CN110577978A - 评价中性粒细胞的活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用新的指标来评价中性粒细胞的活性的方法。本发明的方法是评价中性粒细胞的活性的方法，包括基于根据添加有中性粒细胞刺激剂的生物体试样的髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的测定结果导出的指标，评价中性粒细胞的活性的工序，该指标是从添加中性粒细胞刺激剂的时刻起到髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻为止的时间。
Description
技术领域
本发明涉及评价中性粒细胞的活性的方法。
背景技术
中性粒细胞对于炎性细胞因子和细菌等表现出趋化性，因而在炎症部位聚集，具有吞噬杀灭细菌等的功能，在生物体防御中发挥着重要的作用。作为中性粒细胞吞噬杀灭细菌等的作用机理，已知活性氧(超氧化物、过氧化氢等)的产生、以及因髓过氧化物酶(MPO)引起的次氯酸的产生等。
另一方面，因中性粒细胞的过度的活化而造成的活性氧的产生被指出成为氧化应激的原因，引起细胞或组织的障碍而与多种病症相关(例如参照非专利文献1)。另外，近年来已知从中性粒细胞放出的MPO也参与作为氧化应激的另一原因的脂质的过氧化(例如非专利文献1)。
作为评价中性粒细胞的功能等的方法，例如在专利文献1中公开了如下方法：包括使用含有全血的同一试样测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性的工序，上述髓过氧化物酶活性的测定、以及上述超氧化物产生活性的测定的至少一种是基于荧光的检测而进行，上述荧光的检测是通过对包含上述试样的试样容器照射从激发光源输出的激发光，利用荧光检测器检测所释放的荧光，并且，上述激发光源和上述荧光检测器是相对于上述试样容器的上述激发光的照射面，配置于同一侧，基于测得的髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性来评价中性粒细胞的活性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2015-84757号公报
非专利文献
非专利文献1：生物试样分析,Vol.35,No2,2012年,pp.133～139.
发明内容
发明要解决的技术问题
中性粒细胞一旦接触细菌和真菌类，就会以由中性粒细胞质膜包裹的方式，吸收至中性粒内形成吞噬体。接着，吞噬体与颗粒融合，颗粒内容物被释放到吞噬体内。通过在细胞膜(吞噬体的膜)上形成的NADPH氧化酶系，产生活性氧(超氧化物、过氧化氢)，杀灭细菌和真菌类。另外，由于颗粒内容物所含的髓过氧化物酶(EC编号1.11.2.2)的酶反应，由过氧化氢(H2O2)和氯离子(Cl-)生成次氯酸(HOCl)(或其卤素等价物)，杀灭细菌和真菌类。
在专利文献1所记载的方法中，例如在添加中性粒细胞刺激剂后，对活性氧和次氯酸(或其卤素等价物)进行定量，算出测得的峰面积，由此导出髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性。然后，基于测得的髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性来评价中性粒细胞的活性。
另一方面，本发明的发明人发现，在罹患动脉硬化等疾病、以及过度疲劳等处于被认为中性粒细胞过度活化而面临氧化应激状态的状况的被检验者中，基于专利文献1所记载的方法，在添加中性粒细胞刺激剂后通过活性氧和次氯酸(或其卤素等价物)的定量测得髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性时，直至峰向上升起的时间延长。本发明基于该新的见解，其目的在于提供一种利用新的指标来评价中性粒细胞的活性的方法。
用于解决技术问题的手段
本发明提供一种方法，所述方法是评价中性粒细胞的活性的方法，包括基于根据添加有中性粒细胞刺激剂的生物体试样的髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的测定结果导出的指标，评价中性粒细胞的活性的工序，上述指标是从添加上述中性粒细胞刺激剂的时刻起到髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻为止的时间。
本发明的评价方法中，将从添加中性粒细胞刺激剂的时刻起、到髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻为止的时间(以下也称为“指标时间”)作为指标，因而能够评价中性粒细胞的活性。在罹患动脉硬化等疾病、以及过度疲劳等处于被认为中性粒细胞过度活化而面临氧化应激状态的状况的被检验者中，指标时间延长。可以认为这是由于中性粒细胞过度活化，结果对于如下刺激的感受性下降的缘故。因此，本发明的评价方法还可以理解为例如评价中性粒细胞的感受性的方法。
