CN110592026B - 一种HBV cccDNA与宿主互作研究模型构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本公开属于生物工程技术领域,具体涉及一种HBV cccDNA与宿主互作研究模型构建及应用。本公开提供了一种高度模拟乙型肝炎病毒基因组cccDNA的微环DNA模型构建及其应用,通过构建pmini‑MC‑HBV‑Intron质粒,体外获得高纯度MC‑HBV微环质粒;通过优化嵌合内含子序列和RNA的二级结构,实现了嵌合内含子在RNA水平上的高效可变剪接,获得可体外高水平复制的MC‑HBV。该MC‑HBV可高度模拟HBV病毒与宿主细胞间的生理活动。本公开还建立了体外标记MC‑HBV模型和检测的技术,为揭示HBV cccDNA与宿主相互作用关系、功能调节机制和探寻HBV治疗新靶点的提供了极好的模型。
Description
技术领域
本公开属于生物工程技术领域,具体涉及一种构建可支持HBV高水平持续复制的HBV cccDNA微环模型(MC-HBV)的方法及利用多种标记方法探究cccDNA与肝细胞相互作用研究的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
乙型肝炎病毒简称乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV),是一种DNA病毒,属于嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae),其慢性感染与肝硬化及肝癌关系密切,是肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最为重要的诱发因素。HBV基因组为松散环状DNA(RC-DNA),在感染宿主胞核中形成共价闭合的环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA),并结合宿主细胞组蛋白、病毒核心蛋白等以微小染色体形式存在。cccDNA作为模板,形成为前基因组RNA(pgRNA);以pgRNA为模板,在HBV逆转录酶作用下,形成子代rcDNA,并在肝细胞质中装配形成完整的HBV,并释放出肝细胞,进入血液中;肝细胞质中的rcDNA也可再进入肝细胞核,再次形成cccDNA,继续同样的过程复制。这样,由于cccDNA的存在,使得病毒无法彻底清除,是慢乙肝无法治愈的真正原因。
cccDNA是HBV转录的唯一模板和体内病毒储存库,也是HBV持续存在的主要原因,目前重组干扰素及核苷类似物等抗病毒治疗手段难以清除cccDNA,对cccDNA与宿主相互作用规律的认识也知之甚少。建立高度模拟HBV cccDNA且支持HBV复制的良好模型,并解析cccDNA与宿主相互作用机制尤为迫切,而目前常用的HBV表达载体多大于1.0拷贝,且携带很多外源载体序列,转染肝细胞产生cccDNA拷贝数也较低,严重制约了cccDNA相关机制研究的开展。
目前HBV感染性克隆模型主要包括>1.0拷贝的表达质粒(如HBV1.2、HBV1.3表达质粒)和新近开发的cccDNA微环载体质粒(包括prcccDNA/pCMV-Cre系统、HBVcircle系统),prcccDNA/pCMV-Cre系统产生的重组rcccDNA(recombinant cccDNA)转录pgRNA经可变剪接后,可产生野生型的cccDNA,但rcccDNA获得需prcccDNA和pCMV-Cre质粒共转染肝细胞系,存在转染率低、产生cccDNA拷贝数少的缺点,限制其进一步应用。HBVcircle系统虽体外高度模拟cccDNA,但其基因组残余的attR序列无法去除,在子代病毒中一直存在,存在潜在的未知影响。另外,目前并没有建立HBV cccDNA直接标记与检测的方法,从而限制HBV cccDNA与肝细胞相互作用的探究。体外可大量获得高度模拟且直接标记检测的cccDNA质粒,体内可产生与亲代一致的子代病毒的HBV cccDNA模型,对HBV cccDNA与宿主互作研究及cccDNA特异性治疗靶点的开发具有重要的意义。
发明内容
针对上述研究背景,基于微环载体技术、cccDNA标记与检测技术、pull down联合质谱分析技术和生物信息学技术,本公开提供了一种HBV cccDNA微环模型(MC-HBV)及cccDNA与肝细胞相互作用研究的模型,该模型支持高水平的HBV复制,转染细胞得到的子代病毒具有完全的感染性,在宿主体内可形成cccDNA,高度模拟HBV cccDNA的生理活性。本公开还提供了该模型的生物素标记、荧光素标记、EdU标记及检测方法,标记效率接近100%。基于该cccDNA-宿主互作模型,本公开发明人发现了cohesin复合体和CTCF是cccDNA的结合蛋白,确认了cohesin/CTCF复合体抑制了HBV的转录和复制,同时也证明了本公开提供的cccDNA-宿主互作模型作为抗HBV研究模型具有良好的模拟效果。
基于上述技术效果,本公开提供以下技术方案:
本公开第一方面,提供一种HBV cccDNA模型的构建方法,所述构建方法包括以下步骤:
构建真核表达载体质粒pmini-MC-HBV-Intron,转化感受态细胞挑选阳性克隆转化至感受态细胞挑取单克隆培养扩增培养得到pCMV-Cre/prcccDNA质粒,将pCMV-Cre/prcccDNA质粒、引物加入肝癌细胞中进行转染得到pgDNA,通过补加序列消除pgRNA的茎环结构,转录补加序列后的pgRNA得到所述MC-HBV微环质粒,即所述HBV cccDNA模型。
优选的,所述表达载体质粒pmini-MC-HBV-Intron构建过程如下:通过PCR扩增HBV内含子(HBV-Intron)序列与载体骨架片段,通过Infusion cloning技术连接扩增片段得到真核表达质粒pmini-MC-HBV-Intron。
进一步优选的,所述HBV内含子序列如SEQ ID NO:1所示。
本公开第二方面,提供第一方面所述HBV cccDNA模型的构建方法得到的HBVcccDNA模型,即MC-HBV微环质粒。
本公开第三方面,提供第二方面所述HBV cccDNA模型在抗乙肝病毒药物研发中的应用。
优选的,所述应用包括抗HBV活性评价方面的应用。
优选的,所述应用包括构建HBV细胞或动物模型。
本公开第三方面,提供一种标记第二方面所述HBV cccDNA的方法,所述方法为采用生物素进行体外标记、荧光素体外标记或核酸类似物进行体外标记。
优选的,所述核酸类似物进行体外标记的步骤如下:
将载体质粒pmini-MC-HBV-Intron转化感受态细胞中加入胸腺嘧啶类似物(EdU)进行培养,提取EdU-MC-HBV质粒转染细胞获得EdU标记的MC-HBV微环质粒。
本公开第四方面,提供一种筛选HBV cccDNA结合宿主因子的方法,所述方法包括以下步骤:将第三方面所述方法标记后的MC-HBV与肝细胞核蛋白相互作用,采用未标记的MC-HBV作为对照,通过液相色谱-质谱(LC-MS)技术分析cccDNA互作蛋白,结合生物信息学手段确定HBV cccDNA结合的宿主因子,并通过pull-down、ChIP、MFP488-MC-HBV和EdU-HBVcccDNA模型确定与cccDNA相互作用的宿主蛋白。
本公开提供的HBV cccDNA模型可作为分析HBV cccDNA与肝细胞相互作用的Biotin-MC-HBV/pull down/MS/生物信息学分析模型。基于该模型,本公开发现cohesin/CTCF复合体能够结合cccDNA。进一步的,本公开利用多种HBV复制模型证实cohesin/CTCF复合体抑制HBV复制。
本公开第五方面,提供cohesin/CTCF复合体促进剂作为抗HBV药物的应用。
优选的,所述cohesin/CTCF复合体为SMC3或SMC1A。
与现有技术相比,本公开的有益效果是:
1.本公开提供了一种HBV cccDNA的构建方法,通过该方法构建的HBV cccDNA在体外能够实现高水平的HBV复制,转染HuH7细胞可高效表达HBsAg、HBeAg、HBc病毒蛋白,转录pgRNA,产生RC-DNA、cccDNA等形式病毒DNA,其转染获得的子代病毒也具有感染靶细胞的能力。MC-HBV可在肝细胞中形成cccDNA微染色体。高度模型HBV病毒的生理行为,是一种良好的研究模型。
2.本公开还提供了针对该MC-HBV进行体外标记和检测的技术,为该模型在研究中的应用提供了可靠地检测方法。
3.本公开还提供了一种cccDNA-宿主互作模型,通过Biotin-MC-HBV/pull-down/MS/生物信息学分析体系对于HBV cccDNA相关的结合蛋白进行筛选和研究。基于该模型,发明人发现了cohesin/CTCF复合体结合cccDNA并抑制HBV转录和复制。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解,本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开,并不构成对本公开的不当限定。
图1为实施例1中MC-HBV构建及工作原理示意图;
图2为实施例2中MC-HBV可变剪接和支持HBV复制能力分析结果图;
其中,图2A为MC-HBV内含子序列;
图2B为电泳分析验证重组诱导效率结果图;
图2C为MC-HBV、PP和pCMV-Cre/prcccDNA组转染细胞后上清中HBsAg和HBeAg的水平结果图;
图2D为PCR方法检测pgRNA和cccDNA中嵌合内含子可变剪接。
图3为实施例3中Intron-attR序列优化恢复pgRNA可变剪接能力结果图;
其中,图3A为补加序列后的内含子序列;
图3B为嵌合内含子RNA二级结构示意图;
图3C为电泳分析验证重组诱导效率结果图;
图3D为PCR分析优化嵌合内含子结构后cccDNA及pgRNA可变剪接结果图;
图4为实施例4中MC-HBV支持HBV高水平复制验证结果图;
其中,图4A为MC-HBV、PP和pCMV-Cre/prcccDNA组转染细胞后上清中HBsAg和HBeAg水平结果图;
图4B为间接免疫荧光(IFA)检测HBsAg照片;
图4C为Western blot检测转染细胞中HBc蛋白表达条带图;
图4D为southern blot分析MC-HBV肝细胞产生不同HBV cccDNA中间体结果图;
图4E为MC-HBV支持HBsAg/HBeAg和cccDNA持续产生的动态结果图;
图5为实施例5中MC-HBV拯救子代病毒具备完全感染性验证结果图;
