CN110613065A - 一种瓜实蝇固体培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种瓜实蝇固体培养基，包括：5‑25wt％的南瓜；1‑15wt％的碳源，所述碳源包括单糖、双糖或者多糖中的一种或者多种；10‑46wt％的氮源，所述氮源包括酵母粉和/或谷物粉；0.025‑0.1wt％的钙源；以及0.25‑1wt％的固化剂，所述固化剂为琼脂和/或琼脂糖；其余为水。本发明瓜实蝇幼虫固体培养基简单高效，经济适用，易于操作，节省人工，同时可有效定量，彻底解决了瓜实蝇室内人工大量饲养的技术难题，极显著的推进了我国瓜实蝇固体培养基的研究发展，为瓜实蝇日后各项科学研究提供了大量的虫源，具有显著的经济和社会效益。

Description

一种瓜实蝇固体培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别地涉及一种瓜实蝇幼虫固体培养基及其制备方法。

背景技术

瓜实蝇Bactrocera(Zeugodacus)cucurbitae(Coquillett)，隶属于双翅目(Diptera)，实蝇科(Tephritidae)，镞实蝇属(Zeugodacus)。瓜实蝇是蔬菜和水果的重要害虫，其寄主广，危害性大，包括危害南瓜、丝瓜、苦瓜、柑橘、芒果和番石榴等100多种蔬菜和水果，可造成高达30％-100％的损失。

瓜实蝇被我国列为进境植物检疫性有害生物和重点管理的外来入侵物种，其起源于印度，广泛分布于热带及亚热带国家和地区。瓜实蝇在中国各地均可以安全越夏。瓜实蝇在中国不能越冬的分布北界为(31±2)°N左右。目前瓜实蝇在中国分布于广东、广西、海南、云南、贵州、江西、福建、四川、重庆、湖南等省份和地区，其中海南、广东、广西、云南南部、四川局部地区为高度适生区。目前，该虫适生区北界已至北京北部及河北中北部，河北、安徽、湖南、江西、江苏等地的中度适生区部分已成为高度适生区。随着全球气候变暖，其适生区范围还将向陕西、辽宁、河北等地北扩，至2020年，适生区范围相比目前将增加37.04％。

随着瓜实蝇生物学、毒理学、生态学、遗传学和分子生物学等学科领域的深入研究和防治技术的发展，实验室需要大量发育一致的瓜实蝇为试验材料。但是由于瓜实蝇天然食物易受生产季节的限制，且容易腐烂变质，影响种群的扩繁和实验室的环境卫生，使得探索瓜实蝇固体培养基配方及配置方法迫在眉睫。科学人工饲养瓜实蝇，解决瓜实蝇的大量饲养及季节性短缺问题，变得更加重要。

目前关于瓜实蝇幼虫的固体培养基的研究较少，现有的固体培养基为固体粉末混合的饲料，且多包含卫生纸，使得饲料很难混合均匀，费工费时又容易被微生物污染，且成本较高而不能推广。而饲料中营养分布不均匀也是导致现有培养基瓜实蝇的子代孵化率比较低的因素之一。同时，饲料由固体粉末混合而成且饲料混合不均匀，也使得对于瓜实蝇抗性的检测较难实现。因此需要提供一种经济适用的瓜实蝇幼虫固体培养基，为瓜实蝇各项科学试验研究提供大量子代孵化率高、发育一致的供试虫源。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种瓜实蝇固体培养基，包括：5-25wt％的南瓜；1-15wt％的碳源，所述碳源包括单糖、双糖或者多糖中的一种或者多种；10-46wt％的氮源，所述氮源包括酵母粉和/或谷物粉； 0.025-0.1wt％的钙源；以及0.25-1wt％的固化剂，所述固化剂为琼脂和/ 或琼脂糖；其余为水。

如上所述的培养基，所述单糖包括葡萄糖和/或果糖。

如上所述的培养基，所述双糖包括蔗糖和/或麦芽糖。

如上所述的培养基，所述谷物粉包括大豆粉、玉米粉或者木薯粉中的一者或者多者。

如上所述的培养基，所述钙源为氯化钙。

如上所述的培养基，还包括0.25-1wt％的酵母提取物。

如上所述的培养基，还包括pH调节剂，所述pH调节剂为丙酸。

如上所述的培养基，还包括pH调节剂，所述pH调节剂为0.3-1.2％的丙酸。

如上任一所述的培养基，其pH值为4-5。

一种配置瓜实蝇培养基的方法，包括：将5-25wt％的南瓜制成南瓜泥；将5-20wt％的酵母粉和1.5-6wt％的大豆粉加入南瓜泥中，形成混合物A；将3.5-15wt％的玉米粉、1-5wt％的葡萄糖、0.025-0.1wt％的氯化钙和 0.25-1wt％的琼脂，加入混合物A中，形成混合物B；加水后对混合物B进行高温处理，形成溶液C；以及将溶液C冷却。