进行评价的工序可以包括将指标时间与基准值比较，在指标时间大于基准值时，评价为中性粒细胞的感受性下降的步骤。
上述生物体试样优选是含有全血的试样。这是因为在含有全血的试样中不需要将中性粒细胞分离，因而操作简便，还能够避免因分离操作而对中性粒细胞造成应激，并且，能够获得包括与血液中所含的各种各样的体液因子等的相互作用在内的更接近生物体内的动态的信息。
另外，进行评价的工序除了包括基于指标时间评价中性粒细胞的活性的步骤之外，还可以包括基于髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰面积来评价中性粒细胞的活性的步骤。在指标时间延长的被检验者中，有时还同时观察到峰面积减少。因此，通过一并实施基于峰面积的评价，能够多方面地评价中性粒细胞的活性。另外，基于峰面积，还能够一并评价“食”等外源性因素或生物体所具备的抗氧化酶等的炎症防御能力(抗氧化能力或防止氧化应激的能力)。
根据本发明的评价方法，能够区分例如罹患动脉硬化等疾病、以及过度疲劳等处于被认为中性粒细胞过度活化而面临氧化应激状态的状况的被检验者。因此，本发明还提供一种方法，该方法是收集用于判断对象是否罹患因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的疾病、或者是否处于因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的状态的数据的方法，该数据收集方法包括根据添加有中性粒细胞刺激剂的生物体试样的髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的测定结果来导出上述数据的工序，上述数据是从添加上述中性粒细胞刺激剂的时刻起到髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻为止的时间，上述生物体试样是从上述对象获取的生物体试样。
根据本发明的发明人发现的另外的见解，在例如罹患动脉硬化等疾病、以及过度疲劳等处于被认为中性粒细胞过度活化而面临氧化应激状态的状况的被检验者中，在该状况改善后，与处于该状况时相比，指标时间缩短。因此，本发明还提供一种方法，所述方法是收集用于判断对象的因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的疾病或状态的治疗效果的数据的方法，包括根据添加有中性粒细胞刺激剂的生物体试样的髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的测定结果来导出上述数据的工序，上述数据是从添加上述中性粒细胞刺激剂的时刻起到髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻为止的时间，上述生物体试样是从治疗后的上述对象获取的生物体试样。发明效果
根据本发明，能够提供一种利用新的指标来评价中性粒细胞的活性的方法。本发明的评价方法将上述的指标时间作为指标进行评价，因而还能够评价中性粒细胞的感受性。根据本发明，还能够例如判断对象是否罹患因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的疾病、或者是否处于因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的状态、以及判断对象的因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的疾病或状态的治疗效果。
附图说明
图1是表示在试验例1中，使用包含从罹患下肢动脉硬化闭塞症、且实施末梢血管介入治疗的患者采集的全血的生物体试样，测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性的结果的曲线图。
图2是表示在试验例1中，解析治疗前的超氧化物产生活性的峰面积、髓过氧化物酶活性的峰面积和超氧化物产生活性的指标时间彼此之间的相关关系的结果的曲线图。
图3是表示在试验例2中，使用包含从健康人采集的全血的生物体试样，测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性的结果的曲线图。
图4是表示在试验例3中，使用包含从健康人采集的全血的生物体试样，测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性，导出指标时间的结果的曲线图。