其中,图5A为子代病毒感染细胞后HBsAg、HBeAg表达水平及荧光图像;
图5B为qPCR检测上清中HBV-DNA水平;
图5C为pgRNA及cccDNA表达水平;
图6为实施例6中MC-HBV体内可形成cccDNA微染色体验证结果图;
其中,图6A为ChIP-qPCR分析H3、AcH3、p300、CBP在MC-HBV的富集程度;
图6B为cccDNA结合H4的乙酰化水平;
图6C为IFN-α处理3d后ChIP分析H4Ac与cccDNA的结合;
图7为实施例7中Biotin-MC-HBV生物素标记模型与检测结果图;
图8为实施例8中MFP488-MC-HBV荧光素标记模型与检测结果图;
图9为实施例9中EdU-MC-HBV核酸类似物标记与检测结果图;
其中,图9A为电泳检测EdU-MC-HBV和MC-HBV条带图;
图9B为荧光显微镜验证EdU-MC-HBV标记结果;
图10为实施例10中Biotin-MC-HBV/pull-down/MS结合生物信息学技术揭示cccDNA宿主互作蛋白谱;
其中,图10A Biotin-MC-HBV/pull-down/MS体系的流程示意图为;
图10B为Biotin-MC-HBV的pull down效率检测图和western blot验证HDAC1,H3,H3K122ac的pull down条带图;
图10C为质谱鉴定到的453个蛋白利用生物信息学通路富集与可视化分析划分为DNA构象调节和RNA代谢调控的聚类图;
图10D为164个参与DNA构象调节的蛋白蛋白利用生物信息学通路富集与可视化分析聚类图;
图10E为164个参与DNA构象调节的蛋白蛋白利用生物信息学蛋白-蛋白相互作用网络分析的可视化图及cohesin复合体组成与鉴定到cohesin组分的结果图;
图11为实施例11中基于多种cccDNA-宿主互作模型明确cohesin组分SMC3和SMC31A结合cccDNA的结果图;
其中,图11A为pull down试验确认SMC3和SMC1A与cccDNA相互作用;
图11B为ChIP确认SMC3和SMC1A与cccDNA相互作用;
图11C为MFP488-MC-HBV模型确认SMC3和SMC1A与cccDNA共定位荧光图;
图11D为EdU-HBV感染模型确认SMC3在核内与cccDNA共定位荧光图;
图12为实施例12中基于多种HBV复制模型明确cohesin抑制HBV复制的结果图;
其中,图12A为SMC3调控cohesin组分稳定性的western blot结果图;
图12B为在Huh7/MC-HBV模型、HLCZ01/HBV感染模型中SMC3过表达抑制HBV复制的结果图;
图12C为在Huh7/MC-HBV模型、HLCZ01/HBV感染模型中干扰SMC3促进HBV复制的结果图;
图13为实施例13中CTCF结合cccDNA并介导cohesin抗HBV复制作用的结果图;
其中,图13A为ChIP和荧光共定位试验确认CTCF与cccDNA相互作用结果图;
图13B为ReChIP试验确定CTCF与SMC3共同结果在cccDNA的结果图;
图13C为ChIP试验确定干扰CTCF抑制SMC3在cccDNA富集的结果图;
图13D为干扰SMC3表达降低CTCF与SMC1A相互作用的结果图;
图13E为干扰CTCF表达抑制SMC3抗HBV复制的结果图。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的,cccDNA是HBV转录的唯一模板和体内病毒储存库,也是HBV持续存在的主要原因。建立高度模拟HBV的cccDNA对解析cccDNA与宿主的相互作用机制,研究相应治疗策略和药物具有重要意义。本公开提供了一种高度模拟、并且高纯度的cccDNA质粒,是一种良好的研究模型。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案,以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1MC-HBV真核表达质粒的构建
1.采用高保真DNA聚合酶扩增HBV-Intron和MN0501载体骨架片段;
1)HBV Intron-attR序列:
5’-cgtgttacag(S gene)-
2)高保真DNA聚合酶扩增体系:
PCR扩增条件:98℃预变性3min,然后98℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸30s并重复30个循环,最后72℃延伸8min。
2.DNA凝胶电泳,切胶回收定量;
3.Infusion cloning技术连接,构建真核表达质粒pmini-MC-HBV-Intron
50℃孵育15min;
4.转化DH5a感受态,在Kan+抗性LB培养板中选择培养;
5.挑取单克隆,菌液PCR筛选阳性克隆,测序验证;
6.转化ZYCY3S2T感受态细胞,挑取单克隆至200ulLB培养基中,37℃培养2h;
7.摇菌,亲本质粒扩增:取2ul新鲜菌液接种到200ml LB培养基中,32℃培养12h;
8.诱导attB/P重组,产生minicircle HBV cccDNA(MC-HBV):补加400ml LB、1/1000volum Arabinose、50mg/ml Kan+,用1M NaOH调节pH至7.0,32℃继续培养5h,中间每间隔1.5h调节一次pH值;
