CN110636858A - 人抗脑信号蛋白4d抗体 - Google Patents

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Abstract

提供用于治疗与脑信号蛋白‑4D(SEMA4D)病理学相关的疾病的组合物和方法，所述疾病包括自体免疫疾病、炎症性疾病、癌症、神经炎症性疾患和神经变性疾病。

Description

人抗脑信号蛋白4D抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月5日提交的美国临时专利申请序列号62/501,981的权益，所述美国临时专利申请以引用方式整体并入本文。
背景技术
脑信号蛋白4D(Semaphorin 4D，SEMA4D)，也称为CD100，是一种属于脑信号蛋白基因家族的跨膜蛋白。SEMA4D在细胞表面上作为同二聚体表达，但在细胞活化后，SEMA4D可通过蛋白水解裂解从细胞表面释放以产生蛋白质的可溶性形式sSEMA4D，该sSEMA4D也具有生物活性。参见Suzuki等，Nature Rev.Immunol.3:159-167(2003)；Kikutani等，NatureImmunol.9:17-23(2008)。
SEMA4D以高水平在包括脾、胸腺和淋巴结的淋巴器官中，以及在诸如脑和肾等非淋巴器官中表达。在淋巴器官中，SEMA4D在静息T细胞上大量表达，但在静息B细胞和抗原递呈细胞(APC)(诸如树突细胞(DC))上仅微弱表达。然而，在由各种免疫刺激活化之后，它在这些细胞中的表达被上调。可溶性SEMA4D从免疫细胞的释放也由于细胞活化而增加。
SEMA4D已牵涉于某些癌症的发展中(Ch’ng等，Cancer110:164–72(2007)；Campos等，Oncology Letters 5:1527-35(2013)；Kato等,Cancer Sci.102:2029-37(2011))，并且若干报道表明该影响的一种机理是SEMA4D在促进肿瘤血管生成方面具有作用(Conrotto等，Blood 105:4321-4329(2005).Basile等，J Biol.Chem.282:34888–34895(2007)；Sierra等，J.Exp.Med.205:1673(2008)；Zhou等，Angiogenesis 15:391-407(2012))。肿瘤生长和转移涉及在肿瘤细胞、基质和免疫浸润物，以及内皮细胞和血管结构之间交叉对话的复杂过程。SEMA4D在一系列广泛肿瘤类型中过度表达，并且也由被募集至肿瘤微环境中的炎症性细胞产生。新近研究表明SEMA4D在构成肿瘤基质的不同细胞类型的迁移、存活、分化和组构中起作用(Evans等，Cancer Immunol.Res.3:689–701(2015))。
SEMA4D牵涉于神经变性疾患、自体免疫疾病、脱髓鞘性疾病和癌症中。在中枢神经系统(CNS)中，SEMA4D在例如浸润性免疫细胞和寡树突细胞前体细胞上表达，并且它的受体在例如神经元、寡树突细胞、星形细胞和内皮细胞上表达(Okuno,T.等，J.Immunol.184:1499–1506(2010))。SEMA4D可充当轴突导向分子(Swiercz等，Neuron 35:51-63(2002))，并且可介导γ-氨基丁酸能和谷氨酸能突触发育(Paradis等，Neuron 53:217-232(2007))以及具有其他活性。
也已显示SEMA4D在神经元和寡树突细胞前体细胞的迁移和分化、CNS炎症和神经变性中起作用。举例来说，SEMA4D缺陷性小鼠对实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)的发展具有抗性(Kumanogoh A等，Immunity 13:621-631(2000))，并且在EAE的情况下阻断SEMA4D可抑制小神经胶质细胞活化和神经炎症(Okuno,T.等，J.Immunol.184:1499–1506(2010))。类似地，SEMA4D刺激内皮细胞可导致产生促炎性细胞因子IL-8(Yang,YH等，PLoS One 6:e25826(2011))。
新近出版物已证明抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)在治疗癌症与神经炎症性/神经变性疾病两者方面均具有功效。举例来说，用抗SEMA4D抗体VX15/2503进行的新近I期临床试验证明了在治疗实体肿瘤方面的安全性和功效。参见例如Patnaik,A.等，Clin.Cancer Res.22:827-836(2016)以及Southwell AL等，Neurobiol.Dis 76:46-56(2015)。然而，仍然需要例如关于结合特征、免疫原性和/或效能具有改进和/或改善概况的额外抗SEMA4D抗体。
发明内容
本公开提供用于治疗与脑信号蛋白-4D(SEMA4D)病理学相关的疾病的组合物和方法，所述疾病为诸如自体免疫疾病、炎症性疾病、癌症、神经炎症性疾病和神经变性疾患。根据本文说明的本公开的各个方面，提供特异性结合SEMA4D的抗体或其抗原结合片段。根据本文说明的本公开的其他方面，提供一种用于治疗患有自体免疫疾病、炎症性疾病、癌症、神经炎症性疾病和神经变性疾患的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的特异性结合SEMA4D且中和SEMA4D活性的抗体或抗原结合片段。
在某些方面，特异性结合SEMA4D的抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；其中所述VH包括互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR包括分别与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同一，或除所述HCDR中的一者、两者或全部三者中的一个、两个、三个或四个氨基酸取代之外分别与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同一的氨基酸序列；并且其中所述VL包括互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR包括分别与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8同一，或除所述LCDR中的一者、两者或全部三者中的一个、两个、三个或四个氨基酸取代之外分别与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8同一的氨基酸序列。
在某些方面，抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段包括VH互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VH互补决定区包括分别与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同一的氨基酸序列；以及VL互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述VL互补决定区包括分别与SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8同一的氨基酸序列。
在某些方面，抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段包括VH，所述VH包括框架区(HFW)HFW1、HFW2、HFW3和HFW4；以及VL，所述VL包括框架区(LFW)LFW1、LFW2、LFW3和LFW4。在某些方面，框架区可源于人抗体或非人抗体。
在某些方面，抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段包括VH，所述VH包括氨基酸序列SEQID NO:1。在某些方面，抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段包括VL，所述VL包括氨基酸序列SEQID NO:5。在某些方面，抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段包括VH和VL，所述VH和VL分别包括氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5。
在某些方面，本文提供的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段的VH包括与SEQ ID NO:1至少80％、85％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列。在某些方面，本文提供的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段的VL包括与SEQ ID NO:5至少80％、85％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列。在某些方面，VH可包括与SEQ ID NO:1至少80％、85％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列，并且VL可包括与SEQ ID NO:5至少80％、85％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列。
在某些方面，本文提供的抗SEMA4D抗体或其片段包括融合于VH的C末端的重链恒定区或其片段。在某些方面，重链恒定区或其片段是人重链恒定区。在某些方面，重链恒定区或其片段可为人IgG4恒定区。在某些方面，重链恒定区或其片段是非人恒定区。在某些方面，重链恒定区或其片段是鼠IgG1恒定区。在某些方面，抗SEMA4D抗体或其片段包括VH和VL，其中轻链恒定区或其片段融合于所述VL的C末端。在某些方面，本文提供的抗SEMA4D抗体或其片段包括融合于VL的C末端的轻链恒定区或其片段。在某些方面，轻链恒定区是人轻链恒定区，例如人λ或人κ轻链恒定区。在某些方面，轻链恒定区是非人轻链恒定区，例如鼠λ轻链恒定区。
在某些方面，本文提供的抗SEMA4D抗体或其片段可为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、单链Fv片段(scFv)、或二硫键连接的Fv片段(sdFv)。在某些方面，抗SEMA4D抗体或其片段可为多特异性的，例如双特异性的。
在某些方面，本文提供的抗SEMA4D抗体或其片段可特异性结合人SEMA4D、小鼠SEMA4D、大鼠SEMA4D、和/或非人灵长类动物SEMA4D，例如食蟹猴SEMA4D和/或狨猴SEMA4D。在某些方面，本文提供的抗SEMA4D抗体或其片段可以特征在于解离常数KD不大于500nM、100nM、50.0nM、40.0nM、30.0nM、20.0nM、10.0nM、9.0nM、8.0nM、7.0nM、6.0nM、5.0nM、4.0nM、3.0nM、2.0nM、1.0nM、0.50nM、0.10nM、0.050nM、0.01nM、0.005nM或0.001nM的亲和力结合SEMA4D，例如人SEMA4D、小鼠SEMA4D、大鼠SEMA4D和/或非人灵长类动物SEMA4D，例如食蟹猴SEMA4D和/或狨猴SEMA4D。
在某些方面，本文提供的抗SEMA4D抗体或其片段可抑制SEMA4D结合SEMA4D受体，例如丛蛋白-B1(Plexin-B1)、丛蛋白-B2、CD72，或它们的任何组合。
在某些方面，在向受试者施用后，抗SEMA4D抗体或其片段引发最小抗抗体免疫应答或不引发抗抗体免疫应答。
在某些方面，抗SEMA4D抗体或其片段包括与其融合或缀合的异源性部分。在某些方面，异源性部分可为例如多肽、细胞毒性剂、治疗剂、前药、脂质、碳水化合物、核酸、可检测标记、聚合物，或它们的任何组合。在某些方面，异源性部分可包括结合分子、酶、细胞因子、淋巴因子、激素肽，或它们的任何组合。在另一方面，异源性部分可包括放射性核素、生物毒素、酶活性毒素，或它们的任何组合。在另一方面，异源性部分可包括酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记，或它们的任何组合。
在某些方面，本公开提供一种药物组合物，其包括本文提供的抗SEMA4D抗体或其片段，以及载体。
在某些方面，本公开提供一种分离的多核苷酸或多核苷酸组合，所述分离的多核苷酸或多核苷酸组合包括一个或多个编码抗SEMA4D抗体或其片段的核酸序列。在另一方面，多核苷酸或多核苷酸组合包括编码抗SEMA4D抗体或其片段的VH的核酸序列。在另一方面，多核苷酸或多核苷酸组合包括编码抗SEMA4D抗体或其片段的VL的核酸序列。在另一方面，多核苷酸或多核苷酸组合包括编码抗SEMA4D抗体或其片段的VH和VL的核酸序列。在另一方面，本公开提供一种包括多核苷酸的载体，所述多核苷酸包括一个或多个编码抗SEMA4D抗体或其片段的核酸序列。在另一方面，本公开提供一种包括所述载体的宿主细胞。在另一方面，本公开提供一种产生抗SEMA4D抗体或其片段的方法。
在所提供方法的某一方面，抗SEMA4D抗体或抗原结合片段在人受试者中中和SEMA4D。
根据本文说明的各个方面，本公开提供一种治疗患有自体免疫疾病或疾患、炎症性疾病或疾患、癌症、神经炎症性疾病或疾患、神经变性疾病或疾患，或它们的任何组合的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的特异性结合SEMA4D且中和SEMA4D活性的抗体或抗原结合片段。在某些方面，神经炎症性疾病或疾患是多发性硬化症。在某些方面，神经变性疾病或疾患是中风、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、唐氏综合征(Downsyndrome)、共济失调、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶性痴呆(FTD)、HIV相关认知损害、CNS狼疮、轻度认知损害，或它们的组合。在某些方面，自体免疫疾病或炎症性疾病是关节炎。在某些方面，自体免疫疾病或炎症性疾病是类风湿性关节炎。
附图说明
图1A比较通过ELISA所测量的MAbD2517和MAbVX15/2503(两者均在PBS中配制)与人SEMA4D的结合。
图1B比较通过ELISA所测量的MAbD2517和MAbVX15/2503(两者均在PBS中配制)与食蟹猴SEMA4D的结合。
图1C比较通过ELISA所测量的MAbD2517和MAbVX15/2503(两者均在PBS中配制)与狨猴SEMA4D的结合。
图1D比较通过ELISA所测量的MAbD2517和MAbVX15/2503(两者均在PBS中配制)与小鼠SEMA4D的结合。
图2A示出相较于MAbVX15/2503，MAbD2517阻断人SEMA4D与293PLXNB1细胞结合的能力。
图2B示出相较于MAbVX15/2503，MAbD2517阻断食蟹猴SEMA4D与293PLXNB1细胞结合的能力。
图2C示出相较于MAbVX15/2503，MAbD2517阻断小鼠SEMA4D与293PLXNB1细胞结合的能力。
图2D示出相较于MAbVX15/2503，MAbD2517阻断大鼠SEMA4D与293PLXNB1细胞结合的能力。
图3A示出用对照小鼠IgG1/2B8或嵌合抗体MAbD2585(10mg/kg，腹膜内，每周一次，共计5周)治疗的Balb/c小鼠中的肿瘤体积的测量结果。
图3B示出用对照小鼠IgG1/2B8或嵌合抗体MAbD2585治疗的Balb/c小鼠的存活时间。
图3C示出用对照小鼠IgG1/2B8或嵌合抗体MAbD2585治疗的Balb/c小鼠中的肿瘤消退频率。
具体实施方式
定义
应注意术语”一个(种)(a/an)”实体是指一个(种)或多个(种)那个实体；例如”一个(种)结合分子”应理解为代表一个(种)或多个(种)结合分子。因此，术语“一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换使用。
此外，当在本文中使用时，“和/或”应视为明确公开两个指定特征或组分中的各者，伴有或不伴有另一者。因此，如本文在诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)，以及“B”(单独)。同样，如诸如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”意图涵盖以下实施方案中的各者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非另外定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与由本公开所相关领域中的普通技术人员通常理解相同的含义。举例来说，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary of Celland Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；以及Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,Oxford University Press向技术人员提供本公开中使用的许多术语的综合词典。
单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)接受形式表示。数值范围包括界定范围的数值。除非另外指示，否则氨基酸序列以氨基至羧基定向从左至右书写。本文提供的标题并非是对本公开的各个方面或方面的限制，所述各个方面或方面可通过参照说明书整体而得到。因此，通过参照说明书整体，以下紧接着定义的术语得以更充分阐释。
每当以措辞“包含”描述实施方案时，也提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的另外类似实施方案。
氨基酸在本文中通过它们的通常已知三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸通过它们的通常接受的单字母代码来提及。
如本文所用，术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的其中细胞群体的特征在于细胞生长不受调控的生理状况。癌症可例如被分类为实体肿瘤或恶性肿瘤、或血液癌症或恶性肿瘤。两种类型均可以转移癌形式向远端部位迁移。实体肿瘤可例如被分类为肉瘤、癌瘤、黑素瘤或其转移癌。
如本文所用的“肿瘤”和“赘瘤”是指由过度细胞生长或增殖产生的任何良性(非癌性)或恶性(癌性)组织团块，包括癌前病变。在某些实施方案中，本文所述的肿瘤表达SEMA4D受体，例如丛蛋白-B1、丛蛋白-B2和/或CD72，和/或可表达SEMA4D。
如本文所用，术语“多肽”意图涵盖单一“多肽”以及多个“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)加以线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链，并且不指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代具有两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可替代这些术语中的任一者加以使用，或可与这些术语中的任一者互换使用。术语“多肽”也意指具有多肽的表达后修饰的产物，所述修饰包括不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、以及由已知保护/封阻基团达成的衍生化、蛋白水解裂解、或由非天然存在的氨基酸达成的修饰。多肽可源于生物来源，或通过重组技术产生，但未必从指定核酸序列翻译。它可以任何方式来产生，包括通过化学合成。
如本文公开的多肽可具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个、或2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可具有确定三维结构，但它们未必具有所述结构。具有确定三维结构的多肽被称为经折叠，并且不具有确定三维结构的多肽而是可采用许多不同构象，并且被称为未折叠。如本文所用，术语糖蛋白是指偶联于至少一个碳水化合物部分的蛋白质，所述碳水化合物部分通过例如丝氨酸或天冬酰胺的氨基酸的含氧或含氮侧链来连接于所述蛋白质。
就“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物来说，其意指不处于它的天然环境中的多肽。不要求特定纯化水平。举例来说，分离的多肽可从它的天然或自然环境移除。如本文所公开，在宿主细胞中表达的重组产生多肽和蛋白质被视为分离的，已通过任何适合技术加以分离、分级分离、或部分或实质上纯化的天然或重组多肽也被视为分离的。
如本文所用，术语“非天然存在的多肽”或其任何语法变化形式是明确排除但仅排除所述多肽的由或可能由评判者或行政或司法机关确定或解释为“天然存在”的那些形式的条件性定义。
本文公开的其他多肽是先前多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任何组合。如本文公开的术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留相应天然抗体或多肽的至少一些性质的任何多肽，所述性质例如是与抗原特异性结合。除在本文中其他地方讨论的特异性抗体片段之外，多肽的片段也包括例如蛋白水解片段以及缺失片段。例如多肽的变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。在某些方面，变体可为非天然存在的。非天然存在的变体可使用本领域已知的诱变技术来产生。变异多肽可包含保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是已被改变以便展现未关于原始多肽所见的额外特征的多肽。实例包括融合蛋白。变异多肽也可在本文中称为“多肽类似物”。如本文所用，多肽的“衍生物”也可指具有一个或多个通过官能性侧基的反应来加以化学衍生的氨基酸的主题多肽。也作为“衍生物”加以包括的是含有二十种标准氨基酸的一种或多种衍生物的那些肽。举例来说，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；并且鸟氨酸可取代赖氨酸。