图5是表示在试验例3中，使用包含从下肢动脉硬化闭塞症患者(治疗前)采集的全血的生物体试样，测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性，导出指标时间的结果的曲线图。
图6是表示在试验例3中，使用包含从下肢动脉硬化闭塞症患者(介入治疗1个月后)采集的全血的生物体试样，测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性，导出指标时间的结果的曲线图。
图7是表示在试验例3中，使用包含从脑疾病患者采集的全血的生物体试样，测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性，导出指标时间的结果的曲线图。
图8是表示在参考例中，使用试验例1的生物体试样，解析血浆中MPO活性与刺激时MPO活性(添加中性粒细胞刺激剂测得的MPO活性)之间的相关关系的结果的曲线图。
具体实施方式
下面，对用于实施本发明的方式进行详细说明。但本发明并不限定于以下的实施方式。
本实施方式的评价中性粒细胞的活性的方法(也称为“评价方法”)包括基于根据添加有中性粒细胞刺激剂的生物体试样的髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的测定结果导出的指标，评价中性粒细胞的活性的工序(也称为“评价工序”)，作为指标，采用从添加中性粒细胞刺激剂的时刻起、到髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻为止的时间。
本实施方式的评价方法可以进一步包括在生物体试样中添加中性粒细胞刺激剂的工序(也称为“添加工序”)、使用添加有中性粒细胞刺激剂的生物体试样测定髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的工序(也称为“测定工序”)、和根据髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的测定结果来导出上述指标(指标时间)的工序(也称为“导出工序”)。但是，本实施方式的评价方法并不必须具备添加工序、测定工序和导出工序，也可以以利用另外导出的指标时间仅实施评价工序的方式来构成。
生物体试样只要是从生物体采集的包含中性粒细胞的试样即可。中性粒细胞例如包含在血液中、唾液中、龈沟渗出液中。生物体试样例如可以是包含从生物体采集的试样(例如、血液(全血)、唾液、龈沟渗出液)原液的试样，也可以是包含对从生物体采集的试样进行处理、将中性粒细胞浓缩或分离而得到的处理液的试样。将中性粒细胞浓缩或分离而得到的处理液，例如可以按照使用流式细胞计将中性粒细胞浓缩或分离的方法等常规方法进行制备。
生物体试样可以是从生物体采集的试样原液或处理液原液，也可以是利用生理食盐水、缓冲液等将从生物体采集的试样或处理液稀释而得到的试样。在进行稀释时，只要能够检测出髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性即可，稀释率可以适当设定。例如，在对全血进行稀释时，优选稀释为10～750倍，更优选稀释为50～500倍，进一步优选稀释为100～400倍，更进一步优选稀释为200～300倍，特别优选稀释为220～280倍。
中性粒细胞刺激剂只要是将中性粒细胞的功能(例如趋化、吞噬)活化的物质即可。作为中性粒细胞刺激剂，例如可以列举甲酰甲硫氨酰亮氨酰苯丙氨酸(fMLP：中性粒细胞趋化肽)、佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸盐(PMA)、调理化酵母多糖(OZ)。它们可以单独使用1种或将2种以上组合使用。
髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性例如可以使用荧光指示剂、发光(例如化学发光)指示剂或吸光指示剂，经时地检测荧光、发光或吸光来进行测定。指示剂可以使用市售的指示剂，也可以使用市售的测定试剂盒。
髓过氧化物酶活性的测定例如可以使用与因髓过氧化物酶产生的次氯酸(或其卤素等价物)反应的荧光指示剂、发光指示剂或吸光指示剂进行测定。作为这样的指示剂，例如可以列举氨基苯基荧光素(APF：Aminophenyl fluorescein)、牛磺酸/TNB(参照J.Clin.Invest.,Vol.70,pp.598～607,1982年)、8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4-(2H,3H)二酮(L-012：参照Anal Biochem.,Vol.271(1),pp.53-58,1999年)。
APF与HOCl的反应能够利用荧光(例如激发波长490nm、荧光波长515nm)检测。牛磺酸/TNB与HOCl的反应能够利用吸光(例如波长412nm)检测。L-012与HOCl的反应的特异性低，但能够利用化学发光(例如波长455nm)检测。
