锌，其原料包括：纳米氧化锌、磷脂和胆固醇，所述纳米氧化锌、磷脂和胆固醇三者的重量比为1：(13‑17)：(0.8‑1.2)。本发明还公开了该磷脂包封纳米氧化锌的制备方法。以磷脂为主材包封纳米氧化锌，磷脂无毒，具有良好的生物亲和力，动物细胞膜的主要成分也为磷脂，采用磷脂包封无机材料氧化锌可以提高材料的生物相容性，使包封纳米氧化锌具有缓释性能并降低包封纳米氧化锌的细胞毒性。本发明的制备方法步骤简单、参数易控制、操作难度低，且制备周期较短，能实现大规模量产。
Description
技术领域
本发明涉及饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种磷脂包封纳米氧化锌及其制备方法。
背景技术
从物理化学到生物医学科学ZnO纳米粒子(NPs)在不同研究领域的基础研究和潜在应用中引起了很多关注。ZnO纳米粒子是一种多功能的功能材料，其优越的性能在催化剂、传感器、半导体、微电子、纺织、化妆品、水处理等领域具有潜在的应用。此外，ZnO纳米粒子具有抗菌活性和抗炎特性。可以作为抗生素和杀菌剂替代品。各种ZnO纳米粒子的合成路线非常多。然而，控制它们在常见溶液(如水和乙醇)中的晶体形貌结构，稳定性和分散性仍然具有挑战性。
由于ZnO纳米粒子具有比表面积大等物理性质，其也具有较高的细胞毒性。事实上，良好分散的纳米粒子已被证明更具毒性。纳米晶体的溶解导致锌离子的释放，在一定程度上细胞毒性与可溶性Zn2+浓度有关，而ZnO纳米晶体与HeLa细胞的直接接触或内化将导致更高的细胞毒性。
目前，可以采用不同的措施来减少纳米材料的聚集，提高分散性，稳定性和生物相容性。例如有机涂层或封端(聚乙二醇(PEG)，L-多巴，PVP等)。然而，一些封端剂也同样具有细胞毒性作用。
有鉴于此，有必要提供一种分散性好、生物稳定性高、生物相容性好的纳米氧化锌制剂。
发明内容
本发明的目的在于提出一种磷脂包封纳米氧化锌及其制备方法，该磷脂包封纳米氧化锌具有良好的分散性、高生物稳定性和较好的生物相容性。该制备方法步骤简单，操作难度低，制备而成的磷脂包封纳米氧化锌具有较好的性能。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种磷脂包封纳米氧化锌，其原料包括：纳米氧化锌、磷脂和胆固醇，纳米氧化锌、磷脂和胆固醇三者的重量比为1：(13-17)：(0.8-1.2)。
一种磷脂包封纳米氧化锌制备方法，包括以下步骤：
(1)、将纳米氧化锌、磷脂和胆固醇混合制成混合液A，混合液A做为脂相；
(2)、在缓冲液中加入表面活性剂制成混合液B，混合液B做为水相；
(3)、将混合液A缓慢注入混合液B中，进行反应；
(4)、将反应生成的沉淀物进行洗涤和干燥，获得磷脂包封纳米氧化锌。
进一步的，步骤(1)中，将纳米氧化锌、磷脂和胆固醇与乙醇混合均匀制成混合液A。
进一步的，步骤(3)中，将进行反应后的反应液转移至旋转蒸发仪中；在110rpm、60℃条件下，将反应液中的乙醇去除。
进一步的，步骤(1)中，纳米氧化锌、磷脂和胆固醇三者的重量比为1：(13-17)：(0.8-1.2)。
进一步的，步骤(2)中，缓冲液由PBS缓冲液和表面活性剂组成，混合液B中表面活性剂的体积占比为(0.1-0.2)％。
进一步的，步骤(3)中，反应是在55-65℃下反应1.5-2.5小时。
进一步的，步骤(4)中，将步骤(3)中的反应液加入到离心管，加入PBS缓冲液，离心后弃去上清液，如此使用PBS缓冲液清洗多次；
在步骤(4)中，将清洗后的沉淀物放入冷冻干燥机进行干燥。
进一步的，步骤(1)中，还包括制备纳米氧化锌的步骤，如下：
