CN110585199A - 甲苯达唑在制备治疗急性t淋巴白血病药物中的应用 - Google Patents

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王卫
徐缓
楼开炎
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及甲苯达唑在制备治疗急性T淋巴白血病药物中的应用。本发明首次发现甲苯达唑可以抑制急性T淋巴白血病细胞的增殖活性，使急性T淋巴白血病细胞的周期阻滞在G2/M期，抑制细胞有丝分裂，促进细胞的凋亡，该抑制效应不受细胞耐药性的影响。并且甲苯达唑能够抑制Notch1信号通路的表达，下调下游转录因子c‑Myc和Hes1。同时，甲苯达唑是一种已批准上市的广谱抗寄生虫药物，安全性高，开发成本低，能够为辅助治疗急性T淋巴白血病提供新的药物来源。

Description

甲苯达唑在制备治疗急性T淋巴白血病药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及甲苯达唑在制备治疗急性T淋巴白血病药物中的应用。
背景技术
甲苯达唑(Mebendazole，MBZ)属于苯并咪唑氨基甲酸酯类药物，1971年合成并投入临床，1974年被FDA批准上市，适用于驱除肠道寄生虫感染，阻碍寄生虫细胞微管系统的形成，使细胞周期停滞在G2/M期，影响细胞有丝分裂，具有广谱、高效、安全性高的特点。
急性T淋巴白血病(T-ALL)为高度侵袭性血液系统恶性疾病，占儿童急性淋巴白血病(ALL)的15％，成人ALL的25％。因为环境变化和生活习惯等综合原因，T-ALL发病率呈逐年升高趋势。T-ALL预后较差，易复发，复发后难以通过化疗再次达到完全缓解，且多种治疗药物都会产生耐药性，故临床上急需寻找新的治疗药物。目前认为Notch1是T-ALL发生中的重要的原癌基因，大约 50％的T-ALL患者都存在Notch1的突变，因此针对Notch1信号通路的分子靶向治疗药物受到越来越多的关注。
老药新用，是指已上市药物新适用症或新用途的开发，其药物动力学以及安全性数据资料详尽，缩短研发周期并节约研究经费。目前为止，尚未有甲苯达唑抑制急性T淋巴白血病细胞增殖活力及Notch1信号通路方面的报道。
发明内容
发明人长期从事甲苯达唑制剂及治疗作用的研究，在研究中发现了甲苯达唑在急性T淋巴白血病的治疗中效果显著。
因此，本发明的主要目的在于提供甲苯达唑对急性T淋巴白血病的治疗作用。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明第一方面公开了甲苯达唑在制备治疗急性T淋巴白血病药物中的应用，所述甲苯达唑的结构式如式1所示：
本发明第二个方面公开了甲苯达唑在制备抑制急性T淋巴白血病细胞增殖的药物中的应用。
本发明第三个方面公开了甲苯达唑在制备促进急性T淋巴白血病细胞凋亡的药物中的应用。
本发明第四个方面公开了甲苯达唑在制备抑制Notch1信号通路的药物中的应用。
优选的，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选的，所述药物为丸剂、胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂或口服液。
本发明第五个方面公开了甲苯达唑在建立治疗急性T淋巴白血病医学模型中的应用。
优选的，急性T淋巴白血病医学模型中的细胞株为人急性T淋巴白血病细胞CCRF-CEM和/或人急性T淋巴白血病细胞耐药株CEM/C1。
本发明通过实验发现，甲苯达唑对急性T淋巴白血病细胞CCRF-CEM和耐药株CEM/C1的增殖具有非常好的抑制作用，且甲苯达唑抑制急性T淋巴白血病细胞的增殖活性的效果随着甲苯达唑浓度的增加和用药时间的延长而更加显著。并且本发明首次发现甲苯达唑能够克服急性T淋巴白血病细胞CCRF-CEM 的耐药株CEM/C1(耐喜树碱和长春新碱)的耐药性。
本发明的一具体实施例中还发现所述药物甲苯达唑能够使细胞周期停滞在 G2/M期，促进细胞凋亡。甲苯达唑还能够抑制Notch1信号通路中的Notch1受体胞内区(NICD)，且下调下游转录因子Hes1、c-Myc的表达量，从而达到抑制急性T-淋巴白血病细胞的目的。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