超氧化物产生活性的测定例如可以使用与超氧化物反应的荧光指示剂、发光指示剂或吸光指示剂进行测定。作为这样的指示剂，例如可以列举2-甲基-6-苯基-3,7-二氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-酮(CLA)、2-甲基-6-(4-甲氧基苯基)-3,7-二氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-酮(MCLA)、2-甲基-6-对甲氧基苯基乙炔基咪唑并吡嗪酮(MPEC)、靛青型咪唑并吡嗪酮化合物(NIR-CLA)、2-[2,4,5,7-四氟-6-(2-硝基-4,5-二甲氧基苯基磺酰氧基)-3-氧代-3H-氧杂蒽-9-基]苯甲酸(BES-So)。
CLA与超氧化物的反应能够利用化学发光(例如最大发光波长380nm)检测。MCLA与超氧化物的反应能够利用化学发光(例如最大发光波长465nm)检测。MPEC与超氧化物的反应能够利用化学发光(例如最大发光波长430nm)检测。NIR-CLA与超氧化物的反应能够利用化学发光(例如最大发光波长800nm)检测。BES-So与超氧化物的反应能够利用荧光(例如激发波长505nm、荧光波长544nm)检测。
髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性只要测定其中之一就能够实现利用本实施方式的评价方法的评价，但是也可以例如基于专利文献1中记载的方法，对于同一生物体试样测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性这两者。
荧光、发光或吸光的检测例如可以使用荧光光度计、发光测定装置、吸光光度计等公知的装置实施。另外，生物体试样包含全血时的荧光的检测优选基于专利文献1中记载的方法实施。
指标时间是从添加中性粒细胞刺激剂的时刻起、到髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻为止的时间。参照图3对指标时间的导出方法进行说明。图3是表示使用包含从健康人采集的全血的生物体试样，测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性的结果的曲线图。图3的曲线图中，横轴表示经过时间(测量时间)，右纵轴和左纵轴分别表示髓过氧化物酶活性(荧光发光量(测定值))和超氧化物产生活性(化学发光量(测定值))。
图3的曲线图汇总表示对于同一健康人在连续的3天之内每天早晨实施采血、对各个生物体试样(包含全血的试样)测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性的结果；以及大约在1个月后再次实施采血、对于所得到的生物体试样(包含全血的试样)测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性的结果。其中，该健康人主诉仅在第1天感到之前的疲惫未消除而极度疲劳，处于被认为中性粒细胞过度活化而面临氧化应激状态的状况。
图3中，箭头A表示添加中性粒细胞刺激剂的时刻。箭头B和箭头C分别表示在使用第2天和第1天的生物体试样的测定中超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻。同样，箭头D和箭头E分别表示在使用第2天和第1天的生物体试样的测定中髓过氧化物酶活性的峰向上升起的时刻。例如，从箭头A所示的时刻起、到箭头C所示的时刻为止的时间是根据由第1天的生物体试样测得的超氧化物产生活性导出的指标时间。另外，例如从箭头A所示的时刻起、到箭头B所示的时刻为止的时间是根据由第2天的生物体试样测得的超氧化物产生活性导出的指标时间。其中，在图3的示例中，被检验者(健康人)主诉极度疲劳的第1天的指标时间表现出比第2天的指标时间大的值。另外，根据图3可以理解，髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性仅测定其中之一，就能够实现利用本实施方式的评价方法的评价。
髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻例如能够如下确定：在生物体试样中添加中性粒细胞刺激剂后，直至髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰出现为止，持续进行足够时间的测定，之后，绘制测定值相对于测定时间的曲线图，根据该曲线图，确定为测定值的斜率相对于本底值(background level)发生变化的时刻(峰的山麓附近)。
