CN110596258A - 一种基于代谢组学分析鉴别松花粉灭菌方式的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于代谢组学分析鉴别松花粉灭菌方式的方法，包括包括制备松花粉提取液，对提取液进行色谱检测和质谱检测，对检测数据分析处理确定松花粉标志性代谢产物以及对松花粉标志性代谢产物进行二级质谱检测。本发明的有益效果是：本发明通过乙醇提取松花粉代谢物进行UPLC‑QE‑MS分析，UPLC‑QE‑MS数据使用Compound Discover处理，再将数据导入SIMCA14.0软件，使用主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS‑DA)和正交‑偏最小二乘判别分析(OPLS‑DA)进行多元统计分析，能够快速准确地寻找出不同灭菌方式松花粉的代谢产物，从而用于不同灭菌方式松花粉的区分鉴别。

Description

一种基于代谢组学分析鉴别松花粉灭菌方式的方法
技术领域
本发明涉及检测分析技术领域，尤其涉及一种基于代谢组学分析鉴别松花粉灭菌方式的方法。
背景技术
松花粉多指马尾松Pinus massoniana Lamb.、油松(Pinus tabulaeformisCarr.)、赤松(Pinus densiflora)、黑松等松科植物的雄性生殖细胞。松花粉在我国的应用历史千年有余。松科植物约110种，分布于欧洲、亚洲、北美洲、非洲北部。马尾松、油松、华山松等为我国特有的乡土树种，黑松原产日本进和韩国东部沿海地区，在我国辽宁、河北、河南、山东、江苏、浙江、江西及湖北等地大面积引种栽培。
灭菌主要是除去食品中的有害微生物，从而保证食物对人体的安全性。灭菌方法主要有热杀菌和非热杀菌。热杀菌主要是以热处理的方式改善视频的品质、延长食品贮藏期。根据要杀灭的微生物的种类，热杀菌主要分为巴氏杀菌(pasteurisation)和商业杀菌(sterilization)。巴氏杀菌是一种比较温和的杀菌方式，典型的巴氏杀菌条件为62.8℃，30min。可以有效地钝化食品中酶的活性，并破坏食物中的热敏性微生物和致病菌。商业杀菌是一种较为强烈的方式，主要是将食品加热到较高的温度并维持一定的时间以达到杀死所有致病菌、腐败菌、和绝大部分微生物的目的，从而延长食品的货架期，但是它对食品中的营养成分破坏较大。超高温瞬时灭菌(UHT)是指将食品加热到120℃以上,持续几秒钟，然后迅速冷却至室温的一种杀菌方法。 Stevenson研究了英国UHT对英国牛奶中的碘含量的影响，结果证明了与常规奶相比，UHT灭菌牛奶中的碘含量降低了27％。也说明了UHT灭菌会对食品营养物质造成一定的破坏。由于传统的热杀菌会不同程度地造成食品营养和风味物质的改变，尤其是一些热敏性物质，所以非热杀菌技术受到越来越多的关注和重视。常见的非热杀菌有超高压杀菌(UHP)，处理过程一般在常温下进行，处理时间可以从几秒到几十分钟。超高压杀菌可以杀菌、破坏酶、改善物料结构。除此之外，食品常用的灭菌方法还有高压蒸汽灭菌、辐照灭菌、微波灭菌、电离灭菌等。
松花粉常用的灭菌方法主要有辐照灭菌、超高温瞬时灭菌、微波灭菌等。其中对于辐照灭菌松花粉，早期研究证明了辐照灭菌能有效杀死90％的杂菌。有人研究了超高温瞬时灭菌破壁松花粉(UHT-PP)和60Co辐照灭菌破壁松花粉的脂质氧化稳定性，结果表明UHT松花粉更容易发生酸败，可能是因为在加工过程中发生了显着的脂质氧化和抗氧化降解。不同处理方式的松花粉成分存在细微的差别，如何对不同灭菌方式的松花粉进行准确的区分和定性尚存在一定的难度。
发明内容
本发明针对不同灭菌方式的松花粉不易区分的问题，提供一种基于代谢组学分析鉴别松花粉灭菌方式的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种基于代谢组学分析鉴别松花粉灭菌方式的方法，其特征在于，包括如下步骤；
1)制备松花粉提取液
将松花粉与乙醇涡旋混合，经超声提取后置入离心机中离心，将上清液经过孔径为0.22μm的滤膜过滤，即得松花粉提取液；
2)色谱检测
