CN110579452A

CN110579452A - 测定生乳制品或低巴氏乳制品中酪蛋白和血清蛋白的方法

Info

Publication number: CN110579452A
Application number: CN201910492787.0A
Authority: CN
Inventors: 伊内丝·伯鲁兹-亚拉贡
Original assignee: Spectralys Innovation
Current assignee: Spectralys Innovation
Priority date: 2018-06-08
Filing date: 2019-06-06
Publication date: 2019-12-17
Also published as: FR3082310A1; FR3082310B1; US20190376942A1; EP3578958A1; JP2020020782A; EP3578958B1; CA3044756A1

Abstract

测定如生乳或低巴氏乳的液体食品中酪蛋白和血清蛋白含量的方法，由以下连续步骤组成：a)通过加入具有预定pH的缓冲液形成含血清蛋白和酪蛋白的该液体食品溶液，酪蛋白呈凝固形式悬浮在溶液中而血清蛋白溶于溶液；b)搅拌溶液以形成血清蛋白和酪蛋白的均匀混合物；c)获得混合物的多个正面荧光光谱，其通过至少一种确定波长的电磁辐射由均匀混合物的激发产生；d)加入预定量水稀释混合物以由过滤分离可溶性血清蛋白与悬浮于溶液的凝固酪蛋白；e)获得经稀释混合物的多个直角荧光光谱，其通过至少一种确定波长的电磁辐射由经稀释混合物的激发产生；f)通过多路径分析正面荧光光谱和直角荧光光谱，确定液体食品的酪蛋白和血清蛋白含量。

Description

测定生乳制品或低巴氏乳制品中酪蛋白和血清蛋白的方法

技术领域

本发明涉及评估食品的蛋白含量的方法。本发明具体涉及同时定量液体蛋白食品(诸如生乳或低巴氏灭菌乳(raw or low pasteurized milk))中所含的酪蛋白和血清蛋白的方法。

背景技术

本发明尤其但不仅仅能应用于乳制品工业和奶酪行业，特别是制造奶酪、酸奶、婴用奶粉(infant powders)、液态乳或者液体或粉末形式的乳制品成分。

在乳或奶酪的情况下，通常存在两种类型的蛋白：一方面为酪蛋白，其在凝乳酶作用下是不溶性可凝固胶团；而另一方面为血清蛋白，其是可溶的、含于乳清中。

特别地，本发明应用于生的产品(raw product)或低热处理的产品。这些产品含有(例如在热的作用下)未变性且可以沉淀的血清蛋白，以及包含这些产品的可凝固蛋白。

关于这种组合物，已知存在的蛋白和酪蛋白的含量对于确定包含它们的乳或奶酪的工艺质量，以及其产量、其质地，以及更普遍地，其制成品的质量是至关重要的。

在这种情况下，奶酪制造商和乳制品行业的制造商必须控制乳的酪蛋白波动的含量，因为这些将直接影响奶酪产量。例如，为了保证最佳质量，奶酪制作者应优选在每种产品中保持恒定的蛋白比例和恒定的奶酪重量。因此，有必要预测待处理产品的体积以获得酪蛋白的量，从而获得等价的或甚至相同的凝乳的量。

因此，为了保持恒定的凝乳体积并满足管控标准，制造商必须在回顾时纠正凝乳的重量。事先根据酪蛋白定量而实施的乳体积调整更加符合成本效益，这一认识确保了成品的一致性。

此外，血清蛋白的定量使得可以确定食品中这些蛋白与酪蛋白之间的比例，该比例被定义为血清蛋白含量除以酪蛋白含量。然而，该比例对于控制诸如酸奶或婴儿配方食品的产品的制造是重要的，因为它分别影响其坚固性和质地，或其消化性。此外，血清蛋白和酪蛋白之间的比例是婴儿配方食品标签的规定标准，并且必须准确地报告。如果奶酪用乳(cheese milk)经过热处理，由于变性蛋白与存在的酪蛋白一起沉淀，该比例也决定了奶酪产量。因此，知晓该比例使得可以靶向产品的巴氏灭菌温度，以控制将变性的血清蛋白的比例，并因此，以达到变性血清蛋白与酪蛋白的所需的比值。

