CN110616221A - 一种猪小肠上皮细胞启动子siecp及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪小肠上皮细胞启动子SIECP及其应用。本发明公开的猪小肠上皮细胞启动子SIECP为序列表中序列1所示的DNA分子。本发明的SIECP，可以在小肠上皮细胞中启动目的基因表达，可用于培育转基因动物，为构建稳定、高效的小肠转录调控元件提供理论依据，对环境友好型转基因动物的生产以及小肠疾病的基因治疗研究具有参考价值，在生命科学领域以及小肠疾病治疗领域有广泛的应用前景。

Description

一种猪小肠上皮细胞启动子SIECP及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种猪小肠上皮细胞启动子SIECP及其应用。

背景技术

小肠既是消化吸收的主要场所，也是重要的免疫屏障，高发肠炎及肠癌等疾病。例如，溃疡性结肠炎在我国的发病率约为万分之一，病毒性肠炎在美国每年有5100万人感染，但具体的发病原因和有效的治疗方法都有待进一步探究。因此，探明各类肠炎的发病机理，并找到合适的模式动物意义十分重大。

外源性基因在目标组织的高效、稳定表达是转基因动物研究和基因治疗的重要前提。在小肠表达病原体受体或抗病因子等外源基因是探究小肠相关疾病的重要手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有启动子活性的DNA分子，其名称为SIECP，所述SIECP为下述a)或b)或c)：

a)序列表中序列1所示的DNA分子，所述DNA分子具有启动子功能；

b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA片段；

c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min 0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的SIECP核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的SIECP核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SIECP核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％、95％以上的同一性。

本发明还提供了含有所述SIECP的生物材料，为下述B1)至B19)中的任一种：

B1)含有所述SIECP的表达盒；

B2)含有所述SIECP的重组载体；

B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；

B4)含有所述SIECP的重组微生物；

B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；

B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有所述SIECP的转基因动物细胞系；

B9)含有B1)所述表达盒的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12)含有所述SIECP的转基因动物组织；

B13)含有B1)所述表达盒的转基因动物组织；

B14)含有B2)所述重组载体的转基因动物组织；

B15)含有B3)所述重组载体的转基因动物组织；

B16)含有所述SIECP的转基因动物器官；

B17)含有B1)所述表达盒的转基因动物器官；

B18)含有B2)所述重组载体的转基因动物器官；

B19)含有B3)所述重组载体的转基因动物器官。

上述生物材料中，所述表达盒可由所述SIECP、所述SIECP启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述SIECP以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为荧光素酶基因。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pGL3-Basic质粒。

所述重组载体中，由所述SIECP启动目的基因的表达。在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为pGL3-SIECP。所述pGL3-SIECP为将pGL3-Basic质粒的MluⅠ和NheⅠ识别序列间的DNA片段替换为序列1所示的DNA片段得到的重组载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。

所述细胞可为IPEC-J2细胞。

上述表达盒或重组载体可以通过原核显微注射法、胚胎干细胞介导法、逆转录病毒载体法、精子介导的基因转移、核移植转基因法、体细胞核移植法、线粒体介导法等常规生物学方法转化动物器官或组织或细胞，得到转基因动物细胞或组织或器官。

上述生物材料中，所述转基因动物细胞系、所述转基因动物组织和所述转基因动物器官均不包括繁殖材料。

本发明还提供了所述SIECP在作为启动子中的应用。

所述SIECP可为动物组织或细胞特异性启动子。

具体的，所述动物组织可为动物小肠。所述细胞可为动物小肠上皮细胞。所述动物小肠上皮细胞可为猪小肠上皮细胞，如IPEC-J2细胞。

本发明还提供了所述SIECP或所述生物材料在以下(a)至(c)中任一项中的应用：

(a)培育转基因动物；

(b)制备治疗肠道疾病药物；

(c)在动物中驱动目的基因的表达；

(d)驱动目的基因在动物小肠中表达。

上述应用中，所述驱动目的基因在动物小肠中表达可为驱动目的基因在动物小肠上皮细胞中表达。

本发明还提供了目的基因在动物小肠中表达的方法，所述方法包括：将含有所述SIECP和目的基因的表达盒导入动物中，实现目的基因在动物小肠中的表达。

扩增所述SIECP全长或部分片段的引物对，也属于本发明的保护范围。

本发明的SIECP，可以在小肠上皮细胞中启动目的基因表达，可用于培育转基因动物，为构建稳定、高效的小肠转录调控元件提供理论依据，对环境友好型转基因动物的生产以及小肠疾病的基因治疗研究具有参考价值，在生命科学领域以及小肠疾病治疗领域有广泛的应用前景。