将步骤1)所得松花粉提取液进行UPLC-QE-MS上样分析检测，色谱柱为ACQUITYUPLC BEH C18柱(2.1×150mm，1.7μm)，柱温25℃，进样流速为0.3μL/min，进样体积为2μL，色谱检测参数为：
正谱条件：洗脱液A相为含0.1％(v:v)甲酸的10Mm醋酸铵水溶液，B 相为0.1％(v:v)磷酸乙腈溶液，梯度洗脱流程为：0-3.5min 98％A，3.5-4min 98％-90％A，4-5min 90％-85％A，5-5.5min 85％-75％A，5.5-6.5min 75％-65％A， 6.5-7.5min 65％-55％A，7.5-8.75min 55％-35％，8.75-9.75min 35％-20％A， 9.75-11.75min 20％-10％A，11.75-14min 10％-1％A，14-16.5min 1％A， 16.5-17.5min 1％-90％A，17.5-20min 95％A；
负谱条件：洗脱液A相为10Mm醋酸铵水溶液，B相为乙醇，梯度洗脱流程为：0-1.5min 95％A，1.5-3min 95％-80％A，3-4min 80％-65％A，4-5min 65％-25％A，5-6.5min25％-10％A，6.5-10min 10％-1％A，10-12min 1％A， 12-14min 1％-95％A，14-16min95％A；
3)质谱检测
将步骤1)所得松花粉提取液进行质谱检测，质谱检测条件为：
一级质谱
正谱条件：分辨率，75000(FWHM)；鞘气，30Arb；辅助气，15Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.8kV；毛细管温度，300℃；辅助气温度，330℃。扫描范围，m/z：90-1225。扫描模式：Full Ms；
负谱条件：分辨率，75000(FWHM)；鞘气，30Arb；辅助气，15Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.8kV；毛细管温度，300℃；辅助气温度，330℃，扫描范围，m/z：90-1225，扫描模式：Full Ms；
二级质谱
正谱条件：分辨率，165000(FWHM)；鞘气，35Arb；辅助气，10Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.6kV；毛细管温度，310℃；辅助气温度，350℃；扫描范围，m/z：90-1225，HCD高能碰撞池碰撞能量NCE:40、50、70、90，扫描模式：Full MS-ddMS2；
负谱条件：分辨率，165000(FWHM)；鞘气，35Arb；辅助气，10Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.6kV；毛细管温度，310℃；辅助气温度，350℃；扫描范围，m/z：90-1225。HCD高能碰撞池碰撞能量NCE:40、50、70、90，扫描模式：Full MS-ddMS2；
4)Compound Discover数据处理
使用Compound Discover软件对步骤2)和步骤3)所得检测数据进行提取、分析、整理，通过峰对齐、去卷积、降噪、归一化处理，得到原始数据矩阵；
5)SIMCA软件数据处理
将步骤4)的原始数据矩阵导入SIMCA14.0进行分析，使用主成分分析 PCA、偏最小二乘判别PLS-DA和正交-偏最小二乘判别OPLS-DA分析数据，运用置换排列实验检验，结合原始数据矩阵中的物质在两种松花粉中峰面积比值Ratio和P值，Ratio值大于2或小于0.5且P值小于0.01的代谢物即认定为松花粉标志性代谢产物；
6)松花粉标志性代谢产物的二级质谱检测
将步骤5)的松花粉标志性代谢产物进行二级质谱分析，得到二级质谱信息，二级质谱保留时间与一级质谱保留时间的允许偏差为0.2min，保留时间对应的物质即为不同灭菌方式松花粉的标志性代谢产物。
