CN110585434B

CN110585434B - Prmt5抑制剂在抗病毒中的应用

Info

Publication number: CN110585434B
Application number: CN201910965037.0A
Authority: CN
Inventors: 韩丽辉; 马大鹏; 杨敏; 王秋实; 林月轲; 秦振志; 孙偲瑜
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2019-10-11
Filing date: 2019-10-11
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2039-10-11
Also published as: CN110585434A

Abstract

本发明提供PRMT5抑制剂在抗病毒中的应用。本发明通过分析巨噬细胞中PRMT5的表达水平，发现在HSV‑1病毒感染过程中，PRMT5的蛋白表达量随感染时间延长而降低。构建PRMT5的敲低和过表达模型，发现PRMT5能够显著抑制cGAS‑STING信号分子的激活。对PRMT5发挥作用的下游靶点进行筛选，免疫共沉淀实验发现PRMT5能特异性结合cGAS而不结合下游分子STING、TBK1和IRF3。给予抑制剂EPZ015666进行预处理检测发现能够显著增强cGAS‑STING激活和下游IFNβ的诱导，改善HSV‑1病毒感染对小鼠肺脏器官的损伤。本发明为抗DNA病毒的治疗提供了新的候选药物EPZ015666，拓展了传统抗病毒治疗的手段，为抗病毒药物的筛选和治疗提供了新方向。

Description

PRMT5抑制剂在抗病毒中的应用

技术领域

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及PRMT5抑制剂在抗病毒中的应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

病毒是一种携带遗传信息能够入侵宿主细胞、威胁人类的健康的一种主要的病原生物，病毒结构简单通常包括由DNA或RNA构成的核酸成分和包裹在外层的衣壳结构共同包装而成，目前已报道的一些常见DNA病毒有疱疹病毒、乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒、痘病毒等，当这些病毒侵染细胞后其DNA被释放到宿主胞浆中，这种成分可被宿主胞内特定的受体识别进而启动机体的抗病毒免疫反应。

cGAS是一种细胞内的DNA受体，其分子结构包含两个DNA结合结构域和一个核苷酸转移酶结构域。在缺乏DNA情况下处于抑制状态；而在DNA存在情况下，cGAS与DNA结合后导致酶活中心的构象发生变化，从而催化ATP和GTP合成第二信使2’3’-cGAMP，它能够与定位于内置网上的STING分子的“口袋”结构域结合，引起构象变化而激活STING。活化的STING再由内质网经高尔基体迁移至细胞和周围，在该过程中其C端结构募集并活化 TBK1，进而磷酸化下游分子IRF3并促进其二聚化入核，激活I型干扰素的转录，启动抗病毒天然免疫反应。

PRMT5属于II型精氨酸甲基转移酶，能够催化底物蛋白发生精氨酸的对称二甲基化修饰，作为一种表观遗传酶，它既能够修饰组蛋白参与机体转录后调控，又可修饰非组蛋白的精氨酸残基，进而影响多种蛋白和信号途径，发挥着十分重要的生物学功能。近来研究表明，PRMT5 作为一种“癌基因”在多种肿瘤中高表达，不仅如此这种表达水平与肿瘤的发生发展呈现出高度的正相关性。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明在前期筛选基础中，发现了癌症研究领域广为关注的蛋白 PRMT5能与宿主抗病毒关键分子cGAS互作，通过进一步研究，首次发现并证明给予PRMT5 抑制剂EPZ015666预处理能够增强细胞内IFNβ的诱导反应，增强宿主抵抗DNA病毒的能力，从而表明其具有作为一种抗病毒药物的潜能，拓展了传统抗病毒治疗的手段，为抗病毒药物的筛选和治疗提供了新方向。

本发明的第一个方面，提供PRMT5抑制剂在如下(a)-(d)至少一种中的应用：

(a)增强cGAS-STING信号通路的激活，或者制备增强cGAS-STING信号通路激活的产品；

(b)诱导抗病毒因子IFNβ表达，或者制备诱导抗病毒因子IFNβ表达的产品；

(c)增强抗病毒分子cGAS与DNA的结合，或者制备用于增强抗病毒分子cGAS与DNA结合的产品；

(d)抗病毒或抑制病毒，或者制备抗病毒或抑制病毒的产品。

本发明的第二个方面，活性成分包括PRMT5抑制剂，具有如下(a')-(d')中一种或多种功能的产品也在本发明的保护范围：

(a')增强cGAS-STING信号通路的激活；

(b')诱导抗病毒因子IFNβ表达；

(c')增强抗病毒分子cGAS与DNA的结合；

(d')抗病毒或抑制病毒。

其中，所述病毒为DNA病毒，所述DNA病毒包括但不限于疱疹病毒、乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒、痘病毒等，进一步优选为单纯疱疹病毒1型(HSV-1)。

进一步的，所述(d')功能具体表现为如下任意一种或多种：

1)保护宿主对HSV-1的病毒感染；

2)增强宿主对HSV-1病毒感染的抵抗作用；

3)降低因HSV-1感染引发的宿主肺部损伤。

其中，PRMT5抑制剂为抑制蛋白活性的物质，包括但不限于小分子化合物、干扰PRMT5 基因表达的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、适体等；