如上所述的方法，还包括对所述溶液C进行分装。

如上所述的方法，还包括将所述南瓜在沸水中煮5-20分钟。

如上所述的方法，还包括向所述混合物A或者所述混合物B中加入0.25-1 wt％的酵母提取物和/或2-10wt％的蔗糖。

如上所述的方法，还包括向所述溶液C中加入体积分数占0.3-1.2％的丙酸。

本发明瓜实蝇幼虫固体培养基简单高效，经济适用，易于操作，节省人工，同时可有效定量，彻底解决了瓜实蝇室内人工大量饲养的技术难题，极显著的推进了我国瓜实蝇固体培养基的研究发展，为瓜实蝇日后各项科学研究提供了大量的虫源，具有显著的经济和社会效益。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本申请的各个特定实施例在以下进行了足够详细的描述，使得具备本领域相关知识和技术的普通技术人员能够实施本申请的技术方案。应当理解，还可以利用其它实施例或者对本申请的实施例进行结构、逻辑或者电性的改变。

为了详细说明本发明瓜实蝇幼虫固体培养基的技术内容、操作过程等，将结合实施例作进一步说明。

南瓜是瓜实蝇的天然食物，自然界中，瓜实蝇卵在南瓜上孵化、化蛹及羽化。本申请的瓜实蝇幼虫固体培养基结合瓜实蝇天然对南瓜的需求，在南瓜中添加碳源、氮源、钙源等营养物质，在琼脂的凝胶作用下最终制成瓜实蝇幼虫固体培养基。根据本申请的一个实施例，培养基中还可以包括酸度调节剂、防腐剂和防霉剂。其中，酸度调节剂可以将培养基pH值调整至瓜实蝇生长发育所需的最适pH，增加瓜实蝇的子代孵化率、化蛹率、蛹重及其羽化率。防腐剂可以延长培养基的保存及使用时间，方便实验的随时进行。根据本申请的一个实施例，根据实验需求，还可以在培养基中添加抗生素。

根据本申请的一个实施例，碳源可以为糖类，如单糖，包括葡萄糖、果糖等；双糖，包括蔗糖、麦芽糖等；多糖包括淀粉、果胶、纤维糖等中的一种或者多种。根据本申请的一个实施例，培养基中同时包括单糖、双糖和多糖，以便为瓜实蝇从卵发育成成虫的不同阶段提供源源不断的能量。根据本申请的一个实施例，培养基中包括蔗糖，蔗糖不仅可以为瓜实蝇提供糖类营养，还可以与琼脂结合，加强琼脂的凝胶能力。

氮源可以为谷物粉、酵母粉等。谷物不仅可以提供丰富的氮源，还可以为瓜实蝇发育提供大量的糖类。根据本申请的一个实施例，谷物可以包括大豆粉、玉米粉、木薯粉等。根据本申请的一个实施例，培养基中包括大豆粉。大豆粉不仅可以提供丰富的碳源与氮源，还可以对固体培养基杀菌，延长固体培养基发霉、变质的时间。酵母粉中除包含多肽、氨基酸、核苷酸等，还包括瓜实蝇生长发育所必需的的维生素和微量元素。

本领域技术人员应当理解，除高纯度的化学试剂，任何天然的营养添加物，如酵母粉、玉米、大豆等，均不可分离的看做碳源或者氮源，其均包括生物成长发育所需的多种营养物质。

根据本申请的一个实施例，钙源可以为氯化钙(CaCl₂)。在瓜实蝇发育过程中，尤其子代孵化、化蛹、羽化过程中，需要补充大量的钙离子。本申请中使用氯化钙不仅可以可以为瓜实蝇的发育提供钙源，氯化钙还可以与琼脂相互作用，加强琼脂的凝聚作用。

根据本申请的一个实施例，酸度调节剂为丙酸。同时，丙酸还可以作为本申请培养基的防腐剂和防霉剂。

实施例一：

瓜实蝇幼虫固体培养基包括5-25wt％的南瓜，5-20wt％的酵母粉，0.25-1 wt％的酵母提取物，1.5-6wt％的大豆粉，3.5-15wt％的玉米粉，1-5wt％的葡萄糖，2-10wt％的白砂糖，0.025-0.1wt％的氯化钙，0.25-1wt％的琼脂，体积分数占0.3-1.2％的丙酸，以及适量的水。

根据本申请的一个实施例，瓜实蝇幼虫固体培养基包括8wt％的南瓜，8 wt％的酵母粉，0.4wt％的酵母提取物，2.4wt％的大豆粉，5.2wt％的玉米粉，2wt％的葡萄糖，4.8wt％的白砂糖，0.04wt％的氯化钙，0.44wt％的琼脂，体积分数占0.48％的丙酸，以及适量的水。