9.验证重组效率:取5ml菌液用质粒小提试剂盒抽提少量质粒,做诱导组和EcoRI单酶切组,两组分别与亲本质粒(亲本对照)进行电泳分析,初步验证重组效率及分析是否存在亲本质粒或RNA污染;
10.重组不完全则继续室温静置培养3-5h,调节pH值稳定在7.0;重组完全则直接进行质粒大量抽提。
实施例2MC-HBV可变剪接能力和支持HBV复制能力分析
HuH7细胞消化,制成浓度为2×105个细胞/ml的细胞悬液,按需要种至细胞培养板或培养皿中。过夜培养16h-24h后,将MC-HBV、PP和pCMV-Cre/prcccDNA质粒分别转染HuH7细胞48h,ELISA检测培养上清HBsAg和HBeAg,利用P1P2引物进行RT-PCR和PCR扩增检测pgRNA能否发生可变剪接,子代cccDNA能否产生。
1.ELISA检测上清中HBsAg
1)每孔加入20μl样品稀释液;
2)分别在相应孔中加入100μl阴、阳性对照血清或待测上清,37℃反应1h;
3)加入50ul HRP酶标记抗体,37℃继续反应30min;
4)PBST洗3-5遍;
5)分别加入50ul显色液A和显色液B,37℃反应30min;
6)加入50ul终止液于双波长450nm/630nm波长下读取OD值。
2.ELISA检测上清中HBeAg
1)分别在相应孔中加入50μl阴、阳性对照血清或待测上清;
2)加入50ul HRP酶标记抗体,37℃反应25min,室温静置5min;
3)PBST洗3-5遍;
4)分别加入50ul显色液A和显色液B,37℃反应30min;
5)加入50ul终止液,于双波长450nm/630nm波长下读取OD值。
3.RT-PCR检测pgRNA
1)细胞转染48h后,吸弃培养基,PBS溶液洗3次。以6孔板为例,每孔加入1mlTrizol,吹打混匀后移至1.5ml EP管中,室温裂解10min;
2)加入200μl氯仿,涡旋振荡混匀15s,室温静置5min;
3)4℃、12000rpm、15min离心,将上层水相转移到新的EP管中;
4)加入等体积异丙醇,颠倒混匀,4℃静置10min;
5)4℃、12000rpm、10min离心,白色沉淀即为RNA;
6)弃上清,75%乙醇(DEPC水配制,4℃预冷)洗一次;
7)吸弃残留液体后,开盖室温干燥15min左右,RNA沉淀完全透明;
8)根据沉淀量加入适量DEPC水溶解RNA,测浓度和纯度后进行逆转录;
9)在冰上将1μl DNase I、1μl 10×Reaction Buffer+MgCl2和1μg RNA溶液加到新的EP管中,RNase-free ddH2O补足至10μl,混匀;
10)37℃水浴30min,去除基因组DNA;
11)加入1μl 50mM EDTA,65℃水浴10min;
12)按照下列体系向上述EP管中再加入各组分,总体积20μl:
混匀后,42℃水浴反应60min,70℃加热5min终止反应;
利用P1P2引物进行PCR扩增检测pgRNA是否可变剪接
P1:GTATTTCCCTGCTGGTGGC
P2:GGTGAGTGATTGGAGGTTG
PCR扩增条件:95℃预变性5min,然后95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s并重复27个循环,最后72℃延伸10min。
13)琼脂糖凝胶电泳。
4.提取细胞DNA,采用14)步骤中PCR方法检测cccDNA水平
1)细胞吸弃培养基,PBS洗两次;
2)HBV基因组DNA定量试剂盒(QianGen)提取DNA;
3)PCR扩增;
4)琼脂糖凝胶电泳。
实施例3Intron-attR序列优化恢复pgRNA可变剪接能力
RNA二级结构对pre-mRNA可变剪接效率具有重要影响,实施例2中5'Intron-attR-3'Intron结构存在较多的茎环结构,二级结构由单棒状结构变为2个发卡结构,可能是抑制RNA可变剪接的主要原因。根据碱基互补配对原则,补加gtcgcgcccgggga序列,将其结构改变为同5'Intron-loxp-3'Intron和pCI-Neo载体内含子类似的单一棒状结构。后续验证步骤同实施例2。
实施例4MC-HBV支持HBV高水平复制
MC-HBV转染HuH7细胞72h,检测HBsAg、HBeAg、HBc水平。
1.ELISA检测上清中HBsAg和HBeAg;
2.Western blot检测转染细胞中HBc蛋白表达
1)BCA法测定蛋白浓度;
2)加入1/5终体积的5×SDS蛋白上样缓冲液,充分混匀后,将样品于100℃加热变性10min;
3)SDS-PAGE电泳:按25μg上样,浓缩胶内使用的电压为80V,分离胶内使用的电流为120V;
4)转膜:将PVDF膜提前用甲醇活化5min,400mA,4℃转膜1h。完成后将PVDF膜移至平皿内,加入封闭液室温封闭1h;
5)一抗孵育:一抗原液按1:5000稀释为工作液,4℃孵育过夜,适量TBST洗涤三次,每次15min;
6)二抗孵育:二抗原液按1:10000稀释为工作液,室温孵育1h,TBST洗涤三次,每次15min;
7)显色:用ECL A:B液按1:1配制,混合液覆盖PVDF膜,置于蛋白凝胶成像仪器下显像。