进一步的，所述PRMT5抑制剂为EPZ015666(GSK3235025，CAS#:1616391-65-1)，其是一种有效的，灵敏度高且副作用小的靶向PRMT5酶活性的选择性抑制剂。

在本发明中，以上所有所述产品均可为药物。

本发明的有益技术效果：

本发明利用质谱鉴定到PRMT5为cGAS的互作蛋白，并进一步通过共聚焦显微镜观察巨噬细胞中二者在HSV-1感染细胞中能够发生结合。构建PRMT5的敲低和过表达模型，发现 PRMT5能够显著抑制cGAS-STING信号分子的激活。对PRMT5发挥作用的下游靶点进行筛选，免疫共沉淀实验发现PRMT5能特异性结合cGAS而不结合下游分子STING、TBK1和IRF3。给予抑制剂EPZ015666进行预处理检测发现能够显著增强cGAS-STING激活和下游IFNβ的诱导，改善HSV-1病毒感染对小鼠肺脏器官的损伤。本发明为抗DNA病毒的治疗提供了新的候选药物EPZ015666，拓展了传统抗病毒治疗的手段，为抗病毒药物的筛选和治疗提供了新方向，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1.发现在HSV-1感染过程中PRMT5能够与cGAS发生互作。(A)质谱鉴定到PRMT5为cGAS 的结合蛋白。(B)免疫共沉淀检测在293T细胞中外源cGAS和PRMT5的相互作用情况。(C) 激光共聚焦显微镜检测HSV-1感染巨噬细胞中内源cGAS和PRMT5的结合情况。

图2.抑制PRMT5能够增强cGAS激活的下游I型干扰素表达。(A)抑制剂EPZ015666预处理细胞，qPCR检测ISD对IFNβ基因mRNA表达的影响，**p<0.01。(B)抑制剂EPZ015666 预处理巨噬细胞，qPCR检测HT-DNA对IFNβ基因mRNA表达的影响，*p<0.05。(C)抑制剂 EPZ015666预处理巨噬细胞，qPCR检测HSV-1感染对IFNβ基因mRNA表达的影响，*p<0.05。 (D)抑制剂EPZ015666预处理巨噬细胞，qPCR检测cGAMP对IFNβ基因mRNA表达的影响，n.s.指无显著性差异。(E)向巨噬预先转染对照组siRNA和prmt5基因的siRNA1和2，感染HSV-1 3h和6h,qPCR检测IFNβ和CXCL10基因mRNA表达的影响，*p<0.05，**p<0.01。 (F)向MEF细胞内预先转染对照组质粒和真核PRMT5表达质粒，western检测外源prmt5 在细胞内的表达情况。(G)向MEF细胞内预先转染对照组质粒和真核PRMT5表达质粒，感染HSV-1 3和6h,qPCR检测IFNβ和CXCL10基因mRNA表达的影响，*p<0.05，**p<0.01。图3.阻断或敲低PRMT5能够促进cGAS-STING信号途径的激活。(A)IFNβ荧光报告载体系统检测单独转染293T细胞cGAS+STING或cGAS+STING+浓度梯度量PRMT5质粒的信号强度。 (B)ISRE荧光报告载体系统检测单独转染293T细胞cGAS+STING或cGAS+STING+梯度量 PRMT5质粒的信号强度。(C)免疫共沉淀实验检测PRMT5与cGAS、SITNG、TBK1和IRF3 分别共转染于293T细胞后，分子的变化情况。(D)抑制剂EPZ015666预处理巨噬细胞，western blot检测HSV-1感染巨噬细胞3h、6h后cGAS-STING途径信号分子的激活情况。(E)预先分别向巨噬细胞中分别转染无意义siRNA和prmt5siRNA，western blot检测HSV-1感染巨噬细胞3h、6h后cGAS-STING途径信号分子的激活情况。(F)预先分别向巨噬细胞中分别转染无意义siRNA和prmt5 siRNA，western blot检测cGAMP转染巨噬细胞3h和6h后cGAS-STING 途径信号分子的激活情况。

图4.PRMT5结合在cGAS的N端催化对称二甲基化进而抑制cGAS与DNA的结合。(A)规划人源cGAS蛋白不同功能域缺失体。(B)将PRMT5分别与不同长度的cGAS结构域缺失体转染293T细胞，免疫共沉淀实验检测互作情况。(C)将cGAS单独或与PRMT5共同转染293T 细胞，免疫沉淀cGAS，用western blot检测其精氨酸甲基化的修饰情况。(D)抑制剂EPZ015666 预处理巨噬细胞,HSV-1感染3h和6h后免疫沉淀内源cGAS蛋白，western blot检测精氨酸对称二甲基化修饰。(E)抑制剂EPZ015666预处理细胞，裂解细胞液分别与生物素标记的ISD 共孵育，洗脱后用western blot检测结合ISD的cGAS的蛋白量。

图5.抑制剂EPZ015666能够保护HSV-1感染小鼠的肺脏组织损伤；小鼠静脉注射DMSO+PBS 或EPZ015666后感染HSV-1，HE染色肺脏器官。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的一个具体实施方式中，提供PRMT5抑制剂在如下(a)-(d)至少一种中的应用：