例如，根据本申请的一个实施例，制作250mL瓜实蝇幼虫固体培养基，需南瓜20g、玉米粉13g、酵母粉20g、白砂糖12g、葡萄糖5g、大豆粉6g、酵母提取物1g、氯化钙0.1g、琼脂1.1g、丙酸1.2mL，加入水，将溶液定容至250mL。

实施例二：

瓜实蝇幼虫固体培养基的制备方法，包括以下步骤：

1、根据所需培养基的量，称取南瓜。制作本申请的培养基并不限定所添加的南瓜的品种及大小。根据本申请的一个实施例，可以选用成熟期南瓜，其营养物质更丰富。根据本申请的一个实施例，可将南瓜置于沸水中煮5-20分钟，捞出。此过程既可以对南瓜进行消毒杀菌处理，也可以降低南瓜的硬度，方便后续培养基制备。根据本申请的另一个实施例，也可以直接使用不经处理的南瓜。

将南瓜制成南瓜泥，放置容器中备用。根据本申请的一个实施例，可使用料理机、榨汁机、破壁机等制备南瓜泥，甚至可以直接将南瓜捣烂。本申请不限定南瓜制作南瓜泥的方法。

2、称取适量酵母粉和大豆粉，放置在一个烧杯中，并加入适量的水搅拌均匀后，倒入南瓜泥中。根据本申请的一个实施例，本步骤中还可以一并加入白砂糖、酵母提取物、酵母粉等中的一者或者多者，再次搅拌均匀，形成混合物A。

3、称取适量玉米粉、葡萄糖、氯化钙和琼脂，并加入适量的水搅拌均匀后，倒入南瓜泥中。根据本申请的一个实施例，也可以在本步骤中一并加入白砂糖、酵母提取物、酵母粉等中的一者或者多者，再次搅拌均匀，形成混合物 B。

4、在混合物B中加入足够的水，定容至所需体积。对混合物B进行加热，以使其中混合物充分混合，形成溶液C。根据本申请的一个实施例，对混合物 B进行加热至煮沸状态，可同时起到杀菌作用。根据本申请的一个实施例，根据配置培养基的总量调整煮沸时间。例如，配置250mL培养基时，煮沸时间可以为1-20分钟。煮沸时间延长有利于对混合物充分杀菌。根据本申请的一个实施例，也可以将混合物B封装后，放入灭菌锅中进行高温高压灭菌处理，同时使白砂糖、葡萄糖、酵母粉、酵母提取物、琼脂等添加物充分溶解于水中。根据本申请的一个实施例，灭菌锅灭菌程序为121℃，15min。根据本申请的另一个实施例，灭菌锅灭菌程序为117℃，20min。本领域技术人员应当理解，使用灭菌锅进行灭菌的温度、时间均可以调整，此处列举的程序均为本实验室常用程序，并不限定其他实现本申请目的程序使用。

5、根据本申请的一个实施例，将经步骤4完成的溶液C混合均匀，常温冷却。根据本申请的一个实施例，将溶液冷却至50-75℃备用。进一步地，根据本申请的一个实施例，将溶液冷却至60-65℃备用。向冷却至可用温度的溶液中加入适量丙酸，并充分混合均匀。根据本申请的一个实施例，调节溶液pH 至4～5。根据本申请的一个实施例，可在超净台内向溶液中加入丙酸，以免杀菌后的溶液内落入细菌。

6、将瓜实蝇幼虫固体培养基分装成小份。根据本申请的一个实施例，可以利用分配型蠕动泵对培养基进行分装处理。根据本申请的一个实施例，分装的每小份培养基为20mL。根据本申请的一个实施例，本步骤可在超净台中完成。

7、待培养基冷却并凝固后，封口处理，放置4℃冷藏柜保存备用。

实施例三：

采用本发明制备方法制备的瓜实蝇固体培养基进行幼虫饲养，将初孵瓜实蝇幼虫接入上述瓜实蝇固体培养基，进行7天左右的幼虫饲养。

如表1和表2所示，表1为瓜实蝇固体培养基配方表；表2为不同配方瓜实蝇幼虫固体培养基饲养幼虫效果比较。其中，第一行为配置培养基时可能用到的材料或者溶液，实验组A、B、C为根据本申请的实施例，微调各物质添加量，配置培养基的配方，CK1为对照组，是经本申请改造前使用的瓜实蝇幼虫培养基配方，CK2为对照组，南瓜是瓜实蝇的天然食物。本申请结合瓜实蝇的天然食物摄入，以及现有的可以培养瓜实蝇幼虫的培养基，对瓜实蝇幼虫固体培养基的成分及各成分的含量进行调整，配置自导孵化率、化蛹率、平均蛹重及羽化率均较高的培养基。