迄今为止，用于定量酪蛋白和血清蛋白的已知和标准化方法，凯氏定氮法包括使用需要实验室操作的装置和溶剂。因此，对于从食品中收集样品而言，分析的结果是延迟的，并且无法及时采取这种处理过程。

另一种已知方法旨在通过红外和/或近红外光谱分析对总蛋白进行定量。实行经常改变的复杂校准，该方法能够定量乳中的酪蛋白。然而，该方法不能定量具有营养价值的变性的血清蛋白。通过红外和/或近红外光谱测量的蛋白的总含量减去酪蛋白的含量，获得血清蛋白和蛋白-蛋白胨部分的可溶性含量的总和，它们是非变性的，且与酪蛋白没有已知的相互作用。

特别地，已知使用荧光光谱法可以通过使用适当的缓冲液沉淀酪蛋白来测量样品(例如生乳样品)的血清蛋白。借助于光谱仪，然后可以测量蛋白浓缩的标记氨基酸的荧光，并且特别是样品内变性血清蛋白的组分色氨酸的荧光。

此外，已知旨在使蛋白透明后通过荧光测量样品中它们的总含量的方法。这些方法使得可以通过总蛋白比例减去可溶性蛋白比例来计算酪蛋白比例。

专利申请FR 2752941和FR 3019299公开了依赖于在透明介质中使用直角荧光测量来确定样品的蛋白和/或酪蛋白含量的方法的实例。这些方法之一由通过酸缓冲液沉淀乳样品组成。大约5分钟后，通过直角荧光测量可以推断蛋白的总含量，误差度约为3％。此外，另一种方法是通过影响离子强度的缓冲液使乳样品透明，以使酪蛋白的胶团不稳定并具有合适的pH。约3分钟后，进行直角荧光测量，以推断蛋白的总含量，误差度约为5％。在相同的乳样品的基础上，由此测量的总蛋白减去可溶性蛋白的含量值使得可以推断出酪蛋白的含量。

然而，凯氏定氮法是复杂的、污染的并且成本高，而后一种方法在工业环境中实施起来相对麻烦。特别地，根据现有技术的后一种方法具有三个主要缺点。首先，它很慢，因为需要大约8分钟来测量酪蛋白的比例。其次，通过累积添加误差，蛋白的总含量减去蛋白的可溶性含量具有大约8％的显著程度的不准确性。第三，由于需要两种样品制剂，这些方法相对不易使用。

发明内容

为了克服上述缺点中的至少一个，本发明的一个目的是提出一种同时定量酪蛋白和血清蛋白的方法，包括液体蛋白食品(诸如生乳或低巴氏灭菌乳)。

为此目的，本发明的目的涉及一种用于测定液体食品(诸如生乳或低巴氏灭菌乳)中酪蛋白含量和血清蛋白含量的方法，其特征在于，所述方法包括由以下各项组成的连续步骤：

a)通过加入具有预定pH的缓冲液形成所述液体食品的溶液，所述溶液包含所述血清蛋白和所述酪蛋白，所述酪蛋白以凝固形式悬浮在溶液中，并且血清蛋白溶解在溶液中；

b)搅拌溶液，以形成血清蛋白和酪蛋白的均匀混合物；

c)获得所述混合物的多个正面荧光光谱(frontal fluorescence spectra)，所述正面荧光光谱通过至少一种确定波长的电磁辐射由所述均匀混合物激发而产生；