3.间接免疫荧光(IFA)检测HBsAg;
1)将无菌盖玻片放于12孔板中,加入单细胞悬液,培养24h;
2)MC-HBV转染HuH7细胞72h;
3)弃去培养基,PBS洗一遍后,用4%多聚甲醛室温固定30min;
4)弃去固定液,加入2mg/ml甘氨酸,室温孵育5min后,弃去甘氨酸溶液,PBS洗3遍;
5)在玻片上滴加100μl用PBS稀释的10%羊血清,然后用parafilm膜覆盖在盖玻片上面,培养板置于湿盒中,37℃封闭30min;
6)PBS洗3遍,在parafilm膜上滴加100μl用PBS稀释的一抗,滴加到盖玻片上,parafilm膜覆盖后置于湿盒中,37℃作用45min;
7)PBS洗3遍,将荧光二抗用PBS稀释,滴到玻片上,parafilm膜覆盖后置于湿盒中,37℃作用45min;
8)PBS洗5遍,用DAPI染色液避光染色10min;
9)PBS洗3遍,用抗荧光淬灭剂封片和荧光共聚焦显微镜分析。
4.MC-HBV转染HuH7细胞9d,ELISA检测上清中HBsAg,PCR方法检测cccDNA水平。
实施例5MC-HBV拯救子代病毒具备完全感染性
MC-HBV转染HuH7细胞72h后,收集上清,细胞上清再感染HuH7-NTCP细胞72h,检测HBsAg、HBeAg、pgRNA、HBV-DNA、cccDNA表达水平。
1.ELISA检测上清中HBsAg、HBeAg水平;
2.RT-PCR检测pgRNA可变剪接能力;
3.PCR检测cccDNA水平;
4.qPCR检测上清中HBV-DNA水平
1)吸取5μl样本稀释液加入到八联管中;
2)加入待测上清5μl,移液枪吸打3-5次混匀,静置10min
3)配制qPCR反应体系:按比例(PCR反应液38μl+酶混合液2μl+内标0.2μl)配制PCR混合液;
4)加样:在8联排中每孔加入22.5μl上述配制的溶液,再加入第1)步中样本上清2.5μl,反应体系为25μl;
5)qPCR扩增条件:50℃ 2min(活化UNG酶);94℃ 5min(活化Taq酶);94℃ 15s(变性),57℃ 30s(退火,延伸,收集荧光信号),45个循环;25℃ 10s冷却仪器。
实施例6MC-HBV体内可形成cccDNA微染色体
cccDNA在细胞核内结合宿主因子形成微染色体,其表观修饰状态与HBV复制密切相关,运用ChIP-qPCR方法分析H3、AcH3、p300、CBP在MC-HBV的富集程度,进一步利用HBx过表达和IFN-α刺激分析cccDNA结合H4的乙酰化水平,评估MC-HBV是否形成cccDNA微染色体。
1.MC-HBV转染HuH7细胞
1)72h后弃上清,PBS洗2次,加入10ml 1%甲醛,37℃交联10min;
2)PBS洗2次(PBS要冰上预冷,按1:300加入PMSF);
3)收集细胞;
4)向每管中加入200ul SDS Lysis buffer(含0.67ul PMSF)重悬细胞,冰浴10min;
5)超声破碎细胞(功率25W、超2秒、停10秒、超声20次),使基因组DNA随机断裂成为200~1000bp长度的片段;
6)13000rpm离心10min,弃去沉淀,收集上清;
7)取出20ul上清作为Input组,按照后面的步骤(18-22)进行解交联后纯化DNA,电泳检测超声效果后再进行实验组的实验。
8)确定超声效果后,剩余上清均分为5组,转入5ml EP管中,再用ChIPdilutionbuffer稀释10倍(按1:300加入PMSF);
9)预沉淀:向每管上清中加入60ul Protein A偶联的Agarose,4℃旋转30min;
10)3000rpm离心1min,弃珠子,上清转至新的5ml EP管中;
11)向两管上清中分别加入IgG和H3、H3Ac、H3K4me3和CBP抗体(2~4ug),分别是阴性对照组和实验组,4℃旋转过夜;
12)孵育过夜后,向每管中再加入60ul Protein-A偶联的Agarose,4℃旋转孵育4h;
13)3000rpm离心1min,弃上清;
14)依次用1ml低盐、高盐、LiCl溶液各洗一次珠子,每次加入溶液后,4℃旋转5min,3000rpm离心1min;
15)用1ml TE buffer洗珠子两次,室温颠转5min,3000rpm离心1min,吸弃TEbuffer,保留珠子;
16)用250ul洗脱buffer(1%SDS,0.1M NaHCO3)室温溶解15min,中间轻弹混匀。室温、1min、1000rpm离心,上清转至新的1.5ml EP管中;
17)重复上步骤一次,同样将上清转至上述EP管中(每组有500ul液体);
18)解交联:分别向两管中加入20ul 5M NaCl,65℃水浴解交联4h以上;
19)加入10ul 0.5M EDTA,20ul 1M Tris-HCl pH6.5和2ul 10mg/ml ProteineaseK,45℃水浴1h;
20)向每管中加入等体积苯酚:氯仿:异戊醇(体积比,25:24:1),上下颠倒混匀5min以上,室温、10min、13000rpm离心,上清转至新的离心管中;
21)分别加入2倍体积无水乙醇,-20℃沉淀30min,13000rpm离心30min,弃去上清;