其中，步骤1)中松花粉与乙醇的用量比为1g:60mL，超声提取时间为 30min；离心机的转速为7000rpm/min，离心温度为4℃，离心时间为10min。步骤4)Compound Discover数据处理过程中设置参数为：峰对齐时保留时间偏差为1.5min，质量偏差为4ppm，未知元素组成设定C90、H190、O15、P3、Br3、C14。步骤6)松花粉标志性代谢产物的二级质谱质谱检测条件为：采用Full MS-ddMS2的扫描模式进行碎片信息的采集，其中HCD高能碰撞池碰撞能量NCE为40、50、70、90。
本发明的有益效果是：本发明通过乙醇提取松花粉代谢物进行 UPLC-QE-MS分析，UPLC-QE-MS数据使用Compound Discover处理，再将数据导入SIMCA14.0软件，使用主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交-偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)进行多元统计分析，能够快速准确地寻找出不同灭菌方式松花粉的代谢产物，从而用于不同灭菌方式松花粉的区分鉴别。
附图说明
图1从上到下分别为辐照组与新鲜组松花粉的总离子流图；
图2为PCA得分图；
图3为载荷双标图；
图4为UHT松花粉与新鲜松花粉的总离子流图；
图5为UHT与新鲜花粉比较的PCA得分图；
图6为PCA载荷双标图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本实施例中使用的仪器、试剂和松花粉样品如下：
1、仪器与软件：
2、试剂：
3、松花粉样品由烟台新时代健康产业有限公司提供，以下为7种松花粉样品表型和产地信息：
基于代谢组学分析鉴别上述松花粉灭菌方式的方法，步骤如下：
(1)制备松花粉提取液
分别称取上述4种不同表型松花粉的粉末0.5g，分别加入30ml乙醇涡旋混合，分别经超声提取30min后，7000rpm/min的转速下离心10min，所得上清液过孔径0.22μm滤膜，即得松花粉提取液，备用；
(2)色谱检测
将步骤(1)所得提取液各1ml注入进样瓶，采用UPLC-QE-MS上样分析检测，检测参数为：
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)，柱温25℃；
正谱条件：洗脱液A相为含0.1％(v:v)甲酸的10Mm醋酸铵水溶液，B 相为0.1％(v:v)磷酸乙腈溶液，梯度洗脱流程为：0-3.5min 98％A，3.5-4min 98％-90％A，4-5min 90％-85％A，5-5.5min 85％-75％A，5.5-6.5min 75％-65％A， 6.5-7.5min 65％-55％A，7.5-8.75min 55％-35％，8.75-9.75min 35％-20％A， 9.75-11.75min 20％-10％A，11.75-14min 10％-1％A，14-16.5min 1％A， 16.5-17.5min 1％-90％A，17.5-20min 95％A；
负谱条件：洗脱液A相为10Mm醋酸铵水溶液，B相为乙醇，梯度洗脱流程为：0-1.5min 95％A，1.5-3min 95％-80％A，3-4min 80％-65％A，4-5min 65％-25％A，5-6.5min25％-10％A，6.5-10min 10％-1％A，10-12min 1％A， 12-14min 1％-95％A，14-16min95％A。
流速：0.3μL/min；进样体积：2μL；
(3)质谱检测
将步骤(1)所得提取液进行质谱检测，质谱检测条件为：
一级质谱
正谱条件：分辨率，75000(FWHM)；鞘气，30Arb；辅助气，15Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.8kV；毛细管温度，300℃；辅助气温度，330℃。扫描范围，m/z：90-1225。扫描模式：Full Ms；
负谱条件：分辨率，75000(FWHM)；鞘气，30Arb；辅助气，15Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.8kV；毛细管温度，300℃；辅助气温度，330℃，扫描范围，m/z：90-1225，扫描模式：Full Ms；
二级质谱
