CN110622915A - 制备小鼠矽肺模型的改良方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备小鼠矽肺模型的改良方法，包括以下步骤：步骤1：对小鼠进行预处理，分离颈前肌群并暴露气管；步骤2：用无齿镊将小鼠舌头轻轻拉出口外，用20g钝针头经口咽前壁，直视下插入气管约2‑3cm；步骤3：用注射器快速注入所述气管内50μL SiO2悬液后，移去注射器，将针头与呼吸机连接，通气10‑30s；步骤4：当小鼠正常呼吸恢复时，移除所述呼吸机，继续观察呼吸正常时，拔出针头；步骤5：缝合皮肤，并进行后期护理和观察。该方法简单易操作，较高程度的模拟了人类的染尘过程，并且具有小鼠死亡率低、模型成功率高、可操作性强的优点。
Description
技术领域
本发明属于矽肺动物模型的制备技术领域，具体涉及一种制备小鼠矽肺模型的改良方法。
背景技术
矽肺是由于长期吸入SiO2粉尘引起的，是以矽结节的形成和弥漫性肺间质纤维化为主要表现的常见职业病。了解矽肺的发病机制和防治措施有赖于疾病动物模型的建立。目前，建立小动物矽肺模型的方法有多种，比如：气管插管(气管造口术)滴注SiO2悬液、经鼻腔内滴注和口咽部吸入SiO2悬液、采用染尘系统每日雾化吸入SiO2粉尘等方法。
上述方法虽然是现有技术常用的方法，但是都各具优缺点。其中，气管插管(气管造口术)滴注SiO2悬液是最常用的方法，但是该方法中SiO2悬液易于堵塞大支气管，引起动物窒息死亡以及SiO2在两侧肺中分布不均匀，因此，导致动物模型成功率低，动物死亡率高；此外，气管造口术也会加剧动物的创伤和应激反应，影响后续实验结果。鼻腔内滴注和口咽部吸入方法最为简便易行，但有文献报道，大约50％的SiO2会滞留于鼻腔中，进入肺内的SiO2量明显减少，而且样本之间的SiO2量不稳定，因此，模型成功率也较低。利用染尘系统每日雾化吸入SiO2粉尘，此方法能够最好的模拟人类的染尘致病过程，比较符合矽肺的自然进展规律，并已成功地用于大鼠模型制备中；但是，该方法受到特殊设备条件，粉尘成本和造模时间较长等因素的限制，不能广泛得以应用。更重要的是，国内外及本发明前期研究，分别用微米级SiO2染尘小鼠(C57BL/6小鼠染尘6个月，ICR小鼠染尘2个月)和纳米级SiO2染尘小鼠(C57BL/6小鼠和ICR小鼠均染尘2个月)，结果表明：利用染尘系统每日雾化吸入SiO2粉尘，不同颗粒级的SiO2在不同品系小鼠肺内沉积都很少，不能成功制备小鼠模型。
鉴于现有技术中制备矽肺动物模型的方法中存在的各种缺陷，亟需构建一种既能降低动物死亡率，提高动物模型成功率，还能更接近人类的染尘致病过程的动物模型，以为矽肺发病机制和防治措施的研究提供优异的动物模型。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种制备小鼠矽肺模型的改良方法，该方法简单易操作，较高程度的模拟了人类的染尘过程，并且具有小鼠死亡率低、模型成功率高、可操作性强的优点。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种制备小鼠矽肺模型的改良方法，包括以下步骤：
步骤1：对小鼠进行预处理，分离颈前肌群并暴露气管；
步骤2：用无齿镊将小鼠舌头轻轻拉出口外，用20g钝针头经口咽前壁，直视下插入气管2-3cm；
步骤3：用注射器快速注入所述气管内50μL SiO2悬液后，移去注射器，将针头与呼吸机连接，通气10-30s；
步骤4：当小鼠正常呼吸恢复时，移除所述呼吸机，继续观察呼吸正常时，拔出针头；
步骤5：缝合皮肤，并进行后期护理和观察。
优选的是，步骤1中小鼠预处理包括以下步骤：