22)500ul 70%乙醇清洗沉淀两次后,室温晾干10min,30ul超纯水溶解DNA。
获得的DNA溶液通过qPCR检测cccDNA的富集水平(以β-globin为内参进行标化)。
qPCR反应体系:
qPCR扩增条件:95℃ 5min;95℃ 30s,58℃ 30s,72℃ 30s,28个循环;72℃ 5min;4℃保存。
2.MC-HBV转染HuH7细胞12h后,1000IU IFN-α处理3d,ChIP分析H4Ac与cccDNA的结合;
3.MC-HBV与HBx表达质粒共转染HuH7细胞3d,ChIP分析H4Ac与cccDNA的结合。
实施例7Biotin-MC-HBV生物素标记模型与检测
MC-HBV利用Label IT nucleic acid labeling kit进行体外生物素标记,Biotin-MC-HBV可被高效标记和pull down;
1.用G50 microspin column纯化生物素化的MC-HBV(Biotin-MC-HBV)质粒;
2.Biotin-MC-HBV点到尼龙膜上,用HRP-Streptavidin和ECL法进行Dot blot检测;
3.Biotin-MC-HBV与streptavidin-beads孵育4h,未标记的MC-HBV作为对照,进行pull-down;
4.TE洗4次后,Dot blot检测pull down效率。
实施例8MFP488-MC-HBV荧光素标记模型与检测
1.MC-HBV利用Label IT nucleic acid labeling kit进行体外MFP-488荧光素标记;
2.MFP488-MC-HBV转染Huh7细胞后12h,4%多聚甲醛固定后,DAPI染核;
3.激光共聚焦扫描显微镜检测MFP488-MC-HBV;
实施例9EdU-MC-HBV核酸类似物标记与检测
1.优化EdU浓度,EdU浓度过高导致宿主菌生长抑制,过低导致EdU标记效果较差,根据培养12h不影响细菌增殖且质粒可被EdU有效标记,1-10uM EdU为最佳使用浓度范围;
2.pmini-HBV-intron转化ZYCY3S2T感受态细胞,挑取单克隆至200ulLB培养基中,培养12h后,加5uM EdU继续培养5h;
3.补加400ml LB、1/1000volum Arabinose、50mg/ml Kan+,用1M NaOH调节pH至7.0,32℃继续培养5h,中间每间隔1.5h调节一次pH值,诱导attB/P重组;
4.验证重组效率和EdU-MC-HBV质粒提取方法同实施例1,发现EdU标记并不影响重组产生MC-HBV和内切酶识别;
5.将EdU-MC-HBV和MC-HBV质粒转染Huh7细胞,转染后12h,多聚甲醛固定;
6.利用Appolo-488 EdU label kit点击化学检测EdU-MC-HBV,DAPI染核。荧光共聚焦显微镜观察发现MC-HBV和EdU-MC-HBV转染细胞胞浆中均出现被DAPI染色且呈蓝色的荧光斑点,但只有EdU-MC-HBV组被Appolo-488标记,显示为绿色的荧光点,同时与蓝色的荧光点存在很好的叠合性,说明EdU-MC-HBV成功被EdU标记,且标记效率接近100%。
实施例10Biotin-MC-HBV/pull-down/MS结合生物信息学技术揭示cccDNA宿主互作蛋白谱
Biotin-MC-HBV与HepG2细胞核蛋白相互作用,未标记的MC-HBV作为对照,pulldown后,利用液相色谱-质谱(LC-MS)技术鉴定到354个cccDNA互作蛋白,并利用生物信息学进行GO和KEGG等通路富集分析,结合可视化通路富集网络和蛋白-蛋白相互作用网路分析,发现cccDNA功能调节主要划分为DNA构象/功能调节和RNA代谢调控两个偶联过程,而164个DNA构象调控蛋白主要参与染色质构象、染色体构象、DNA与蛋白相互作用、基因转录沉默、染色体分离5个关键过程,并进一步将调控上述过程的关键蛋白进行蛋白互作网路分析,解析了cccDNA-宿主互作蛋白图谱,为阐明cccDNA转录调控和结构维持等重要科学问题提供了重要的研究手段与新的研究靶点。
1.利用细胞核浆蛋白分离试剂盒分离HepG2细胞核蛋白;
2.Biotin-MC-HBV与HepG2胞核蛋白4℃孵育4h,未标记的MC-HBV作为对照;
3.加入streptavidin-beads继续孵育2h后,PBST洗6遍;
4.蛋白样品加入1xSDS Loading煮沸5min后,western blot验证HDAC1,H3,H3K122ac被成功pull down,与报道一致,确认了此方法的可行性;
5.蛋白样品进一步进行蛋白酶解,利用液相色谱-质谱(LC-MS)技术检测cccDNA互作蛋白;
6.鉴定到的蛋白进行GO和KEGG通路富集分析,可视化通路富集网络和蛋白-蛋白相互作用网路分析。
实施例11基于多种cccDNA-宿主互作模型明确cohesin重要组分SMC3和SMC1A结合cccDNA
1.利用MC-HBV模型和pull-down试验,如实施例10,证实SMC3和SMC1A均可结合HBVcccDNA;
2.ChIP试验分析SMC3和SMC1A与cccDNA相互作用,MC-HBV转染Huh7细胞,转染72h后,进行ChIP试验,方法如实施例6,发现SMC3和SMC1A均在cccDNA上显著富集,说明SMC3和SMC1A可以结合HBV cccDNA;