“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸被具有类似侧链的另一氨基酸置换的氨基酸取代。已在本领域中定义具有类似侧链的氨基酸的家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。举例来说，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。在某些实施方案中，本公开的多肽和抗体的序列中的保守性取代不消除含有氨基酸序列的多肽或抗体与结合分子所结合的抗原的结合。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法在本领域中是熟知的(参见例如Brummell等，Biochem.32:1180-1 187(1993)；Kobayashi等，Protein Eng.12(10):879-884(1999)；以及Burks等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:.412-417(1997))。
术语“多核苷酸”意图涵盖单一核酸以及多个核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、cDNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如见于肽核酸(PNA)中)。术语“核酸”或“核酸序列”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。
就“分离的”核酸或多核苷酸来说，其意指所述核酸或多核苷酸的从它的天然环境分离的任何形式。举例来说，经凝胶纯化多核苷酸或载体中含有的编码多肽的重组多核苷酸将被视为“分离的”。此外，已被工程改造来具有克隆限制位点的多核苷酸区段例如PCR产物被认为“分离的”。分离的多核苷酸的其他实例包括维持在异源性宿主细胞中的重组多核苷酸，或在非天然溶液诸如缓冲液或盐水中的纯化(部分或实质上)多核苷酸。分离的RNA分子包括体内或体外RNA多核苷酸转录物，其中转录物不是将见于自然界中的转录物。分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的所述分子。此外，多核苷酸或核酸可为或可包括调控元件诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如本文所用，术语“非天然存在的多核苷酸”或其任何语法变化形式是明确排除但仅排除所述核酸或多核苷酸的由或可能由评判者或行政或司法机关确定或解释为“天然存在”的那些形式的条件性定义。
如本文所用，“编码区”是由被翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不被翻译成氨基酸，但它可被视为编码区的一部分，但例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等任何侧接序列不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单一多核苷酸构建体中，例如在单一载体上，或存在于单独多核苷酸构建体中，例如在单独(不同)载体上。此外，任何载体都可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如单一载体可单独编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，载体、多核苷酸或核酸可包括融合或未融合于另一编码区的异源性编码区。异源性编码区包括不限于编码专门化元件或基序诸如分泌信号肽或异源性功能性结构域的那些。
在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可包括可操作地与一个或多个编码区缔合的启动子和/或其他转录或转译控制元件。可操作缔合是在以下情况下时：例如多肽的基因产物的编码区以将所述基因产物的表达置于调控序列的影响或控制下的方式与一个或多个调控序列相关联。如果诱导启动子功能会导致编码所需基因产物的mRNA的转录，以及如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调控序列引导基因产物的表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，那么两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相缔合的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么启动子区域将可操作地与那个核酸缔合。启动子可为在预定细胞中引导DNA的实质性转录的细胞特异性启动子。除启动子之外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，也可可操作地与多核苷酸缔合以引导细胞特异性转录。
多种转录控制区为本领域技术人员所知。这些转录控制区包括不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子-A联合)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(诸如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcomavirus))的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白(actin)、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中的基因表达的其他序列。额外适合转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子(例如可由干扰素或白介素诱导的启动子)。
类似地，多种翻译控制元件为本领域普通技术人员所知。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子、以及源于微小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也被称为CITE序列)。
在其他实施方案中，多核苷酸可为RNA，例如呈信使RNA(mRNA)、转移RNA或核糖体RNA形式。
多核苷酸和核酸编码区可与编码引导由如本文公开的多核苷酸编码的多肽的分泌的分泌肽或信号肽的额外编码区相缔合。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦增长蛋白质链跨越粗糙内质网的输出已被引发，所述信号肽或分泌前导序列即从成熟蛋白质裂解。本领域普通技术人员应了解由脊椎动物细胞分泌的多肽可具有融合于多肽的N末端的信号肽，其从完全或“全长”多肽裂解以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方案中，使用天然信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或那个序列的保留引导可操作地与它缔合的多肽的分泌的能力的功能性衍生物。或者，可使用异源性哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。举例来说，野生型前导序列可被人组织纤维蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶的前导序列取代。
本文公开某些结合分子或其抗原结合片段、变体或衍生物。除非明确提及全尺寸抗体，否则术语“结合分子”涵盖全尺寸抗体以及所述抗体的抗原结合亚单位、片段、变体、类似物或衍生物，例如以与抗体分子类似的方式结合抗原，但使用不同骨架的经工程改造抗体分子或片段。
如本文所用，术语“结合分子”以它的最广泛意义指代特异性结合受体例如表位或抗原决定簇的分子。如本文进一步所述，结合分子可包含一个或多个本文所述的“抗原结合结构域”。结合分子的一非限制性实例是抗体或其保留抗原特异性结合的片段。
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗原结合结构域”是指结合分子的为特异性结合表位所必需，并且足以特异性结合表位的区域。举例来说，“Fv”，例如抗体的呈两个单独多肽亚单位形式或呈单链形式的可变重链和可变轻链，被视为“结合结构域”。其他结合结构域包括不限于源于骆驼科动物物种的抗体的可变重链(VHH)，或在纤维连接蛋白骨架中表达的六个免疫球蛋白互补决定区(CDR)。如本文所述的“结合分子”可包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或更多个“抗原结合结构域”。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”可在本文中可互换使用。抗体(或如本文公开的其片段、变体或衍生物)包括至少重链可变区(对于骆驼科动物物种)或至少重链可变区和轻链可变区。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构是相对充分了解的。参见例如Harlow等，Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)。除非另外陈述，否则术语“抗体”涵盖在从抗体的小抗原结合片段至全尺寸抗体的范围内的任何事物，例如包括两个完全重链和两个完全轻链的IgG抗体、包括四个完全重链和四个完全轻链，并且任选包括J链和/或分泌组分的IgA抗体、或包括十个或十二个完全重链和十个或十二个完全轻链，并且任选包括J链的IgM抗体。
如将在以下更详细讨论，术语“免疫球蛋白”包括可加以生物化学区分的各种广泛类别的多肽。本领域技术人员将了解，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε(gamma、mu、alpha、delta、epsilon)，在它们之中具有一些子类(例如γ1-γ4或α1-α2)。这个链的性质将抗体的“类别”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白子类(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等是充分表征的，并且已知其会赋予功能专门化。这些类别和同种型中的各者的经修饰形式可易于为熟练技术人员鉴于本公开所辨别，因此，在本公开的范围内。
轻链被分类为κ或λ(kappa、lambda)。各重链类别可与κ或λ轻链结合。一般来说，当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或经遗传工程改造宿主细胞产生时，轻链和重链彼此共价键合，并且两个重链的“尾部”部分通过共价二硫键联或非共价键联来彼此键合。在重链中，氨基酸序列从在Y构型的叉形末端的N末端延伸至在各链的底部的C末端。某些抗体例如IgG抗体的基本结构包括通过二硫键来共价连接以形成“Y”结构的两个重链亚单位和两个轻链亚单位，所述“Y”结构在本文中也称为“H2L2”结构。
轻链与重链两者均被分成具有结构和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”就功能而言加以使用。就此而言，应了解可变轻(VL)链部分与可变重(VH)链部分两者的可变区决定抗原识别和特异性。相反，轻链的恒定区(CL)和重链的恒定区(CH1、CH2或CH3)赋予生物性质，诸如分泌、经胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯列，恒定区的编号随着它们变得更加远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N末端部分是可变区，并且在C末端部分是恒定区；CH3(或在IgM的情况下的CH4)和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
如上所指示，可变区(即“结合结构域”)允许结合分子选择性识别和特异性结合抗原上的表位。也就是说，结合分子例如抗体的VL区和VH区或互补决定区(CDR)子组组合以形成限定三维抗原结合位点的可变区。更具体来说，抗原结合位点由在VH链和VL链中的各者上的三个CDR限定。某些抗体形成较大结构。举例来说，IgA可形成包括以下各物的分子：两个H2L2单元、J链和分泌组分，全都通过二硫键加以共价连接；并且IgM可形成包括以下各物的五聚或六聚分子：五个或六个H2L2单元以及任选J链，通过二硫键加以共价连接。
存在于抗体抗原结合结构域中的六个“互补决定区”或“CDR”是短的非连续氨基酸序列，其在抗体在水性环境中采用它的三维构型时加以特定定位以形成结合结构域。结合结构域中的其余氨基酸，被称为“框架”区，显示较小分子间可变性。框架区主要采用β折叠构象，并且CDR形成连接β折叠结构，并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分的环。因此，框架区起形成骨架的作用，所述骨架提供使CDR通过链间非共价相互作用来以正确定向定位。由经定位CDR形成的结合结构域限定互补于免疫反应性抗原上的表位的表面。这个互补性表面促进抗体与它的同源表位的非共价结合。本领域普通技术人员可易于鉴定任何给定重链可变区或轻链可变区的分别组成CDR和框架区的氨基酸，因为它们已以各种不同方式加以定义(参见"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"Kabat,E.等,U.S.Department of Health and Human Services,(1983)；以及Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)，其以引用的方式整体并入本文)。
在其中对本领域内使用和/或接受的术语存在两种或更多种定义的情况下，如本文所用的所述术语的定义意图包括所有所述含义，除非明确相反陈述。一特定实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述见于重链多肽与轻链多肽两者的可变区内的非连续抗原结合位点。这些特定区域已例如由Kabat等，U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of Proteins of Immunological Interest"(1983)以及由Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述，所述书籍和文献以引用方式并入本文。当相对于彼此加以比较时，Kabat定义和Chothia定义包括重叠氨基酸或氨基酸子组。然而，将任一定义(或为本领域普通技术人员所知的其他定义)应用于指代抗体或其变体的CDR都意图在如本文定义和使用的所述术语的范围内。以下在表1中阐述如由以上引用的参考文献中的各者定义的涵盖CDR的适当氨基酸作为比较。涵盖特定CDR的确切氨基酸数目将视CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规方式确定哪些氨基酸包含特定CDR。
表1：CDR定义1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1表1中所有CDR定义的编号都根据由Kabat等人阐述的编号惯例(参见下文)。
免疫球蛋白可变区也可使用IMGT信息系统(www://imgt.cines.fr/)(/V-Quest)来分析以鉴定可变区区段，包括CDR。参见例如Brochet,X.等，Nucl.AcidsRes.36:W503-508(2008)。
Kabat等人也定义了可适用于任何抗体的针对可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可将这个“Kabat编号”系统明确指定于任何可变区序列，而不依赖于超出序列自身的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等，U.S.Dept.of Health andHuman Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)阐述的编号系统。然而，除非明确指示使用Kabat编号系统，否则连续编号用于本公开中的所有氨基酸序列。
结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL区或VH区的片段、通过Fab表达文库来产生的片段。ScFv分子在本领域中是已知的，并且例如描述于美国专利5,892,019中。由本公开涵盖的免疫球蛋白或抗体分子可具有免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。
就“特异性结合”来说，它通常意指结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物通过它的抗原结合结构域来结合表位，并且结合必然伴有抗原结合结构域与所述表位之间的某一互补性。根据这个定义，结合分子在以下情况下时被称为“特异性结合”表位：相比于它将结合随机无关表位，它更易于通过它的抗原结合结构域来结合那个表位。术语“特异性”在本文中用于定性某一结合分子结合某一表位所采用的相对亲和力。举例来说，相比于结合分子“B”，结合分子“A”可被视为对给定表位具有更高特异性，或相比于它对相关表位“D”具有的特异性，结合分子“A”可被称为以更高特异性结合表位“C”。
本文公开的结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物可被称为以小于或等于5X10-2 sec-1、10-2sec-1、5X10-3 sec-1、10-3sec-1、5X10-4 sec-1、10-4sec-1、5X10-5 sec-1、或10-5sec-1、5X10-6 sec-1、10-6sec-1、5X10-7 sec-1、或10-7sec-1的解离速率(k(off))结合靶标抗原。
本文公开的结合分子例如抗体或抗原结合片段、变体或衍生物可被称为以大于或等于103M-1sec-1、5X103 M-1sec-1、104M-1sec-1、5X104 M-1sec-1、105M-1sec-1、5X105 M-1sec-1、106M-1sec-1、或5X106 M-1sec-1、或107M-1sec-1的缔合速率(k(on))结合靶标抗原。
如果存在以下情况，那么结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物被称为竞争性抑制参照抗体或抗原结合片段与给定表位的结合：在它在某种程度上阻断所述参照抗体或抗原结合片段与所述表位的结合的程度上，它优先结合那个表位。竞争性抑制可通过本领域中已知的任何方法例如竞争ELISA测定来测定。结合分子可被称为以竞争性方式使参照抗体或抗原结合片段与给定表位的结合抑制至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
如本文所用，术语“亲和力”是指个别表位与例如免疫球蛋白分子的一个或多个结合结构域的结合的强度的量度。参见例如Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)，在第27-28页。如本文所用，术语“亲合力”是指结合结构域群体与抗原之间的复合物的总体稳定性。参见例如Harlow，在第29-34页。亲合力与群体中个别结合结构域与特定表位的亲和力相关，并且也与免疫球蛋白和抗原的效价相关。举例来说，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构的抗原诸如聚合物之间的相互作用将是高亲合力相互作用。二价单克隆抗体与在高密度下存在于细胞表面上的受体之间的相互作用将也具有高亲合力。
如本文公开的结合分子或其抗原结合片段、变体或衍生物也可以它们的交叉反应性加以描述或指定。如本文所用，术语“交叉反应性”是指对一种抗原具有特异性的结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物与第二抗原反应的能力；其是两种不同抗原物质之间的相关性的量度。因此，如果结合分子结合除诱导它的形成的表位以外的表位，那么它具有交叉反应性。交叉反应性表位与诱导性表位通常含有许多相同互补性结构特征，并且在一些情况下，可实际上优于原始表位进行配合。
结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物也可以它们对抗原的结合亲和力加以描述或指定。举例来说，结合分子可以不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10- 4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10- 15M、或10-15M的解离常数或KD结合抗原。
包括单链抗体或其他结合结构域的抗体片段可单独存在，或与以下中的一者或多者组合存在：铰链区、CH1、CH2、CH3或CH4结构域、J链或分泌组分。也包括的是可包括可变区与以下中的一者或多者的任何组合的抗原结合片段：铰链区、CH1、CH2、CH3或CH4结构域、J链或分泌组分。结合分子例如抗体或其抗原结合片段可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。抗体可为人抗体、鼠抗体、驴抗体、兔抗体、山羊抗体、豚鼠抗体、骆驼抗体、美洲驼抗体、马抗体或鸡抗体。在另一实施方案中，在来源方面，可变区可为软骨鱼可变区(例如来自鲨鱼)。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库分离的抗体，或从就一种或多种人免疫球蛋白来说是转基因性的，并且在一些情况下可表达内源性免疫球蛋白，而在一些情况下不表达内源性免疫球蛋白的动物分离的抗体，如下文以及例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598中所述。
