CN110585448A - 一种用于急性肾损伤的纳米诊疗剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于急性肾损伤的纳米诊疗剂及其制备方法与应用，所述纳米诊疗剂包括：黑色素，螯合在所述黑色素内部的金属离子，结合在所述黑色素表面的生物可降解聚合物。本发明以黑色素作为抗氧化治疗剂和金属离子螯合载体，以金属离子作为造影诊断剂，以生物可降解聚合物作为修饰剂，通过螯合和自组装反应，获得所述纳米诊疗剂。合成方法简单易行，温和可控，适宜工业化生产。所述纳米诊疗剂具有优异的血液循环效果和肾靶向性，可同时实现急性肾损伤的成像诊断和抗氧化治疗，在生物医学领域具有良好的应用前景。

Description

一种用于急性肾损伤的纳米诊疗剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医用纳米材料领域，尤其涉及一种用于急性肾损伤的纳米诊疗剂及其制备方法与应用。
背景技术
在住院病人中，特别是严重病患者，急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)是一种严重并发症，具有较高的发病率和死亡率。目前关于急性肾损伤的临床治疗主要依赖于支持性治疗。在急性肾损伤发生过程中，有毒的活性氧会反常地过量产生，与机体内的生物分子反应，引发氧化应激，导致肾损伤和功能紊乱。有效的活性氧清除可以改善肾脏微环境，抑制氧化应激，缓解急性肾损伤。因此，抗氧化纳米材料在急性肾损伤治疗方面具有良好的应用前景。
黑色素分子含有大量的抗氧化基团，可作为高效的抗氧化剂用于活性氧相关疾病的治疗。目前文献主要采用多巴胺聚合法制备黑色素纳米颗粒，粒径尺寸较大，使得纳米材料在血液循环过程中，极易被单核巨噬细胞系统所吞噬，在肝脏积聚增多，肾脏摄取减少。并且抗氧化治疗方式主要是通过原位给药，限制了其通过静脉注射用于其他活性氧相关疾病的治疗，例如急性肾损伤。虽然有文献报道制备出尺寸在10纳米以下的黑色素纳米颗粒，但是制备方法较为复杂。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于急性肾损伤的纳米诊疗剂及其制备方法与应用，旨在解决现有黑色素纳米诊疗剂制备方法复杂、肾靶向性较差、难以应用于诊断和治疗急性肾损伤的问题。
一种用于急性肾损伤的纳米诊疗剂，其中，包括：黑色素，螯合在所述黑色素内部的金属离子，结合在所述黑色素表面的生物可降解聚合物。
进一步地，所述金属离子包括Fe离子、Mn离子、Gd离子、放射性核素89Zr、64Cu中的一种或多种。
更进一步地，所述金属离子为Mn离子和放射性核素89Zr中的一种或两种。
进一步地，所述生物可降解聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、壳聚糖、聚丙交酯、聚乙交酯和聚己内酯中的一种或多种。
更进一步地，所述生物可降解聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇中的一种或两种。
进一步地，所述黑色素与所述金属离子的质量比为10:1-1:1，放射性核素的含量为50-500MBq/mg黑色素，所述黑色素和所述生物可降解聚合物的质量比为1:10-1:1。
进一步地，所述纳米诊疗剂为直径1-20nm的纳米颗粒。
一种本发明所述的纳米诊疗剂的制备方法，其中，包括步骤：将黑色素、金属离子和生物可降解聚合物在二甲亚砜中进行搅拌混合12-24小时，得到混合溶液；再将上述混合溶液加入到水中，分离洗涤，即得到所述纳米诊疗剂。
进一步地，所述二甲亚砜与水的体积比为1:10-1:5。
一种本发明所述的纳米诊疗剂在制备诊断和治疗急性肾损伤制剂中的应用。
有益效果：本发明所述纳米诊疗剂是黑色素、金属离子与生物可降解聚合物的复合物，其中所述金属离子被稳定地螯合在所述黑色素内部，所述生物可降解聚合物修饰在所述黑色素的表面。其中所述金属离子起着造影诊断功能，所述黑色素起着抗氧化治疗功能。所述纳米诊疗剂易于制备，具有优异的血液循环效果和肾靶向性，可同时实现急性肾损伤的成像诊断和抗氧化治疗，在生物医学领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中Mn离子螯合的聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇修饰的纳米诊疗剂(MMPP)的TEM图。
图2为本发明实施例2中MMPP在H2O2刺激下对HEK293细胞的抗氧化保护效果。
图3为本发明实施例3中MMPP与放射性核素89Zr的结合能力。