(d)抗病毒或抑制病毒，或者制备抗病毒或抑制病毒的产品。

本发明的又一具体实施方式中，所述病毒为DNA病毒，所述DNA病毒包括但不限于疱疹病毒、乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒、痘病毒等，进一步优选为单纯疱疹病毒1型(HSV-1)。

本发明的又一具体实施方式中，提供具有如下(a')-(d')功能中的至少一种的产品，所述产品活性成分包括PRMT5抑制剂：

(a')增强cGAS-STING信号通路的激活；

(b')诱导抗病毒因子IFNβ表达；

(c')增强抗病毒分子cGAS与DNA的结合；

(d')抗病毒或抑制病毒。

本发明的又一具体实施方式中，所述(d')功能具体表现为如下任意一种或多种：

1)保护宿主对HSV-1的病毒感染；

2)增强宿主对HSV-1病毒感染的抵抗作用；

3)降低因HSV-1感染引发的宿主肺部损伤。

本发明的又一具体实施方式中，所述宿主为可受到HSV-1感染的动物，包括但不限于哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴、人等。

本发明的又一具体实施方式中，PRMT5抑制剂为抑制PRMT5蛋白表达或降低PRMT5蛋白活性的物质；包括但不限于小分子化合物、干扰PRMT5基因表达的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、适体等。

本发明的又一具体实施方式中，所述PRMT5抑制剂为EPZ015666(GSK3235025，CAS#: 1616391-65-1)，其是一种有效的，灵敏度高且副作用小的靶向PRMT5酶活性的选择性抑制剂。

本发明的又一具体实施方式中，以上所有所述产品均可为药物。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物还包括药物可接受的载体，并且该药物可以为各种口服或非口服剂型。对此，本发明的药物可以与稀释剂或赋形剂如填充剂、增稠剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等组合配制。预期口服给药的固体制剂可以为片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊等形式。对于这些固体试剂，本发明的药物与至少一种赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶组合配制。除了单一的赋形剂，可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石等。

本发明的又一具体实施方式中，预期口服给药的液体制剂为混悬剂、内用溶液、乳剂、糖浆等。除了单一的稀释剂如水或液体石蜡，在液体制剂中可以包含各种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。此外，本发明的药物可以为肠胃外剂型，例如无菌水溶液、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干剂、栓剂等。可注射的丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及酯如油酸乙酯可以适于非水性溶剂和栓剂。栓剂的基质材料包括Witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可油脂、月桂精油脂以及甘油明胶。

本发明的又一具体实施方式中，根据目的，本发明的药物可口服施用或肠胃外施用。对于肠胃外施用，本发明的药物施用的途径可为：外用、腹膜内、直肠内、皮下、静脉内、肌肉内或胸内。施用的剂量可根据患者体重、年龄和性别、健康状况、饮食、施用时间、施用途径、排泄率和疾病严重性而变化。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例1质谱鉴定cGAS结合蛋白

1.1实验材料：DMEM培养基、胎牛血清、293T细胞、碧云天磷酸钙转染试剂盒、pCDNA3.1-Flag-cGAS重组质粒、考马斯亮蓝、质谱检测仪器、共聚焦显微镜、cGAS抗体、PRMT5抗体、Sigma M2 Flag珠子

1.2实验仪器：质谱仪

1.3实验步骤：

1.3.1细胞培养和质粒转染：

(1)细胞转染前一天，按照1X10⁶/ml细胞量，将293T细胞均匀铺5个10cm的培养皿。

(2)次日，超净台内吸取10μg pCDNA3.1-Flag-cGAS真核表达质粒与100μl CaCl₂溶液混匀后，滴加入100μl BBS溶液中。

(3)重复上述步骤制备制备5管混合液，并于室温静置15min。

(4)混匀5管液体均匀滴加到5盘293T细胞培养基中，轻轻摇匀放回37℃培养箱继续培养。 1.3.2裂解细胞与cGAS融合蛋白的免疫沉淀：

(1)质粒转染48h后，将5个10cm皿从培养箱内取出，弃掉皿中的培养基，用PBS冲洗1-2遍。

(2)向每个皿中加300-500μl IP Buffer并转移至1.5ml EP管中放置于冰上裂解15min，IP Buffer配制：IP Buffer：PI比例为300:1，现配现用。

(3)将管于4℃，12000rpmX15min离心。

(4)收上清向每管内加入2-3μl兔抗Flag标签抗体，于4℃反转摇床上摇4-6h。

(5)每管加入30ul M2 Flag珠子继续转移至4℃反转摇床摇过夜。

(6)次日取摇管于4℃，6000rpmX1min离心，弃上清后加入600μl IP裂解液，重复5次该步骤。

(7)轻轻的弃上清，用枪小心的吸干珠子周围的液体，向每管内加入30ul的1X蛋白loading，与95℃加热5min变形蛋白。

1.3.3 Western Blot跑胶：

(1)凝胶配制

分离胶的配制

堆积胶的配制

用ddH₂O洗净两片玻璃板立起来晾干，玻璃板干燥后安装胶架，将新配置好的10％分离胶液灌入胶板中，吸取1ml的无水乙醇往返滴加封板，室温凝胶约15-40min后弃去乙醇并用滤纸条侧边吸干。将新配好的堆积胶灌入胶板，小心插入梳子以避免气泡产生，等待室温凝固15min。