d)通过加入预定量的水稀释混合物，以通过过滤分离可溶性血清蛋白与悬浮在溶液中的凝固的酪蛋白；

e)获得所述经稀释混合物的多个直角荧光光谱，所述直角荧光光谱通过至少一种具有确定波长的电磁辐射由所述经稀释混合物激发而产生；和

f)通过对正面荧光光谱和直角荧光光谱进行多路径分析来测定液体食品的酪蛋白含量和血清蛋白含量。

根据可以一起或单独使用的不同附加特征：

-至少一个电磁辐射的波长为270纳米至340纳米，并且优选地等于280纳米；

-所述缓冲液是乙酸钠缓冲液和/或pH值为4.50至4.65，优选等于4.55或4.6的缓冲液；

-通过测量混合物和/或经稀释混合物中存在的色氨酸的荧光漫射，而在步骤c)期间获得至少一个正面荧光光谱和/或在步骤e)期间获得至少一个直角荧光光谱；

-步骤a)期间加入的液体食品和缓冲液的体积使得液体食品体积与缓冲液体积之比在1至5之间，优选等于3；

-搅拌步骤b)通过涡旋实现；和

-所述多路径分析是应用选自多元线性回归方法或偏最小二乘回归方法的回归方法的PARAFAC分析。

附图说明

本发明的其他特征和优点将从下面给出的描述中显现，并参考附图，附图示出了实施方案的实例，没有限制性质。

在图中：

-图1是说明当实施根据本发明的方法的步骤时由多元线性回归模型(在纵坐标上)预测的几个乳样品的酪蛋白含量的百分比值的图，其根据酪蛋白值的参考内容(横坐标)表示；和

-图2是示出当实施根据本发明的方法的步骤时由多元线性回归模型(在纵坐标上)预测的几种其他乳样品的酪蛋白含量的百分比值的图，其根据酪蛋白值的参考内容(横坐标)表示。

当然，为了满足特定需要，本领域技术人员可以对以下描述进行修改。尽管涉及不同的实施方案，但是本发明不限于这些特定实施方案，并且对于本领域技术人员来说，可以认为对本发明的应用范围特定的所有修改都是显而易见的。

具体实施方式

根据本发明的方法的第一步由取样一定体积的液体食品，向其中加入经浓缩缓冲液组成。

在根据本发明的示例性实施方案中，如下制备和处理生乳的测量样品。将体积为7.5毫升的乳与体积为2.5毫升的pH为4.55的缓冲液混合。在非限制性方式中，与缓冲液混合的牛奶的体积范围为1毫升至10毫升，但也可以选择使得乳体积和缓冲液体积的混合物的pH与初始缓冲液保持尽可能接近，在本例中为4.55。

优选地，缓冲液是乙酸钠的缓冲液。根据本发明的其他实施方案，缓冲液是磷酸钠或磷酸钾缓冲液。根据本发明的其他实施方案，缓冲液的pH在4.5和4.65之间。

优选地，选择乳的体积和缓冲液的体积，以便不过度稀释样品。特别地，优选混合物中缓冲液体积和乳体积的比例在十分之二和十分之三之间。

在该缓冲液的作用下，酪蛋白凝固以形成食品可凝固蛋白的致密沉淀物，该沉淀物悬浮溶液中，该溶液包含初始乳的可溶性血清蛋白。

然后例如通过涡旋搅拌该组分(assembly)以获得混合物，在该混合物中沉淀物和溶液是均匀的。涡旋搅拌相对于通过离心搅拌是有利的，例如，因为它防止混合物的组分粘附到混合物所在的容器的侧面，在这种情况下，更它们中的一些难以回收。然后将该混合物倒入有足够容量容纳的桶中。

在酪蛋白凝固后，乳中含有的酪蛋白倾向于在光的作用下扩散(diffuse)，而血清蛋白是透明的和非扩散的。因此，可以确定酪蛋白是99％的发射光的原因；而血清蛋白实际上完全不干扰它，因为它们是透明的和非扩散的。

为此目的，获得了由混合物发射的一个或更多个正面荧光光谱，例如，通过用单色光源照射样品，所述单色光的波长在270和300纳米之间，并且优选地等于280纳米。荧光辐射可以通过光谱仪(例如，包括CCD照相机的光谱仪)记录。有利地，正面荧光的测量使得可以确定混合物的完整印记(print)。