(a)、将二水合乙酸锌和乙醇混合制成澄清溶液，记为A液；
(b)、将氢氧化钠和双蒸水加入乙醇制成澄清溶液，记为B液；
(c)、将B液缓慢滴入被加热的A液中，进行反应，得反应液；
(d)、将反应液离心并弃去上清液，采用乙醇洗涤，得沉淀物；
(e)、沉淀物烘干，即得纳米氧化锌。
进一步的，在步骤(a)和(b)中，氢氧化钠与二水合乙酸锌的质量比为1：(2.8-3.2)；
步骤(c)中，反应温度为58-62℃，反应时间为2-3小时。
本发明的有益效果为：以磷脂为主材包封纳米氧化锌，磷脂无毒，具有良好的生物亲和力，动物细胞膜的主要成分也为磷脂，采用磷脂包封无机材料氧化锌可以提高材料的生物相容性，使包封纳米氧化锌具有缓释性能并降低包封纳米氧化锌的细胞毒性。本发明的方法中，将脂相缓慢注入水相，使脂相分散在水相中，经过一段时间的反应，磷脂成功包封氧化锌，形成细小颗粒沉淀物，该沉淀物即为磷脂包封纳米氧化锌，该磷脂包封纳米氧化锌具有良好的分散性，能降低锌离子的溶出，具有缓释效果。本发明的制备方法步骤简单、参数易控制、操作难度低，且制备周期较短，能实现大规模量产。
附图说明
图1是实施例组A3和A5的纳米氧化锌透射电镜形貌图；
图2是对比例A1、A2和A3的纳米氧化锌的透射电镜形貌图；
图3是对比例A4和A5的纳米氧化锌的透射电镜形貌图；
图4是对比例A6-A8的纳米氧化锌的透射电镜形貌图，
图5是实施例B3制得的磷脂包封纳米氧化锌透射电镜形貌图；
图6是对比例B1和B2制得的磷脂包封纳米氧化锌透射电镜形貌图；
图7是对比例B3-B5制得的磷脂包封纳米氧化锌透射电镜形貌图；
图8是实施例B3制得的磷脂包封纳米氧化锌的红外分析图；
图9是实施例B3制得的磷脂包封纳米氧化锌的EDS分析图；
图10是实施例B3制得的磷脂包封纳米氧化锌的细胞毒性分析图；
图11是实施例B3制得的磷脂包封纳米氧化锌的ICP溶出分析图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。
一种磷脂包封纳米氧化锌，其原料包括：纳米氧化锌、磷脂和胆固醇，纳米氧化锌、磷脂和胆固醇三者的重量比为1：(13-17)：(0.8-1.2)。
以磷脂为主材包封纳米氧化锌，磷脂无毒，具有良好的生物亲和力；胆固醇可以保证磷脂层的稳定性和强度，磷脂和胆固醇相配合能模拟细胞膜组成，而实现成膜和使该膜有较好的稳定性和牢固性。动物细胞膜的主要成分也为磷脂，采用磷脂包封无机材料氧化锌可以提高材料的生物相容性，使包封纳米氧化锌具有缓释性能并降低包封纳米氧化锌的细胞毒性。
一种磷脂包封纳米氧化锌制备方法，包括以下步骤：
(1)、将纳米氧化锌、磷脂和胆固醇混合制成混合液A，混合液A做为脂相；
(2)、在缓冲液中加入表面活性剂制成混合液B，混合液B做为水相；
(3)、将混合液A缓慢注入混合液B中，进行反应；
(4)、将反应生成的沉淀物进行洗涤和干燥，获得磷脂包封纳米氧化锌。
上述的方法中，将脂相缓慢注入水相，使脂相分散在水相中，经过一段时间的反应，磷脂成功包封氧化锌，形成细小颗粒沉淀物，该沉淀物即为磷脂包封纳米氧化锌，该磷脂包封纳米氧化锌具有良好的分散性，能降低锌离子的溶出，具有缓释效果。上述的制备方法步骤简单、参数易控制、操作难度低，且制备周期较短，能实现大规模量产。
进一步的，步骤(1)中，将纳米氧化锌、磷脂和胆固醇与乙醇混合均匀制成混合液A。乙醇作为溶剂，能稀释磷脂和胆固醇，使得混合液A具有较好的流动性，也使纳米氧化锌能在混合液A中更均匀的分布，还能使混合液A注入混合液B后能快速分散，有利于形成颗粒均匀的沉淀。混合液A中，纳米氧化锌与乙醇的比例为0.1g/10ml，在实际操作中，乙醇的量能将米氧化锌、磷脂和胆固醇良好分散即可。