1)麻醉：用质量分数为1％戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉小鼠，所述小鼠注射戊巴比妥钠的用量为50mg/kg；
2)固定、剪毛：仰卧位固定小鼠，颈部垫高，门齿用丝线固定，自下颌至胸骨上方颈部区域剪毛，用碘酒、酒精消毒；
3)暴露气管：用眼科剪沿颈部中线做纵切口0.5-1cm，以分离颈前肌群并暴露气管。
优选的是，步骤3中所述SiO2悬液是由以下方法制备：将微米级SiO2颗粒在玛瑙研钵中研磨2-3h，再于200℃真空干燥箱中烘烤2h后，用质量分数0.9％NaCl溶液将所述SiO2颗粒配制成SiO2悬液。
优选的是，所述SiO2悬液浓度为50-200mg/mL。
优选的是，步骤3中所述呼吸机参数设置为：呼吸频率115次/分钟，通气量40mL/kg，呼吸比1：1。
优选的是，步骤5中缝合皮肤具体为：间断缝合颈部皮肤，并用碘酒、酒精消毒。
优选的是，步骤5中缝合皮肤后，将小鼠置于37℃保温垫上保温，直至意识恢复，密切观察呼吸状态，24h内每2h观察一次小鼠情况。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过预处理小鼠使气管暴露，直视下经口气管内插管滴注SiO2悬液，确保悬液进入气管和肺内，这是模型成功的前提条件；再通过建立呼吸机辅助，通过高潮气量促使SiO2颗粒在两侧肺部均匀分布，并保持气道不受阻塞，使肺部的病理变化更接近于矽肺的自然特征，确保模型的可重复性和科学性，其成功率高达98％；同时由于呼吸机的正压通气，保持呼吸道通畅，并在小鼠出现异常呼吸时利用呼吸机及时抢救，大大降低了动物的死亡率，相比现有技术，死亡率为16％，确保了模型的可行性。通过后续的组织学验证，观察到矽结节和纤维化病变的弥散性分布，更接近于雾化吸入法中肺组织的病理学变化。因此，本发明公开的制备小鼠矽肺模型的改良方法，具有简单易操作，较高程度的模拟了人类的染尘过程，并且小鼠死亡率低、模型成功率高、可操作性强的优点。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明小鼠矽肺模型制备过程示意图；
图2为本发明气管内滴注50mg/mL SiO2悬液，40×HE染色的小鼠肺部病理变化情况；
图3为本发明气管内滴注50mg/mL SiO2悬液，200×HE染色的小鼠肺部病理变化情况；
图4为本发明气管内滴注100mg/mL SiO2悬液，40×HE染色的小鼠肺部病理变化情况；
图5为本发明气管内滴注100mg/mL SiO2悬液，200×HE染色的小鼠肺部病理变化情况；
图6为本发明气管内滴注200mg/mL SiO2悬液，40×HE染色的小鼠肺部病理变化情况；
图7为本发明气管内滴注200mg/mL SiO2悬液，200×HE染色的小鼠肺部病理变化情况；
图8为本发明在不同浓度的SiO2悬液暴露下，不同时间点结节面积与总肺组织面积之比，G：50mg/mL SiO2悬液；H：100mg/mL SiO2悬液；I：200mg/mL SiO2悬液；
图9为本发明在不同时间点，不同浓度的SiO2悬液暴露下，结节面积与总肺组织面积之比，J：3d；K：4w；L：8w；M:16w；
图10为现有技术鼻腔滴注SiO2悬液法制备小鼠模型的效果图；
图11为现有技术口咽吸入SiO2悬液法制备小鼠模型的效果图；
图12为现有技术气管内灌注SiO2悬液法制备小鼠模型的效果图；
图13为现有技术雾化吸入SiO2粉尘法制备大鼠模型的效果图。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
制备小鼠矽肺模型的改良方法
1、实验动物
SPF级C57BL/6小鼠(华北理工大学实验动物中心提供)，雌雄均可，月龄8-16周，体重20-30g。