如本文所用，术语“重链亚单位”包括源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列，包含重链亚单位的结合分子例如抗体包括以下中的至少一者：VH区、CH1结构域、铰链(例如上铰链区、中铰链区和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或其变体或片段。举例来说，除VH区之外，结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物也可包括CH1结构域；CH1结构域、铰链和CH2结构域；CH1结构域和CH3结构域；CH1结构域、铰链和CH3结构域；或CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。在某些方面，除VH区之外，结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物也可包括CH3结构域和CH4结构域；或CH3结构域、CH4结构域和J链。此外，用于本公开中的结合分子可缺乏某些恒定区部分，例如CH2结构域的全部或一部分。本领域普通技术人员将了解，这些结构域(例如重链亚单位)可被修饰以使它们在氨基酸序列方面从原始免疫球蛋白分子进行变化。
结合分子(例如抗体或其片段)的重链亚单位可包括源于不同免疫球蛋白分子的结构域。举例来说，多肽的重链亚单位可包括源于IgG1分子的CH1结构域和源于IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链亚单位可包括部分地源于IgG1分子以及部分地源于IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链亚单位可包含部分地源于IgG1分子以及部分地源于IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所用，术语“轻链亚单位”包括源于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。轻链亚单位包括以下中的至少一者：VL或CL(例如Cκ或Cλ)结构域。
结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可以它们识别或特异性结合的抗原的表位或部分加以描述或指定。靶标抗原的与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的部分是“表位”或“抗原决定簇”。视抗原的大小、构象和类型而定，靶标抗原可包含单一表位或至少两个表位，并且可包括许多表位。
如先前所指示，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚单位结构和三维构型是熟知的。如本文所用，术语“VH区”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变区，并且术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(最靠近氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域邻近于VH区，并且在典型免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
如本文所用，术语“CH2结构域”包括在使用常规编号流程的情况下，重链分子的例如从IgG抗体的约氨基酸244延伸至氨基酸360的部分(氨基酸244至360，Kabat编号系统；以及氨基酸231-340，EU编号系统；参见Kabat EA等(在前面所引用的书中))。CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C末端，并且包含约108个氨基酸。某些免疫球蛋白类别例如IgM还包括CH4区。
如本文所用，术语“铰链区”包括重链分子的使CH1结构域接合于CH2结构域的部分。这个铰链区包含约25个氨基酸，并且是柔性的，因此允许两个N末端抗原结合区独立移动。
如本文所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可与第二硫醇基团形成二硫键或二硫桥的硫醇基团。在某些IgG分子中，CH1区和CL区由二硫键连接，并且在使用Kabat编号系统的情况下，两个重链由在对应于239和242的位置处的两个二硫键连接(位置226或229，EU编号系统)。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫反应性区域或位点从第一物种获得或源于第一物种，而恒定区(其可为完整的、部分的或经修饰的)从第二物种获得的抗体。在一些实施方案中，靶标结合区域或位点将来自非人来源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区是人恒定区。
术语“多特异性抗体”或“双特异性抗体”是指在单一抗体分子内具有针对两个或更多个不同表位的结合结构域的抗体。除典型抗体结构之外，其他结合分子也可被构建来具有两个结合特异性。由双特异性或多特异性抗体达成的表位结合可为同时的或依序的。三源杂交瘤和杂交杂交瘤是可分泌双特异性抗体的细胞系的两个实例。双特异性抗体也可通过重组手段来构建。(和Heiss,Future Oncol.6:1387-94(2010)；Mabry和Snavely,IDrugs.13:543-9(2010))。双特异性抗体也可为微型双功能抗体。
如本文所用，术语“经工程改造抗体”是指其中重链和轻链或两者中的可变区通过至少部分置换CDR或框架区中的一个或多个氨基酸来改变的抗体。在某些方面，可将来自具有已知特异性的抗体的整个CDR移植至异源性抗体的框架区中。尽管交替CDR可源于与框架区所源于的抗体具有相同类别或甚至子类的抗体，但CDR也可源于不同类别的抗体，例如源于来自不同物种的抗体。其中一个或多个来自具有已知特异性的非人抗体的“供者”CDR被移植至人重链框架区或轻链框架区中的经工程改造抗体在本文中称为“人源化抗体”。在某些方面，并非所有CDR都用来自供者可变区的完全CDR置换，然而供者的抗原结合能力可仍然被转移至接受者可变区中。鉴于例如美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370中阐述的解释，将完全在本领域技术人员的能力内的是，通过进行常规实验或通过试错测试来获得功能性经工程改造或人源化抗体。
如本文所用，术语“工程改造”包括通过合成手段来操作核酸或多肽分子(例如通过重组技术、体外肽合成、通过对肽进行酶促或化学偶联、或这些技术的某一组合)。
如本文所用，术语“连接”、“融合(fused/fusion)”或其他语法等效形式可互换使用。这些术语是指通过包括化学缀合或重组手段的无论什么手段来使两个或更多个要素或组分接合在一起。“同框融合”是指以维持原始ORF的翻译阅读框的方式使两个或更多个多核苷酸开放阅读框(ORF)接合以形成连续较长ORF。因此，重组融合蛋白是含有两个或更多个对应于由原始ORF编码的多肽的区段的单一蛋白质(所述区段在自然界中通常不这样接合)。尽管由此使得阅读框遍及融合区段是连续的，但区段可由例如同框接头序列加以物理分隔或空间分隔。举例来说，可同框融合编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸，但由编码至少一个免疫球蛋白框架区或额外CDR区的多核苷酸分隔，只要“融合”CDR作为连续多肽的一部分加以共翻译即可。
在多肽的情形下，“线性序列”或“序列”是多肽中处于氨基末端至羧基末端方向的一定顺序的氨基酸，其中在序列中彼此相邻的氨基酸在多肽的一级结构中是连续的。多肽的在多肽的另一部分的“氨基末端”或“N末端”的部分是在连续多肽链中较早出现的那个部分。类似地，多肽的在多肽的另一部分的“羧基末端”或“C末端”的部分是在连续多肽链中较迟出现的那个部分。举例来说，在典型抗体中，可变区在恒定区的“N末端”，并且恒定区在可变区的“C末端”。
如本文所用的术语“表达”是指基因产生生物化学物质例如多肽所采用的过程。所述过程包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现形式，包括不限于基因敲低以及短暂表达与稳定表达两者。这包括不限于使基因转录成信使RNA(mRNA)，以及使所述mRNA翻译成多肽。如果最终所需产物是生物化学物质，那么表达包括产生那个生物化学物质和任何前体。基因的表达会产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可为核酸例如通过基因转录产生的信使RNA、或从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰例如多腺苷酸化的核酸、或具有翻译后修饰例如甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白质亚单位缔合、蛋白水解裂解等的多肽。
如本文所用，术语“抗SEMA4D结合分子”是指特异性结合SEMA4D的分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。除非明确提及全尺寸抗体诸如天然存在的抗体，否则术语“抗SEMA4D抗体”涵盖全尺寸抗体以及抗原结合片段以及所述抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或以与抗体分子类似的方式结合抗原的经工程改造抗体分子或片段。
诸如“治疗(treating/treatment)”或“用以治疗(to treat)”或“缓和(alleviating)”或“用以缓和(to alleviate)”的术语是指治愈、减缓、减轻现有经诊断病理性病症或疾患的症状，和/或使现有经诊断病理性病症或疾患的进展停止或减缓的治疗性措施。诸如“预防(prevent/prevention)”、“避免”、“制止”等的术语是指防止未诊断的所靶向病理性病症或疾患的显现的防治性或预防性措施。因此，“需要治疗者”可包括已患有疾患者；倾向于患有疾患者；以及待预防疾患者。如本文所用，诸如“将受益于疗法的受试者”和“需要治疗的动物”的短语包括将受益于施用如本文所述的疗法的受试者，诸如哺乳动物受试者。
术语“治疗有效量”是指抗体、多肽、多核苷酸、小有机分子或其他药物的有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或疾患的量。
就“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”来说，其意指需要诊断、预后或疗法的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家养动物、农场动物和动物园动物、运动动物或玩赏动物，诸如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、母牛、熊等。
靶多肽描述–SEMA4D
如本文所用，术语“脑信号蛋白-4D”、“SEMA4D”和“SEMA4D多肽”可互换使用，“SEMA4D”和“Sema4D”也可互换使用。在某些实施方案中，SEMA4D在细胞的表面上表达，或由细胞分泌。在另一实施方案中，SEMA4D是膜结合型的。在另一实施方案中，SEMA4D是可溶性的，例如sSEMA4D。在另一实施方案中，SEMA4D可包括全尺寸SEMA4D或其片段、或SEMA4D变异多肽，其中SEMA4D的片段或SEMA4D变异多肽保留全尺寸SEMA4D的一些或所有功能性质。
全尺寸人SEMA4D蛋白是一种由两个150kDa多肽链组成的同二聚跨膜蛋白。SEMA4D属于脑信号蛋白细胞表面受体家族，并且也被称为CD100。人SEMA4D/Sema4D与小鼠SEMA4D/Sema4D两者均可从它们的跨膜形式以蛋白水解方式裂解以产生120kDa可溶性形式，从而产生两个Sema4D亚型(Kumanogoh等，J.Cell Science116:3464(2003))。脑信号蛋白由最初被确定为在神经元与它们的适当靶标之间建立精确连接方面起重要作用的轴突导向因子的可溶性蛋白和膜结合型蛋白组成。在结构上被视为IV类脑信号蛋白，SEMA4D由氨基末端信号序列继之以含有17个保守半胱氨酸残基的特征性‘Sema’结构域、Ig样结构域、富含赖氨酸的链段、疏水性跨膜区域和细胞质尾部组成。
SEMA4D多肽包括约13个氨基酸的信号序列继之以约512个氨基酸的脑信号蛋白结构域、约65个氨基酸的免疫球蛋白样(Ig样)结构域、104个氨基酸的富含赖氨酸的链段、约19个氨基酸的疏水性跨膜区域、以及110个氨基酸的细胞质尾部。细胞质尾部中的用于酪氨酸磷酸化的共有位点支持SEMA4D与酪氨酸激酶的预测缔合(Schlossman等人编(1995)Leucocyte Typing V(Oxford University Press,Oxford))。
已知SEMA4D具有至少三个功能性受体，即丛蛋白-B1、丛蛋白-B2和CD72。丛蛋白-B1在非淋巴组织中表达，并且已显示其是SEMA4D的高亲和力(1nM)受体(Tamagnone等,Cell99:71-80(1999))。已显示SEMA4D刺激丛蛋白-B1信号传导会诱导神经元的生长锥崩塌，并且诱导寡树突细胞的突起延伸崩塌和凋亡(Giraudon等，J.Immunol.172:1246-1255(2004)；Giraudon等，NeuroMolecular Med.7:207-216(2005))。在结合SEMA4D之后，丛蛋白-B1信号传导介导R-Ras的失活，从而导致整合素介导的对细胞外基质的附着的降低，以及RhoA的活化，从而导致由细胞骨架的重新组织所引起的细胞崩塌(Kruger等,NatureRev.Mol.Cell Biol.6:789-800(2005)；Pasterkamp,TRENDS in Cell Biology 15:61-64(2005))。丛蛋白-B2对SEMA4D具有中等亲和力，并且新近报道指示丛蛋白-B2在角质化细胞上表达，并且使SEMA4D阳性γδT细胞活化以促进上皮修复(Witherden等，Immunity 37:314-25(2012))。
在淋巴组织中，CD72被用作低亲和力(300nM)SEMA4D受体(Kumanogoh等，Immunity13:621-631(2000))。B细胞和抗原递呈细胞(APC)表达CD72，并且抗CD72抗体与sSEMA4D具有许多相同作用，诸如增强CD40诱导的B细胞应答和B细胞CD23脱落。CD72被认为通过募集可与许多抑制性受体缔合的酪氨酸磷酸酶SHP-1来充当B细胞应答的负性调控剂。SEMA4D与CD72的相互作用导致SHP-1的解离，以及丧失这个负性活化信号。已显示SEMA4D在体外促进T细胞刺激以及B细胞聚集和存活。添加SEMA4D表达性细胞或sSEMA4D在体外使CD40诱导的B细胞增殖和免疫球蛋白产生增强，并且在体内加速抗体应答(Ishida等，Inter.Immunol.15:1027-1034(2003)；Kumanogoh和H.Kukutani,Trends in Immunol.22:670-676(2001))。sSEMA4D使CD40诱导的DC成熟增强，包括上调共刺激性分子和增加IL-12的分泌。此外，sSEMA4D可抑制免疫细胞迁移，此可通过添加阻断性抗SEMA4D小鼠抗体来逆转(Elhabazi等，J.Immunol.166:4341-4347(2001)；Delaire等，J.Immunol.166:4348-4354(2001))。
Sema4D在高水平下在包括脾、胸腺和淋巴结的淋巴器官中，以及在非淋巴器官诸如脑、心脏和肾中表达。在淋巴器官中，Sema4D在静息T细胞上大量表达，但在静息B细胞和抗原递呈细胞(APC)诸如树突细胞(DC)上仅微弱表达。
细胞活化使SEMA4D的表面表达以及可溶性SEMA4D(sSEMA4D)的产生增加。SEMA4D的表达样式表明它在免疫系统中起重要生理性以及病理性作用。已显示SEMA4D会促进B细胞活化、聚集和存活；使CD40诱导的增殖和抗体产生增强；使对T细胞依赖性抗原的抗体应答增强；使T细胞增殖增加；使树突细胞成熟以及刺激T细胞的能力增强；并且直接牵涉于脱髓鞘和轴突变性中(Shi等，Imm unity 13:633-642(2000)；Kumanogoh等，J.Immunol.169:1175-1181(2002)；以及Watanabe等,J.Immunol.167:4321-4328(2001))。
人抗SEMA4D抗体
本公开提供一种抗SEMA4D结合分子，例如抗SEMA4D结合分子，例如具有与分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5的VH和VL相关或同一的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。在某些方面，所提供结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)是完全人结合分子。
在某些方面，本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)具有VH区和VL区，所述VH区和VL区包含与具有分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5的VH区和VL区的参照抗SEMA4D抗体分子的VH区和VL区具有至少约80％、约85％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同一性的氨基酸序列。
在某些方面，抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可抑制SEMA4D与它的受体例如丛蛋白-B1、丛蛋白-B2或CD72的相互作用。在某些方面，抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可抑制SEMA4D介导的丛蛋白-B1信号转导。
在某些方面，抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)竞争性抑制包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的可变重链区(VH)和含有氨基酸序列SEQ IDNO:5的可变轻链区(VL)的参照抗体结合SEMA4D。在某些方面，抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)与包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VL的参照抗体结合相同SEMA4D表位。在某些方面，抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的VH包含三个互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且VL包含三个CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述CDR分别包含氨基酸序列SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，例外之处是在所述CDR中的一者或多者中具有至少一个、两个、三个、四个、五个或六个单一保守性氨基酸取代。在某些方面，CDR分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
在某些方面，抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的VH包含与SEQ ID NO:1至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列，并且抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的VL包含与SEQ IDNO:5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列。在某些方面，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:1，并且VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。
本文也提供编码如本文所述的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多肽、编码所述多肽的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、以及包含所述载体或多核苷酸的宿主细胞，其例如用于产生如本文提供的抗SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。
抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的适合生物活性变体)由本公开提供，并且可根据本文提供的方法或根据为本领域普通技术人员熟知的方法来制备和使用。所述变体保留本文提供的参照抗SEMA4D抗体的某些所需结合性质。用于制备抗体变体的方法通常在本领域中是可用的。