附图说明

图1为pGL3-SIECP重组质粒的构建和荧光素酶检测过程示意图。

图2为双荧光素酶检测结果。＊＊＊表示有显著性差异。PC表示转染阳性对照质粒pGL3-Control的细胞，SIECP表示转染pGL3-SIECP的细胞，NC表示转染阴性对照质粒pGL3-Basic的细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的pGL3-Basic质粒、pGL3-Control、pRL-TK均记载在文献“周雯，王青松，人claudin－10基因启动子转录调控的初步分析，生物技术，2015年25(3)”中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、

本实施例提供了一个来源于中国实验用小型猪的DNA片段，具有启动子活性，记为SIECP。检测流程图见图1。

1、目的片段的获取

以中国实验用小型猪基因组为模板，进行PCR扩增，得到PCR产物。所用引物如下：

上游引物为5'-CGacgcgtGTTTGCTTGGCTTGATCAGCAG-3'(含MluⅠ识别序列)；

下游引物为5'-CTAgctagcATTGACCAGCTCCCCTCTAGTG-3'(含NheⅠ识别序列)。

2、pGL3-SIECP重组质粒的构建

将步骤1得到的PCR产物利用MluⅠ和NheⅠ进行双酶切，将所得酶切片段与pGL3-Basic质粒利用MluⅠ和NheⅠ双酶切得到的载体大片段相连，得到重组质粒，将序列正确的重组质粒命名为pGL3-SIECP。

pGL3-SIECP为将pGL3-Basic质粒中MluⅠ和NheⅠ识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的DNA片段得到的重组质粒。

3、细胞转染

待测质粒：步骤2的pGL3-SIECP、阴性对照质粒pGL3-Basic、阳性对照质粒pGL3-Control。

转染：将各待测质粒分别与内对照质粒pRL-TK按20:1的摩尔比混匀于150μl电击液中，得到质粒混合液；于6孔板中培养的IPEC-J2细胞，吸弃液体，然后加入1ml PBS冲洗一遍，再加入500μl的胰酶消化细胞，待多数细胞变圆后，加入1ml含有10％FBS的DMEM培养基终止消化，吹打细胞并将细胞转移至15mL离心管中，1000g离心5min，吸净上清，用质粒混合液重悬细胞，将其转移至电击杯中；而后将电击杯放在核电转仪中电击，电击程序结束后，立即加入1ml含有10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，然后将其转移至6孔板中，添加含有10％FBS的DMEM培养基至2ml，37℃培养。

双荧光素酶活性分析：37℃培养24h后，吸走6孔板中的培养基，PBS冲洗一遍；加入500μl的胰酶消化细胞，待多数细胞变圆后，加入1ml10％FBS的DMEM培养基终止消化，吹打细胞，得到细胞悬液。每孔各吸取75μl细胞悬液至COSTAR的96孔板，向各孔加75μl Dual-luciferase reagent，排枪混匀，室温避光反应30min，酶标仪检测萤火虫荧光素酶活性；随后再向各孔加75μl Dual-Stop&Reagent，排枪混匀，室温避光反应30min，酶标仪检测海肾荧光素酶活性。以萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性比值(即相对荧光素酶活性)即可代表启动子的启动强度，最后计算平均值和标准差。

结果(图2)显示，转染pGL3-SIECP的细胞的萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性比值为54.8±4.3，转染阴性对照质粒pGL3-Basic的细胞的萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性比值为5±0.73，转染阳性对照质粒pGL3-Control的细胞的萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性比值为100±5.72。

<110> 中国农业大学

<120> 一种猪小肠上皮细胞启动子SIECP及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2127