图4为本发明实施例4中89Zr-MMPP在急性肾损伤小鼠体内的正电子发射计算机断层扫描成像图。
图5为本发明实施例5中MMPP在急性肾损伤小鼠体内的核磁共振成像图。
图6为本发明实施例6中血尿素氮浓度评估MMPP对急性肾损伤模型的治疗效果。
图7为本发明实施例6中血肌酐浓度评估MMPP对急性肾损伤模型的治疗效果。
具体实施方式
本发明提供一种用于急性肾损伤的纳米诊疗剂及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种用于急性肾损伤的纳米诊疗剂，其中，包括：黑色素，螯合在所述黑色素内部的金属离子，结合在所述黑色素表面的生物可降解聚合物。
黑色素(melanin)是一种不溶于水的天然内源生物色素，广泛存在于动植物体内。黑色素可以是人工提取的黑色素，也可以是聚多巴胺及其衍生物，含有丰富的抗氧化基团，可清除活性氧自由基，对生物体进行抗氧化防护。黑色素具有很强的金属离子螯合能力，可结合具有造影诊断功能的金属离子，用于疾病的成像诊断。黑色素的纳米载体易于制造、稳定、生物可降解且无毒。
具有造影功能的金属离子包括Fe离子、Mn离子、Gd离子、放射性核素89Zr、64Cu等不限于此中的一种或多种。Fe离子、Mn离子和Gd离子具有较高的弛豫时间和良好的核磁共振成像(Magnatic resonance imaging,MRI)造影性能，可作为高效MRI造影剂用于疾病成像诊断。放射性核素89Zr和64Cu是用于正电子发射计算机断层扫描(Positron emissiontomography,PET)成像的正电子核素，在体内稳定性好，在PET成像中分辨率高，适合标记抗体和纳米载体。
生物可降解聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、壳聚糖、聚丙交酯、聚乙交酯和聚己内酯等不限于此中的一种或多种。生物可降解聚合物具有良好的生物相容性，可作为形貌调控剂和稳定剂修饰在黑色素的表面。
本发明所述纳米诊疗剂是黑色素、金属离子与生物可降解聚合物的复合物，其中所述金属离子被稳定地螯合在所述黑色素内部，所述生物可降解聚合物修饰在所述黑色素的表面。其中所述金属离子起着造影诊断功能，所述黑色素起着抗氧化治疗功能。所述纳米诊疗剂易于制备，具有优异的血液循环效果和肾靶向性，可同时实现急性肾损伤的成像诊断和抗氧化治疗，在生物医学领域具有良好的应用前景。
优选地，所述黑色素与所述金属离子的质量比为10:1-1:1，以提高金属离子的利用率，进而达到良好的成像效果。需说明的是，此处金属离子不包括放射性核素。
优选地，当所述金属离子为放射性核素89Zr或64Cu时，所述放射性核素的含量为50-500MBq/mg黑色素，以提高载体黑色素的利用率。
优选地，所述黑色素和所述生物可降解聚合物的质量比为1:10-1:1，以提高生物可降解聚合物的利用率，进而改善纳米诊疗剂的形貌和稳定性。
优选地，所述黑色素采用人工提取的黑色素。
优选地，所述金属离子采用Mn离子和放射性核素89Zr中的一种或两种。Mn离子是人体所必需的微量元素，能参与人体的正常新陈代谢，且可作为高效MRI造影剂；89Zr主要以+4价态存在于水溶液中，易与路易斯碱O原子形成八配位结构。89Zr的半衰期为78.4h，在体内稳定性好，在PET成像中分辨率高，利于观测纳米诊疗剂在动物体内的生物分布。
本发明将Mn离子和放射性核素89Zr与黑色素纳米粒子结合得到优选的纳米诊疗剂，所优选的纳米诊疗剂是一种联合正电子发射计算机断层扫描成像和核磁共振成像诊断的纳米诊疗剂，以黑色素作为载体材料，该载体材料稳定地螯合Mn离子和放射性核素89Zr在其内部。
优选地，所述生物可降解聚合物为聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇中的一种或两种。在黑色素纳米载体的合成过程中，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇可以作为稳定剂和形貌调控剂。本发明将聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇修饰在黑色素纳米颗粒的表面不仅能调控纳米粒子的粒径尺寸，而且能改善纳米粒子的血液循环效果和肾靶向性，利于纳米诊疗剂累积到肾脏部位，发挥成像诊断和抗氧化治疗作用。
优选的，所述纳米诊疗剂的粒径为直径1-20nm的纳米颗粒。该粒径范围内的纳米粒子具有良好的肾脏聚集和肾清除性。
需说明的是，本发明还可在所述纳米诊疗剂中进一步螯合其他金属离子和生物可降解聚合物，以获得性能更优的纳米诊疗剂。