用于诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域中是熟知的。参见例如Walker和Gaastra编(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company,New York)；Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492(1985)；Kunkel等,MethodsEnzymol.154:367-382(1987)；Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor,N.Y.)；美国专利号4,873,192；以及其中引用的参考文献；其以引用的方式并入本文。关于不影响目标多肽的生物活性的适当氨基酸取代的指导可见于以引用的方式整体并入本文的Dayhoff等(1978),Atlas of Protein Sequence andStructure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.),第345-352页的模型中。Dayhoff等人的模型使用点接受突变(PAM)氨基酸类似性矩阵(PAM250矩阵)来确定适合保守性氨基酸取代。在某些方面，使用保守性取代，诸如使一个氨基酸与具有类似性质的另一氨基酸交换。如由Dayhoff等人的模型的PAM 250矩阵教导的保守性氨基酸取代的实例包括但不限于 和
在构建抗SEMA4D结合分子例如抗体或其抗原结合片段、目标多肽的变体时，进行修饰以使变体继续具有所需性质，例如能够特异性结合例如在细胞的表面上表达或由细胞分泌的SEMA4D例如人SEMA4D、非人灵长类动物SEMA4D(例如食蟹猴、狨猴和/或恒河猴SEMA4D)和/或啮齿动物SEMA4D(例如小鼠和/或大鼠SEMA4D)，其中结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物具有如本文所述的SEMA4D结合、受体阻断或中和活性。在某些方面，在编码变异多肽的DNA中进行的突变维持阅读框，并且不创建可产生二级mRNA结构的互补性区域。参见欧洲专利申请公布号75,444。
用于测量抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的结合特异性和/或活性的方法包括但不限于标准结合测定，包括竞争性结合测定、用于监测由T细胞或B细胞达成的免疫球蛋白分泌的测定、T细胞增殖测定、凋亡测定、ELISA测定等。参见例如WO 93/14125；Shi等，Immunity 13:633-642(2000)；Kumanogoh等，J.Immunol.169:1175-1181(2002)；Watanabe等，J.Immunol.167:4321-4328(2001)；Wang等，Blood 97:3498-3504(2001)；以及Giraudon等，J.Immunol.172:1246-1255(2004)中公开的所述测定，所述文献全都以引用的方式并入本文。
当在本文中讨论本文公开的包括恒定区、CDR、VH区或VL区的任何特定多肽是否与另一多肽至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或甚至约100％同一时，同一性％可使用本领域中已知的方法和计算机程序/软件来测定。供比较的序列的最优比对可例如通过局部同源性算法(Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482-489(1981))、通过整体比对算法(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970))、通过类似性搜索方法(Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988)；Altschul等,Nucl.Acids Res.25:3389-402(1997))、通过这些算法的通常使用缺省设置的计算机化执行程序(例如Wisconsin Genetics软件包(Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST)、或通过手动比对和目视检查(参见例如CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel等(编),1994)来进行。
出于本公开的目的，序列同一性百分比可使用Smith-Waterman同源性搜索算法，采用空位开放罚分12和空位延伸罚分2、BLOSUM矩阵62，利用搜索来测定。变体可例如与参照抗SEMA4D抗体(例如本文提供的MAb 2517)有少至1至15个氨基酸残基、少至1至10个氨基酸残基诸如6-10个氨基酸残基、少至5个、少至4个、3个、2个或甚至1个氨基酸残基的差异。
在某些方面，本公开提供一种特异性结合SEMA4D的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体或其片段包含VH和VL。在某些方面，VH包含互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR包含分别与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同一，或除所述HCDR中的一者、两者或全部三者中的一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸取代之外分别与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同一的氨基酸序列。在某些方面，HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同一的氨基酸序列。在某些方面，VL包含互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR包含分别与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8同一，或除所述LCDR中的一者、两者或全部三者中的一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸取代之外分别与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8同一的氨基酸序列。在某些方面，LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别与SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8同一的氨基酸序列。在某些方面，VH还包含框架区(HFW)HFW1、HFW2、HFW3和HFW4，并且VL还包含框架区(LFW)LFW1、LFW2、LFW3和LFW4。在某些方面，框架区源于人抗体。在某些方面，例如当抗体将用于非人模型系统中时，框架区源于非人抗体例如小鼠抗体。在某些方面，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。在某些方面，VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。
在某些方面，本公开提供一种特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的包含VH和VL的抗体例如全人抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。在某些方面，VH包含与SEQ ID NO:1至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。在某些方面，VL包含与SEQ ID NO:5至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。在某些方面，VH包含与SEQ ID NO:1至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列；并且VL包含与SEQ ID NO:5至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。在某些方面，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:1，并且VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。在某些方面，VH和VL是全人VH和VL。
在某些方面，如本文提供的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可特异性结合人SEMA4D、啮齿动物SEMA4D例如小鼠SEMA4D和/或大鼠SEMA4D、和/或非人灵长类动物SEMA4D例如食蟹猴SEMA4D和/或狨猴SEMA4D。
在某些方面，抗体或其片段、变体或衍生物还包含融合于VH的C末端的重链恒定区或其片段、变体或衍生物。重链恒定区或其片段可源于任何物种，但在某些方面，重链恒定区或其片段、变体或衍生物是人重链恒定区或源于人重链恒定区，例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE或IgM恒定区。在某些方面，重链恒定区是人IgG4恒定区或其片段、变体或衍生物。在某些方面，例如当所提供抗SEMA4D抗体或其片段将用于非人模型系统中时，重链恒定区或其片段可为非人重链恒定区，例如鼠重链恒定区诸如鼠IgG1恒定区。
在某些方面，抗体或其片段、变体或衍生物还包含融合于VL的C末端的轻链恒定区或其片段、变体或衍生物。轻链恒定区或其片段可源于任何物种，但在某些方面，轻链恒定区或其片段源于人轻链恒定区，例如人κ或λ恒定区。在某些方面，轻链恒定区或其片段、变体或衍生物是人λ轻链恒定区，或源于人λ轻链恒定区。在某些方面，轻链恒定区是人λ恒定区。在某些方面，例如当所提供抗SEMA4D抗体或其片段将用于非人模型系统中时，轻链恒定区或其片段可为非人轻链恒定区，例如鼠轻链恒定区诸如鼠λ恒定区。
在某些方面，本公开提供一种包含如上所述的VH区和VL区的抗SEMA4D抗体片段。在某些方面，片段可为例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、单链Fv片段(scFv)或二硫键连接的Fv片段(sdFv)。
在某些方面，由本公开提供的抗SEMA4D抗体或其片段、变体或衍生物可为多特异性的，例如双特异性的。除如本文提供的SEMA4D抗体的结合性质之外，如本文提供的多特异性抗体或其片段也可结合额外SEMA4D表位或可结合其他无关表位。
在某些方面，如本文提供的抗SEMA4D抗体或其片段可以特征在于解离常数KD不大于500nM、100nM、50.0nM、40.0nM、30.0nM、20.0nM、10.0nM、9.0nM、8.0nM、7.0nM、6.0nM、5.0nM、4.0nM、3.0nM、2.0nM、1.0nM、0.50nM、0.10nM、0.050nM、0.01nM、0.005nM或0.001nM的结合亲和力特异性结合SEMA4D例如人SEMA4D、小鼠SEMA4D、食蟹猴SEMA4D、狨猴SEMA4D，或它们的任何组合。用于测量抗体或其片段对SEMA 4D的KD的方法和装置诸如BIACORE为本领域普通技术人员所熟知。
在某些方面，由本公开提供的抗SEMA4D抗体或其片段可抑制SEMA4D结合SEMA4D受体，例如丛蛋白-B1、丛蛋白-B2和/或CD72。
在某些方面，本文提供的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物是全人抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，并且在向人受试者施用后引发最小抗抗体免疫应答或不引发抗抗体免疫应答。用以测量受试者中的抗抗体免疫应答的方法在本领域中是熟知的。参见例如Darwish,IA,Int.J.Biomed.Sci.2:217-235(2006)。
可以许多方式使抗SEMA4D抗体的恒定区突变以改变效应物功能。举例来说，参见美国专利号6,737,056B1和美国专利申请公布号2004/0132101A1，其公开使抗体与Fc受体的结合最优化的Fc突变。
在某些本文提供的抗SEMA4D结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物中，可使用本领域中已知的技术来使Fc部分突变以调节例如增加或降低效应物功能。举例来说，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他手段)可降低Fc受体对循环经修饰抗体的结合，由此使肿瘤定位增加。在其他情况下，符合本公开的恒定区修饰调节补体结合，因此可使血清半衰期增加或降低。恒定区的其他修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分，此举由于抗原特异性或抗体柔性增加而允许达成定位增强。由修饰所致的生理概况、生物可用度和其他生物化学作用，诸如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期，可易于使用熟知免疫技术在不进行过度实验下来测量和定量。
本文提供的抗SEMA4D结合分子例如抗体或其片段包括例如通过以下方式来修饰的衍生物：使任何类型的分子共价连接于抗体以使共价连接不阻止抗体特异性结合它的同源表位。举例而非以限制方式来说，抗体衍生物包括已例如通过以下方式来修饰的抗体：糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/封阻基团达成的衍生化、蛋白水解裂解、连接于细胞配体或其他蛋白质等。众多化学修饰中的任一者都可通过已知技术来进行，所述技术包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化等。另外，衍生物可含有一个或多个非经典氨基酸。
“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有携带类似电荷的侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。本领域中已定义具有携带类似电荷的侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。或者，突变可诸如通过饱和诱变来沿编码序列的全部或一部分加以随机引入，并且所得突变体可关于生物活性加以筛选以鉴定保留活性(例如，结合抗SEMA4D多肽的能力、阻断SEMA4D与它的受体的相互作用的能力、或抑制、延迟或降低受试者例如癌症患者中的转移的能力)的突变体。
举例来说，有可能仅在抗体分子的框架区中或仅在抗体分子的CDR区中引入突变。所引入突变可为沉默或中性错义突变，即对抗体结合抗原的能力不具有影响，或具有少许影响。这些类型的突变可适用于使密码子使用最优化或使杂交瘤的抗体产生改进。或者，非中性错义突变可改变抗体结合抗原的能力。本领域技术人员将能够设计和测试具有所需性质的突变分子，所述所需性质诸如在抗原结合活性方面不改变或在结合活性方面改变(例如，在抗原结合活性方面改进或在抗体特异性方面变化)。在诱变之后，所编码蛋白质可以常规方式表达，并且所编码蛋白质的功能活性和/或生物活性(例如免疫特异性结合SEMA4D多肽的至少一个表位的能力)可使用本文所述的技术或通过以常规方式修改本领域中已知的技术来测定。
在某些方面，本文提供的抗SEMA4D结合分子例如抗体或其片段可包含至少一个优化互补决定区(CDR)。就“优化CDR”来说，其意指CDR已被修饰和优化以改进对包含优化CDR的抗SEMA4D结合分子赋予的结合亲和力和/或抗SEMA4D活性。“抗SEMA4D活性”或“SEMA4D阻断活性”可包括调节例如降低、消除、减小或阻止一种或多种SEMA4D活性的活性。非限制性SEMA4D活性包括：B细胞活化、聚集和存活；CD40诱导的增殖和抗体产生；对T细胞依赖性抗原的抗体应答；T细胞或其他免疫细胞增殖；树突细胞成熟；脱髓鞘和轴突变性；多能神经前体和/或寡树突细胞的凋亡；诱导内皮细胞迁移；抑制自发性单核细胞迁移；促进肿瘤细胞生长或转移、结合细胞表面丛蛋白-B1或其他受体、或与可溶性SEMA4D或在SEMA4D+细胞的表面上表达的SEMA4D相关的任何其他活性。在一特定实施方案中，抗SEMA4D活性包括能够与抑制、延迟或降低原发性肿瘤细胞生长和肿瘤转移组合，或独立于原发性肿瘤细胞生长和肿瘤转移来抑制、延迟或降低肿瘤转移。抗SEMA4D活性也可归属于使与SEMA4D表达相关的疾病的发生或严重性降低，所述疾病包括但不限于某些类型的癌症，包括实体肿瘤和淋巴瘤；自体免疫疾病；炎症性疾病，包括中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)炎症性疾病；神经变性疾病；移植排斥和侵袭性血管生成。
编码抗SEMA4D抗体的多核苷酸
本公开也提供一种分离的多核苷酸或两种或更多种多核苷酸，所述一种分离的多核苷酸或两种或更多种多核苷酸包含一个或多个编码如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的核酸序列。
在一个方面，本公开提供一种分离的多核苷酸或多核苷酸组合,所述分离的多核苷酸或多核苷酸组合包含一个或多个核酸序列，所述一个或多个核酸序列编码如本文提供的抗SEMA4D结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物或其亚单位，例如重链亚单位或其片段或轻链亚单位或其片段。
在某些方面，如本文提供的多核苷酸或多核苷酸组合包含编码抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)的VH的核酸序列。在某些方面，如本文提供的多核苷酸或多核苷酸组合包含编码抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)的VL的核酸序列。在某些方面，如本文提供的多核苷酸或多核苷酸组合包含编码抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)的VH的核酸序列和编码抗SEMA4D结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物的VL的核酸序列。在某些方面，VH编码核酸序列和VL编码核酸序列位于同一载体上。这种载体由本公开提供。在某些方面，VH编码核酸序列和VL编码核酸序列位于单独载体上。所述载体也由本公开提供。由本公开提供的载体可还包含用以允许表达抗体或其片段的遗传元件。所述遗传元件诸如启动子、多腺苷酸化序列和增强子在本文中其他地方加以描述。本公开进一步提供一种宿主细胞，其包含本文提供的多核苷酸或多核苷酸组合和/或本文提供的一种或多种载体。
也提供一种用于产生如本文提供的抗SEMA4D抗体或其片段、变体或衍生物的方法，其中所述方法包括培养如本文提供的宿主细胞以及回收抗体或其片段。
在某些方面，本公开提供一种分离的多核苷酸或两种或更多种多核苷酸，所述一种分离的多核苷酸或两种或更多种多核苷酸包含一个或多个编码抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物或其亚单位的核酸序列，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH包含互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR包含分别与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同一，或除所述HCDR中的一者、两者或全部三者中的一个、两个、三个或四个氨基酸取代之外分别与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同一的氨基酸序列；并且所述VL包含互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR包含分别与SEQ ID NO:6、SEQID NO:7和SEQ ID NO:8同一，或除所述LCDR中的一者、两者或全部三者中的一个、两个、三个或四个氨基酸取代之外分别与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8同一的氨基酸序列。
在某些方面，本公开提供一种分离的多核苷酸或两种或更多种多核苷酸，所述一种分离的多核苷酸或两种或更多种多核苷酸包含一个或多个编码抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物或其亚单位的核酸序列，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH包含与SEQ ID NO:1至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:5至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
任何上述多核苷酸都可还包括编码例如如在本文中其他地方所述的重链恒定区或轻链恒定区或其片段、用以引导所编码多肽的分泌的信号肽、或如本文所述的其他异源性多肽的额外核酸序列。此外，如在本文中其他地方更详细所述，本公开包括包含上述多核苷酸中的一者或多者的组合物。
在一个实施方案中，本公开包括包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的组合物，所述第一多核苷酸包含编码如本文所述的VH的核酸序列，并且所述第二多核苷酸编码如本文所述的VL。
本公开也包括本文提供的多核苷酸的片段，如在其他地方所述。另外，提供编码融合多肽、Fab片段和如本文所述的其他衍生物的多核苷酸。
由本公开提供的多核苷酸可通过本领域中已知的任何方法来产生或制造。举例来说，如果抗体的核苷酸序列是已知的，那么编码抗体的多核苷酸可由化学合成寡核苷酸组装(例如，如Kutmeier等，Bio Techniques 17:242(1994)中所述)，简而言之，此涉及合成含有编码抗体的序列的各部分的重叠寡核苷酸，使那些寡核苷酸退火和连接，接着通过PCR来扩增经连接寡核苷酸。
