CN110606867A - 一种高纯度蛋白质结晶的获取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例涉及一种高纯度蛋白质结晶的获取方法，所述方法包括：制备胶体晶体多层膜；根据拟纯化的目标蛋白的晶体生长条件，配备晶体第一生长溶液和第二生长溶液；制备样品池，并在所述样品池中注入所述第一生长溶液；将制备的胶体晶体多层膜平铺在所述样品池中的所述第一生长溶液上方；将所述第二生长溶液注入所述样品池中的所述胶体晶体多层膜上方；将遮挡物覆盖在所述样品池中的所述第二生长溶液上方，以形成密闭空间；将所述样品池置于恒温条件下，所述第一生长溶液中的目标蛋白经扩散通过所述胶体晶体多层膜之间的孔隙进入所述第二生长溶液，在所述第二生长溶液中生长出高纯度蛋白质结晶。
Description
技术领域
本发明实施例涉及分离纯化技术领域，尤其涉及一种高纯度蛋白质结晶的获取方法。
背景技术
蛋白质是生物体内含量丰富、多功能及多种类的生物大分子，是一切生命活动的物质基础。在医药、农业和食品加工业中具有潜在的应用价值。因此，了解蛋白质分子的结构并加以应用，对于医药、农业和食品加工业等领域的快速发展具有一定的推动作用。
蛋白质分子的功能特性主要取决于它独特的三维空间结构，因此，研究蛋白质分子的三维空间结构可以了解和确定它的功能。研究蛋白质的功能特性就需要对其进行富集，而蛋白质分子以晶体结构存在时是比较稳定且便于分析的，所以蛋白质结晶成为了人们重点关注的问题之一。
蛋白质结晶时主要存在两类杂质：小分子和大分子杂质。一方面，缓冲盐溶液以及沉淀剂会产生小分子杂质；另一方面，大分子杂质种类繁多，包括蛋白质的自聚体以及分离目标蛋白时混杂的其他蛋白分子等。杂质结合于蛋白质晶体中会对其生长产生显著的影响，从而对研究蛋白质的功能特性产生影响，因此如何更大程度的减少杂质获得高纯度的蛋白质晶体是当前急需解决的问题。
发明内容
鉴于此，为解决现有技术中的问题，本发明实施例提供了一种高纯度蛋白质结晶的获取方法。
第一方面，本发明实施例提供了一种高纯度蛋白质结晶的获取方法，所述方法包括：
制备胶体晶体多层膜；
根据拟纯化的目标蛋白的晶体生长条件，配备晶体第一生长溶液和第二生长溶液；
制备样品池，并在所述样品池中注入所述第一生长溶液；
将制备的胶体晶体多层膜平铺在所述样品池中的所述第一生长溶液上方；
将所述第二生长溶液注入所述样品池中的所述胶体晶体多层膜上方；
将遮挡物覆盖在所述样品池中的所述第二生长溶液上方，以形成密闭空间；
将所述样品池置于恒温条件下，所述第一生长溶液中的目标蛋白经扩散通过所述胶体晶体多层膜之间的孔隙进入所述第二生长溶液，在所述第二生长溶液中生长出高纯度蛋白质结晶。
在一个可能的实施方式中，所述制备胶体晶体多层膜，包括：
根据胶体微球直径的大小选择不同的方法将单分散胶体微球自组装成高度有序的胶体晶体多层膜。
在一个可能的实施方式中，所述胶体晶体多层膜包括两层胶体晶体膜或者三层胶体晶体膜。
在一个可能的实施方式中，所述第一生长溶液中的目标蛋白的浓度至少为相同温度条件下目标蛋白在所述第一生长溶液中溶解度的120％或以上，以形成目标蛋白的过饱和溶液。
在一个可能的实施方式中，所述第一生长溶液为包括目标蛋白、杂质以及沉淀剂的晶体生长溶液，其中溶液具有满足目标蛋白生长的酸碱度。
在一个可能的实施方式中，所述第二生长溶液为不包含目标蛋白与杂质，但包含沉淀剂的晶体生长溶液。
在一个可能的实施方式中，所述制备样品池，包括：
利用目标材质的玻璃制备样品池。
在一个可能的实施方式中，所述将遮挡物覆盖在所述样品池中的所述第二生长溶液上方，以形成密闭空间，包括：
将目标材质的玻璃片覆盖在所述样品池中的所述第二生长溶液上方，以形成密闭空间。