3.利用MFP488-MC-HBV模型分析SMC3和SMC1A与cccDNA相互作用,MFP488-MC-HBV转染Huh7细胞,转染72h后,进行免疫荧光检测,方法如实施例4和实施例8,荧光共定位发现MFP488-MC-HBV与SMC3和SMC1A有很好的共定位现象,说明SMC3和SMC1A可以结合HBVcccDNA;
4.利用EdU-HBV模型,参照专利ZL 2017 1 0153469.2方法,EdU-HBV感染Huh7-NTCP细胞24h后,利用点击化学技术标记HBV cccDNA,利用免疫荧光技术染色SMC3,荧光共定位分析发现SMC3与HBV cccDNA存在明显共定位现象,说明SMC3可直接结合HBV cccDNA。
实施例12cohesin复合体抑制HBV转录与复制
SMC3是cohesin复合体的重要组分,有文章报道SMC3对cohesin复合体的稳定性有重要影响,干预SMC3表达后,western blot检测cohesin组分SMC1A、PSD5A、PSD5B、RAD21表达,发现SMC3干扰导致其他亚单位表达水平显著降低,而过表达SMC3明显促进其他亚单位蛋白水平,说明SMC3在维持cohesin复合体稳定性中的重要作用,后续主要干预SMC3表达,评估cohesin复合体对HBV的复制作用;
1.分析SMC3过表达对HBV复制的作用,在Huh7/MC-HBV模型中,共转染Flag-SMC3和MC-HBV,在HLCZ01模型中,转染Flag-SMC3表达质粒12h后,感染HBV,在上述模型中转染或感染72h后,检测上清中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA水平,检测细胞内pgRNA、cccDNA和HBcAg水平变化,检测方法如实施例4,结果发现SMC3过表达显著抑制HBV转录与复制;
2.分析内源性SMC3对HBV复制的作用,在Huh7/MC-HBV模型中,共转染siSMC3小干扰RNA和MC-HBV,在HLCZ01模型中,转染siSMC3小干扰RNA 12h后,感染HBV,在上述模型中转染或感染72h后,检测上清中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA水平,检测细胞内pgRNA、cccDNA和HBcAg水平变化,结果发现干扰SMC3表达显著促进HBV转录与复制;
实施例13CTCF结合cccDNA并介导cohesin抗HBV复制作用的结果图
CTCF被报道对cohesin复合体的染色质定位与富集具有至关重要的作用,而实施例10鉴定到的cccDNA互作蛋白中也包含CTCF。为此,进一步探究CTCF在cohesin调控HBV复制中的作用,有文章报道SMC3对cohesin复合体的稳定性有重要影响,干预SMC3表达后,western blot检测cohesin组分SMC1A、PSD5A、PSD5B、RAD21表达,发现SMC3干扰导致其他亚单位表达水平显著降低,而过表达SMC3明显促进其他亚单位蛋白水平,说明SMC3在维持cohesin复合体稳定性中的重要作用,后续主要干预SMC3表达,评估cohesin复合体对HBV的复制作用;
1.利用MC-HBV和MFP488-MC-HBV模型,通过ChIP试验和荧光过定位分析CTCF与cccDNA共定位,方法如实施例4、实施例6和实施例8,结果发现CTCF可结合HBV cccDNA;
2.ReChIP分析CTCF与cohesin复合体是否形成复合体共同结合cccDNA
1)Flag-CTCF和MC-HBV共转染Huh7细胞,转染72h后,利用Flag抗体进行第一轮ChIP试验,方法如实施例6;
2)第一轮ChIP产物用DDDK小肽进行洗脱,将Flag-CTCF/cccDNA复合物从Protien-A/G磁珠上进行解离;
3)第二轮ChIP用SMC3抗体进行免疫沉淀,方法如实施例6;
4)ChIP-qPCR分析发现SMC3在洗脱Flag-CTCF/cccDNA复合物中也存在显著的cccDNA富集,说明CTCT/cohesin形成复合体共同结合cccDNA上;
3.分析CTCF对cohesin复合体结合cccDNA的作用,在MC-HBV模型中,干扰CTCF,用SMC3抗体进行ChIP,方法如实施例6,结果发现干扰CTCF表达显著抑制SMC3在cccDNA上的富集;
4.分析CTCF与cohesin复合体相互作用,干扰SMC3表达,利用CTCF抗体进行免疫共沉淀,发现CTCF与SMC1A的相互作用能力显著减弱,进一步说明CTCF与cohesin复合体相互作用形成cohesin/CTCF复合体;
5.分析CTCF对cohesin复合体抗HBV复制的作用,在MC-HBV模型中,干扰CTCF表达后,转染MC-HBV和Flag-SMC3表达质粒,转染后72h检测上清中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA水平,检测细胞内pgRNA、cccDNA和HBcAg水平变化,检测方法如实施例4,结果发现CTCF干扰后,SMC3抑制HBV转录与复制的作用显著降低。