或者，编码如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的多核苷酸可由源于适合来源的核酸序列产生。如果含有编码特定抗体的多核苷酸的克隆不可用，但抗体分子的序列是已知的，那么编码抗体的核酸可以化学方式合成，或通过以下方式来从适合来源(例如，抗体cDNA文库、或从核酸例如多A+RNA产生的cDNA文库，所述核酸从表达抗体或其他抗SEMA4D抗体的任何组织或细胞诸如被选择来表达抗体的杂交瘤细胞分离)获得：使用可杂交于序列的3'末端和5'末端的合成引物进行的PCR扩增或使用对欲鉴定的特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针进行的克隆，所述特定基因序列例如是来自cDNA文库的编码抗体或其他抗SEMA4D抗体的cDNA克隆。可接着使用本领域中熟知的任何方法来将通过PCR产生的经扩增核酸克隆至可复制克隆载体中。
一旦确定抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的核苷酸序列和相应氨基酸序列，即可使用本领域中熟知的用于操作核苷酸序列的方法来操作它的核苷酸序列以产生具有不同氨基酸序列，例如以创建氨基酸取代、缺失和/或插入的抗体，所述方法例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见例如Sambrook等(1990)Molecular Cloning,ALaboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)以及Ausubel等人编(1998)Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons,NY)中所述的技术，所述书籍均以引用的方式整体并入本文)。
编码抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的多核苷酸或多核苷酸组合可由可为未修饰RNA或DNA或经修饰RNA或DNA的任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成。举例来说，编码抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸或多核苷酸组合可由单链和双链DNA、是单链区域和双链区域的混合物的DNA、单链和双链RNA、以及是单链区域和双链区域的混合物的RNA、可为单链或更通常是双链或是单链区域和双链区域的混合物的包含DNA和RNA的杂合分子组成。此外，编码抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的多核苷酸或多核苷酸组合可由包含RNA或DNA或RNA与DNA两者的三链区域组成。编码抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的多核苷酸或多核苷酸组合也可含有一个或多个经修饰碱基或由于稳定性或由于其他原因而加以修饰的DNA或RNA骨架。“经修饰”碱基包括例如三苯甲基化碱基和不常见碱基诸如肌苷。可对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括以化学方式、以酶促方式或以代谢方式修饰的形式。
编码源于免疫球蛋白的多肽(例如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的非天然变体的分离多核苷酸或多核苷酸组合可通过以下方式来创建：将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列中以使一个或多个氨基酸取代、添加或缺失被引入所编码蛋白质中。突变可通过标准技术诸如定点诱变和PCR介导的诱变来引入。在某些方面，可在一个或多个非必需氨基酸残基处进行保守性氨基酸取代。
融合蛋白和抗体缀合物
如在本文中其他地方更详细讨论，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可在N末端或C末端进一步重组融合于异源性多肽，或化学缀合(包括共价和非共价缀合)于多肽或其他异源性部分。举例来说，抗SEMA4D抗体可重组融合或缀合于适用作检测测定中的标记的分子和效应物分子诸如异源性多肽、药物、放射性核素或毒素。参见例如PCT公布WO92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利号5,314,995；和EP 396,387。在某些方面，异源性部分可为多肽、细胞毒性剂、治疗剂、前药、脂质、碳水化合物、核酸、可检测标记、聚合物，或它们的任何组合。示例性异源性多肽包括不限于结合分子、酶、细胞因子、淋巴因子、激素肽，或它们的任何组合。示例性细胞毒性剂包括不限于放射性核素、生物毒素、酶活性毒素，或它们的任何组合。示例性可检测标记包括不限于酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记，或它们的任何组合。
如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可包括例如通过以下方式来修饰的衍生物：使任何类型的部分共价连接于抗体以使共价连接不阻止结合分子结合SEMA4D。举例而非以限制方式来说，抗体衍生物可例如通过以下方式来修饰：糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/封阻基团达成的衍生化、蛋白水解裂解、连接于细胞配体或其他蛋白质等。众多化学修饰中的任一者都可通过已知技术来进行，所述技术包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化等。另外，衍生物可含有一个或多个非经典氨基酸。
如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可由通过肽键或经修饰肽键例如肽电子等排体来彼此接合的氨基酸组成，并且可含有除20种基因编码氨基酸以外的氨基酸。举例来说，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可通过天然过程诸如翻译后加工，或通过本领域中熟知的化学修饰技术来修饰。所述修饰充分描述于基础教科书中和更详细的专著中以及大量研究文献中。修饰可存在于抗SEMA4D结合分子中的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端，或在诸如碳水化合物的部分上。此外，给定抗SEMA4D结合分子可含有许多类型的修饰。抗SEMA4D结合分子可例如由于泛素化而为分支的，并且它们可为伴有或不伴有分支的环状。环状、分支以及分支环状抗SEMA4D结合分子可由翻译后天然过程所致，或可通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚定物、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白质添加氨基酸诸如精氨酰化以及泛素化。(参见例如Proteins--Structure andMolecular Properties,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,NY；第2版(1993)；Johnson编(1983)Posttranslational Covalent Modification of Proteins(AcademicPress,NY),第1-12页；Seifter等,Meth.Enzymol.182:626-646(1990)；Rattan等,Ann.NYAcad.Sci.663:48-62(1992))。
本公开也提供包含如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)以及异源性多肽的融合蛋白。抗体与其融合的异源性多肽可适用于发挥功能或适用于靶向抗SEMA4D多肽表达性细胞。如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可使用本领域中已知的方法来融合或缀合于一个或多个异源性多肽或其他部分以使多肽的体内半衰期增加或用于免疫测定中。举例来说，在一个实施方案中，可使PEG或人血清白蛋白融合或缀合于如本文提供的抗SEMA4D结合分子以使它们的体内半衰期增加。参见Leong等，Cytokine 16:106(2001)；Adv.in DrugDeliv.Rev.54:531(2002)；或Weir等,Biochem.Soc.Transactions 30:512(2002)。
此外，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可融合于一个或多个标记序列诸如肽以有助于它们的纯化或检测。在某些实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，诸如pQE载体(QIAGEN,Inc.)中提供的标签以及其他标记氨基酸序列，其中许多可商购获得。如Gentz等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)中所述，举例来说，六组氨酸提供对融合蛋白的便利纯化。适用于纯化的其他肽标签包括但不限于“HA”标签，其对应于源于流感血凝素蛋白的表位(Wilson等,Cell 37:767(1984))，以及“flag”标签。
融合蛋白可使用本领域中熟知的方法来制备(参见例如美国专利号5,116,964和5,225,538)。可凭经验选择进行融合所处的精确位点以使融合蛋白的分泌或结合特征最优化。接着将编码融合蛋白的DNA转染至宿主细胞中以达成表达。
如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可以非缀合形式使用，或可缀合于多种分子中的至少一者，例如以改进分子的治疗性质，有助于靶标检测，或用于患者的成像或治疗。如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可在纯化之前或之后，或当进行纯化时加以标记或缀合。
特定来说，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可缀合于治疗剂、前药、细胞毒性剂、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药物制剂或PEG。
本领域技术人员将了解视选择用以缀合的试剂而定，缀合物也可使用多种技术来组装。举例来说，具有生物素的缀合物例如通过使结合多肽与生物素的经活化酯诸如生物素N-羟基丁二酰亚胺酯反应来制备。类似地，具有荧光标记的缀合物可在偶联剂例如本文所列的那些存在下制备，或通过与异硫氰酸酯例如荧光素异硫氰酸酯反应来制备。如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的缀合物可以类似方式制备。
本公开进一步涵盖缀合于诊断剂或治疗剂的如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)。所述抗SEMA4D结合分子可在诊断上用于例如监测疾病的发展或进展以例如测定给定治疗和/或预防方案的功效，所述监测是作为临床测试程序的一部分。举例来说，检测可通过使抗SEMA4D结合分子偶联于可检测物质来促进。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、在使用各种正电子发射断层摄影术的情况下的正电子发射金属、以及非放射性顺磁性金属离子。对于可缀合于抗体以用作根据本公开的诊断剂的金属离子，参见例如美国专利号4,741,900。适合酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适合荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素(phycoerythrin)；发光物质的一实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光物质的实例包括荧光素酶、虫荧光素和水母素；并且适合放射性物质的实例包括125I、131I、111In、90Y或99Tc。
如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可缀合于治疗性部分诸如细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。
如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)也可通过使它偶联于化学发光化合物来以可检测方式加以标记。接着通过检测在化学反应的过程期间出现的发光的存在来测定化学发光标签化抗SEMA4D结合分子的存在。特别适用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺(isoluminol)、芳族吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可以可检测方式加以标记所采用的一种方式是使所述抗SEMA4D结合分子连接于酶，以及在酶免疫测定(EIA)中使用所连接产物(Voller,A.,"The Enzyme Linked ImmunosorbentAssay(E LISA)"Microbiological Associates Quarterly Publication,Walkersvill e,Md.；Diagnostic Horizons 2:1-7(1978)；Voller等,J.Clin.Pathol.31:507-520(1978)；Butler,Meth.Enzymol.73:482-523(1981)；Ma ggio编(1980)Enzyme Immunoassay,CRCPress,Boca Raton,Fla.；Ishikawa等人编(1981)Enzyme Immunoassay(Kgaku Shoin,Tokyo))。结合于抗SEMA4D结合分子的酶将与适当底物例如发色底物以产生化学部分的方式反应，所述化学部分可例如通过分光光度测量手段、荧光测量手段或通过目视手段来检测。可用于对抗体进行可检测标记的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、催化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。另外，检测可通过采用酶的发色底物的比色方法来实现。检测也可通过相较于以类似方式制备的标准物，以目视方式比较底物的酶促反应的程度来实现。
检测也可使用多种其他免疫测定中的任一者来实现。举例来说，通过对抗SEMA4D结合分子进行放射性标记，有可能通过使用放射免疫测定(RIA)来检测结合分子。放射性同位素可通过包括但不限于γ计数器、闪烁计数器或放射自显影术的手段来检测。
如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)也可使用荧光发射金属诸如152Eu或镧系的其他金属来以可检测方式加以标记。这些金属可使用诸如二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团来连接于结合分子。
用于使各种部分缀合于如本文提供的抗SEMA4D结合分子的技术为本领域普通技术人员所熟知。
抗体多肽的表达
可根据熟知方法，使用逆转录酶和DNA聚合酶来同时或单独制备编码如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的轻链和重链的DNA序列。PCR通过共有恒定区引物或通过基于公开重链和轻链DNA和氨基酸序列的更特异性引物来引发。如上所讨论，PCR也可用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这个情况下，可通过共有引物或较大同源性探针诸如小鼠恒定区探针来筛选文库。
DNA，通常是质粒DNA，可使用本领域中已知的技术来从细胞分离，根据例如详细阐述于与在本文中其他地方提供的重组DNA技术相关的参考文献中的标准熟知技术加以限制定位和测序。
在操作分离的遗传物质以提供如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)之后，可将编码结合分子的多核苷酸插入表达载体中以引入一种或多种可用于产生所需量的抗SEMA4D结合分子的宿主细胞中。
重组表达抗SEMA4D抗体或其片段、衍生物或类似物例如抗体的重链或轻链需要构建一种或多种含有编码所述抗体的多核苷酸或多核苷酸组合的表达载体。一旦已获得编码抗体分子或抗体的重链或轻链或其部分(例如含有重链可变区或轻链可变区的部分)的多核苷酸或多核苷酸组合，即可通过重组DNA技术，使用本领域中熟知的技术来产生一种或多种用于产生抗体分子的载体。因此，本文描述用于通过表达含有抗体编码核酸序列的多核苷酸或多核苷酸组合来制备蛋白质的方法。为本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有抗体编码序列和适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本公开提供可复制载体，其包含编码可操作地连接于启动子的如本文提供的抗SEMA4D结合分子例如抗体或其重链或轻链或重链可变区或轻链可变区的核酸序列。所述载体可包括编码抗体重链和/或轻链的恒定区的核苷酸序列(参见例如PCT公布WO 86/05807；PCT公布WO89/01036；以及美国专利号5,122,464)，并且可将抗体的可变区克隆至这种载体中以表达整个重链或轻链。
术语“载体”或“表达载体”在本文中用于意指根据本公开作为用于在宿主细胞中引入和表达所需基因的运载体加以使用的载体。如为本领域技术人员所知，所述载体可易于从例如质粒、噬菌体和病毒例如逆转录病毒之中加以选择。一般来说，可与本公开相容的载体将包含选择标记、用以有助于克隆所需基因的适当限制位点，并且能够进入真核或原核细胞和/或在真核或原核细胞中复制。
可采用众多表达载体系统。举例来说，一个类别的载体利用源于动物病毒诸如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其他载体涉及使用具有内部核糖体结合位点(IRES)的多顺反子系统。另外，可通过引入一个或多个允许对经转染宿主细胞进行选择的标记来选择已将DNA整合至它们的染色体中的细胞。标记可提供营养缺陷型宿主的原始营养型、杀生物剂抗性(例如抗生素)、或对重金属诸如铜的抗性。可选择标记基因可直接连接于待表达的DNA序列，或通过共转化来引入同一细胞中。额外元件也可为mRNA的最优合成所需。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
在某些方面，可将经克隆可变区核酸分子连同如上所讨论加以合成的重链恒定区和轻链恒定区基因一起插入表达载体中。当然，可使用能够引发在真核细胞中表达的任何表达载体。适合载体的实例包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF 1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可Invitrogen,San Diego,Calif.从获得)以及质粒pCI(可Promega,Madison,Wis.从获得)。一般来说，筛选大量经转化细胞中的表达适合高水平的免疫球蛋白重链和轻链的那些经转化细胞是可例如通过机器人系统来进行的常规实验。
更通常地，一旦已制备编码如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的单体亚单位的载体或DNA序列，即可将表达载体引入适当宿主细胞中。将质粒引入宿主细胞中可通过为本领域技术人员熟知的各种技术来实现。这些技术包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、用包膜化DNA进行的细胞融合、显微注射和用完整病毒进行的感染。参见Ridgway(1988)"MammalianExpression Vectors",Vectors,Rodriguez和Denhardt编(Butterworths,Boston,Mass.),第24.2章,第470-472页。通常，将质粒引入宿主中是通过电穿孔来进行。可使具有表达构建体的宿主细胞在适合于产生轻链和重链的条件下生长，并且测定重链和/或轻链蛋白质合成和组装。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活的细胞分选仪分析(FACS)、免疫组织化学分析等。
表达载体可通过常规技术来转移至宿主细胞中，并且经转染细胞可接着通过常规技术来培养以产生如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)。因此，本公开包括含有编码可操作地连接于启动子例如异源性启动子的如本文提供的抗体或其重链或轻链的多核苷酸或多核苷酸组合的宿主细胞。在关于双链抗体的表达的某些实施方案中，可使编码重链与轻链两者的载体在宿主细胞中共表达以表达和组装整个结合分子，如下所详述。
如本文所用，“宿主细胞”是指具有使用重组DNA技术加以构建，并且编码至少一个异源性多核苷酸的载体的细胞。在描述用于从重组宿主分离抗体的方法时，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换用于表示抗体的来源，除非另外明确指定。换句话说，从“细胞”回收多肽可意指从短暂离心全细胞或从含有培养基与悬浮细胞两者的细胞培养物。