本发明首次发现甲苯达唑可用于制备治疗急性T淋巴白血病的药物，是甲苯达唑的又一新的适应症，对于急性T淋巴白血病患者无疑将是一个巨大的福音。
附图说明
图1显示了甲苯达唑对T-ALL细胞CCRF-CEM、CEM/C1生长的抑制作用。
图2显示了甲苯达唑对T-ALL细胞CCRF-CEM、CEM/C1细胞存活率的抑制作用。
图3显示了甲苯达唑对T-ALL细胞CCRF-CEM的细胞周期阻滞作用。
图4显示了甲苯达唑对T-ALL细胞CEM/C1的细胞周期阻滞作用。
图5显示了甲苯达唑促进急性T-ALL细胞CCRF-CEM、CEM/C1的凋亡作用。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1甲苯达唑对T-ALL细胞生长的抑制作用
向培养中的T-ALL细胞CCRF-CEM、CEM/C1加入200和500nM浓度的 MBZ，培养24、48和72小时后使用全自动细胞计数仪进行细胞计数。实验中使用喜树碱(CPT，100nM)和长春新碱(VCR，10nM)作为阳性对照，并验证CEM/C1细胞的多重耐药性。结果如图1所示，CPT和VCR对T-ALL的生长抑制效果在耐药株CEM/C1中显著降低，而甲苯达唑能够抑制T-ALL生长，且不受CEM/C1细胞耐药性的影响。
实施例2甲苯达唑对T-ALL细胞细胞存活率的抑制作用
本实施例使用MTS细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒进行检测，具体步骤如下：
(1)分别将对数生长期的急性T淋巴白血病细胞CCRF-CEM、CEM/C1铺到12孔板中，每孔50000个细胞，所用培养基为10％(v/v)FBS的RPMI1640 培养基。
(2)用VCR、CPT和MBZ分别处理细胞，对照组不加药，最终稀释浓度分别为喜树碱100nM，长春新碱10nM，甲苯达唑200和500nM，24小时后转移到96孔板中，每孔100μl体积。
(3)用MTS细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测细胞活性，每孔加入20μl MTS，在培养箱中孵育2小时后用酶标仪490nm处检测各孔的OD值。
通过OD值计算细胞存活率，结果如图2所示，甲苯达唑能够T-ALL细胞 CCRF-CEM和其耐药株CEM/C1的细胞存活率，不受细胞耐药性的影响。
实施例3甲苯达唑对T-ALL细胞周期的阻滞作用
本实施例研究甲苯达唑对T-ALL细胞周期的阻滞作用，包括以下步骤：
(1)急性T淋巴白血病细胞CCRF-CEM、CEM/C1铺到6孔板中，每孔5×105个细胞，对照组不加药，加入的甲苯达唑浓度梯度依次为250nM、500nM、1000 nM。
(2)加药48h后，依次收集细胞至离心管中，1500rpm离心5min，吸取上清液，加入预冷的1×PBS缓冲液重悬，洗涤细胞2次，弃上清。
(3)加入4％的多聚甲醛固定液重悬细胞，使细胞的终浓度为1×106ml，固定15min。
(4)离心去掉多聚甲醛后用含0.1％TritonX-100的PBS溶液处理细胞2min 使细胞穿孔，2500rpm离心3min去上清，再用PBS洗一遍。
(5)用0.5ml的PBS重悬细胞后，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) 染液后，室温孵育10min，在1h内用流式细胞仪测定周期。
结果如图2所示，甲苯达唑阻滞T-ALL细胞CCRF-CEM周期，随着甲苯达唑浓度的增加：G2/M期增多，G0和S期减少。
如图3所示，甲苯达唑阻滞T-ALL细胞CEM/C1周期，随着甲苯达唑浓度的增加：G2/M期增多，G0和S期减少。
实施例4甲苯达唑促进T-ALL细胞的凋亡
本实施例研究甲苯达唑对T-ALL细胞的凋亡作用，包括以下步骤：
(1)急性T淋巴白血病细胞CCRF-CEM、CEM/C1铺到6孔板中,每孔5×105个细胞，对照组不加药，加入的甲苯达唑浓度梯度依次为250nM、500nM、1000 nM。