正谱条件：分辨率，165000(FWHM)；鞘气，35Arb；辅助气，10Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.6kV；毛细管温度，310℃；辅助气温度，350℃；扫描范围，m/z：90-1225，HCD高能碰撞池碰撞能量NCE:40、50、70、90，扫描模式：Full MS-ddMS2；
负谱条件：分辨率，165000(FWHM)；鞘气，35Arb；辅助气，10Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.6kV；毛细管温度，310℃；辅助气温度，350℃；扫描范围，m/z：90-1225。HCD高能碰撞池碰撞能量NCE:40、50、70、90，扫描模式：Full MS-ddMS2。
(4)Compound Discover数据处理
使用Compound Discover软件对步骤2)和步骤3)所得检测数据进行提取、分析、整理，通过峰对齐、去卷积、降噪、归一化处理，得到原始数据矩阵；在Compound Discover数据处理过程中设置参数：峰对齐时保留时间偏差为1min，质量偏差为5ppm，未知元素组成设定C90、H190、N10、 P3、Br3、C14；
(5)SIMCA软件数据处理
将步骤(4)的原始数据矩阵导入SIMCA14.0进行分析，使用主成分分析PCA、偏最小二乘判别PLS-DA和正交-偏最小二乘判别OPLS-DA分析数据，运用置换排列实验检验；结合原始数据矩阵中的物质在两种松花粉中峰面积比值Ratio和P值，Ratio值大于2或小于0.5且P值小于0.01的代谢物即认定为松花粉标志性代谢产物；
(6)松花粉标志性代谢产物的二级质谱信息
将步骤(5)的松花粉标志性代谢产物进行二级质谱分析，得到二级质谱信息，质谱检测条件为：采用Full MS-ddMS2(TOP5)的扫描模式进行碎片信息的采集，其中HCD高能碰撞池碰撞能量NCE：40、50、70、90，二级质谱保留时间与一级质谱保留时间的允许偏差为0.2min，保留时间对应的物质即为不同灭菌方式松花粉的标志性代谢产物。
Compound Discover处理后得到的原始数据矩阵进行序号填充处理后导入SIMCA14.0，然后进行行列转换、设置Primary ID和Secondary ID后保存为excel格式，然后进行PCA、PLS-DA和OPLS-DA处理，并对PLS-DA进行排列置换检验，结果如图1-6所示。
辐照灭菌松花粉与新鲜松花粉的多元统计分析。辐照灭菌松花粉属于云南松，为了更好地了解辐照灭菌对松花粉代谢物的影响，我们将辐照组花粉与新鲜松花粉进行比较分析，图1为从上到下分别是辐照组与新鲜组松花粉的总离子流图。除去前一分钟与最后一分钟的离子峰，在15.5-18.5min时间段内，两者的峰存在一些差异。接下将数据导入Compound Discover软件，比对结果进行筛选，筛选条件为Ratio值大于10或小于0.1，将筛选后的数据导入SIMCA软件进一步分析。图2为PCA得分图，辐照组松花粉与新鲜松花粉得到了很好的区分，右侧为辐照组，左侧为新鲜松花粉组。图3是我们得到的载荷双标图，其中X表示可能的差异性代谢物，从图中可以看出有较多的代谢物分布在右侧即新鲜松花粉组，这都说明了辐照灭菌组与新鲜松花粉组存在一定的差异性。
UHT灭菌松花粉与新鲜松花粉之间的多云统计分析。将UHT松花粉与新鲜云南松进行比较分析，图4为UHT松花粉与新鲜松花粉的总离子流图，除去前一分钟与最后一分钟的信息，从图中可以看出10-11min与 15.5-18.5min处出有一些差异，所以我们用CompoundDiscover软件与 SIMCA软件对Full MS模式下采集到的一级质谱数据做一步分析。由于原始数据信息量庞大，我们首先对信息进行筛选，Ratio值设定范围为大于20，小于0.05，且P值小于0.01。图5是UHT与新鲜花粉比较的PCA得分图，从图中可以看出两者在第一主成分上得到了很好的分离。图6是PCA载荷双标图，其中X代表可能的差异性代谢物，左侧的表明这些代谢物分布在新鲜松花粉中，右侧的代谢物较多地集中在UHT灭菌松花中。