多种宿主表达载体系统可用于表达如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)。所述宿主表达系统代表目标编码序列可通过其来产生以及随后纯化的运载体，但也代表当用适当核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达如本文提供的抗体分子的细胞。这些表达系统包括但不限于微生物诸如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有含有源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子或人巨细胞病毒立即早期启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)。在某些方面，尤其是对于表达完整重组抗体分子，诸如大肠杆菌的细菌细胞或真核细胞可用于表达重组抗体分子。举例来说，哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)与载体联合是一种有效抗体表达系统(Foecking等,Gene 45:101(1986)；Cockett等,Bio/Technology 8:2(1990))。
用于蛋白质表达的宿主细胞系可具有哺乳动物来源。示例性宿主细胞系包括但不限于CHO(中国仓鼠卵巢)、DG44和DUXB11(DHFR缺陷性中国仓鼠卵巢株系)、HeLa(人宫颈癌)、CVI(猴肾株系)、COS(CVI的具有SV40 T抗原的衍生物)、VERY、BHK(幼小仓鼠肾)、MDCK、293、WI38、R1610(中国仓鼠纤维母细胞)BALBC/3T3(小鼠纤维母细胞)、HAK(仓鼠肾株系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3×63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。宿主细胞系通常可从商业服务机构、美国组织培养物保藏中心或从公开文献获得。
此外，可选择调节插入序列的表达或以所需特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞品系。对蛋白质产物的所述修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对于蛋白质的功能可为重要的。不同宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特定机理。可选择适当细胞系或宿主系统以确保对所表达外来蛋白质的正确修饰和加工。为此，可使用具有用于达成适当初级转录物加工、基因产物糖基化和磷酸化的细胞机构的真核宿主细胞。
对于长期高产率产生重组蛋白，可使用稳定表达。举例来说，可对稳定表达抗体分子的细胞系进行工程改造。并非使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可用由适当表达控制元件(例如启动子、增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)和可选择标记控制的DNA转化。在引入外来DNA之后，可使经工程改造细胞在富集培养基中生长1-2天，接着转换成选择性培养基。重组质粒中的可选择标记赋予选择抗性，并且允许细胞将质粒稳定整合至它们的染色体中，并且生长以形成转化灶，所述转化灶转而可被克隆以及扩增成细胞系。这个方法可有利地用于对稳定表达抗体分子的细胞系进行工程改造。
抗体分子的表达水平可通过载体扩增来增加(对于综述，参见Bebbington和Hentschel(1987)"The Use of Vectors Based on Gene Amplification for theExpression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning"(Academic Press,NY)第3卷)。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，存在于宿主细胞的培养中的抑制剂的水平增加将使标记基因的拷贝数增加。因为经扩增区域与抗体基因缔合，所以抗体的产生也将增加(Crouse等,Mol.Cell.Biol.3:257(1983))。
体外生产允许按比例扩大以产生大量所需多肽。用于在组织培养条件下进行哺乳动物细胞培养的技术在本领域中是已知的，并且包括例如在气升反应器中或在连续搅拌器反应器中进行均质悬浮培养，或例如在中空纤维、微囊中、在琼脂糖微珠粒或陶瓷柱筒上进行固定或包埋细胞培养。如果必要和/或需要，那么多肽的溶液可通过惯用色谱方法来纯化，所述方法例如凝胶过滤、离子交换色谱法、经DEAE-纤维素进行的色谱法或(免疫)亲和色谱法，例如在合成铰链区多肽的生物合成之后，或在本文所述的HIC色谱法步骤之前或之后。
编码如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的核酸分子也可在非哺乳动物细胞诸如昆虫、细菌或酵母或植物细胞中表达。易于摄取核酸的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，诸如大肠杆菌或沙门氏菌属(Salmonella)的菌株；以及芽孢杆菌科(bacillaceae)的成员，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌属(Pneumococcus)的成员；链球菌属(Streptococcus)的成员和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。应进一步了解，当在细菌中表达时，异源性多肽通常变为包涵体的一部分。包涵体可被分离、纯化，接着组装成功能性分子。当需要四价形式的抗体时，亚单位可接着自组装成四价抗体(WO 02/096948A2)。
在细菌系统的情况下，视所表达抗体分子的预定用途而定，可有利地选择许多表达载体。举例来说，当欲产生大量这种蛋白质以产生抗体分子的药物组合物时，引导高水平的易于纯化融合蛋白产物的表达的载体可为合乎需要的。
除原核生物之外，也可使用真核微生物。在真核微生物之中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见面包酵母是最通常使用的，但许多其他菌株通常是可用的，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
在昆虫系统的情况下，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病病毒(AcNPV)通常作为载体用于表达外来基因。病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可将抗体编码序列个别地克隆至病毒的非必需区域(例如多角体蛋白(polyhedrin)基因)中，并且置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
一旦已重组表达如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)，它即可通过本领域中已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法来纯化，例如通过色谱法(例如离子交换色谱法，亲和色谱法，特别是利用对蛋白A的亲和力，以及尺寸分级柱色谱法)、离心、差异性溶解，或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。或者，用于使如本文提供的抗体的亲和力增加的方法公开于美国专利申请公布号2002 0123057A1中。
使用治疗性抗SEMA4D抗体进行的治疗方法
本公开提供用于使用如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)来治疗患有与SEMA4D病理学相关的疾病或疾患的受试者的方法。
以下讨论涉及采用如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)，针对各种疾病和疾患进行的诊断方法和治疗，所述抗SEMA4D结合分子例如能够特异性结合SEMA4D例如人SEMA4D、小鼠SEMA4D、或人SEMA4D和小鼠SEMA4D，并且具有SEMA4D中和活性。
在一个方面，本公开提供一种用于中和人受试者中的SEMA4D的方法，其包括向所述人受试者施用如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)。在某些方面，人受试者需要针对自体免疫疾病或疾患、炎症性疾病或疾患、癌症、神经炎症性疾病或疾患、神经变性疾病或疾患或它们的任何组合进行治疗。在某些方面，神经炎症性疾病或疾患是多发性硬化症。在某些方面，神经变性疾病或疾患是中风、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、唐氏综合征、共济失调、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶性痴呆(FTD)、HIV相关认知损害、CNS狼疮、轻度认知损害，或它们的组合。在某些方面，自体免疫疾病或炎症性疾病是关节炎例如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化(参见例如PCT公布号WO2015/054628，其以引用的方式整体并入本文)、或骨变性疾病诸如骨质疏松(参见例如美国专利号9,447,191，其以引用的方式整体并入本文)。
在一个方面，治疗包括向受试者施加或施用如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)，向来自受试者的分离的组织或细胞系施加或施用，其中所述受试者患有疾病、疾病的症状，或具有朝向疾病的倾向。在另一方面，治疗也包括向受试者或向来自患者的分离的组织或细胞系施加或施用包含如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的药物组合物，所述受试者或患者患有疾病、疾病的症状，或具有朝向疾病的倾向。
在一个方面，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可适用于治疗癌症，例如治疗各种恶性和非恶性肿瘤。就“抗肿瘤活性”来说，其意指使恶性细胞增殖或积累的速率降低，因此，使现有肿瘤或在出现在疗法期间的肿瘤的情况下的生长速率下降，和/或破坏现有赘生性(肿瘤)细胞或新形成赘生性细胞，因此使在疗法期间的肿瘤总体尺寸降低。举例来说，用如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)进行的疗法可引发生理应答，例如血管生成降低或CTL向肿瘤微环境迁移。用于用如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)治疗癌症的方法可例如见于PCT公布号WO 2014/209802[组合免疫疗法]中，所述公布以引用方式整体并入本文。
在一个方面，本公开提供一种如本文提供的抗SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，所述抗SEMA4D结合分子用作药剂，特别是用于治疗或防治癌症或用于在癌前期病症或病变的情况下使用。
在另一方面，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可适用于治疗自体免疫疾病或炎症性疾病。在另一方面，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可适用于治疗神经炎症性疾病或神经变性疾病。用于治疗神经炎症性疾病或神经变性疾病的方法可例如见于PCT公布号WO2013/055922[BBB],PCT公布号WO2015/061330[HD]和PCT公布号WO 2013/170221[神经发生/中风]中，所述公布的内容以引用方式整体并入本文。
根据本文提供的方法，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可用于促进关于恶性人细胞的正性治疗响应。就关于癌症治疗的“正性治疗响应”来说，其意指疾病的与这些结合分子例如抗体或其片段的抗肿瘤活性相关的改善，和/或与疾病相关的症状的改善。也就是说，可观察到抗增生作用、对进一步肿瘤外生长的阻止、肿瘤尺寸的降低、肿瘤血管结构的减少、癌细胞的数目的降低、和/或与疾病相关的一种或多种症状的减轻。因此，举例来说，疾病的改善可被表征为完全响应。就“完全响应”来说，其意指不存在临床可检测疾病，伴有任何先前异常放射摄影研究、骨髓和脑脊髓液(CSF)的正常化。或者，疾病的改善可被分类为部分响应。就“部分响应”来说，其意指在不存在新病变下，所有可测量肿瘤负荷(即存在于受试者中的肿瘤细胞的数目)降低至少约50％，并且持续至少一个月。这种响应仅可适用于可测量肿瘤。
如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)也可适用于治疗免疫系统的炎症性疾病和缺陷或疾患。炎症性疾病的特征在于炎症和组织破坏，或它们的组合。就“消炎活性”来说，其意指降低或预防炎症。“炎症性疾病”包括任何炎症性免疫介导过程，其中免疫应答的引发事件或靶标涉及非自身抗原，包括例如同种抗原、异种抗原、病毒抗原、细菌抗原、未知抗原、或过敏原。在一个实施方案中，炎症性疾病是外周或中枢神经系统的炎症性疾患。在另一实施方案中，炎症性疾病是关节的炎症性疾患。
此外，术语“炎症性疾病”包括“自体免疫疾病”。如本文所用，术语“自体免疫性”通常被理解为涵盖涉及“自身”抗原的炎症性免疫介导过程。在自体免疫疾病中，自身抗原触发宿主免疫应答。自体免疫疾病可由针对自身抗原(自体抗原)的不当免疫应答所致，所述不当免疫应答偏离自身耐受性的正常状态。一般来说，充当细胞毒性分子或免疫复合物的抗体(特别是但不仅仅是IgG抗体)是各种自体免疫疾病的主要介体，所述自体免疫疾病中的许多可具有致衰弱性或危急生命。
在一个实施方案中，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可用于治疗多发性硬化症(MS)。MS，也称为播散性硬化症或散播性脑脊髓炎，是一种自体免疫病症，其中免疫系统攻击中枢神经系统，从而导致脱髓鞘。多发性硬化症的名称涉及在神经系统中形成的瘢痕(硬化，也被称为斑块或病变)。MS病变通常涉及接近于小脑的脑室的白质区域、脑干、基底神经节和脊髓以及视神经。MS导致对作为负责创建和维持髓鞘的细胞的寡树突细胞的破坏。MS导致髓磷脂变薄或完全丧失，并且随着疾病进展，导致轴突横断。
神经症状可随MS而变化，并且疾病经常进展至身体和认知失能。MS采取若干形式，其中新症状在离散发作中出现(复发形式)或随时间缓慢积累(进行性形式)。在发作之间，症状可完全离去，但经常产生永久神经损害，尤其是随着疾病进展。
使用如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)来中和SEMA4D可用于通过若干不同机理来减轻MS的严重性，例如抗SEMA4D单克隆抗体可阻断由SEMA4D达成的免疫成熟和活化以通过降低对CNS抗原的二级免疫应答来降低复发率，并且抗SEMA4D单克隆抗体可阻断可溶性SEMA4D在介导CNS中的寡树突细胞的凋亡方面的作用，可通过降低脱髓鞘来减轻疾病严重性。
在一个方面，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可用于治疗关节炎。关节炎是一种关节炎症性疾病，其可由其中免疫系统攻击关节的自体免疫病症引起。在某些实施方案中，关节炎选自由以下组成的组：骨关节炎、痛风性关节炎、僵直性脊椎炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、类风湿性关节炎、青少年发作型类风湿性关节炎、感染性关节炎、炎症性关节炎、败血性关节炎、退变性关节炎、残毁性关节炎和莱姆关节炎(Lyme arthritis)。在一个实施方案中，关节炎是类风湿性关节炎(RA)。
本公开包括通过向受试者施用如本文提供的抗SEMA4D结合分子来治疗或预防关节炎的方法。如本文提供的方法可减轻与关节炎例如类风湿性关节炎相关的疼痛、肿胀或僵硬。本公开也涉及用于改进关节性能、功能和健康的方法。在本公开的一些实施方案中，治疗导致关节炎严重性评分降低、关节炎严重性/曲线下面积降低、与关节炎相关的组织病理学参数(炎症、血管翳、软骨损害和骨损害)降低、血清花生四烯酸水平降低、或抗胶原抗体降低。在某些实施方案中，有益或所需临床结果包括但不限于与关节炎相关的症状的缓和；对关节炎的预防；关节炎的发作的延迟；群体中关节炎的发生率降低；与关节炎相关的病症的程度减小；与关节炎相关的病症、疾患或疾病的状态的稳定化(例如不恶化)；与关节炎相关的病症、疾患或疾病进展的发生延迟或减缓；病症、疾患或疾病状态的改善，与关节炎相关的病症、疾患或疾病的缓解(无论是部分缓解还是总体缓解)，无论是可检测还是不可检测；或与关节炎相关的病症、疾患或疾病的改进或改善。
本文提供的方法可用于治疗患有关节炎的个体或处于显现关节炎的风险下的个体。因此，在一些实施方案中，本公开提供一种治疗具有正常关节、边界关节炎关节、或真正关节炎关节的受试者的方法，所述方法包括向如本文所述的受试者施用如本文提供的抗SEMA4D结合分子。在一些实施方案中，本文提供的方法可用于持续受试者的余生来治疗慢性关节炎。
根据如本文提供的方法，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可用于促进关于治疗或预防自体免疫疾病和/或炎症性疾病的正性治疗响应。就关于自体免疫疾病和/或炎症性疾病的“正性治疗响应”来说，其意指疾病的与这些抗体的消炎活性、抗血管生成活性、抗凋亡活性等相关的改善，和/或与疾病相关的症状的改善。也就是说，可观察到抗增生作用、对SEMA4D表达性细胞的进一步增殖的阻止、炎症性应答的降低，包括但不限于炎症性细胞因子、粘附分子、蛋白酶、免疫球蛋白(在其中携带SEMA4D的细胞是B细胞的情况下)、其组合的分泌降低等，消炎蛋白质的产生增加、自体反应性细胞的数目降低、免疫耐受性增加、自体反应性细胞存活的抑制、凋亡的降低、内皮细胞迁移的降低、自发性单核细胞迁移的增加、由sSEMA4D或SEMA4D表达性细胞的刺激作用介导的一种或多种症状的减轻和/或减少。所述正性治疗响应不局限于施用途径，并且可包括向供体、供体组织(诸如像器官灌注)、宿主、其任何组合等施用。
临床响应可使用筛选技术来评估，诸如磁共振成像(MRI)扫描、x射线放射摄影成像、计算机断层摄影(CT)扫描、流式细胞计量术或荧光激活的细胞分选仪(FACS)分析、组织学分析、宏观病理学分析和血液化学分析，包括但不限于可通过ELISA、RIA、色谱法等来检测变化。除这些正性治疗响应之外，经受用如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)进行的疗法的受试者可经受与疾病相关的症状得以改善的有益作用。
如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可与至少一种其他癌症疗法组合使用，所述癌症疗法包括但不限于手术或手术程序；免疫调节疗法、放射疗法；化学疗法，任选与自体骨髓移植组合，或其他癌症疗法；其中额外癌症疗法在抗SEMA4D结合分子例如抗体或其抗原结合片段疗法之前、期间或之后施用。因此，当组合疗法包括施用如本文提供的抗SEMA4D结合分子例如抗体或其抗原结合片段与施用如同化学疗法、放射疗法、其他抗癌抗体疗法、基于小分子的癌症疗法、或基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法一样的另一治疗剂组合时，如本文提供的方法涵盖共同施用、使用单独制剂或单一药物制剂、或/和以任一顺序连续施用。
如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可与针对自体免疫和炎症性疾病的任何已知疗法组合使用，所述疗法包括已知适用于或已用于或当前用于治疗自体免疫和炎症性疾病的任何药剂或药剂组合。因此，当组合疗法包括施用抗SEMA4D结合分子与施用另一治疗剂组合时，本文提供的方法涵盖共同施用、使用单独制剂或单一药物制剂、以及以任一顺序连续施用。在一些实施方案中，本文所述的抗SEMA4D抗体与免疫抑制性药物或消炎药物组合施用，其中抗体和治疗剂可以任一顺序依序施用，或同时施用(即并行或在相同时间范围内)。
在某些方面，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可单独使用，或与免疫抑制性药物组合使用，以治疗和/或预防类风湿性关节炎。如上所讨论，治疗有效性可使用任何手段来评估，并且包括但不限于如由根据美国风湿病学学会(American College of Rheumatology)准则、欧洲风湿病结盟(European Leagueof Rheumatism)准则或任何其他准则确定的临床响应所度量的有效性。参见例如Felson等,Arthritis.Rheum.38:727-35(1995)以及van Gestel等,Arthritis Rheum.39:34-40(1996)。
在其他方面，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可单独使用，或与免疫抑制性药物组合使用，以治疗和/或预防多发性硬化症。
本公开的另一方面是如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)用于诊断监测组织中的蛋白质水平例如以测定给定治疗方案的功效的用途，所述诊断监测是作为临床测试程序的一部分。举例来说，检测可通过使抗体偶联于可检测物质来促进。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。适合酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适合荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物质的一实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括荧光素酶、虫荧光素和水母素；并且适合放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。