本发明实施例提供的技术方案，针对相关技术中的不足，制备胶体晶体多层膜；根据拟纯化的目标蛋白的晶体生长条件，配备晶体第一生长溶液和第二生长溶液；制备样品池，并在所述样品池中注入所述第一生长溶液；将制备的胶体晶体多层膜平铺在所述样品池中的所述第一生长溶液上方；将所述第二生长溶液注入所述样品池中的所述胶体晶体多层膜上方；将遮挡物覆盖在所述样品池中的所述第二生长溶液上方，以形成密闭空间；将所述样品池置于恒温条件下，所述第一生长溶液中的目标蛋白经扩散通过所述胶体晶体多层膜之间的孔隙进入所述第二生长溶液，在所述第二生长溶液中生长出高纯度蛋白质结晶，可以更大程度的减少杂质获得高纯度的蛋白质晶体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明实施例中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例的一种高纯度蛋白质结晶的获取方法的实施流程示意图；
图2为本发明实施例的一种胶体晶体多层膜的示意图；
图3为本发明实施例的另一种样品池的示意图；
图4为本发明实施例的一种在样品池平铺胶体晶体多层膜的示意图；
图5为本发明实施例的一种在样品池注入第二溶液的示意图；
图6为本发明实施例的一种可通过溶质分子直径的示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以具体实施例做进一步的解释说明，实施例并不构成对本发明实施例的限定。
在本发明实施例中，采用胶体晶体薄膜也可以实现类似于凝胶层析分离，利用胶体微球之间的孔隙可实现蛋白的分离纯化，该方法与凝胶层析技术原理有一定的相似之处，都是根据蛋白质分子大小不同进行去除杂质，得到品质较高的蛋白质。目前的技术可以将单分散胶体微球自组装成高度有序的胶体晶体薄膜，并且微球之间的孔隙大小可以通过单分散胶体微球的直径大小进行调节。胶体晶体的组装方法非常多，常用的有自然沉淀法、离心沉淀法和溶剂蒸发法等。
本发明实施例实现晶体生长的原理是：首先，配制两种溶液，一种溶液是含有目标蛋白(欲进行结晶的蛋白)和杂质的晶体第一生长溶液，溶液中含有一定浓度的目标蛋白和一定浓度的沉淀剂，且溶液具有适合目标蛋白生长晶体的pH值；另外一种第二生长溶液除了与前述溶液相比，不含有目标蛋白与杂质外，其他溶液组成一致。制备出合适的胶体晶体薄膜，使胶体微球之间的孔隙大于目标蛋白分子的体积。利用胶体晶体薄膜比较柔软，可漂浮于水面上的特点，将胶体晶体薄膜置于上述所配制的晶体第一生长溶液、晶体第二生长溶液两种溶液之间，由于晶体第一生长溶液和晶体第二生长溶液之间存在目标蛋白的浓度梯度，目标蛋白和尺寸小于胶体微球之间孔隙的杂质分子将从晶体第一生长溶液中通过溶液扩散经过胶体晶体薄膜之间的孔隙后，进入到晶体第二生长溶液中。当晶体第二生长溶液中目标蛋白的浓度逐渐增大并达到过饱和程度后，目标蛋白将在晶体第二生长溶液中进行结晶。而晶体第一生长溶液中比胶体微球之间的孔隙体积更大的杂质分子则无法通过胶体晶体薄膜进入到晶体第二生长溶液中。这样在晶体第二生长溶液中，由于去除了大部分的杂质，目标蛋白经过结晶后，可以生长出高品质的蛋白质晶体。
本发明实施例与凝胶层析技术相比有以下几点不同之处：1，由于胶体晶体薄膜厚度较小，蛋白分子扩散相对容易，所以不需要像凝胶层析技术外加高压帮助分子扩散。2，由于胶体晶体薄膜体积非常小，胶体晶体薄膜内部蛋白溶液的死体积非常小。3，胶体晶体薄膜比较容易制备，所使用的材料费用低廉，使用完毕后无需再生。4，凝胶层析技术操作比较复杂，层析柱材料价格昂贵，而利用胶体晶体薄膜进行去除杂质操作简单、材料廉价。5，凝胶层析技术只是将目标蛋白分离出来，而本方法可以一边将目标蛋白与大多数杂质进行分离，一边对目标蛋白进行结晶。最终获得的目标蛋白是胶体晶体膜分离与晶体结晶两种分离纯化技术相耦合后的结果，所获得的目标蛋白含有的杂质更少、纯度更高。
基于上述原理，本发明实施例提供一种高纯度蛋白质结晶的获取方法，如图1所示，该方法具体可以包括以下步骤：
101，制备胶体晶体多层膜；