(2)配置1X电泳缓冲液：称取甘氨酸18.8g，Tris 3.02g，SDS 1g，加入1L ddH₂O搅拌混匀。

(3)上样：将胶板安装于电泳支架上，放于电泳槽中，倒入适量1X电泳缓冲液。轻轻拔掉梳子，向梳子孔加入适量体积的蛋白marker或蛋白上样液。

(4)电泳：恒压90V进行电泳，直至蛋白样进入分离胶。待marker开始出现分层后，调节电压至120V，直至蛋白上样液的条带跑至胶板边缘，即可停止电泳。

1.3.4考马斯亮蓝染胶与质谱检测

(1)小心拆下玻璃板将胶整个放入一个新的干净10cm皿中，盖上盖子。

(2)向10cm皿中倒入适量考马斯亮蓝快速染液，放置于水平摇床轻轻摇过夜。

(3)小心弃去考马斯染液，倒入ddH₂O进行脱色，经该步骤可见到在cGAS目标条带上方出现了被染色的蛋白。

(4)超净台内用手术刀片切下目标蛋白条带。

(5)在56℃下，用20mM DTT降解胶条30min，避光下用55mM碘乙酰胺中烷基化1小时。

(6)用胰蛋白酶和50mM碳酸氢铵原位消化胶条37℃过夜。

(7)次日，用5％甲酸、50％乙腈和0.1％甲酸/75％乙腈萃取消化多肽。

(8)吸取多肽样品进行上样检测。

(9)送检结果通过蛋白质识别和数据库进行搜索，发现目标蛋白为PRMT5。

实施例2免疫共沉淀实验检测PRMT5能够与cGAS发生相互作用

2.1.实验材料:

DMEM培养基、胎牛血清、293T细胞、碧云天磷酸钙转染试剂盒、pCDNA3.1-Flag-cGAS、 pCDNA3.1-HA-PRMT5、兔抗HA抗体、鼠抗Flag抗体、Protein A agarose

2.2.实验仪器：凝胶成像显影仪器

2.3实验步骤：

(1)转染前一天按照2X10⁶/ml的细胞量，将293T细胞铺1个6孔板。

(2)次日，利用磷酸钙转染试剂盒，按照每孔2ug质粒的量分别将pCDNA3.1-Flag-cGAS、 pCDNA3.1-HA-PRMT5质粒分别或一起转染至293T细胞内并放回37℃细胞培养箱继续孵育(步骤同1.3.1)。

(3)培养48h后取细胞进行裂解(步骤同1.3.2)

(4)取裂解样品X2(Flag-cGAS，HA-PRMT5，Flag-cGAS+HA-PRMT5)分别取出48ul，并补加12ul 5X蛋白loading于95℃，煮沸5min作为input样品。

(5)向EP管中分别加入兔抗HA抗体+Protein A agarose、鼠抗Flag抗体+ProteinA agarose，4℃反转摇床摇过夜。

(6)次日，取出EP管洗珠子(步骤同1.3.2)。

(7)后续跑胶用western blot检测蛋白(前4个步骤同1.3.3)。

(8)120v电压跑胶，至蛋白上样液的条带跑至胶板边缘停止电泳。

(9)配置1X转膜缓冲液，配方如下：5.82g Tris和2.93g甘氨酸溶于800mL ddH₂O，再加 200mL甲醇，混匀。

(10)转膜：根据胶大小裁剪PVDF膜：裁剪出与分离胶大小适宜的PVDF膜和滤纸，将PVDF 膜置于甲醇浸泡约1min活化膜，取出后在1X转膜液中浸泡，将滤纸、PVDF膜和凝胶由下到上按照滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸的顺序依次放好，用玻璃棒按照一个方向均匀涂抹驱赶气泡。将“三明治”结构放入半干转膜仪中，调节电压至14V转膜1h。

(11)封闭：转膜结束后，配制5％脱脂奶粉：称取2g脱脂奶粉加入40ml TBS-T溶解。镊子夹膜边缘放入封闭奶粉中室温封闭1h。

(12)一抗孵育：将抗体按照说明书配好。将已封闭好的PVDF膜置于抗体孵育盒中，加入预先配置好的抗体，4℃孵育摇过夜。

(13)洗膜液的配置：1L PBS-T中加入1mL吐温，混匀。

(14)洗膜：将PVDF膜从孵育盒中取出，放入洗膜液中，洗涤3-5min，共三次。

(15)二抗孵育：根据一抗种属来源选择合适二抗，按照1：5000配置二抗稀释液，将洗好的膜放入二抗稀释液中。室温，摇床室温慢孵育1h左右。

(16)洗膜：将PVDF膜取出，TBS-T洗涤3次，3-5min/次。

(17)显影：将ECL显影液组分A和B液混合，均匀滴加到膜上，放入凝胶成像系统进行检测。

实施例3共聚焦显微镜观察胞内PRMT5与cGAS的相互作用

3.1.实验材料:

DMEM培养基、胎牛血清、腹腔巨噬细胞、cGAS抗体、PRMT5抗体、固定液、荧光二抗、DAPI、肉汤。

3.2.实验仪器：共聚焦显微镜

3.3实验步骤：

3.3.1腹腔巨噬细胞的制备：

(1)取6-8周龄的C57野生型小鼠，腹腔注射约1ml肉汤，并放回笼内。

(2)3天后断颈法处死小鼠，放入配好的75％乙醇内浸泡消毒。

(3)将小鼠四肢固定转移至超净台内。

(4)左手用镊子轻轻挑起腹部下缘的皮肤，右手持剪刀剪开一道口，用钝头镊阔开腹部皮肤。

(5)注射器吸取6-8ml DMEM培养基右下腹部脂肪团处进针，注射入小鼠腹腔内。

(6)轻轻拔针并拨动腹部冲洗腹腔内的巨噬细胞，注射器抽取灌洗液并回收入一新的50ml管内。

(7)细胞计数，按照2.5X10⁶/ml铺板。

3.3.2细胞爬片：

(1)尖头镊子轻轻夹起略小于培养板孔径大小的圆形玻璃片，于酒精灯外焰微烤放于培养孔内。

(2)将分好的巨噬细胞铺在孔内，轻轻摇匀后放回培养箱继续培养。

(3)培养3-6h待巨噬细胞贴壁后，给细胞换液在放回培养箱继续孵育。

(4)取出培养板，向孔内加入HSV-1分别感染3h，6h。

(5)时间到取出细胞弃上清，PBS洗两遍。

(6)向孔内加入4％多聚甲醛室温固定15-30min。

(7)时间到弃固定液，每孔加入0.5％Triton X-100破膜约15min。

(8)弃上清，用PBS洗三遍，加入1％BSA进行封闭。

(9)时间到弃上清，按照抗体说明书配置cGAS和PRMT5一抗，并混合在一起加入孔内，放回4℃孵育过夜。

(10)次日，回收一抗用PBS洗3次，根据说明书利用DAPI配置荧光二抗，混合加入孔内室温孵育1h。

(11)弃上清，PBS洗三次，吸干片子上的液体，暗室内用封片液封片。

(12)用共聚焦显微镜观察并拍摄胞内cGAS和PRMT5蛋白的互作情况。

本发明在前期通过质谱的方法，鉴定到了精氨酸甲基转移酶PRMT5为cGAS的结合蛋白 (图1A)，经过进一步免疫共沉淀的实验进行验证，结果显示：PRMT5确实能够与cGAS发生结合(图1B)。为更加直观的检测二者的结合，随后在巨噬细胞中，经过爬片制备了HSV-1感染时间点的细胞样品，经共聚焦显微镜扫描结果显示，PRMT5和cGAS蛋白在HSV-1感染过程中在细胞胞浆区域存在相互作用(图1C)。

实施例4 QPCR检测PRMT5抑制剂EPZ015666对cGAS诱导下游IFNβ的影响

4.1.实验材料:

腹腔巨噬细胞、MEF细胞、Trizol、RNA反转试剂盒、SYBR GREEN，引物，ISD、HT-DNA、cGAMP。

4.2.实验仪器：荧光定量时实PCR检测仪

4.3实验步骤：

4.3.1 EPZ015666诱导处理细胞:

(1)制备腹腔巨噬细胞(步骤同3.31)。

(2)利用5uM EPZ015666的抑制剂预处理细胞半小时以上，分别向细胞内转染HT-DNA,ISD 或cGAMP，HSV-1感染细胞并放回培养箱继续培养6h以上。

4.3.2处理细胞RNA的提取：

按TRIzol(Invitrogen)试剂说明进行，步骤如下：

(1)取出细胞，接入PBS洗2-3次吸干液体，每孔加入500ul RNA抽提试剂Trizol1mL，吹打数次并将裂解液转移至新的1.5ml EP管内至于冰上孵育5min。

(2)每管加入100μL三氯甲烷，充分震荡。

(3)室温静置5min后于4℃12000rpm X 15min离心。

(4)结束可见分层，小心吸取上层透明液体转移至新的EP管内，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，此时可见絮状物出现，并于室温静置沉淀10min。

(5)4℃，12000rpm X 10min离心。

(6)弃上清，加1mL 75％乙醇(DEPC水配好的)充分漂洗。

(7)7500rpm 4℃离心10min。

(8)弃上清，室温干燥10min。

(9)加入20-30μL DEPC水，静置10min使沉淀充分溶解

(10)检测RNA浓度，直接进行反转录或置于-80℃保存备用。

4.3.3 RNA的反转录:

(1)于RNase free的Ep管中依次加入下表所列试剂：

(2)混匀后，简短离心，并置于42℃孵育3min，按下表继续加样

(3)将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应中，充分混匀。

(4)42℃孵育15min。

(5)95℃孵育3min之后置于冰上，得到cDNA用于后续实验或-80℃保存。

4.3.4qPCR检测mRNA的表达

IFNβ上游引物为：CAGCTCCAAGAAAGGACGAAC(SEQ ID NO.1)