进一步的，步骤(3)中，将进行反应后的反应液转移至旋转蒸发仪中；在110rpm、60℃条件下，将反应液中的乙醇去除。以蒸发的方式去除反应液中的乙醇，不仅能够保证乙醇的完全去除，还能有效降低对沉淀物的影响，保证了磷脂包封纳米氧化锌的产品质量。通过限定旋转蒸发仪的参数，在提高乙醇去除速度的同时保证了反应液中沉淀物的稳定。步骤(3)中，混合液A和混合液B的体积比为1：(1-2)。
进一步的，步骤(1)中，纳米氧化锌、磷脂和胆固醇三者的重量比为1：(13-17)：(0.8-1.2)。三种原料在这种比例范围内，能实现磷脂包封纳米氧化锌的良好分散性，当胆固醇或磷脂的用量过少时，纳米氧化锌包封效果差，部分纳米氧化锌没有被包封，被包封的纳米氧化锌由于包覆膜很薄常发生聚团现象，分散性很差；当胆固醇用量过多时，包封的纳米氧化锌也常发生聚团现象，纳米氧化锌外的包覆膜不均匀，产品质量差；当磷脂用量过多时，纳米氧化锌能被均匀的包封，包覆膜厚度较一致，但会造成材料的浪费。
进一步的，步骤(2)中，缓冲液由PBS缓冲液和表面活性剂组成，混合液B中表面活性剂的体积占比为(0.1-0.2)％。PBS缓冲液作为溶剂能对磷脂和胆固醇起保护作用，保护两者分子结构及功能的完整性，PBS缓冲液的pH为6-7。表面活性剂优选的采用吐温-80，缓冲液中加入该成分能提高反应液的稳定性，增强磷脂和胆固醇的活性，对反应液中生成沉淀有促进作用。
进一步的，步骤(3)中，反应是在55-65℃下反应1.5-2.5小时。在此反应温度下能保证较高的反应速度和生成较稳定的反应产物，通过控制反应时间使得反应完全和增加包覆膜的稳定性
进一步的，步骤(4)中，将步骤(3)中的反应液加入到离心管，加入PBS缓冲液，离心后弃去上清液，如此使用PBS缓冲液清洗多次。反应液在去除乙醇后，分离沉淀和洗涤沉淀物，采用PBS缓冲液洗涤沉淀物，能对包覆膜起保护作用，防止在洗涤过程中包覆膜有损伤，进而提高产品的质量。
在步骤(4)中，将清洗后的沉淀物放入冷冻干燥机进行干燥。以冷冻干燥的方式，而非常温或高温干燥，目的是这种冷冻干燥的方式对包覆膜的影响较小，能保持包覆膜分子排列结构，制成的磷脂包封纳米氧化锌有良好的缓释锌离子效果。具体的冷冻干燥的参数为0.37mbar，﹣65℃。
进一步的，步骤(1)中，还包括制备纳米氧化锌的步骤，如下：
(a)、将二水合乙酸锌和乙醇混合制成澄清溶液，记为A液；
(b)、将氢氧化钠和双蒸水加入乙醇制成澄清溶液，记为B液；
(c)、将B液缓慢滴入被加热的A液中，进行反应，得反应液；
(d)、将反应液离心并弃去上清液，采用乙醇洗涤，得沉淀物；
(e)、沉淀物烘干，即得纳米氧化锌。
采用直接法制备纳米氧化锌，将二水合乙酸锌和氢氧化钠分别制成溶液后，再将具有二水合乙酸锌的溶液滴入被加热的含氢氧化钠溶液中，反应过程平稳，能制成高质量的纳米氧化锌。该制备步骤简单、易操作，适用于大规模生产。
进一步的，在步骤(a)和(b)中，氢氧化钠与二水合乙酸锌的质量比为1：(2.8-3.2)；步骤(c)中，反应温度为58-62℃，反应时间为2-3小时。
以下通过实施例和对比例进一步阐述本发明。
实施例组A纳米氧化锌的制备
实施例A1-A5的纳米氧化锌的制备步骤，如下：
(a)、将二水合乙酸锌和乙醇混合制成澄清溶液，记为A液；
(b)、将氢氧化钠和双蒸水加入乙醇制成澄清溶液，记为B液；
(c)、A液放入水浴锅，将B液缓慢滴入被加热的A液中，在58-62℃下反应2-3小时，得反应液，氢氧化钠与二水合乙酸锌的质量比为1：(2.8-3.2)；