例如在通过由髓过氧化物酶产生的次氯酸(或其卤素等价物)的定量来进行髓过氧化物酶活性的测定的情况下，指标时间通常为290～470秒。关于该指标时间，例如，在罹患动脉硬化等疾病、以及过度疲劳等处于被认为中性粒细胞过度活化而面临氧化应激状态的状况的被检验者中，由于中性粒细胞对于刺激的感受性下降，因而向更大的值(例如超过500秒)位移。
例如在通过超氧化物歧化酶的定量来进行超氧化物产生活性的测定的情况下，指标时间通常为65～150秒。关于该指标时间，例如，在罹患动脉硬化等疾病、以及过度疲劳等处于被认为中性粒细胞过度活化而面临氧化应激状态的状况的被检验者中，由于中性粒细胞对于刺激的感受性下降，因而向更大的值(例如超过200秒)位移。
中性粒细胞的活性能够基于所导出的指标时间进行评价。如上所述，在指标时间显示更大的值的情况下，表明中性粒细胞对于刺激的感受性下降。例如，在所导出的指标时间超过某规定的基准值的情况下，可以评价中性粒细胞的感受性(对于刺激的感受性)下降。同样，在所导出的指标时间为某规定的基准值的情况下，可以评价为中性粒细胞的感受性(对于刺激的感受性)正常。
基准值可以根据目的适当设定。例如，可以根据对大量人的检体测得的指标时间通过取平均值等来导出基准值。基准值例如可以根据性别、年龄等为多个值。并且，对于特定的个人，也可以将健康状态时的测定值作为基准值。另外，在收集用于判断因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的疾病或状态的治疗效果的数据的方法中，可以将治疗前的指标时间作为基准值。
关于本实施方式的评价方法，评价工序除了包括基于指标时间评价中性粒细胞的活性的步骤之外，还可以包括基于髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰面积来评价中性粒细胞的活性的步骤。通过一并实施基于峰面积的评价，能够多方面地评价中性粒细胞的活性。另外，基于峰面积，还能够一并评价“食”等外源性因素或生物体所具备的抗氧化酶等的炎症防御能力(抗氧化能力或防止氧化应激的能力)。
本实施方式的评价方法例如还能够用于收集用于判断对象是否罹患因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的疾病、或者是否处于因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的状态的数据的方法(第一数据收集方法)、以及收集用于判断对象的因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的疾病或状态的治疗效果的数据的方法(第二数据收集方法)等。
本实施方式的第一数据收集方法是包括根据添加有中性粒细胞刺激剂的生物体试样的髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的测定结果来导出指标时间的工序、收集导出的指标时间作为该数据的方法。生物体试样是从对象获取的生物体试样。
作为因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的疾病，例如可以列举下肢动脉硬化闭塞症等动脉硬化症、癌、炎症性疾病、高血脂症、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森氏症、酒精依赖症等。作为因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的状态，例如可以列举过度疲劳、剧烈运动后的吸烟、衰老等。
本实施方式的第二数据收集方法是包括根据添加有中性粒细胞刺激剂的生物体试样的髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的测定结果来导出指标时间的工序、收集导出的指标时间作为该数据的方法。生物体试样是从治疗后的对象获取的生物体试样。
第二数据收集方法可以是还包括对于从治疗前的对象获取的生物体试样导出上述的指标时间的工序、进一步收集导出的指标时间(治疗前)作为上述数据的方法。
本实施方式的第一数据收集方法和第二数据收集方法中的具体的实施方式等如上所述。
实施例
下面基于实施例对本发明进行更为具体的说明。但本发明并不限定于以下的实施例。
〔试验方法〕
在本实施例中，通过以下所示的方法实施中性粒细胞的活性评价。(髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性的测定)
髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性基于专利文献1的实施例所记载的方法进行测定。具体而言，作为试样容器，使用以日本特开2018-025480号公报的图1所记载的测定容器为基准的容器。生物体试样以如下方式制备：在温度保持在37℃的RH缓冲液(10mMHEPES、154mM NaCl、5.6mM KCl、pH7.4)中添加下述式(1)所示的MCLA(MCLA商品名、东京化成工业株式会社生产)使其达到0.5μM、下述式(2)所示的APF(APF商品名、SEKISUI MEDICALCO.,LTD.生产)使其达到10μM、以及CaCl2使其达到1mM，以37℃孵育4分钟，在所得到的溶液中添加从对象(被检验者)采集的血液(全血)3μL(稀释250倍)。将制得的生物体试样以37℃孵育1分钟后，使用荧光和发光同时测定装置开始测定。
作为激发光，使LED(480nm)一边以125m秒的间隔闪烁，一边开始向上述的生物体试样照射。在2.5分钟之后，在生物体试样中添加蛋白激酶C活化剂(PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸盐)：中性粒细胞刺激剂)使其达到0.1μM，测定APF的荧光强度(髓过氧化物酶活性)和MCLA的化学发光强度(超氧化物产生活性)。
(指标时间的导出)
绘制通过上述方法测得的APF的荧光强度(荧光发光量)和MCLA的化学发光强度(化学发光量)相对于时间(测量时间)的曲线图，根据该曲线图导出指标时间。指标时间是从添加中性粒细胞刺激剂的时刻(添加刺激剂)起、到髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻为止的时间。髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻确定为荧光强度或化学发光强度的测定值的斜率相对于本底值发生变化的时刻(峰的山麓附近)。
〔试验例1：罹患动脉硬化的患者的评价〕
将罹患下肢动脉硬化闭塞症、并实施末梢血管介入治疗的患者作为对象(被检验者)，在介入治疗前以及该介入治疗1个月后的诊察时进行采血(共计2次)。使用采集的全血，按照上述试验方法测定髓过氧化物酶活性(荧光发光量)和超氧化物产生活性(化学发光量)。将代表性的的被检验者(2名)的结果示于图1。
如图1所示，两名患者在治疗1个月后，髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻均比治疗前提早(即，指标时间减小)。两名患者的介入治疗效果均较高，可见症状的改善，作为目前评价下肢动脉狭窄、闭塞的指标ABI值(踝肱指数：AnkleBrachial Pressure Index)也得到改善。由图1的曲线图导出的指标时间如下述表1所示。
[表1]
使用由30名患者(被检验者)获得的数据，对于髓过氧化物酶活性的峰面积与超氧化物产生活性的峰面积(治疗前：图2(A)、治疗1个月后：图2(D))、髓过氧化物酶活性的峰面积与超氧化物产生活性的指标时间(治疗前：图2(B)、治疗1个月后：图2(E))、以及超氧化物产生活性的峰面积与超氧化物产生活性的指标时间(治疗前：图2(C)、治疗1个月后：图2(F))，解析各自的相关关系，将结果示于图2。治疗前的超氧化物产生活性的峰面积与超氧化物产生活性的指标时间的相关系数为-0.579，显示负相关(图2(C))。治疗前的髓过氧化物酶活性的峰面积与超氧化物产生活性的指标时间的相关系数也为同值，显示负相关(图2(B))。其中，在治疗1个月后，两者的相关性均降低(图2(E)和图2(F))。在健康人的情况下，指标时间基本恒定，可以认为不存在与两峰面积的负相关，可以认为在治疗效果上相关性降低。
〔试验例2：健康人的评价〕
将健康人作为对象(被检验者)，不定期(每周数次)地进行采血(共计80次左右)。使用采集的全血，按照上述试验方法测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性。图3是表示将对于同一被检验者(健康人)的连续3天(图3中、第1天～第3天)和约1个月后的测定结果汇总表示的曲线图。该被检验者主诉仅在第1天感到之前的疲惫未消除而极度疲劳，处于被认为中性粒细胞过度活化而面临氧化应激状态的状况。
如图3所示，在主诉极度疲劳的那一天的测定结果中，髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻比通常时延缓。在共计80次左右的测定结果中，目前为止髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻延缓的只有这一天。并且，得到了两活性的峰面积均为与通常相比减少的结果。得到峰面积通常与大约1个月后的测定结果同等程度的结果。第3天的峰面积变得稍大可以认为是第1天晚上进行了轻微运动的影响。由于轻微运动的影响等，得到了直至运动后第2天(图3中、第3天)为止峰面积阶段性地增加的趋势。根据图3的曲线图导出的指标时间和峰面积如下述表2所示。