在正交-偏最小二乘判别(OPLS-DA)中结合原始数据矩阵中的物质在两种松花粉中峰面积比值Ratio和P值，Ratio值大于10或小于0.5且P值小于0.01的代谢物即认定为松花粉标志性代谢产物。将这些代谢产物进行二级质谱分析，在二级质谱中保留时间与一级质谱保留时间对应的物质确定为不同灭菌方式松花粉标志性代谢产物，保留时间允许偏差为0.2min。
表1列出6种可能的差异性代谢物。这六种可能的差异性代谢物分别是 2-甲酰吡啶、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、山奈酚、十六烷基甜菜碱、十四烷基N-[(烯丙基氧基)羰基]丙氨酸、脱氢胆酸。其中2-甲酰吡啶和脱氢胆酸的Ratio值分别为63.951、49.751，由于Ratio值是辐照组与新鲜组的比值，所以这两种化合物在辐照组含量较多。其余四种代谢物的Ratio值均小于1，也就是说新鲜松花粉中含有较多的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、山奈酚、十六烷基甜菜碱、十四烷基N-[(烯丙基氧基)羰基]丙氨酸。这也说明了松花粉经辐照灭菌处理后，一些代谢物的含量会发生变化，同时也证明了辐照灭菌对松花粉代谢物具有一定的影响。
表2列出12种可能的差异性代谢物，其他物质的定性有待于进一步分析。这12种代谢物分别是2-甲酰吡啶、苯甲酸、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、吡哆胺、1-环己基-4-哌啶酮、1-(4-甲基苯基)-3-吗啉丙烷-1-酮、亚甲基丁二酸二丁酯、山奈酚、1-(4-吗啉基)-3-[(1,7,7-三甲基双环[2.2.1] 庚-2-基)氧基]-2-丙醇、十四烷基N-[(烯丙基氧基)羰基]丙氨酸、脱氢胆酸、2-亚油酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。其中2-甲酰吡啶Ratio值较高，为102.53，也就是说在UHT灭菌松花粉中含有较多的2-甲酰吡啶，除此之外还有含有较多的苯甲酸、1-环己基-4-哌啶酮、脱氢胆酸和2-亚油酸-sn-甘油 -3-磷酸乙醇胺。其余的7种代谢物的Ratio值都小于1，也就是说新鲜松花粉含有较多山奈酚、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、十四烷基N-[(烯丙基氧基)羰基]丙氨酸等物质。UHT灭菌花粉与新鲜松花粉之间存在一定的差异性，说明了UHT灭菌处理会对松花粉的代谢物造成一定的影响，使一些代谢物的相对含量发生变化。
表1.辐照灭菌松花粉与新鲜松花粉差异性代谢物二级质谱信息
表2.UHT灭菌松花粉与新鲜松花粉差异性代谢物二级质谱信息
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于代谢组学分析鉴别松花粉灭菌方式的方法，其特征在于，包括如下步骤；
1)制备松花粉提取液
将松花粉与乙醇涡旋混合，经超声提取后置入离心机中离心，将上清液经过孔径为0.22μm的滤膜过滤，即得松花粉提取液；
2)色谱检测
将步骤1)所得松花粉提取液进行UPLC-QE-MS上样分析检测，色谱柱为ACQUITY UPLCBEH C18柱(2.1×150mm，1.7μm)，柱温25℃，进样流速为0.3μL/min，进样体积为2μL，色谱检测参数为：
正谱条件：洗脱液A相为含0.1％(v:v)甲酸的10Mm醋酸铵水溶液，B相为0.1％(v:v)磷酸乙腈溶液，梯度洗脱流程为：0-3.5min 98％A，3.5-4min 98％-90％A，4-5min 90％-85％A，5-5.5min 85％-75％A，5.5-6.5min 75％-65％A，6.5-7.5min 65％-55％A，7.5-8.75min55％-35％，8.75-9.75min 35％-20％A，9.75-11.75min 20％-10％A，11.75-14min 10％-1％A，14-16.5min 1％A，16.5-17.5min 1％-90％A，17.5-20min 95％A；