在根据本发明的方法的步骤期间获得的电磁波谱的波长优选地在270纳米和300纳米之间。

在本发明中，色氨酸用作分析食品中血清蛋白的可溶性含量的标记。优选地，上清液中存在的色氨酸通过荧光定量。因此，色氨酸的荧光使得可以测定低变性可溶性蛋白中的浓度，因此与蛋白的含量强相关。

有利地，280纳米的波长对于由存在的酪蛋白发射的色氨酸的定量是最佳的。色氨酸的定量也可以通过其在紫外线中的吸收来进行。

根据其他实施方案，考虑到收集附加信息，还可以通过至少一种大于300纳米的波长(例如，360纳米)来考虑荧光测量。

根据本发明的实施方案，可以进行一个或更多个测量。在这种情况下，再次搅拌混合物以保证沉淀物和溶液的均匀性。

在应用根据本发明的方法结束时，正面荧光测量使得可以在约一分钟内快速估计食品中酪蛋白的含量并且误差小于3％。

根据本发明的方法的随后步骤由通过用预定量的水稀释混合物样品来使其透明组成。有利地，这种水的添加使得可以将血清蛋白与沉淀的酪蛋白分离。此外，根据相应的步骤使具有预定量的水的混合物样品透明也使得可以对其进行过滤。因此，例如，在含有样品和混合物的桶(tub)中，避免了残留在装置中的蛋白或酪蛋白的损失。

根据本发明的方法的随后步骤由获得稀释混合物的多个直角荧光光谱(也称为常规荧光)组成。直角荧光光谱是由通过至少一种选定波长的电磁辐射经稀释混合物激发产生的。

根据本发明的另一个实施方案，对于280纳米的第一激发波长，对于340纳米的第二激发波长，测量正面荧光。有利地，使用几种激发波长使得可以恢复相应的多个发射光谱，这使得可以提供关于酪蛋白的含量、蛋白乳清含量，或者甚至食品的其他组分的额外信息。此外，对330至350纳米之间的发射波长进行测量有利地使得可以获得最大灵敏度的信号。

需要注意的是，散射(当基质粒子的尺寸接近激发波长时称为瑞利散射，或者当它明显大于波长时称为米氏散射)对应于所考虑的波长的光和基质之间的弹性相互作用(没有能量损失)。该相互作用考虑了基质的结构，且特别是具有接近波长的尺寸的颗粒的尺寸和浓度。

根据本发明方法的一个实施方案，提供了散射过滤步骤，这有利地避免了污染直角荧光测量。

图1表示本发明具有几个乳样品的第一个应用。

在制备一定体积的每种样品以获得悬浮在含可溶性蛋白的溶液中的酪蛋白沉淀物的均匀混合物之后，通过两个激发波长(一个等于280纳米并且另一个等于340纳米)测量该混合物的正面荧光。

然后，为每个样品收集的光谱数据被组织成大尺寸矩阵，称为“激发-发射矩阵”(EEM)，其一维表示激发波长，另一维表示发射波长。然后通过数学分析方法分析由此获得的EEM，这使得可以提取对应于荧光的双线性分布及其相对强度的信息。然后，应用多元线性回归方法来预测每种食品样品中酪蛋白含量的值。

考虑到实施本发明，可以预先进行校准阶段。在通过根据本发明的方法测定给定样品的酪蛋白的含量之前，可以通过数学分析来实施该校准。作为第一实例，当使用单种波长时，实施主成分分析(PCA)或偏最小二乘分析(PLS)。作为第二实例，如果使用多于一种波长，则实施PARAFAC类型分析或任何其他多路径分解方法。