在本发明实施例中，制备胶体晶体多层膜：根据胶体微球直径的大小选择不同的方法将单分散胶体微球自组装成高度有序的胶体晶体多层膜。其中，胶体晶体多层膜包括两层胶体晶体膜或者三层胶体晶体膜(便于蛋白质进行扩散)，如图2所示为一个三层胶体晶体膜，1表示胶体微球，2表示胶体微球之间的孔隙。
102，根据拟纯化的目标蛋白的晶体生长条件，配备晶体第一生长溶液和第二生长溶液；
根据拟纯化的目标蛋白的晶体生长条件，配备晶体第一生长溶液和第二生长溶液。其中，第一生长溶液中的目标蛋白的浓度至少为相同温度条件下目标蛋白在第一生长溶液中溶解度的120％或以上，以形成目标蛋白的过饱和溶液。
第一生长溶液为包括目标蛋白、杂质以及沉淀剂的晶体生长溶液，其中溶液具有满足目标蛋白生长的酸碱度。第二生长溶液为不包含目标蛋白与杂质，但包含沉淀剂的晶体生长溶液，其余成分与第一溶液相同。
103，制备样品池，并在所述样品池中注入所述第一生长溶液；
如图3所示，利用目标材质的玻璃制备样品池，并在样品池中注入晶体第一生长溶液，3指向晶体第一生长溶液。
在本发明实施例中，对于目标材质的玻璃，可以是光学玻璃，可以是有机玻璃，当然也可以是其它材质的玻璃，本发明实施例对此不作限定。
104，将制备的胶体晶体多层膜平铺在所述样品池中的所述第一生长溶液上方；
如图4所示，将制备的胶体晶体多层膜平铺在所述样品池中的所述第一生长溶液上方，4指向胶体晶体多层膜。
105，将所述第二生长溶液注入所述样品池中的所述胶体晶体多层膜上方；
106，将遮挡物覆盖在所述样品池中的所述第二生长溶液上方，以形成密闭空间；
如图5所示，将所述第二生长溶液注入所述样品池中的所述胶体晶体多层膜上方，将目标材质的玻璃片覆盖在所述样品池中的所述第二生长溶液上方，以形成密闭空间。5指向晶体第二生长溶液，6指向目标材质的玻璃片。此时，第一生长溶液的体积远大于第二生长溶液的体积，以便于第一生长溶液中目标蛋白分子扩散进入第二生长溶液后，仍能在第二生长溶液中达到过饱和。
107，将所述样品池置于恒温条件下，所述第一生长溶液中的目标蛋白经扩散通过所述胶体晶体多层膜之间的孔隙进入所述第二生长溶液，在所述第二生长溶液中生长出高纯度蛋白质结晶。
将如图5所示的装置置于恒温条件下，温度的选择基于目标蛋白晶体生长所设定的温度。
所述第一生长溶液中的目标蛋白经扩散通过所述胶体晶体多层膜之间的孔隙进入所述第二生长溶液，随着扩散过程的不断进行，在第二溶液中的目标蛋白的浓度逐渐增大，并在一段时间以后达到过饱和，目标蛋白开始进行结晶。
第一生长溶液中存在的杂质分子，如果其尺寸大于胶体晶体薄膜1之间的孔隙，则无法通过孔隙进入第二生长溶液中。第一生长溶液中的杂质分子，如果其尺寸小于胶体晶体薄膜1之间的孔隙，则仍然可以通过孔隙进入第二生长溶液中。经过胶体晶体薄膜1之间的孔隙进行过滤筛选，第二生长溶液中仅有目标蛋白分子与尺寸小于胶体晶体薄膜1之间孔隙的杂质分子。目标蛋白在第二生长溶液中最终形成的生长溶液的组成较第一生长溶液的组成更加简单，目标蛋白在第二生长溶液中的含量较其在第一生长溶液中的含量增加。在第二生长溶液中生长出的目标蛋白的晶体，其中的杂质含量将小于目标蛋白在第一生长溶液中生长出的晶体。这样，经过胶体晶体薄膜1之间的孔隙过滤筛选、目标蛋白晶体结晶过程中的“自筛选”，这二种纯化方法相耦合作用下，最终获得的目标蛋白将具有较高的纯度。
为了对本发明实施例提供的技术方案进行说明，提供下列实施例，利用SiO2胶体晶体多层膜获得高纯度溶菌酶晶体：
1、制备SiO2胶体晶体多层膜：采用超重力法制备均匀的单分散SiO2颗粒，其平均粒径在30nm左右，然后将颗粒粒径为30nm左右的SiO2微球通过沉淀法将其自组装成高度有序的胶体晶体薄膜，选用的胶体晶体薄膜厚度大概2-3层(便于蛋白质进行扩散作用)即可。
如图6所示，此时SiO2胶体晶体薄膜之间形成的孔隙可通过的溶质分子直径大小为L，则
其中R为SiO2胶体微球的直径，此时当SiO2胶体微球粒径为30nm时，L约为9nm。
2、制备样品池：用玻璃片围成一个样品池，并在样品池中注入含有溶菌酶及杂质的过饱和第一生长溶液3。