IFNβ下游引物为：GGCAGTGTAACTCTTCTGCAT(SEQ ID NO.2)

GAPDH上游引物为：TGGATTTGGACGCATTGGTC(SEQ ID NO.3)

GAPDH下游引物为：TTTGCACTGGTACGTGTTGAT(SEQ ID NO.4)

以上述逆转录反应得到的cDNA为模板，每个待测基因设置三个复孔，冰上操作，反应体系配制如下：

按照两步法PCR设定反应步骤。

反应结束，根据熔解曲线和Ct值，按照2^-ΔΔCT计算得到目的基因在这一模板中的相对表达值后进行分析。

实施例5 QPCR检测PRMT5对cGAS诱导下游IFNβ的影响

(1)分离制备小鼠腹腔巨噬细胞(步骤同前)根据实验分组铺板。

(2)向巨噬细胞内转染对照siRNA和PRMT5 siRNA-1和siRNA-2；向MEF细胞内转染对照质粒和PRMT5的真核表达质粒，转染完成后放回培养箱内进行继续培养。

PRMT5 siRNA-1

上游引物为：CTCCAGTACTTGGAATACTTA(SEQ ID NO.5)

下游引物为：TAAGTATTCCAAGTACTGGAG(SEQ ID NO.6)

PRMT5 siRNA-2

上游引物为：GCGTTTCAAGAGGGAGTTCAT(SEQ ID NO.7)

下游引物为：ATGAACTCCCTCTTGAAACGC(SEQ ID NO.8)

(3)培养48h后给细胞换液放回培养箱内继续孵育1h，时间到取出加入HSV-1感染3h，6h 收细胞RNA样品(步骤同前)。

(4)收蛋白检测PRMT5蛋白的敲低情况。

本发明前期通过质谱鉴定到PRMT5为cGAS结合蛋白后，进一步使用PRMT5的酶活特异性抑制剂：EPZ015666对细胞预处理，马上通过实验对其功能研究，发现抑制PRMT5 的酶活性后，用ISD，HT-DNA或HSV-1感染激活来cGAS，qPCR检测下游IFNβ表达发现：阻断PRMT5酶活能够显著增强cGAS诱导IFNβ的活性(图2A-C)，而用cGAMP 诱导则未看到此表型(图2D)，说明EPZ015666发挥作用的靶点有可能是cGAS。进一步通过siRNA敲低PRMT5的蛋白量(图2F)，或通过细胞内过转PRMT5后检测IFNβ表达，发现PRMT5蛋白依赖其酶活性抑制cGAS对下游IFNβ和CXCL10基因的诱导表达(图2E，2G)。

实施例6荧光报告实验检测PRMT5对cGAS-STING通路的影响

6.1.实验材料:

293T细胞、荧光报告系统、cGAS，STING，PRMT5真核表达质粒

6.2.实验仪器：管式发光仪

6.3实验步骤：

(1)转染前一天，293T细胞浓度为1×10⁵个/孔接种于96孔培养板中，置于37℃，CO₂培养箱培养。

(2)次日，分别向细胞内转染100ng IFNβ-Luc、10ng TK质粒+cGAS+STING或 +cGAS+STING+梯度浓度PRMT5质粒；100ng ISRE-Luc、10ng TK质粒+cGAS+STING 或+cGAS+STING+梯度浓度PRMT5质粒。

(3)转染24h后，弃上清，每孔加入50-100ul细胞裂解液(promega试剂盒自带)。

(4)向裂解液中加入10ul 1X LAR底物于管式发光仪检测读值，记录数值。

(5)向该管内再加入10ul STOP buffer于管式发光仪读值并记录。

(6)计算LAR检测值/STOP检测，值即为样品的相对荧光值。

实施例7免疫共沉淀实验检测PRMT5与cGAS-STING途径分子的结合情况

(1)转染前一天，293T细胞浓度为2×10⁶个/孔接种于6孔培养板中，置于37℃，CO₂培养箱培养。

(2)次日，将1ug PRMT5真核表达质粒分别与1ug cGAS、STING、TBK1和IRF3质粒利用磷酸钙转试剂盒一起转染细胞(步骤同前)。

(3)48h后收细胞，利用免疫共沉淀和western blot实验检测二者互作(步骤同前)。

实施例8 Western blot检测PRMT5抑制剂EPZ015666对cGAS-STING通路信号分子的影响

(2)向巨噬细胞内加入5uM的EPZ015666预处理半小时以上用HSV-1感染细胞3h，6h收蛋白样品(步骤同前)。

(3)转染对照siRNA和PRMT5 siRNA，细胞放回继续培养48h后，HSV-1感染3h，6h或转染cGAMP 3h或6h后收蛋白样品(步骤同前)。

(4)Western blot检测对信号分子cGAS,STING，PRMT5，p-TBK1，p-IRF3的影响(跑胶步骤同前)。

本发明继前期观察到PRMT5功能表型的基础上，进一步通过荧光报告实验证实了PRMT5 能抑制cGAS-STING信号通路的激活(图3A，B)，为进一步验证PRMT5的靶分子，免疫共沉淀实验结果显示PRMT5能特异性结合cGAS而并非其下游分子(图3C)，进一步研究 PRMT5酶活性对cGAS-STING途径的影响，使用抑制剂EPZ015666预处理细胞后给予HSV-1 感染3h，6h，检测发现EPZ015666能特异性增强cGAS-STING信号分子的激活(图3D)，使用siRNA敲低内源PRMT5，检测发现HSV-1活化的cGAS-STING途径中的信号分子激活增强了(图3E)，而cGAMP直接活化的STING下游分子未受影响(图3F)暗示PRMT5抑制剂EPZ015666可特异性用于增强cGAS对其下游的活性。