2、模型制备前准备
(1)将微米级SiO2颗粒在玛瑙研钵中研磨2-3h，然后在200℃真空干燥箱中烘烤2h，以灭菌并去除内毒素污染；用质量分数为0.9％NaCl溶液将其制备成浓度为50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml的SiO2悬液。
(2)术前小鼠禁食水8h。
3、模型制备过程
(1)麻醉：用质量分数1％戊巴比妥钠(戊巴比妥钠质量为50mg/kg)腹腔内注射麻醉小鼠。
(2)固定、剪毛：仰卧位固定小鼠，颈部略垫高，门齿用丝线固定；自下颌至胸骨上方颈部区域剪毛，用碘酒、酒精消毒(如图1A所示)。
(3)暴露气管：用眼科剪沿颈部中线做纵切口0.5-1cm，如图1B所示；分离颈前肌群并暴露气管，如图1C所示。
(4)气管插管：用无齿镊将小鼠舌头轻轻拉出口外，如图1D所示，用20g钝针头经口咽前壁，直视下插入气管约2-3cm，如图1E所示。
(5)气管内灌注SiO2悬液：将SiO2悬液用涡旋振荡器混匀，1mL注射器吸入50μl，快速注入气管内，如图1F所示；移去注射器，将针头与呼吸机连接，通气10-30s；呼吸机参数设置为：呼吸频率115次/分钟，通气量40mL/kg，呼吸比1：1，如图1G所示。
(6)移除呼吸机和针头：当小鼠恢复正常呼吸时，移除呼吸机；继续观察呼吸正常时，拔出针头，如图1H所示。
(7)缝合皮肤：间断缝合颈部皮肤，用碘酒、酒精消毒，如图I所示。
(8)术后护理与观察：将小鼠置于37℃保温垫上保温，直至意识恢复，术后密切观察呼吸状态，如图1J所示；24h内每2h观察一次小鼠情况。
实施例2
本申请公开的改良方法制备的小鼠矽肺模型，分组向气管内滴注不同浓度SiO2悬液，具体：A组注射50mg/mLSiO2悬液，B组注射100mg/mLSiO2悬液，C组注射200mg/mLSiO2悬液，另设对照组，分别观察4组小鼠模型的成功率和死亡率，见表1所示。
表1小鼠模型的成功率和死亡率
注：1.总死亡数等于手术中死亡数加上手术后死亡数；2.171/223代表模型存活数和总存活数(包括对照组存活数和模型组存活数),说明：171＝60+57+55，223＝51+60+57+55；3.成功率等于模型数除以模型存活数；4.死亡率等于总死亡数除以动物总数。
由表1可看出，经本发明所述的改良方法制备的小鼠矽肺模型，模型构建成功率高达98％，死亡率为16％，相比现有技术，大大提高了构建小鼠矽肺模型的成功率，并降低了小鼠的死亡率。
构建成功的A组、B组、C组和对照组，在不同时间点(0d、3d、7d、14d、4w、8w、12w、16w)，解剖获取小鼠矽肺模型的肺部组织，制备切片，HE染色，观察小鼠肺部病理变化，结果如图2-7所示。同时，计算所有样本在不同浓度的SiO2悬液暴露下，不同时间点结节面积与总肺组织面积之比，如图8G、图8H、图8I所示；在不同时间点，不同浓度SiO2暴露下，结节面积与总肺组织面积之比，如图9J、图9K、图9L、图9M所示。
如图2-7所示，结果发现不同浓度的SiO2悬液，不同时间点观察，都能清晰的观察到肺部组织具有均匀分布的结节，和肺间质纤维化的典型矽肺病的病理特征，利于为矽肺发病机制和防治措施的研究提供优异的动物模型。
如图8G、图8H、图8I所示，发现不同浓度SiO2悬液处理后，随着时间增长结节面积与总肺组织面积之比增大；如图9J、图9K、图9L、图9M所示，随着SiO2悬液浓度的增大，在不同时间点的结节面积与总肺组织面积之比增大。
实施例3
比较不同方法制备的动物模型与本申请的改良方法制备的小鼠模型的结节数量(结节是判断矽肺的标准之一)