(d)、将反应液4000rmp离心5分钟并弃去上清液，采用乙醇洗涤，得沉淀物；
(e)、沉淀物在烘箱内60℃烘干2小时，即得纳米氧化锌。
实施例A1-A5的纳米氧化锌的制备步骤(c)的参数如下表所示。下表中的质量比为氢氧化钠与二水合乙酸锌的质量比。
| 步骤(c) | 实施例A1 | 实施例A2 | 实施例A3 | 实施例A4 | 实施例A5 |
| 反应温度 | 60℃ | 62℃ | 60℃ | 58℃ | 60℃ |
| 反应时间 | 120min | 165min | 135min | 150min | 180min |
| 质量比 | 1:2.8 | 1:2.9 | 1:3 | 1:3.1 | 1:3.2 |
实施例A3制成的纳米氧化锌的透射电镜形貌图如图1a所示，实施例A5制成的纳米氧化锌的透射电镜形貌图如图1b所示。由图1可见，制成的纳米氧化锌粒子大小均匀、粒径为纳米级，粒径在10nm以下。实施例A1、A2和A4的制成的纳米氧化锌粒子与实施例A3和A5基本一致。
对比例组A
对比例A1-A8的步骤及参数与实施例A3基本相同，不同之处仅在于步骤(c)，对比例A1-A8的步骤(c)如下表所示。
对比例A1制成的纳米氧化锌的透射电镜形貌图如图2a所示，对比例A2制成的纳米氧化锌的透射电镜形貌图如图2b所示，对比例A3制成的纳米氧化锌的透射电镜形貌图如图2c所示。由图2可见，反应时间越长，晶粒越大，当反应时间为24小时，晶粒长度达到约100nm。
对比例A4制成的纳米氧化锌的透射电镜形貌图如图3a所示，对比例A5制成的纳米氧化锌的透射电镜形貌图如图3b所示。由图3可见，反应温度较低时，得到的晶粒大小约10nm，但晶粒聚团现象明显。
对比例A6制成的纳米氧化锌的透射电镜形貌图如图4a所示，对比例A7制成的纳米氧化锌的透射电镜形貌图如图4b所示，对比例A8制成的纳米氧化锌的透射电镜形貌图如图4c所示。由图4可见，当二水合乙酸锌的用量较少时，制成的晶粒聚团现象明显。
实施例组B
实施例B1-B5的磷脂包封纳米氧化锌及其制备方法如下。
实施例B1-B5的磷脂包封纳米氧化锌，其原料包括：纳米氧化锌、磷脂和胆固醇，所述纳米氧化锌、磷脂和胆固醇三者的重量比为1：(13-17)：(0.8-1.2)。
磷脂包封纳米氧化锌制备方法，包括以下步骤：
(1)、将乙醇加入到容器中，在搅拌状态下按比例加入纳米氧化锌、磷脂和胆固醇，制成混合液A，混合液A做为脂相；
(2)、在PBS缓冲液中加入吐温-80，在60℃磁力搅拌器下充分溶解搅拌，制成混合液B，混合液B做为水相，混合液B中吐温-80的体积占比为(0.1-0.2)％；
(3)、将混合液A缓慢注入混合液B中，在55-65℃下反应1.5-2.5小时；之后，将进行反应后的反应液转移至旋转蒸发仪中；在110rpm、60℃条件下，将反应液中的乙醇去除；
(4)、将反应液加入到离心管，加入PBS缓冲液，离心后弃去上清液，如此使用PBS缓冲液清洗多次；将清洗后的沉淀物放入冷冻干燥机进行干燥。
实施例B1-5中磷脂包封纳米氧化锌的原料配方比例如下表所示。
| 原料 | 实施例B1 | 实施例B2 | 实施例B3 | 实施例B4 | 实施例B5 |
| 纳米氧化锌 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 磷脂 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 |
| 胆固醇 | 0.8 | 0.9 | 1 | 1.1 | 1.2 |
实施例B1-5中磷脂包封纳米氧化锌制备步骤参数如下表所示。