实施例9 PRMT5抑制剂对cGAS的影响

9.1.实验材料

293T细胞、巨噬细胞、Flag-cGAS真核表达质粒，cGAS，PRMT5和精氨酸甲基化抗体、TOYOBO点突变试剂盒

9.2.实验仪器：

PCR仪、显影仪

9.3实验步骤：

9.3.1构建cGAS质粒缺失体：

(1)根据NCBI数据库cGAS蛋白结构域区段将cGAS蛋白分为三部分(DNA结合区域RD，酶活区域NTase，C端结构域CTD)

(2)根据区段设计引物如下：

cGAS(Δ1-160)

上游引物为：GGTGGCGGATCCGAGCTCGG(SEQ ID NO.9)

下游引物为：GGGGCCTCGAAGCTCCGG(SEQ ID NO.10)

cGAS(Δ160-330)

上游引物为：CCTGCTAGCACCCAAGAAGGCCTG(SEQ ID NO.11)

下游引物为：CGCCGCATCCCTCCGTACGAG(SEQ ID NO.12)

cGAS(Δ330-522)

上游引物为：GCTACTTTTTGATTCCAAAGCCAGG(SEQ ID NO.13)

下游引物为：TCTAGATACCCATACGATGTCCAG(SEQ ID NO.14)

(3)试剂盒反应体系如下：

(4)具体反应程序如下：

94℃预变性2min；70℃30s，68℃7.5min，延伸时间1min/kb。

(5)消化模板质粒：反应完成后，体系中直接加入2ul DpnI，混合均匀后37℃反应1h。

(6)PCR自身环化：准备试剂盒中Ligation high和T4 polynucleotide kinase，冰浴融解。溶剂后，轻轻搅拌摇匀。

(7)PCR反应体系如下：

(8)上述体系混合均匀，离心。PCR仪16℃反应1h，

(9)取部分反应液转化。

9.3.2质粒转化

(1)将连接完成的质粒全部加入感受态细胞中，混匀。

(2)冰上放置10min。

(3)42℃水浴热激90s。迅速放冰上静置2min。

(4)加入1ml无抗LB液，摇床37℃振荡培养1h。

(5)时间到了，吸取菌液均匀涂布于平板。

(6)37℃温箱培养过夜。

(7)次日挑单克隆测序。

9.3.3质粒提取

(1)测序正确的菌液放入300ml锥形瓶中，8000rpm离心10min，获取全部细菌沉淀。

(2)弃上清，用吸水纸吸干管壁残留的培养基。加入10mL冰上预冷的SolutionⅠ/RNase A重悬菌体，用涡旋器混匀。

(3)加10mL SolutionⅡ，上下颠倒轻柔混匀10-15次，得到清亮的裂解液，室温放置2min。

(4)加入5mL Buffer N3，轻柔混匀，颠倒几次直至出现白色絮状沉淀，室温孵育2-3min。孵育期间颠倒混匀几次。

(5)15000g，4℃离心10min。去掉细胞碎片和KDS沉淀。

(6)向HiBind Maxi column(柱子)中加入5mL Buffer GPS，室温静置3-10min，然后3000-5000 g，室温5min离心柱子。离心结束后弃掉管中液体。

(7)将第五步的上清倒入filter管中，静置5min。用一个新的50mL离心管收集细胞裂解液。

(8)加入0.1倍体积ETR溶液颠倒混匀7-10次。冰上孵育10-20min。孵育过程中颠倒混匀1-2 次。

(9)42℃水浴5min。裂解液再次变浑浊，之后3000-5000g，25℃离心5min，此时可见ETR溶液形成的蓝色层位于管底。

(10)小心吸取上层的液相，转移至一个新的50mL离心管中，加入0.5体积的无水乙醇，颠倒混匀5-6次，室温孵育2min。

(11)向HiBind Maxi column中加入20mL裂解液，3000-5000g离心3-5min。弃掉离心管中的液体。

(12)重复11步，直至所有的裂解液通过柱子。

(13)加入10mL HB Buffer，3000-5000g离心3-5min，弃掉离心管中液体。

(14)加入15mL DNA wash buffer，3000-5000g，离心3-5min(DNA wash buffer用之前放于室温)。

(15)加入10mL DNA wash buffer。同上离心。

(16)空管离心10-15min，小于6000g，离心3-5min。

(17)干燥column:65℃烤箱中烘烤10-15min。

(18)向column中加入1-3mL Endotoxin-Free Elution Buffer。室温孵育2min。小于6000g，离心5min。

(19)测浓度分装，-80℃保存。

9.3.4免疫共沉淀实验

将PRMT5与cGAS的功能与缺失体分别共转入293T细胞，48h后收细胞，免疫沉淀检测蛋白结合情况。(步骤同前)。

实施例10 DNA结合实验

10.1实验材料

293T细胞、cGAS表达质粒，cGAS，PRMT5和精氨酸甲基化抗体、生物素。

10.2实验仪器：显影仪

10.3实验步骤：

(1)5uM浓度PZ15666预处理或不处理转染cGAS质粒的293T细胞。

(2)将含有ISD或者生物素-ISD的裂解液与链霉亲和素共同孵育。

(3)用相同的缓冲液洗三次后，用热的SDS上样buffer将结合蛋白洗脱.