表1瓜实蝇幼虫固体培养基配方表

表2瓜实蝇幼虫固体培养基幼虫饲养效果比较

注：表中数据是平均数士标准误，同列数据后标有不同字母表示经Duncan’s新复极差法检验差异性显著(P<0.05)

试验方法及生物学参数统计说明

(1)试验方法

取培养皿5-10个，每个为一个试验重复，共计5-10个重复。每个接入初孵幼虫60头于固体培养基表面，盖上盒盖后置于饲养室的条件下进行饲养，7 天后检查幼虫龄期。如果已进入3龄幼虫并将培养皿打开盖，放入含有细沙的饲养盒中，经3天化蛹结束后筛沙取蛹。并计算化蛹率和平均蛹重。待成虫羽化后达到性成熟，接卵200粒于培养皿表面铺好的纸巾上，盖上盒盖后，置于饲养室的条件下待孵化，统计其子代孵化率。

化蛹率(％)＝供试蛹数/供试1龄幼虫数×100

平均蛹重(mg)＝每个蛹的重量之和(mg)/蛹数

(2)羽化率

将收集的瓜实蝇蛹(计数)放入底部铺有一层深度约洁净湿沙的培养皿直径10cm内，置于饲养笼内，待成虫全部羽化后，检查和记录已羽化的蛹壳数 (＝羽化成虫数)和未羽化的蛹数，计算其羽化率。

羽化率(％)＝羽化成虫数/供试蛹数×100

使用本发明的所述的瓜实蝇的幼虫固体培养基后，瓜实蝇的子代孵化率、化蛹率、平均蛹重和羽化率分别为85.50±1.92％，85.10±2.33％，15.89±0.37 mg，88.29±2.42％，均高于对照。尤其提高子代孵化率，可以提高研究样本的数量，对于提高实验的准确率及减小实验的不必要工作量具有积极意义。对于不同的南瓜、玉米粉和丙酸的添加量，发现南瓜20g，玉米粉13g，丙酸1.2 mL的效果最好。因此瓜实蝇固体培养基是可行的，即可对其定量分装，配置方便，又可对其定量优化。

使用本发明的瓜实蝇固体培养基，能够满足瓜实蝇幼虫期发育所需的营养，对其定量接入幼虫，可充分利用营养成分，并且不发生霉变变质和异味散发的问题。

上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此，所有等同的技术方案也应属于本发明公开的范畴。

Claims (14)

1.一种瓜实蝇固体培养基，包括：

5-25wt％的南瓜；

1-15wt％的碳源，所述碳源包括单糖、双糖或者多糖中的一种或者多种；

10-46wt％的氮源，所述氮源包括酵母粉和/或谷物粉；

0.025-0.1wt％的钙源；以及

0.25-1wt％的固化剂，所述固化剂为琼脂和/或琼脂糖；

其余为水。

2.根据权利要求1所述的培养基，所述单糖包括葡萄糖和/或果糖。

3.根据权利要求1所述的培养基，所述双糖包括蔗糖和/或麦芽糖。

4.根据权利要求1所述的培养基，所述谷物粉包括大豆粉、玉米粉或者木薯粉中的一者或者多者。

5.根据权利要求1所述的培养基，所述钙源为氯化钙。

6.根据权利要求1所述的培养基，还包括0.25-1wt％的酵母提取物。

7.根据权利要求1所述的培养基，还包括pH调节剂，所述pH调节剂为丙酸。

8.根据权利要求1所述的培养基，还包括pH调节剂，所述pH调节剂为0.3-1.2％的丙酸。

9.根据权利要求1-8任一所述的培养基，其pH值为4-5。

10.一种配置瓜实蝇培养基的方法，包括：

将5-25wt％的南瓜制成南瓜泥；

将5-20wt％的酵母粉和1.5-6wt％的大豆粉加入南瓜泥中，形成混合物A；

将3.5-15wt％的玉米粉、1-5wt％的葡萄糖、0.025-0.1wt％的氯化钙和0.25-1wt％的琼脂，加入混合物A中，形成混合物B；

加水后对混合物B进行高温处理，形成溶液C；以及

将溶液C冷却。

11.根据权利要求10所述的方法，还包括对所述溶液C进行分装。

12.根据权利要求10所述的方法，还包括将所述南瓜在沸水中煮5-20分钟。

13.根据权利要求10所述的方法，还包括向所述混合物A或者所述混合物B中加入0.25-1wt％的酵母提取物和/或2-10wt％的蔗糖。

14.根据权利要求10所述的方法，还包括向所述溶液C中加入体积分数占0.3-1.2％的丙酸。