本公开HBV基因组微环DNA构建方法,高度模拟HBV cccDNA。通过实施例1、2、3对MC-HBV构建的改进,确定了嵌合内含子经可变剪接敲除外源序列的技术步骤和支持可变剪接的关键序列。通过实施例4、5、6对转染HuH7细胞系后的HBsAg、HBeAg、pgRNA、HBc、HBV-DNA、cccDNA检测分析,表明本公开得到的MC-HBV可支持高水平HBV复制,并在细胞核内形成cccDNA微染色体。通过实施例7、8、9进行MC-HBV模型的生物素、荧光素和EdU标记。通过实施例10,结合Biotin-MC-HBV/pull down/MS和通路富集、可视化富集网路、蛋白与蛋白互作网路分析等生物信息学技术,成功建立了探究cccDNA与宿主相互作用研究的新技术体系。通过实施例11和实施例12,结合Biotin-MC-HBV/pull down、MFP488-MC-HBV模型和ChIP技术,及MC-HBV和HBV感染模型,明确cohesin复合体结合cccDNA并抑制HBV转录与复制。通过实施例13,明确CTCF结合HBV cccDNA,并介导cohesin复合体抗HBV复制的作用。通过实施例10、11、12和13,基于本公开建立的模型发现cohesin/CTCF复合体结合cccDNA并调控HBV复制,也证实了本公开建立的HBV cccDNA与宿主相互作用模型的应用价值。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已,并不用于限制本公开,对于本领域的技术人员来说,本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种HBV cccDNA与宿主互作研究模型构建及应用
<130> 2010
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgtgttacag gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccccc aactggggta 60
actgggctcc ccgggcgcga ccacctattg gtcttactga catccacttt gcctttctct 120
ccacaggcgg ggtttt 136
Claims (7)
1.一种HBV cccDNA模型的构建方法,其特征在于,所述构建方法包括以下步骤:
构建真核表达载体质粒pmini-MC-HBV-Intron,pmini-MC-HBV-Intron如图1所示,转化感受态细胞挑选阳性克隆转化至感受态细胞挑取单克隆培养扩增培养,诱导attB/P重组获得MC-HBV微环质粒,通过补加序列消除pgRNA的茎环结构,转录补加序列后的MC-HBV微环质粒,加入肝癌细胞中进行转染得到pgDNA,即所述HBV cccDNA模型;所述表达载体质粒pmini-MC-HBV-Intron构建过程如下:通过PCR扩增HBV嵌合内含子序列与载体骨架片段,通过Infusion cloning技术连接扩增片段得到真核表达质粒pmini-MC-HBV-Intron;所述HBV嵌合内含子序列为cgtgttacaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagacCCCCAACTGGGGTAACTGGGCTCCCCGGGCGCGACgtcgcgcccggggacacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggcggggtttt。
2.权利要求1所述HBV cccDNA模型的构建方法得到的MC-HBV微环质粒。
3.权利要求1中所述的HBV cccDNA模型在抗乙肝病毒药物研发中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述应用包括抗HBV活性评价方面的应用;所述应用包括构建HBV动物模型。
5.一种标记权利要求2所述MC-HBV微环质粒的方法,其特征在于,所述方法为采用生物素进行体外标记、荧光素体外标记或核酸类似物进行体外标记。
6.如权利要求5所述标记MC-HBV微环质粒的方法,其特征在于,所述核酸类似物进行体外标记的步骤如下:
将载体质粒pmini-MC-HBV-Intron转化感受态细胞中加入胸腺嘧啶类似物进行培养,提取EdU-MC-HBV质粒转染细胞获得EdU标记的MC-HBV微环质粒。
7.一种筛选HBV cccDNA结合宿主因子的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:将权利要求6所述方法标记后的MC-HBV与肝细胞核蛋白相互作用,采用未标记的MC-HBV作为对照,通过液相色谱-质谱(LC-MS)技术分析cccDNA互作蛋白,结合生物信息学手段确定HBVcccDNA结合的宿主因子,并通过pull-down、ChIP、MFP488-MC-HBV和EdU-HBV cccDNA模型确定与cccDNA相互作用的宿主蛋白。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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