实施例B3制得的磷脂包封纳米氧化锌透射电镜形貌图如图5所示，图中粒子大小均匀、分散均匀。对实施例B1、B2、B4和B5制得的磷脂包封纳米氧化锌粒子与实施例B3基本相同。
对比例组B
对比例B1-B5的步骤及参数与实施例B3基本相同，不同之处仅在于纳米氧化锌、磷脂和胆固醇三者的比例不同，具体如下表所示。
| 原料 | 对比例B1 | 对比例B2 | 对比例B3 | 对比例B4 | 对比例B5 |
| 纳米氧化锌 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 磷脂 | 10 | 20 | 15 | 15 | 5 |
| 胆固醇 | 1 | 1 | 0.5 | 2 | 3 |
对比例B1制得的磷脂包封纳米氧化锌透射电镜形貌图如图6a所示，对比例B2制得的磷脂包封纳米氧化锌透射电镜形貌图如图6b所示。由图6可知，当磷脂用量过多时，纳米氧化锌能被均匀的包封，包覆膜厚度较一致，但会造成材料的浪费。
对比例B3-B5制得的磷脂包封纳米氧化锌透射电镜形貌图依次如图7a、b、c所示。由图7可知，当胆固醇或磷脂的用量过少时，纳米氧化锌包封效果差，部分纳米氧化锌没有被包封，被包封的纳米氧化锌由于包覆膜很薄常发生聚团现象，分散性很差；当胆固醇用量过多时，包封的纳米氧化锌也常发生聚团现象，纳米氧化锌外的包覆膜不均匀。
以下通过红外分析、EDS分析、细胞毒性分析、ICP溶出分析来进一步证明本发明磷脂包封纳米氧化锌的性质。
将实施例B3制得的磷脂包封纳米氧化锌进行红外分析，红外分析图如图8所示。根据红外分析，sample1为氧化锌，sample4为磷脂包封纳米氧化锌。从红外图谱来看，原始整体上来说有很多共同的特性，由于其包覆的氧化锌晶体是一样的。例如：在450cm-1左右形成典型的Zn-O强振动模式。在磷脂包封纳米氧化锌样品的红外谱中，2854cm-1、2926cm-1和1735cm-1处出现强峰，对应于磷脂疏水尾中-CHx和C＝O基团的伸缩振动证实了ZnO表面磷脂层的形成。此外，新的拉伸特征of P＝O and P-O在1100and 1235cm-1显现，以及450cm-1处Zn-O键振动峰衰减。这些证据都证明了ZnO与磷脂分子相互作用的成功。
将实施例B3制得的磷脂包封纳米氧化锌进行EDS(能量色散X射线光谱)分析，EDS分析图如图9所示，图中显示，含有ZnO和P元素的存在，证明磷脂成功包封于氧化锌。
将实施例B3制得的磷脂包封纳米氧化锌进行细胞毒性分析，如图10所示。将纳米氧化锌(标号1)和磷脂包封纳米氧化锌(标号4)，在不同浓度，15、25、50、100、200μg/ml下，与海拉细胞共培养24小时。发现磷脂包封纳米氧化锌的样品在浓度较高的情况下，细胞的活性也没有呈现显著性降低。证明该工艺能减少氧化锌对细胞的毒性。
将实施例B3制得的磷脂包封纳米氧化锌进行ICP溶出分析，如图11所示。将一定量纳米氧化锌(sample1)和磷脂包封纳米氧化锌(sample4)悬浮于蒸馏水中，搅拌一定的时间，间隔一定时间后对溶液中的锌离子浓度进行检测，如图11所示，发现磷脂包封纳米氧化锌样品锌离子的溶出明显低于没有用磷脂包封的样品，证明磷脂包封具有一定的缓释效果。
通过上述实施例、对比例以及数据照片，最佳质量比为：纳米氧化锌：磷脂：胆固醇＝1：15：1，将磷脂成功包封于纳米氧化锌表面。磷脂包封氧化锌样品可以降低锌离子的溶出，具有缓释的效果，可以显著降低氧化锌对细胞的毒性。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种磷脂包封纳米氧化锌，其特征在于，其原料包括：纳米氧化锌、磷脂和胆固醇，所述纳米氧化锌、磷脂和胆固醇三者的重量比为1：(13-17)：(0.8-1.2)。