(2)加药24h后，依次收集细胞至离心管中，1500rpm离心5分钟，吸取上清液，加入预冷的1×PBS缓冲液重悬，洗涤细胞2次，弃上清。
(3)加入195μl的Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。再加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI，轻轻混匀。
(4)室温避光孵育20min，之后用流式细胞仪检测。染色试剂Annexin V-FITC为绿色荧光，PI(碘化丙啶)为红色荧光。
如图4所示，甲苯达唑给药24h后能促进T-ALL细胞的凋亡。
实施例5甲苯达唑抑制T-ALL细胞的Notch1信号通路
本实施例通过蛋白质免疫印迹(Western Blot)方法检测甲苯达唑对Notch1、 c-Myc、Hes1蛋白的抑制作用。
包括以下步骤：
(1)将急性T淋巴白血病细胞CCRF-CEM、CEM/C1铺于6孔板中，甲苯达唑的浓度梯度是0、250、500和1000nM。
(2)给药48小时后，收集悬浮细胞至15ml EP管中，2500rpm离心5min，弃掉上清液，
(3)加入200μl配好的细胞裂解液，立即反复吹打并转移至1.5ml离心管，充分裂解40min后应没有明显的细胞沉淀。
(4)待细胞充分裂解后，15000rpm离心10min，首先吸掉DNA透明胶状物，取上清至新的EP管中。
(5)使用BCA法测定提取的总蛋白浓度。
(6)蛋白质变性处理：将5×蛋白上样缓冲液与蛋白按4:1比例混合后，加热至100℃变性8分钟后置冰上冷却。
(7)针对需检测的不同蛋白(Notch1、c-Myc、Hes1、GAPDH)的分子量，配置相应浓度和梯度的SDS-PAGE电泳凝胶。
(8)将变性后的蛋白样品加入SDS-PAGE电泳凝胶中，使用80V电压电泳，待蛋白样品电泳至下层分离胶时暂停电泳后将电压调至120V，使目的蛋白电泳至分离胶2/3处停止电泳。
(9)将电泳完的玻璃板取出，按照海绵-两层滤纸-目的蛋白凝胶-PVDF膜- 两层滤纸-海绵的顺序合上转膜夹，使用300mA的电流转膜。Notch1转膜时间为2h，c-Myc、Hes1和GAPDH转膜1小时。
(10)将PVDF膜放入封闭液(5g脱脂奶粉+100ml TBST)中封闭2h，之后孵育相应的一抗和二抗。抗体浓度根据供应商要求及预实验结果进行稀释。一抗和二抗孵育之后用TBST清洗3次，每次10min。
根据膜的大小配置一定体积的超敏ECL化学发光试剂(A:B＝1:1)，避光孵育2min，置于显影仪器进行目的蛋白的显影。
最终蛋白质免疫印迹(Western Blot)结果如图5所示，甲苯达唑能抑制T-ALL 细胞CCRF-CEM、CEM/C1的Notch1、c-Myc、Hes1目的蛋白的表达。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.甲苯达唑在制备治疗急性T淋巴白血病药物中的应用，所述甲苯达唑的结构式如式1所示：
2.甲苯达唑在制备抑制急性T淋巴白血病细胞增殖的药物中的应用。
3.甲苯达唑在制备促进急性T淋巴白血病细胞凋亡的药物中的应用。
4.甲苯达唑在制备抑制Notch1信号通路的药物中的应用。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，所述药物为丸剂、胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂或口服液。
7.甲苯达唑在建立治疗急性T淋巴白血病医学模型中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，急性T淋巴白血病医学模型中的细胞株为人急性T淋巴白血病细胞CCRF-CEM和/或人急性T淋巴白血病细胞耐药株CEM/C1。
9.根据权利要求7所述的应用，所述甲苯达唑阻滞人急性T淋巴白血病细胞周期在G2/M阶段。
10.根据权利要求7所述的应用，所述甲苯达唑抑制人急性T淋巴白血病细胞的Notch1信号通路。
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