3、利用载玻片轻轻的将制备的SiO2胶体晶体薄膜4转移并置于含有溶菌酶及杂质的过饱和第一生长溶液3上方。
4、配制不含溶菌酶的第二生长溶液5，在SiO2胶体晶体多层膜上方注入第二生长溶液5并在上方用玻璃片6密封形成一个密闭空间，此处含有溶菌酶及杂质的过饱和第一生长溶液3的体积远大于不含溶菌酶及杂质的第二生长溶液5的体积。
5、将该样品池置于20℃下恒温生长，目标蛋白溶菌酶由扩散作用通过SiO2胶体微球之间的孔隙进入到上方的第二生长溶液5中进行结晶，其他的杂质无法通过孔隙，最终便得到了较高品质的溶菌酶晶体。
专业人员应该还可以进一步意识到，结合本文中所公开的实施例描述的各示例的单元及算法步骤，能够以电子硬件、计算机软件或者二者的结合来实现，为了清楚地说明硬件和软件的可互换性，在上述说明中已经按照功能一般性地描述了各示例的组成及步骤。这些功能究竟以硬件还是软件方式来执行，取决于技术方案的特定应用和设计约束条件。专业技术人员可以对每个特定的应用来使用不同方法来实现所描述的功能，但是这种实现不应认为超出本发明的范围。
结合本文中所公开的实施例描述的方法或算法的步骤可以用硬件、处理器执行的软件模块，或者二者的结合来实施。软件模块可以置于随机存储器(RAM)、内存、只读存储器(ROM)、电可编程ROM、电可擦除可编程ROM、寄存器、硬盘、可移动磁盘、CD-ROM、或技术领域内所公知的任意其它形式的存储介质中。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种高纯度蛋白质结晶的获取方法，其特征在于，所述方法包括：
制备胶体晶体多层膜；
根据拟纯化的目标蛋白的晶体生长条件，配备晶体第一生长溶液和第二生长溶液；
制备样品池，并在所述样品池中注入所述第一生长溶液；
将制备的胶体晶体多层膜平铺在所述样品池中的所述第一生长溶液上方；
将所述第二生长溶液注入所述样品池中的所述胶体晶体多层膜上方；
将遮挡物覆盖在所述样品池中的所述第二生长溶液上方，以形成密闭空间；
将所述样品池置于恒温条件下，所述第一生长溶液中的目标蛋白经扩散通过所述胶体晶体多层膜之间的孔隙进入所述第二生长溶液，在所述第二生长溶液中生长出高纯度蛋白质结晶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备胶体晶体多层膜，包括：
根据胶体微球直径的大小选择不同的方法将单分散胶体微球自组装成高度有序的胶体晶体多层膜。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶体晶体多层膜包括两层胶体晶体膜或者三层胶体晶体膜。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一生长溶液中的目标蛋白的浓度至少为相同温度条件下目标蛋白在所述第一生长溶液中溶解度的120％或以上，以形成目标蛋白的过饱和溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一生长溶液为包括目标蛋白、杂质以及沉淀剂的晶体生长溶液，其中溶液具有满足目标蛋白生长的酸碱度。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二生长溶液为不含目标蛋白与杂质，但包含沉淀剂的晶体生长溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备样品池，包括：
利用目标材质的玻璃制备样品池。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将遮挡物覆盖在所述样品池中的所述第二生长溶液上方，以形成密闭空间，包括：
将目标材质的玻璃片覆盖在所述样品池中的所述第二生长溶液上方，以形成密闭空间。
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