作为举例，所述纳米诊疗剂还包括螯合在所述黑色素内部的放射性核素，所述放射性核素的含量为50-500MBq/mg黑色素。所优选的纳米诊疗剂具有优异的血液循环效果和肾靶向性，可同时实现急性肾损伤的成像诊断和抗氧化治疗。
本发明提供一种如本发明所述的纳米诊疗剂的制备方法，其中，包括步骤：将黑色素、金属离子和生物可降解聚合物在二甲亚砜中进行搅拌混合12-24小时，得到混合溶液；再将上述混合溶液加入到水中，分离洗涤，即得到所述纳米诊疗剂。
在实验测试中，发明人首次利用黑色素在二甲亚砜中的易溶性和在水中的不溶性，把黑色素、金属离子和生物可降解聚合物溶解在二甲亚砜中，再把混合溶液加入到水中，可快速获得纳米诊疗剂。
本发明所述纳米诊疗剂的制备方法利用黑色素对金属离子的强螯合能力以及在二甲亚砜和水中溶解度的不同，通过简单混合搅拌即可实现纳米诊疗剂的制备。
通过本发明所述制备方法制备的纳米诊疗剂可同时实现肾脏的核磁共振和正电子发射计算机断层扫描双模态成像以及急性肾损伤的抗氧化治疗，因此在急性肾损伤的诊断与治疗领域将具有良好的应用前景。同时，本发明的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。
本发明中，所述的搅拌混合时间为12-24小时，有利于提高黑色素与金属离子的螯合。
优选地，所述水为超纯水。超纯水中除了水分子外，几乎没有什么杂质，特别适合用作制备纳米诊疗剂的溶剂。
优选地，所述二甲亚砜与所述水的体积比为1:10-1:5，有利于纳米诊疗剂的快速形成。
优选地，所述分离洗涤是依次采用超滤管离心分离和用水洗涤5-8次。洗涤溶剂为超纯水。本发明通过超滤技术浓缩样品，从混合溶液中获取纳米诊疗剂。
需说明的是，本发明还可在已获得的所述纳米诊疗剂中进一步螯合其他金属离子和生物可降解聚合物，以获得性能更优的纳米诊疗剂。具体制备过程如下：
一种纳米诊疗剂的制备方法，其中，包括步骤：
将黑色素、Mn离子和聚乙烯吡咯烷酮在二甲亚砜中进行搅拌混合，再将上述混合溶液分散到水中，通过螯合和自组装反应，得到Mn离子螯合的聚乙烯吡咯烷酮修饰的纳米诊疗剂(记为MMP)；
将所述MMP与聚乙二醇(PEG)进行搅拌混合，得到Mn离子螯合的聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇修饰的纳米诊疗剂(记为MMPP)；
将放射性核素89Zr的草酸盐溶液与所述MMPP进行混合，得到89Zr和Mn离子螯合的聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇修饰的纳米诊疗剂(记为89Zr-MMPP)。
具体的，纳米诊疗剂(89Zr-MMPP)的制备方法包括步骤：
a)将黑色素(melanin)、Mn离子和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)在二甲亚砜中搅拌溶解混合，然后将上述溶液加入到水中，使用超滤离心管分离洗涤，获得Mn离子螯合的聚乙烯吡咯烷酮修饰的纳米诊疗剂(记为MMP)；
b)调节上述步骤a)制备的MMP的水分散液pH值为9.5，然后加入巯基聚乙二醇(HS-PEG)，搅拌12小时后，使用超滤离心管分离洗涤，获得Mn离子螯合的聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇修饰的纳米诊疗剂(记为MMPP)；
c)将上述步骤b)制备的MMPP加入到89Zr的草酸盐溶液中，在37℃震荡混合1小时后，使用脱盐柱收集89Zr和Mn离子螯合的聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇修饰的纳米诊疗剂(记为89Zr-MMPP)。
更具体地，纳米诊疗剂(89Zr-MMPP)的制备方法包括步骤：
a)50mg聚乙烯吡咯烷酮和18mg MnCl2·4H2O溶解在5mL二甲亚砜中，将上述溶液滴加到5mL 1mg/mL黑色素的二甲亚砜溶液中，搅拌混合12小时后，将混合溶液加入到100mL水中，使用分子截留量为30kDa的超滤离心管分离洗涤，获得Mn离子螯合的聚乙烯吡咯烷酮修饰的纳米诊疗剂(记为MMP)；
b)使用28wt％的氨水溶液调节上述步骤a)获得的MMP的水分散液(5mL；MMP浓度为2mg/mL)的pH为9.5，然后逐滴加入5mL 10mg/mL的巯基聚乙二醇，搅拌12小时后，使用分子截留量为30kDa的超滤离心管分离洗涤，获得Mn离子螯合的聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇修饰的纳米诊疗剂(记为MMPP)；