1、参考文献：全尚琨等，帕比司他对小鼠矽肺纤维化的干预作用，用鼻腔滴注SiO2悬液法制备小鼠模型，并观察肺部组织切片的结节情况，如图10所示；
2、参考文献：Sachin K et al.Oropharyngeal administration of silica inSwiss mice:A robust and reproducible model of occupational pulmonaryfibrosis，用口咽吸入SiO2悬液法制备小鼠模型，并观察肺部组织切片的结节情况，如图11所示。
3、参考文献：Wu Q et al，miR-489inhibits silica-induced pulmonaryfibrosis by targeting MyD88 and Smad3 and is negatively regulated by lncRNACHRF，用气管内灌注SiO2悬液法制备小鼠模型，并观察肺部组织切片的结节情况，如图12所示。
4、参考文献：刘燕，Ac-SDKP活化cAMP信号抑制矽肺纤维化的作用及机制，用雾化吸入SiO2粉尘法制备大鼠模型，并观察肺部组织切片的结节情况，如图13所示。
5、采用本发明制备小鼠矽肺模型的改良方法(内容此处省略)，结果详见图2-7。
通过比较不同方法构建的矽肺模型，将图10-13分别与图2-7进行比较，发现本发明所制备的小鼠矽肺模型结节数量最多。
以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.一种制备小鼠矽肺模型的改良方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：对小鼠进行预处理，分离颈前肌群并暴露气管；
步骤2：用无齿镊将小鼠舌头轻轻拉出口外，用20g钝针头经口咽前壁，直视下插入气管2-3cm；
步骤3：用注射器快速注入所述气管内50μL SiO2悬液后，移去注射器，将针头与呼吸机连接，通气10-30s；
步骤4：当小鼠正常呼吸恢复时，移除所述呼吸机，继续观察呼吸正常时，拔出针头；
步骤5：缝合皮肤，并进行后期护理和观察。
2.如权利要求1所述的制备小鼠矽肺模型的改良方法，其特征在于，步骤1中小鼠预处理包括以下步骤：
1)麻醉：用质量分数为1％戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉小鼠，所述小鼠注射戊巴比妥钠的用量为50mg/kg；
2)固定、剪毛：仰卧位固定小鼠，颈部垫高，门齿用丝线固定，自下颌至胸骨上方颈部区域剪毛，用碘酒、酒精消毒；
3)暴露气管：用眼科剪沿颈部中线做纵切口0.5-1cm，以分离颈前肌群并暴露气管。
3.如权利要求1所述的制备小鼠矽肺模型的改良方法，其特征在于，步骤3中所述SiO2悬液是由以下方法制备：将微米级SiO2颗粒在玛瑙研钵中研磨2-3h，再于200℃真空干燥箱中烘烤2h后，用质量分数0.9％NaCl溶液将所述SiO2颗粒配制成SiO2悬液。
4.如权利要求3所述的制备小鼠矽肺模型的改良方法，其特征在于，所述SiO2悬液浓度为50-200mg/mL。
5.如权利要求1所述的制备小鼠矽肺模型的改良方法，其特征在于，步骤3中所述呼吸机参数设置为：呼吸频率115次/分钟，通气量40mL/kg，呼吸比1：1。
6.如权利要求1所述的制备小鼠矽肺模型的改良方法，其特征在于，步骤5中缝合皮肤具体为：间断缝合颈部皮肤，并用碘酒、酒精消毒。
7.如权利要求1所述的制备小鼠矽肺模型的改良方法，其特征在于，步骤5中缝合皮肤后，将小鼠置于37℃保温垫上保温，直至意识恢复，密切观察呼吸状态，24h内每2h观察一次小鼠情况。
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