参考图1，每个样品包含逐渐增加的酪蛋白含量。在第一种应用中，将不同体积的高浓度酪蛋白粉末添加到乳样品中，同时保持蛋白的可溶性含量恒定。

在图1中，通过多元线性回归或偏最小二乘回归(PLS)的简单模型适用于激发-发射矩阵的分解以测定酪蛋白的含量。如果样品被多个光辐射或连续光源照射，则PARAFAC型模型适用。为了构建校准，由此获得的预测值作为酪蛋白的参考值(以每100克样品的酪蛋白克数表示)的函数显示在Y轴上。得到的结果表明所示校准，校准显示校准的平方根等于0.283％；而已获得交叉验证的平方根等于0.320％，这相当于10％的相对误差。

这些结果说明了应用于各种乳样品的根据本发明的方法获得的酪蛋白含量与参考含量值之间存在极好的相关性。

还测试了本发明对几种乳样品的第二种应用，这些样品中的每一种都包含逐渐增加的可溶性蛋白的含量。在第二种应用中，将不同体积的可溶性血清蛋白粉末加入到乳样品中，同时保持蛋白的可溶性含量恒定。

对于该应用的所有样品，酪蛋白的平均浓度定量为0.25％，标准偏差为3％，这与测量的再现性误差相容。该可溶性蛋白部分已被测定并被证实为可靠的结果，其与专利申请FR 2752 941的那些一致。

图2表示本发明对几个样品的第三种应用，每个样品包含一定体积的逐渐增加的微过滤的乳保留物，以便得到酪蛋白和可溶性血清蛋白的含量高度可变的不同样品。

在对每个样品进行均匀化之后，通过用280纳米的第一波长和340纳米的第二波长照射它们中的每一个来进行相应的正面荧光测量。

通过使用PARAFAC分解方法，然后使用多元线性回归方法，图2中显示的结果表明，相对于酪蛋白的参考含量值(以每100克样品的酪蛋白克数表示)，对于每个样品获得酪蛋白的预测含量(在纵坐标上)的可靠校准。

在线性回归的基础上，其中曲线方程由y(x)-0.984x定义，校准结果表明校准误差的平方根等于0.34％，这突出了第三个应用中的样品的很大的变异性。此外，获得等于0.56％的交叉验证误差的平方根表明理想地强校准需要更多数量的样品。然而，由于该方法的速度，每天可以测量数百个样品。

Claims

1.用于测定诸如生乳或低巴氏灭菌乳的液体食品中酪蛋白含量和血清蛋白含量的方法，其特征在于，所述方法包含由以下各项组成的连续步骤：

a)通过加入具有预定pH的缓冲液形成所述液体食品的溶液，所述溶液包含所述血清蛋白和所述酪蛋白，所述酪蛋白以凝固形式悬浮在所述溶液中，而所述血清蛋白溶解在所述溶液中；

b)搅拌所述溶液，以形成所述血清蛋白和酪蛋白的均匀混合物；

c)获得所述混合物的多个正面荧光光谱，所述正面荧光光谱通过至少一种确定波长的电磁辐射由所述均匀混合物激发而产生；

d)通过加入预定量的水稀释所述混合物，以通过过滤分离所述可溶性血清蛋白与悬浮在溶液中的凝固的酪蛋白；

f)通过对所述正面荧光光谱和直角荧光光谱进行多路径分析来测定所述液体食品的酪蛋白含量和血清蛋白含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，至少一种电磁辐射的波长为270纳米至340纳米，并且优选地等于280纳米。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述缓冲液是乙酸钠的缓冲液和/或pH为4.50至4.65、优选等于4.55或4.6的缓冲液。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过测量在所述混合物中和/或在所述经稀释的混合物中存在的色氨酸实现在步骤c)期间获得至少一个正面荧光光谱和/或在步骤e)期间获得至少一个直角荧光光谱。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤a)期间添加的所述液体食品和缓冲液具有使得所述液体食品体积与所述缓冲液体积之间的比例在1和5之间，并且优选等于3的体积。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，搅拌步骤b)通过涡旋实施。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述多路径分析是应用于选自多元线性回归方法或偏最小二乘回归方法的回归方法的PARAFAC分析。