<212> DNA

<213> 猪

<400> 1

gtttgcttgg cttgatcagc agagctacgg aagagaatgc ctctctttgg tacatagaat 60

tcactgaata tggaaggggt ttggcatttt tatttcatct ctgtgaaaca atctttagtc 120

tttcaaatat ctttgtaaaa aattacaggc aagatagaaa agaatgatgg tatttattac 180

caatagaaac agtcttattt gaacatccta tgttgaaata actacttaat acagtgactc 240

ataggagctt tctagtggta ggcaaatgaa aacaaaacaa atgaaacagc atttaatttg 300

ttaggcaata gtgatatgcc ttttattggt tggactctga taaacacctg acaacaaatg 360

gtactttacc cgaagagaca cgtatcatgc accacatagt ctaaccataa acatgtcact 420

gtgagcctca agtggaatac gaaaggcagt tttcacatga ttccaggtag tccttaattt 480

gaataagtaa gtatttaaag cttaagtgac tatagtggct tcgtgttact gtgcatgtaa 540

tgcagaaatt gtgggaatac acaaaaatct attcaaatgt aaagcactaa agcgcttttc 600

acattacctt gtatttgtaa agcccactat tcataaaaac atttcttcaa cagttaattt 660

tctaagacca ttttctgttt accccaagac aaattattta tatctttaag gtgatagtca 720

caaccaaata ttttttgtgt aggtaattta gccaagattt atatataaaa caggttaaca 780

agtgaaattc taatctcaat agacagtaaa ggtgaacaat ttccacgttt aagatcttta 840

tataaaacat aattcaagga gaaatacgct taactctgga gattttaaaa ttttagattt 900

catcttgtag ccctttctat caagttgact atcttttacc tgggttgtct agaagatttg 960

aacttaaggt taggattcta gaagaggctt tagagaaaga tgagggtaaa attaagaccc 1020

tcattctatg cttaagaacc cattttatgg ctataagtat tttctagttc attcaaatag 1080

ccctttgcca gcaccttatt cgttcctttg ccaaaacatc cccatatgct ccccacaacc 1140

accctgtttc aataggtttt gttcacatca ggtttatatt gcaggagttt ccaaggacaa 1200

aagtgggttt cattcgtgtg gctccactca cactaagtta cttgctttaa ttgtagagaa 1260

gtttcctaat taattttccg cagcaaaatt gttaagggct ggaattcccc tcttgaattt 1320

cttcctagaa ttaggattca gaaagcacag gggattccat ccagttggtt tggggactca 1380

agataagtgt ttcttgtcat aggggtagtt agaggtctac tgtgataaac tcaactgctt 1440

gctagtgtgc taataatgac agacacataa gaatcacacg taaggagaat catctaggtt 1500

tcagaaatca gttttatcat tttaacatta ttttgaaggg attggtggtg gaagtaaaaa 1560

tttttaaatt taaatcctat aattcagaat gattttttaa taatagcata cacatggtat 1620

taaaaaactc cagatgacca tacaagacaa taaaattcaa tgaaatgtat ttgagtttgc 1680

aattcctcac caccttccca cgtaaagtgg taaatgtgaa gacaggcatt tgatgttacg 1740

ggaatgagga tgatttatgt ttggagcaga aaagtatcat catcagtttt ccttgaatgt 1800

ctatcagtac ttctgaattt aaaggatggt agactggttt acttgaactc tcaaaagtga 1860

catttttttc ttggtcttcc ttattgagta aagaataaat aaaaagagtg agagattgga 1920

aaccggagcc caccaaagtt taatcattaa tagtgggccc ttctgtgaac ttaggtcctg 1980

attttggagt ttggaatctg acctttcccc caaagataaa cattgttgca ggttcgagga 2040

gggtcactcc cttgctgcca ccgcaagaat ccacttctca gtgactcctc gcttggaact 2100

ggatgcacta gaggggagct ggtcaat 2127

Claims (10)

1.DNA分子，为下述a)或b)或c)：

a)序列表中序列1所示的DNA分子，所述DNA分子具有启动子功能；

b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA片段；

c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

2.含有权利要求1所述DNA分子的生物材料，为下述B1)至B19)中的任一种：

B1)含有权利要求1所述DNA分子的表达盒；

B2)含有权利要求1所述DNA分子的重组载体；

B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；

B4)含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物；

B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；

B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有权利要求1所述DNA分子的转基因动物细胞系；

B9)含有B1)所述表达盒的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12)含有权利要求1所述DNA分子的转基因动物组织；

B13)含有B1)所述表达盒的转基因动物组织；

B14)含有B2)所述重组载体的转基因动物组织；

B15)含有B3)所述重组载体的转基因动物组织；

B16)含有权利要求1所述DNA分子的转基因动物器官；

B17)含有B1)所述表达盒的转基因动物器官；

B18)含有B2)所述重组载体的转基因动物器官；

B19)含有B3)所述重组载体的转基因动物器官。

3.权利要求1所述DNA分子在作为启动子中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述启动子为动物组织或细胞特异性启动子。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述组织为动物小肠。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述细胞为动物小肠上皮细胞。

7.权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述生物材料在以下(a)至(c)中任一项中的应用：

(a)培育转基因动物；

(b)制备治疗肠道疾病药物；

(c)在动物中驱动目的基因的表达；

(d)驱动目的基因在动物小肠中表达。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述驱动目的基因在动物小肠中表达为驱动目的基因在动物小肠上皮细胞中表达。

9.目的基因在动物小肠中表达的方法，包括：将含有权利要求1所述的DNA分子和目的基因的表达盒导入动物中，实现目的基因在动物小肠中的表达。

10.扩增权利要求1所述DNA分子全长或部分片段的引物对。