VIII.药物组合物和施用方法
制备和向有需要的受试者施用如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的方法为本领域技术人员所熟知，或易于由本领域技术人员确定。抗SEMA4D结合分子的施用途径可为例如口服、胃肠外、通过吸入或经表面。如本文所用的术语胃肠外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、经直肠或经阴道施用。尽管所有这些施用形式都涵盖为在本公开的范围内，但施用形式的一实例将是用于注射的溶液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，适于注射的药物组合物可包含缓冲剂(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)，任选包含稳定剂(例如人白蛋白)等。然而，在可与本文教义相容的其他方法中，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可直接递送至不利病症例如实体肿瘤的部位，由此使患病组织对治疗剂的暴露增加。
如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可以药学上有效量施用以在体内治疗SEMA4D介导的疾病，诸如癌症、自体免疫疾病、炎症性疾病，包括中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)炎症性疾病，神经变性疾病和侵袭性血管生成。就此而言，应了解所公开结合分子可被配制以便有助于施用以及促进活性剂的稳定性。在某些方面，如本文提供的药物组合物可包括药学上可接受的无毒无菌载体，诸如生理盐水、无毒缓冲剂、防腐剂等。出于本申请的目的，经缀合或未缀合的如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的药学上有效量意指足以实现与靶标的有效结合，以及实现益处，例如改善疾病或疾患的症状或检测物质或细胞的量。
用于本公开中的药物组合物包含药学上可接受的载体，包括例如离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质诸如人血清白蛋白、缓冲物质诸如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸盐、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
用于胃肠外施用的制剂包括不限于无菌水性或非水性溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油以及可注射有机酯诸如油酸乙酯。水性载体包括例如水、醇性/水性溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M例如0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其他常见胃肠外媒介物包括磷酸钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，诸如基于林格氏右旋糖的那些等。也可存在防腐剂和其他添加剂，诸如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
在某些方面，适于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在可溶于水的情况下)或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。在所述情况下，组合物必须无菌，并且应具有达到存在容易可注射性的程度的流动性。它在制造和储存条件下应是稳定的，并且可针对微生物诸如细菌和真菌的污染作用加以防腐。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合混合物。适当流动性可例如通过使用包覆剂诸如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂加以维持。适用于本文公开的治疗方法中的制剂描述于Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.)第16版(1980)中。
防止微生物作用可由各种抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等实现。在某些方面，等张剂例如糖、多元醇诸如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化钠可被包括在组合物中。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来致使。
在任何情况下，无菌可注射溶液都可通过以下方式制备：将活性化合物(例如单独或与其他活性剂组合的如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物))以所需量，根据需要与一种本文列举的成分或各成分的组合一起并入适当溶剂中，随后进行过滤灭菌。通常，通过将活性化合物并入含有基本分散介质和来自以上列举的成分的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法可包括真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉末。根据本领域中已知的方法，将注射用制剂进行加工，装填至容器诸如安瓿、袋、瓶、注射器或小瓶中，并且在无菌条件下密封。此外，制剂可以药盒形式包装和售卖，所述药盒诸如美国专利申请序列号09/259,337中所述的那些。所述制品可具有标签或包装插页，其指示相关组合物适用于治疗罹患或易患疾病或疾患的受试者。
胃肠外制剂可为单次团注剂量、输液或负荷团注剂量继之以维持剂量。这些组合物可在特定固定或可变间隔下施用，例如一天一次，或以“根据需要”为基础。
由本公开提供的某些药物组合物可以可接受剂型口服施用，所述剂型包括例如胶囊、片剂、水性混悬液或溶液。某些药物组合物也可通过经鼻气雾剂或通过吸入来施用。所述组合物可采用苯甲醇或其他适合防腐剂、用以增强生物可用度的吸收促进剂、和/或其他常规溶解剂或分散剂来制备成于盐水中的溶液。
可与载体物质组合以产生单一剂型的如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的量将视所治疗宿主和特定施用模式而变化。组合物可以单次剂量、多次剂量或历经确定时期以输液形式加以施用。也可调整剂量方案以提供最优所需响应(例如治疗或防治响应)。
如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可根据以上提及的治疗方法以足以产生治疗作用的量向人或其他动物施用。如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可以根据已知技术通过使抗体与常规药学上可接受的载体或稀释剂组合来制备的常规剂型向人或其他动物施用。本领域技术人员将认识到药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特性由它将与其组合的活性成分的量、施用途径以及其他熟知变量决定。
就“治疗有效剂量或量”或“有效量”来说，其意指如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的在施用时，导致关于治疗患有待治疗疾病的患者的正性治疗响应的量。
如本文提供的组合物的用于治疗SEMA4D介导的疾病诸如癌症；自体免疫疾病，例如关节炎、多发性硬化症；炎症性疾病，包括中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)炎症性疾病；神经变性疾病；和侵袭性血管生成的治疗有效剂量视许多不同因素而变化，包括施用手段、靶标部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物、以及治疗是防治性的还是治疗性的。通常，患者是人，但也可治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。治疗剂量可使用为本领域技术人员所知的常规方法加以滴定以使安全性和功效最优化。
如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的待施用量易于由本领域普通技术人员在不进行过度实验下确定。影响抗SEMA4D结合分子的施用模式和相应量的因素包括但不限于疾病的严重性、疾病历史、以及经受疗法的个体的年龄、身高、重量、健康状况和身体状况。类似地，抗SEMA4D结合分子的待施用量将取决于施用模式以及受试者将经受单次剂量还是多次剂量的这个药剂。
本公开也提供抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)制造药剂的用途，所述药剂用于治疗自体免疫疾病和/或炎症性疾病，包括例如关节炎、多发性硬化症、CNS和PNS炎症性疾病，神经变性疾病或癌症。
本公开也提供本公开的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)制造药剂的用途，所述药剂用于治疗自体免疫疾病和/或炎症性疾病，包括例如关节炎、多发性硬化症、CNS和PNS炎症性疾病，神经变性疾病或癌症，其中所述药剂用于已用至少一种其他疗法预治疗的受试者中。就“预治疗(pretreated/pretreatment)”来说，其意指受试者在接受包含抗SEMA4D结合分子的药剂之前已接受一种或多种其他疗法(例如已用至少一种其他癌症疗法治疗)。“预治疗”包括受试者在启动用包含如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的药剂进行的治疗之前2年内、18个月内、1年内、6个月内、2个月内、6周内、1个月内、4周内、3周内、2周内、1周内、6天内、5天内、4天内、3天内、2天内、或甚至1天内已用至少一种其他疗法治疗。受试者不必是用先前一种或多种疗法进行的预治疗的响应者。因此，接受包含抗SEMA4D结合分子的药剂的受试者可已对用先前疗法进行的预治疗，或当预治疗包括多种疗法时，对先前疗法中的一者或多者起响应，或可已未能对用先前疗法进行的预治疗，或当预治疗包括多种疗法时，未能对先前疗法中的一者或多者起响应(例如癌症是难治性的)。受试者可在接受包含如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的药剂之前已接受预治疗的其他癌症疗法的实例包括但不限于手术；放射疗法；化学疗法，任选与自体骨髓移植组合；其他抗癌单克隆抗体疗法；基于小分子的癌症疗法；基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法；类固醇疗法；其他癌症疗法；，或它们的任何组合。
IX.诊断
本公开进一步提供一种在对SEMA4D介导的疾病的诊断期间适用的诊断方法，所述疾病诸如某些类型的癌症、自体免疫疾病、炎症性疾病，包括例如关节炎、多发性硬化症、中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)炎症性疾病，神经变性疾病和侵袭性血管生成，所述诊断方法涉及测量来自个体的组织或其他细胞或体液中SEMA4D蛋白或转录物的表达水平，以及将测量表达水平与正常组织或体液中的标准SEMA4D表达水平进行比较，借此相较于所述标准值，表达水平增加指示有疾患。
如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可用于使用为本领域技术人员所知的经典免疫组织学方法来测定生物样品中的SEMA4D蛋白水平(例如参见Jalkanen等,J.Cell.Biol.101:976-985(1985)；Jalkanen等,J.CellBiol.105:3087-3096(1987))。适用于检测SEMA4D蛋白表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀或Western印迹。适合测定在本文中其他地方更详细描述。
就“测定SEMA4D多肽的表达水平”来说，其意指直接地(例如通过测定或估计绝对蛋白质水平)或相对地(例如通过与第二生物样品中的疾病相关多肽水平进行比较)定性或定量测量或估计第一生物样品中的SEMA4D多肽的水平。在某些方面，可测量或估计第一生物样品中的SEMA4D多肽表达水平，并且将其与标准SEMA4D多肽水平进行比较，所述标准值取自从不患有疾患的个体获得的第二生物样品或通过使来自不患有疾患的一群个体的水平平均化来确定。如本领域中所将了解，一旦已知“标准”SEMA4D多肽水平，它即可重复用作比较标准。
就“生物样品”来说，其意指从潜在表达SEMA4D的个体、细胞系、组织培养物或其他细胞来源获得的任何生物样品。用于从哺乳动物获得组织活检体和体液的方法在本领域中是熟知的。
X.免疫测定
可通过本领域中已知的任何方法来测定如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的免疫特异性结合。可使用的免疫测定包括但不限于使用诸如Western印迹的技术的竞争性和非竞争性测定系统、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心式”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定，略举数例。所述测定在本领域中是常规的和熟知的(参见例如Ausubel等人编,(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.,NY)第1卷，其以引用方式整体并入本文)。示例性免疫测定在以下简要描述(但不意图以限制方式描述)。
另外，如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可如在免疫荧光测定、免疫电子显微术测定或非免疫测定中在组织学方面用于原位检测SEMA4D蛋白或其保守变体或肽片段。原位检测可通过以下方式来实现：从患者移除组织学试样，以及向其施加经标记抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段，例如通过将经标记抗体(或片段)覆盖于生物样品上。通过使用这种程序，有可能不仅确定SEMA4D蛋白或保守变体或肽片段的存在，而且也确定它在所考查组织中的分布。使用本公开，普通技术人员将易于认识到广泛多种组织学方法(诸如染色程序)中的任一者都可被修改以实现所述原位检测。
许多给定的如本文提供的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的结合活性可根据熟知方法来测定。通过采用常规实验，本领域技术人员将能够确定对于各测定有效和最优的测定条件。
存在可用于测量抗体-抗原相互作用的亲和力的多种方法，但用于测定速率常数的方法是相对少许的。大多数方法依赖于对抗体或抗原进行标记，此不可避免地使常规测量复杂化，并且在所测量数量方面引入不确定性。
如在上进行的表面等离子体共振(SPR)提供超过测量抗体-抗原相互作用的亲和力的常规方法的许多优势：(i)不要求对抗体或抗原进行标记；(ii)抗体不需要提前纯化，可直接使用细胞培养上清液；(iii)允许快速半定量比较不同单克隆抗体相互作用的实时测量能够被实现，并且足以达成许多评估目的；(iv)生物特异性表面可被再生以使一系列不同单克隆抗体可易于在相同条件下加以比较；(v)分析程序是完全自动化的，并且可在无用户干预下进行一系列广泛测量。BIAapplications Handbook,AB版(1998年重印),代号BR-1001-86；BIAtechnology Handbook,AB版(1998年重印),代号BR-1001-84。基于SPR的结合研究需要结合对的一个成员被固定在传感器表面上。经固定结合配偶体被称为配体。溶液中的结合配偶体被称为分析物。在一些情况下，配体通过结合称为捕集分子的另一经固定分子来间接连接于表面。SPR响应反映当分析物结合或解离时在检测器表面处的质量浓度变化。
基于SPR，当相互作用发生时，实时测量直接监测相互作用。所述技术充分适合于测定动力学参数。容易进行比较亲和力分级，并且动力学常数与亲和常数两者均可由传感图数据获得。
当跨越配体表面以离散脉冲方式注射分析物时，所得传感图可被分成三个主要阶段：(i)在样品注射期间分析物与配体缔合；(ii)在样品注射期间的平衡或稳定状态，其中分析物结合速率由从复合物的解离加以平衡；(iii)在缓冲液流动期间分析物从表面解离。
缔合和解离阶段提供关于分析物-配体相互作用的动力学的信息(ka和kd，即复合物形成的速率和解离的速率，kd/ka＝KD)。平衡阶段提供关于分析物-配体相互作用的亲和力的信息(KD)。
BIAevaluation软件提供用于使用数值积分与整体拟合算法两者进行曲线拟合的全面工具。在对数据进行适合分析的情况下，相互作用的单独速率常数和亲和常数可由简单探究获得。可通过这个技术测量的亲和力的范围是极其广泛的，在mM至pM的范围内。
表位特异性是单克隆抗体的重要特征。与使用放射免疫测定、ELISA或其他表面吸附方法的常规技术相比，用进行表位定位不需要标记或纯化抗体，并且允许使用一系列若干单克隆抗体进行多位点特异性测试。另外，大量分析可加以自动处理。
成对结合实验测试两种MAb同时结合相同抗原的能力。针对单独表位的MAb将独立结合，而针对相同或密切相关表位的MAb将干扰彼此的结合。用进行这些结合实验是简明的。
举例来说，可使用捕集分子来结合第一Mab，随后依序添加抗原和第二MAb。传感图将揭示(1)有多少抗原结合第一Mab，(2)第二MAb结合表面附着的抗原的程度，(3)如果第二MAb不结合，那么逆转成对测试的顺序是否会改变结果。
肽抑制是用于表位定位的另一技术。这个方法可对成对抗体结合研究进行补充，并且当抗原的一级序列是已知的时，可使功能性表位与结构特征相关联。测试肽或抗原片段对不同MAb与经固定抗原的结合的抑制。干扰给定MAb的结合的肽被假设为在结构上与由那个MAb确定的表位相关。
除非另外指示，否则本公开采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，其属于本领域的技能。所述技术充分说明于文献中。参见例如Sambrook等人编(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人编(1992)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory,NY)；D.N.Glover编,(1985)DNACloning,第I卷和第II卷；Gait编(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis等美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins编(1984)Transcription And Translation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning；专著,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller和Calos编(1987)Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells,(Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等人编,Methods InEnzymology,第154和155卷；Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methods In CellAnd Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir和Blackwell编,(1986)HandbookOf Experimental Immunology,第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；以及在Ausubel等(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)中。
抗体工程改造的一般原理阐述于Borrebaeck编(1995)Antibody Engineering(第2版；Oxford Univ.Press)中。蛋白质工程改造的一般原理阐述于Rickwood等人编(1995)Protein Engineering,A Practical Approach(IRL Press at Oxford Univ.Press,Oxford,Eng.)中。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理阐述于以下中：Nisonoff(1984)Molecular Immunology(第2版；Sinauer Associates,Sunderland,Mass.)；以及Steward(1984)Antibodies,Their Structure and Function(Chapman和Hall,New York,N.Y.)。另外，本领域中已知以及未明确描述的标准免疫学方法可如在Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons,New York；Stites等人编(1994)Basic and ClinicalImmunology(第8版；Appleton&Lange,Norwalk,Conn.)以及Mishell和Shiigi(编)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(W.H.Freeman and Co.,NY)中加以遵循。