负谱条件：洗脱液A相为10Mm醋酸铵水溶液，B相为乙醇，梯度洗脱流程为：0-1.5min95％A，1.5-3min 95％-80％A，3-4min 80％-65％A，4-5min 65％-25％A，5-6.5min 25％-10％A，6.5-10min 10％-1％A，10-12min 1％A，12-14min 1％-95％A，14-16min 95％A；
3)质谱检测
将步骤1)所得松花粉提取液进行质谱检测，质谱检测条件为：
一级质谱
正谱条件：分辨率，75000(FWHM)；鞘气，30Arb；辅助气，15Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.8kV；毛细管温度，300℃；辅助气温度，330℃。扫描范围，m/z：90-1225。扫描模式：FullMs；
负谱条件：分辨率，75000(FWHM)；鞘气，30Arb；辅助气，15Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.8kV；毛细管温度，300℃；辅助气温度，330℃，扫描范围，m/z：90-1225，扫描模式：FullMs；
二级质谱
正谱条件：分辨率，165000(FWHM)；鞘气，35Arb；辅助气，10Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.6kV；毛细管温度，310℃；辅助气温度，350℃；扫描范围，m/z：90-1225，HCD高能碰撞池碰撞能量NCE:40、50、70、90，扫描模式：Full MS-ddMS2；
负谱条件：分辨率，165000(FWHM)；鞘气，35Arb；辅助气，10Arb；反吹气，0Arb；喷雾电压，3.6kV；毛细管温度，310℃；辅助气温度，350℃；扫描范围，m/z：90-1225。HCD高能碰撞池碰撞能量NCE:40、50、70、90，扫描模式：Full MS-ddMS2；
4)Compound Discover数据处理
使用Compound Discover软件对步骤2)和步骤3)所得检测数据进行提取、分析、整理，通过峰对齐、去卷积、降噪、归一化处理，得到原始数据矩阵；
5)SIMCA软件数据处理
将步骤4)的原始数据矩阵导入SIMCA14.0进行分析，使用主成分分析PCA、偏最小二乘判别PLS-DA和正交-偏最小二乘判别OPLS-DA分析数据，运用置换排列实验检验，结合原始数据矩阵中的物质在两种松花粉中峰面积比值Ratio和P值，Ratio值大于2或小于0.5且P值小于0.01的代谢物即认定为松花粉标志性代谢产物；
6)松花粉标志性代谢产物的二级质谱检测
将步骤5)的松花粉标志性代谢产物进行二级质谱分析，得到二级质谱信息，二级质谱保留时间与一级质谱保留时间的允许偏差为0.2min，保留时间对应的物质即为不同灭菌方式松花粉的标志性代谢产物。
2.根据权利要求1所述的基于代谢组学分析鉴别松花粉灭菌方式的方法，其特征在于，步骤1)中松花粉与乙醇的用量比为1g:60mL，超声提取时间为30min。
3.根据权利要求1所述的基于代谢组学分析鉴别松花粉灭菌方式的方法，其特征在于，步骤1)中离心机的转速为7000rpm/min，离心温度为4℃，离心时间为10min。
4.根据权利要求1所述的基于代谢组学分析鉴别松花粉灭菌方式的方法，其特征在于，步骤4)Compound Discover数据处理过程中设置参数为：峰对齐时保留时间偏差为1.5min，质量偏差为4ppm，未知元素组成设定C90、H190、O15、P3、Br3、C14。
5.根据权利要求1所述的基于代谢组学分析鉴别松花粉灭菌方式的方法，其特征在于，步骤6)松花粉标志性代谢产物的二级质谱质谱检测条件为：采用Full MS-ddMS2的扫描模式进行碎片信息的采集，其中HCD高能碰撞池碰撞能量NCE为40、50、70、90。
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沈伟桥等: "松花粉辐射灭菌效应的研究", 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》 *

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