c)将74MBq(2mCi)的89Zr草酸盐溶解在500μL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中，然后滴加200μL 1mg/mL上述步骤b)获得的MMPP，使用2mol/L的Na2CO3溶液调节以上混合液的pH在7-8之间，在37℃震荡混合1小时后，获得89Zr和Mn离子螯合的聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇修饰的纳米诊疗剂(89Zr-MMPP)。
通过本发明所述制备方法制备的纳米诊疗剂可同时实现肾脏的核磁共振和正电子发射计算机断层扫描双模态成像以及急性肾损伤的抗氧化治疗，因此在急性肾损伤的诊断与治疗领域将具有良好的应用前景。同时，本发明的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。
本发明还提供一种如上所述的纳米诊疗剂在制备诊断和治疗急性肾损伤制剂中的应用。
本发明所述的纳米诊疗剂在急性肾损伤治疗中的应用，具体所述的急性肾损伤治疗为抗氧化保护疗法。
本发明具有如下优点：通过本发明所述制备方法制备的纳米诊疗剂可同时实现肾脏的核磁共振和正电子发射计算机断层扫描双模态成像以及急性肾损伤的抗氧化治疗，因此在急性肾损伤的诊断与治疗领域将具有良好的应用前景。同时，本发明的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行说明。
实施例1
合成MMPP
50mg聚乙烯吡咯烷酮和18mg MnCl2·4H2O溶解在5mL二甲亚砜中，将上述溶液滴加到5mL 1mg/mL的黑色素的二甲亚砜溶液中，搅拌混合12小时后，将混合溶液加入到100mL水中，使用分子截留量为30kDa的超滤离心管分离洗涤，获得MMP。然后使用28wt％的氨水溶液调节MMP的水分散液(5mL；MMP浓度为2mg/mL)的pH为9.5，逐滴加入5mL 10mg/mL的巯基聚乙二醇，搅拌12小时后，使用分子截留量为30kDa的超滤离心管分离洗涤，获得MMPP。
MMPP的TEM图如图1所示。从图1可知，所合成的MMPP为超小纳米粒子，粒径约为4.5nm。
实施例2
MMPP在双氧水(H2O2)刺激下对HEK293细胞的抗氧化保护评价
采用标准的MTT法，评价MMPP对HEK293细胞的抗氧化保护作用。HEK293细胞以每孔1×104密度接种到96孔板中，并置于37℃、5％CO2条件下培育24h。吸出96孔板中的旧培养基，分别加入含有不同浓度MMPP的DMEM培养基(黑色素的浓度分别为25，50，100μg/mL)。继续培养30分钟后，加入双氧水(H2O2)，使得双氧水在培养基中的浓度为250μmol/L。继续培养24小时后，吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔加入180μL DMEM培养基和20μL浓度为5mg/mL的MTT。继续培养4小时后，吸出96孔板中的旧培养基，加入200μL DMSO，然后在酶标仪上检测每孔的OD值(检测波长为450nm)，用如下公式计算细胞存活率。细胞存活率(cellviability)(％)＝(样品的OD450值/空白OD450值)×100％，实验结果见图2。
如图2所示，双氧水能够诱导细胞的氧化应激，导致HEK293细胞的凋亡。在双氧水浓度一定时，随着MMPP药物浓度的升高，HEK293细胞存活率(cell viability)会逐渐升高，这是由于黑色素能够清除活性氧，对HEK293细胞进行抗氧化保护。
实施例3
MMPP与放射性核素89Zr的结合能力评价
将74MBq(2mCi)的89Zr草酸盐溶解在500μL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中，然后滴加200μL 1mg/mL MMPP，使用2mol/L的Na2CO3溶液调节以上混合液的pH在7-8之间，在37℃震荡混合不同时间后，使用薄层层析法分析89Zr的标记效果。
如图3所示，在37℃孵育15分钟时，约87.9％的89Zr被标记在MMPP上，当孵育时间为1小时，约89.7％的89Zr被标记在MMPP上。可见，MMPP能够轻易地螯合89Zr。
实施例4
89Zr-MMPP在急性肾损伤小鼠肾脏的蓄积效果的正电子发射计算机断层扫描成像评价
雌性ICR小白鼠(6周，18-22g)，断水15小时后，在后腿肌内注射50％甘油(剂量8mL/kg)，建立小鼠急性肾损伤模型。在急性肾损伤模型建立2小时后，每只小鼠尾静脉注射约5.55MBq的89Zr-MMPP，接着在正电子发射计算机断层扫描(PET)设备上对注射后的小鼠进行成像观察。