阐述免疫学的一般原理的标准参考著作包括Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons,New York；Klein J.,Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination(John Wiley&Sons,NY(1982))；Kennett等人编(1980)Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(PlenumPress,NY)；Campbell(1984)"Monoclonal Antibody Technology",LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology,Burden等人编,(Elsevier,Amsterdam)；Goldsby等人编(2000)Kuby Immunology(第4版；W.H.Freeman and Co.,NY)；Roitt等(2001)Immunology(第6版；London:Mosby)；Abbas等(2005)Cellular andMolecular Immunology(第5版；Elsevier Health Sciences Division)；Kontermann和Dubel(2001)Antibody Engineering(Springer Verlag)；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press)；Lewin(2003)Genes VIII(Prentice Hall,2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies:A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Press)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCR Primer(ColdSpring Harbor Press)。
以上引用的所有参考文献以及本文引用的所有参考文献都以引用方式整体并入本文。
以下实施例通过说明的方式而非通过限制的方式来提供。
实施例
实施例1：产生全人抗SEMA4D单克隆抗体MAb D2517
全人抗SEMA4D单克隆抗体D2517通过以下方法来产生。在痘苗病毒中产生全人抗体的文库，并且根据美国专利申请公布号2013-0288927-A1中所述的方法关于与SEMA4D的结合加以筛选，所述美国专利申请公布以引用方式整体并入本文。根据竞争ELISA，总计96种抗体被分区至六个不同表位群组中。使用小鼠抗体mAb76和mAb67以及小鼠IgG对照来评估人抗体与Jurkat细胞上天然形式的人SEMA4D的竞争性结合。mAb76和mAb67结合人SEMA4D的已知表位，并且与任一者的竞争会指示功能性。在100uL的情况下，在5ug/mL和200,000个细胞下，在FACS缓冲液(1X PBS+0.05％BSA+2mM EDTA)中，使Jurkat细胞与mAb76、mAb67或小鼠IgG对照一起在冰上预孵育30分钟。这使得达成小鼠抗体的饱和结合，从而阻断结合表位。在1ug/mL下，使人测试抗体和对照抗体与二级试剂山羊抗人Fc-Dylight 649抗体(Jackson Immunoresearch 496-170)一起在冰上预孵育30分钟。在使Jurkat细胞与小鼠IgG抗体一起孵育之后，洗涤细胞，并且使其与测试抗体/二级复合物混合物一起在冰上孵育30分钟。随后用200uL FACS缓冲液洗涤细胞两次，并且再混悬于具有PI的250μL PBS/1％BSA和0.5％多聚甲醛固定溶液中。在再混悬之后，在FACS CANTO II上，通过流式细胞计量术来分析细胞。对PI阴性群体进行门控，并且记录和评估Dylight649转变。已相较于人抗体与和无关小鼠IgG一起预孵育的Jurkat细胞的结合来计算结合抑制百分比。
由于MAb C2305能够交叉阻断先前表征的鼠抗SEMA4D抗体67-2和76-1，所以选择它来进行进一步表征。参见例如美国专利号8,496,938，其公开内容以引用方式整体并入本文。
将编码MAb C2305 VH的多核苷酸克隆至含有人γ-4重链恒定区编码序列的哺乳动物表达载体中，从而创建全长重链。将编码MAb C2305 VL的多核苷酸克隆至具有人λ恒定区编码序列的哺乳动物表达载体中，从而创建全长轻链。将含有重链和轻链的表达载体共转染至CHO-S细胞中。使产生的单克隆抗体从细胞分泌，并且在3-6天表达时期之后加以收集。使用蛋白A色谱法纯化所得MAb，并且加以表征。根据流式细胞计量术以及根据ELISA，证明所得全人MAb(MAb C2305)对SEMA4D具有特异性，并且显示其能够与鼠MAb67-2竞争结合SEMA4D。根据以下实施例3中的方法，在受体阻断测定中进一步评估MAb C2305的功能活性。观察到受体阻断，但相比于用作比较物的人源化MAb 2503(美国专利号8,496,938，也被称为VX15/2503)的受体阻断，处于较低水平。
对MAb C2305进行完全测序，并且接着加以工程改造以达成亲和力改进。使重链互补决定区3(HCDR3)经受标准定点诱变技术，并且根据美国专利申请公布号2013-0288927-A1中所述的方法，从轻链文库鉴定了新型全人轻链可变区(VL)。根据这些改变，选择具有改进亲和力的MAb即MAb D2517作为先导抗体。将MAb D2517克隆，组装，并且表达为具有λ轻链的全人IgG4抗体。MAb D2517的VH、VL和CDR序列呈现于表2中。
表2：MAb D2517序列
实施例2：MAb D2517的结合表征
如下通过BIACORE测定来测定MAb D2517的结合特征。用山羊抗人IgG Fc抗体将两者均在PBS中配制的抗体以及比较抗体VX15/2503在低密度下捕集于传感器上，接着使狨猴SEMA4D-His在0–25nm的抗原浓度范围下流过经捕集抗体。结果显示于表3中。MAb D2517对SEMA4D的亲和力类似于VX15/2503的亲和力。
表3：BIACORE测定结果
使用以下方法，通过ELISA来测定MAb D2517结合人SEMA4D、小鼠SEMA4D、狨猴SEMA4D和食蟹猴SEMA4D的能力。将Nunc maxisorp C孔ELISA板用100μL/孔的于1X PBS中配制的CD100-His涂布过夜。在过夜孵育之后，将板洗涤，并且随后用200uL/孔的PBS+0.5％BSA+.025％吐温20在室温下阻断至少1小时。在额外洗涤之后，将100μl/孔稀释MAb(100ng/mL)添加至ELISA板的各孔中，在室温下将所述ELISA板孵育2小时，接着加以洗涤。接着，将100μl/孔的1:10,000山羊抗人Fc抗体(Jackson目录号109-035-098，批号118460)添加至各孔中，并且在室温下将ELISA板孵育1小时。接着将板洗涤，并且用100uL/孔TMB底物显色15分钟。使用100uL/孔2N硫酸来终止检测反应，并且使用板读取器，在450-570nM的波长下对板进行读取。
结果显示于图1A(人SEMA4D)、图1B(狨猴SEMA4D)、图1C(食蟹猴SEMA4D)和图1D(小鼠SEMA4D)中。
实施例3：MAb D2517阻断SEMA4D结合它的受体
如下测试MAbD2517阻断源于各种物种的SEMA4D结合它的受体丛蛋白B1的能力。
在乙酸盐缓冲液中配制MAbD2517和MAbVX15/2503。以三重稀释系列比较抗体阻断SEMA4D-His复合物(人、食蟹猴、小鼠或大鼠SEMA4D)结合293PLXNB1细胞的能力。所有抗体都在96孔板中从1.5μg/mL稀释至88ng/mL并与0.8ug/mL的适当SEMA4D-His以1:1组合，并且在4℃下孵育过夜。
次日，在96孔板中，将抗体/SEMA4D-His复合物或对照添加至2.5x105个293PLXNB1细胞中，并且使结合在4℃下发生30分钟。在洗涤之后，将细胞用抗6xHis抗体-APC染色(30分钟，4℃)，洗涤，并且在FACS Canto II上，通过流式细胞计量术来分析。结果显示于图2A-图2D中。根据曲线计算EC50值，并且显示于表4中。
表4：阻断SEMA4D结合它的受体的EC50值(以nM计)
SEMA4D-his VX15/2503 MAb D2517
人SEMA4D 0.3 1.0
食蟹猴SEMA4D 0.5 1.2
小鼠SEMA4D 0.4 1.2
大鼠SEMA4D 0.6 1.5
实施例4：在肿瘤模型中测试MAbD2517的鼠嵌合等效物
将MAb D2517的VH和VL氨基酸序列(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5)插入表达鼠IgG1和λ恒定区的载体中以产生嵌合抗体MAb D2585。如实施例1中所说明，在CHO-S细胞中表达抗体，并且加以纯化。
将6-8周龄的Balb/c雌性小鼠(n＝12)用30,000个Tubo.A5乳腺肿瘤细胞皮下移植至小鼠的乳腺脂肪垫中。在接种后7天启动用对照小鼠IgG1/2B8.1E7或抗SEMA4D嵌合抗体MAbD2585进行的治疗(10mg/kg，腹膜内，每周一次，共计5周)。用测径规测量肿瘤，在植入后11天开始，2次/周。当肿瘤体积达到800mm3时将动物处死。
通过测径规来测量肿瘤生长，并且测量结果用于使用公式(w2×l)/2来计算肿瘤体积，其中w＝肿瘤的宽度，即较小测量结果，并且l＝肿瘤的长度，以mm计。平均肿瘤体积和定义为到达肿瘤体积＝800mm3所处的终点的时间的卡普兰迈耶(Kaplan Meier)存活曲线分别显示于图3A和图3B中。分别使用对于平均肿瘤体积(p<0.05)进行的双因素方差分析(ANOVA)和对于存活率(p<.0.1)进行的对数秩分析来进行统计分析，所述平均肿瘤体积和所述存活率是统计显著的。
也测量Tubo肿瘤模型中肿瘤消退的频率，并且显示于图3C中。消退是无可触知肿瘤，定义为对于至少两次连续测量，肿瘤测量为<50mm3。用嵌合抗体MAbD2585进行的治疗使携带Tubo的小鼠中的消退数目增加。如通过费雪氏精确检验(Fisher’s Exact test)所测定，相较于对照Ig，经嵌合抗体MAbD2585治疗的小鼠群组中的消退数目是统计显著的(p＝0.01)。
本公开的广度和范围不应由任何上述示例性实施方案限制，而应仅根据以下权利要求和它们的等效物加以限定。

Claims (55)

1.一种特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；其中所述VH包含互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR包含分别与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同一，或除所述HCDR中的一者、两者或全部三者中的一个、两个、三个或四个氨基酸取代之外分别与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同一的氨基酸序列；并且其中所述VL包含互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR包含分别与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8同一，或除所述LCDR中的一者、两者或全部三者中的一个、两个、三个或四个氨基酸取代之外分别与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8同一的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述HCDR1、所述HCDR2和所述HCDR3包含分别与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同一的氨基酸序列，并且其中所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3包含分别与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8同一的氨基酸序列。
3.如权利要求1或权利要求2所述的抗体或其片段，其中所述VH还包含框架区(HFW)HFW1、HFW2、HFW3和HFW4，并且其中所述VL还包含框架区(LFW)LFW1、LFW2、LFW3和LFW4。
4.如权利要求3所述的抗体或其片段，其中所述框架区源于人抗体。
5.如权利要求3所述的抗体或其片段，其中所述框架区源于非人抗体。
6.如权利要求1至4中任一项所述的抗体或其片段，其中所述VH包含氨基酸序列SEQ IDNO:1。
7.如权利要求1至4中任一项所述的抗体或其片段，其中所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:5。
8.如权利要求1至4中任一项所述的抗体或其片段，其中所述VH包含氨基酸序列SEQ IDNO:1，并且所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。
9.一种特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；其中所述VH包含与SEQ ID NO:1至少80％、85％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的抗体或其片段，其中所述VL包含与SEQ ID NO:5至少80％、85％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列。
11.一种特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；其中所述VL包含与SEQ ID NO:5至少80％、85％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的抗体或其片段，其中所述VL包含与SEQ ID NO:5至少80％、85％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列。
13.一种特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；其中所述VH包含与SEQ ID NO:1至少80％、85％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列；并且其中所述VL包含与SEQ ID NO:5至少80％、85％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列。
14.如权利要求13所述的抗体或其片段，其中所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:1，并且其中所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。
15.如权利要求1至14中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段还包含融合于所述VH的C末端的重链恒定区或其片段。
16.如权利要求15所述的抗体或其片段，其中所述重链恒定区或其片段是人重链恒定区。
17.如权利要求16所述的抗体或其片段，其中所述重链恒定区或其片段是人IgG4恒定区。
18.如权利要求15所述的抗体或其片段，其中所述重链恒定区或其片段是非人重链恒定区。
19.如权利要求18所述的抗体或其片段，其中所述重链恒定区或其片段是鼠IgG1恒定区。
20.如权利要求1至19中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段还包含融合于所述VL的C末端的轻链恒定区或其片段。
21.如权利要求20所述的抗体或其片段，其中所述轻链恒定区或其片段是人轻链恒定区。
22.如权利要求21所述的抗体或其片段，其中所述轻链恒定区或其片段是人λ轻链恒定区。
23.如权利要求20所述的抗体或其片段，其中所述轻链恒定区或其片段是非人轻链恒定区。
24.如权利要求23所述的抗体或其片段，其中所述轻链恒定区或其片段是鼠λ轻链恒定区。
25.如权利要求1至24中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、单链Fv片段(scFv)、或二硫键连接的Fv片段(sdFv)。
26.如权利要求1至25中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段是多特异性的。
27.如权利要求1至26中任一项所述的抗体，其可特异性结合人SEMA4D、小鼠SEMA4D、大鼠SEMA4D、或非人灵长类动物SEMA4D。
28.如权利要求27所述的抗体或其片段，其中所述非人灵长类动物SEMA4D是食蟹猴SEMA4D或狨猴SEMA4D。
29.如权利要求27或权利要求28所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段以特征在于解离常数KD不大于500nM、100nM、50.0nM、40.0nM、30.0nM、20.0nM、10.0nM、9.0nM、8.0nM、7.0nM、6.0nM、5.0nM、4.0nM、3.0nM、2.0nM、1.0nM、0.50nM、0.10nM、0.050nM、0.01nM、0.005nM或0.001nM的亲和力特异性结合SEMA4D；并且其中所述SEMA4D是人SEMA4D、小鼠SEMA4D、食蟹猴SEMA4D、狨猴SEMA4D，或它们的任何组合。
30.如权利要求1至29中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段可抑制SEMA4D与SEMA4D受体的结合。
31.如权利要求30所述的抗体或其片段，其中所述SEMA4D受体是丛蛋白-B1、丛蛋白-B2、CD72，或它们的组合。
32.如权利要求1至31中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段在向人受试者施用后引发最小抗抗体免疫应答或不引发抗抗体免疫应答。
33.如权利要求1至32中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段还包含与其融合或缀合的异源性部分。
34.如权利要求33所述的抗体或其片段，其中所述异源性部分包括多肽、细胞毒性剂、治疗剂、前药、脂质、碳水化合物、核酸、可检测标记、聚合物，或它们的任何组合。
35.如权利要求34所述的抗体或其片段，其中所述多肽包括结合分子、酶、细胞因子、淋巴因子、激素肽，或它们的任何组合。
36.如权利要求34所述的抗体或其片段，其中所述细胞毒性剂包括放射性核素、生物毒素、酶活性毒素，或它们的任何组合。
37.如权利要求34所述的抗体或其片段，其中所述可检测标记包括酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记，或它们的任何组合。
38.一种组合物，其包含如权利要求1至37中任一项所述的抗体或其片段，以及载体。
39.一种分离的多核苷酸或多核苷酸组合，其包含一个或多个编码如权利要求1至37中任一项所述的抗体或其片段或其亚单位的核酸序列。
40.如权利要求39所述的多核苷酸或多核苷酸组合，其包含编码所述抗体或其片段的所述VH的核酸序列。
41.如权利要求39所述的多核苷酸或多核苷酸组合，其包含编码所述抗体或其片段的所述VL的核酸序列。
42.如权利要求39所述的多核苷酸或多核苷酸组合，其包含编码所述抗体或其片段的所述VH的核酸序列和编码所述抗体或其片段的所述VL的核酸序列。
43.如权利要求42所述的多核苷酸或多核苷酸组合，其中所述VH编码核酸序列和所述VL编码核酸序列位于同一载体上。
44.如权利要求43所述的载体。
45.如权利要求42所述的多核苷酸或多核苷酸组合，其中所述VH编码核酸序列和所述VL编码核酸序列位于单独载体上。
46.如权利要求45所述的载体。
47.如权利要求44或权利要求46所述的载体，其还包含用以允许表达所述抗体或其片段的遗传元件。
48.一种宿主细胞，其包含如权利要求39至43或45中任一项所述的多核苷酸或多核苷酸组合，或如权利要求44或权利要求46所述的载体。
49.一种产生如权利要求1至37中任一项所述的抗体或其片段的方法，其包括培养如权利要求48所述的宿主细胞，以及回收所述抗体或其片段。
50.一种中和人受试者中的SEMA4D的方法，其包括向所述人受试者施用如权利要求1至37中任一项所述的抗体或其片段或如权利要求38所述的组合物。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述人受试者需要针对自体免疫疾病或疾患、炎症性疾病或疾患、癌症、神经炎症性疾病或疾患、神经变性疾病或疾患或它们的任何组合进行治疗。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述神经炎症性疾病或疾患是多发性硬化症。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述神经变性疾病或疾患是中风、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、唐氏综合征、共济失调、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶性痴呆(FTD)、HIV相关认知损害、CNS狼疮、轻度认知损害，或它们的组合。
54.如权利要求51所述的方法，其中所述自体免疫疾病或所述炎症性疾病是关节炎。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述自体免疫疾病或所述炎症性疾病是类风湿性关节炎。
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