(4)Western blot检测cGAS与ISD的结合情况。

实施例11 cGAS精氨酸甲基化检测

11.1过表达cGAS精氨酸甲基化的检测：

(1)转染前一天按照2X10⁶/ml的密度铺细胞。

(2)利用磷酸钙转染试剂盒将1ug PRMT5，1ug cGAS质粒分别或共转入293T细胞内，放回继续培养。

(3)培养48h后，裂解细胞，免疫沉淀cGAS，western blot检测其精氨酸甲基化程度(步骤同前)。

11.2内源cGAS精氨酸甲基化的检测：

(1)制备巨噬细胞，转染前一天按照2.5X10⁶/ml的密度铺板子。

(2)5uM EPZ015666预处理细胞1h以上。

(3)用HSV-1感染细胞3h，6h。

(4)裂解细胞，向裂解液中分别加入IgG抗体+Protein A agarose，cGAS抗体+Protein A agarose。

(5)western blot检测内源cGAS精氨酸甲基化情况。

本发明前期发现PRMT5能够结合并抑制cGAS对下游激活，在此基础上通过构建cGAS 功能域缺失体(图4A)并检测与PRMT5的互作区域，结果显示PRMT5可结合到cGAS的 RD区域(图4B)，考虑到RD区域为cGAS结合和DNA的区域，进步使用EPZ015666检测 cGAS与DNA的结合强度，结果表明抑制内源PRMT5酶活性显著增强了cGAS结合DNA的能力(图4E)，为进一步验证这该作用是否是PRMT5对cGAS精氨酸甲基化修饰所引起，通过抗体检测外源过转(图4C)和内源cGAS的精氨酸甲基化(图4D)，结果表明PRMT5能够催化甲基化发生对称二甲基化，并且这种修饰作用是会随着HSV-1的感染时间延长而逐渐降低。

实施例12抑制剂EPZ015666对HSV-1感染小鼠的保护作用

(1)取6-8周龄的C57小鼠，按照HSV-1感染和给药分为两组：HSV-1不感染DMSO给药组、 HSV-1不感染EPZ015666给药组；HSV-1感染DMSO、HSV-1感染EPZ015666给药组。

(2)按照50mg/kg重量向小鼠的尾静脉分别注射DMSO和EPZ015666药物。

(3)给药1h后，将1X10⁶PFU HSV-1/只通过尾静脉注射入小鼠体内。

(4)HSV-1感染小鼠24h后，处死小鼠，取各组小鼠的肺脏组织，并进行HE染色。

(5)片子置于显微镜下观察并记录实验结果。

实施例13统计分析

统计分析应用非配对t检验和GraphPad Prism5.0统计软件。P<0.05水平认为具有统计学意义。

本发明为证明PRMT5在抗病毒模型中的作用效应，利用了过表达和敲低PRMT5的模型分别对cGAS及下游信号通路的激活进行了验证，后续实验证明PRMT5对cGAS的这种抑制作用依赖于它的精氨酸甲基转移酶活性，分子机制方面有实验证据表明PRMT5通过直接结合 cGAS的RD区并对其进行对称而甲基化修饰进而阻止了cGAS与DNA结合的强度，抑制其下游的激活。综上所述，细胞和动物实验都证实抑制剂EPZ015666能够增强宿主对病毒感染的抵抗作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> PRMT5抑制剂在抗病毒中的应用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cagctccaag aaaggacgaa c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggcagtgtaa ctcttctgca t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tggatttgga cgcattggtc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tttgcactgg tacgtgttga t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctccagtact tggaatactt a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

taagtattcc aagtactgga g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gcgtttcaag agggagttca t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

atgaactccc tcttgaaacg c 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ggtggcggat ccgagctcgg 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ggggcctcga agctccgg 18

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

cctgctagca cccaagaagg cctg 24

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cgccgcatcc ctccgtacga g 21

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gctacttttt gattccaaag ccagg 25

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

tctagatacc catacgatgt ccag 24

Claims

1.PRMT5抑制剂在制备抗病毒或抑制病毒的产品中的应用；

所述PRMT5抑制剂为EPZ015666；所述病毒为HSV-1。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述制备抗病毒或抑制病毒的产品中的应用具体表现为如下任意一种或多种：

1)保护宿主对HSV-1的病毒感染；

2)增强宿主对HSV-1病毒感染的抵抗作用；

3)降低因HSV-1感染引发的宿主肺部损伤。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述宿主为可受到HSV-1感染的动物。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述宿主为哺乳动物。

5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述宿主包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴和人。