如图4所示，89Zr-MMPP具有良好的血液循环和肾脏蓄积效果。尾静脉注射1和24小时后，89Zr-MMPP在肾脏的蓄积量分别约为13.5％ID/g和11.0％ID/g。
实施例5
MMPP在急性肾损伤小鼠肾脏的蓄积效果的核磁共振成像评价
在急性肾损伤模型建立2小时后，每只小鼠尾静脉注射200μL MMPP(Mn离子浓度为0.404mmol/L)，接着在布鲁克4.7T小动物MRI扫描仪上进行核磁共振成像观察。
如图5所示，尾静脉注射MMPP后，急性肾损伤小鼠的肾脏区域变亮，表明MMPP具有良好的肾脏蓄积效果，这和正电子发射计算机断层扫描成像结果相一致。
实施例6
纳米诊疗剂对急性肾损伤模型的治疗效果评价
为了评价纳米诊疗剂MMPP的生物相容性和对小鼠急性肾损伤模型的治疗效果，将健康小鼠随机分为两组：(1)注射磷酸盐缓冲溶液(健康对照组)；(2)注射含有500μg黑色素的MMPP(肾毒性评估组)，将急性肾损伤小鼠随机分为三组：(3)注射磷酸盐缓冲溶液(急性肾损伤模型对照组)；(4)注射含有200μg黑色素的MMPP(低剂量MMPP治疗组)；(5)注射含有500μg黑色素的MMPP(高剂量MMPP治疗组)。尾静脉注射治疗剂24小时后，小鼠被处死，收集血液样品。通过检测血清中尿素氮(blood urea nitrogen)和肌酐(creatinine)的含量来评价MMPP的治疗效果。
如图6和图7所示，相对于健康对照组，MMPP具有良好的生物相容性，几乎没有肾毒性。相对于急性肾损伤模型对照组，MMPP能够降低急性肾损伤小鼠的尿素氮和肌酐指标，表明MMPP能够缓解和治疗小鼠的急性肾损伤。并且随着MMPP剂量的增加，治疗效果能够得到改善。
本发明所述的黑色素纳米诊疗剂(89Zr-MMPP)可同时实现肾脏的核磁共振和正电子发射计算机断层扫描双模态成像以及急性肾损伤的抗氧化治疗。
本发明具有如下优点：通过本发明所述制备方法制备的纳米诊疗剂可同时实现肾脏的核磁共振(MR)和正电子发射计算机断层扫描(PET)双模态成像以及急性肾损伤的抗氧化治疗，在急性肾损伤的诊断与治疗领域将具有良好的应用前景。同时，本发明的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于急性肾损伤的纳米诊疗剂，其特征在于，包括：黑色素，螯合在所述黑色素内部的金属离子，结合在所述黑色素表面的生物可降解聚合物。
2.根据权利要求1所述的纳米诊疗剂，其特征在于，所述金属离子包括Fe离子、Mn离子、Gd离子、放射性核素89Zr、64Cu中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的纳米诊疗剂，其特征在于，所述金属离子为Mn离子和放射性核素89Zr中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述的纳米诊疗剂，其特征在于，所述生物可降解聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、壳聚糖、聚丙交酯、聚乙交酯和聚己内酯中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的纳米诊疗剂，其特征在于，所述生物可降解聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇中的一种或两种。
6.根据权利要求2所述的纳米诊疗剂，其特征在于，所述黑色素与所述金属离子的质量比为10:1-1:1，放射性核素的含量为50-500MBq/mg黑色素，所述黑色素和所述生物可降解聚合物的质量比为1:10-1:1。
7.根据权利要求1所述的纳米诊疗剂，其特征在于，所述纳米诊疗剂为直径1-20nm的纳米颗粒。
8.一种如权利要求1-7任一所述的纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：将黑色素、金属离子和生物可降解聚合物在二甲亚砜中进行搅拌混合12-24小时，得到混合溶液；再将上述混合溶液加入到水中，分离洗涤，即得到所述纳米诊疗剂。
9.根据权利要求8所述的纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于，所述二甲亚砜与水的体积比为1:10-1:5。
10.一种如权利要求1-7任一所述的纳米诊疗剂在制备诊断和治疗急性肾损伤制剂中的应用。
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