2.一种磷脂包封纳米氧化锌制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、将纳米氧化锌、磷脂和胆固醇混合制成混合液A，混合液A做为脂相；
(2)、在缓冲液中加入表面活性剂制成混合液B，混合液B做为水相；
(3)、将混合液A缓慢注入混合液B中，进行反应；
(4)、将反应生成的沉淀物进行洗涤和干燥，获得磷脂包封纳米氧化锌。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将纳米氧化锌、磷脂和胆固醇与乙醇混合均匀制成混合液A。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将进行反应后的反应液转移至旋转蒸发仪中；在110rpm、60℃条件下，将反应液中的乙醇去除。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，纳米氧化锌、磷脂和胆固醇三者的重量比为1：(13-17)：(0.8-1.2)。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，缓冲液由PBS缓冲液和表面活性剂组成，所述混合液B中表面活性剂的体积占比为(0.1-0.2)％。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述反应是在55-65℃下反应1.5-2.5小时。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，将步骤(3)中的反应液加入到离心管，加入PBS缓冲液，离心后弃去上清液，如此使用PBS缓冲液清洗多次；
在所述步骤(4)中，将清洗后的沉淀物放入冷冻干燥机进行干燥。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，还包括制备纳米氧化锌的步骤，如下：
(a)、将二水合乙酸锌和乙醇混合制成澄清溶液，记为A液；
(b)、将氢氧化钠和双蒸水加入乙醇制成澄清溶液，记为B液；
(c)、将B液缓慢滴入被加热的A液中，进行反应，得反应液；
(d)、将反应液离心并弃去上清液，采用乙醇洗涤，得沉淀物；
(e)、沉淀物烘干，即得纳米氧化锌。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(a)和(b)中，氢氧化钠与二水合乙酸锌的质量比为1：(2.8-3.2)；
所述步骤(c)中，反应温度为58-62℃，反应时间为2-3小时。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP4183261A1 (en) * | 2021-11-17 | 2023-05-24 | Vepidan ApS | A feed supplement formulation for use in a fodder for feeding a livestock |
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| CN107029246A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-08-11 | 燕山大学 | 一种四氧化三铁/奥曲肽修饰的纳米脂质体及其制备方法 |
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