[表2]
〔试验例3：患者和健康人的评价〕
将健康人、罹患动脉硬化的患者和罹患脑疾病的患者作为对象(被检验者)，按照上述试验方法测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性，导出指标时间。将结果示于图4～图7和表3。
图4是表示使用包含从健康人采集的全血的生物体试样，测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性，导出指标时间的结果的曲线图。将13名20～50多岁的健康的志愿者作为检验者，使用不定期采集的全血进行测定(共计76个试样)。图4(A)中，a标绘根据超氧化物产生活性导出的指标时间的平均值和标准偏差，b标绘根据超氧化物产生活性导出的指标时间。图4(B)中，a标绘根据髓过氧化物酶活性导出的指标时间的平均值和标准偏差，b标绘根据髓过氧化物酶活性导出的指标时间。在健康人中，根据超氧化物产生活性导出的指标时间处于65～150秒左右的范围内，根据髓过氧化物酶活性导出的指标时间处于290～470秒左右的范围内(图4和表3)。
图5是表示使用包含从下肢动脉硬化闭塞症患者(治疗前)采集的全血的生物体试样，测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性，导出指标时间的结果的曲线图。被检验者罹患下肢动脉硬化闭塞症，治疗前的指标时间高于健康人测定的上述范围、并且确认到介入治疗的治疗效果的患者有12名。在图5(A)和(B)中，a和b与图4同样(即，a标绘指标时间的平均值和标准偏差，b标绘指标时间)。
图6是表示使用包含从下肢动脉硬化闭塞症患者(介入治疗1个月后)采集的全血的生物体试样，测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性，导出指标时间的结果的曲线图。被检验者与图5相同。在图6(A)和(B)中，a和b与图4同样(即，a标绘指标时间的平均值和标准偏差，b标绘指标时间)。如图5、图6以及表3所示，根据髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性导出的指标时间在介入治疗后均减小。另一方面，介入治疗后的指标时间比在健康人中确认到的指标时间大。可以认为这是由于被检验者(患者)中高龄人士居多而受到衰老的影响、并且除了动脉硬化以外还患有多种疾病等原因。
图7是表示使用包含从脑疾病患者采集的全血的生物体试样，测定髓过氧化物酶活性和超氧化物产生活性，导出指标时间的结果的曲线图。将39名罹患脑疾病的患者作为被检验者，使用不定期地采集的全血进行测定(共计48个试样)。进行细分，重症肌无力症为14名(共计16个试样)、多发性硬化症为11名(共计12个试样)、视神经脊髄炎为6名(共计8个试样)、慢性炎症性脱髄性多发神经炎为3名(共计6个试样)、米费症候群为2名(共计3个试样)、法布里病为1名(共计2个试样)、Sweet综合症为1名(共计1个试样)。在图7(A)和(B)中，a和b与图4同样(即，a标绘指标时间的平均值和标准偏差，b标绘指标时间)。如图7和表3所示，脑疾病患者中，疾病和阶段均复杂且多样化，因而导出的指标时间的偏差大。重症肌无力症等是基于慢性炎症的自身免疫缺陷。在脑疾病患者中导出的指标时间大幅超出在健康人中确认到的指标时间的范围的例子增多，可以推测处于因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的状态。
[表3]
根据图4～图7和表3所示的结果，例如在根据超氧化物产生活性(化学发光量)导出的指标时间超过150秒、或者根据髓过氧化物酶活性(荧光发光量)导出的指标时间超过500秒的情况下，可以认为罹患因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的疾病、或者处于因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的状态。即，作为基准值，例如，对于根据超氧化物产生活性(化学发光量)导出的指标时间，可以采用150～200秒(例如150秒或200秒)；对于根据髓过氧化物酶活性(荧光发光量)导出的指标时间，可以采用500～550秒(例如500秒或550秒)。
〔参考例：利用中性粒细胞刺激剂的刺激的有无与指标时间的相关关系〕
使用从试验例1的对象(被检验者)采集的全血，按照与上述试验方法同样的步骤进行髓过氧化物酶活性的测定，算出峰面积(刺激时MPO活性)。从相同的全血中分离血浆，使用比色法检测试剂盒(Ab105136，Abcam公司生产)，测定髓过氧化物酶活性(血浆中MPO活性)。其中，关于血浆中MPO活性，不使中性粒细胞刺激剂与中性粒细胞作用，测定由中性粒细胞分泌的MPO的活性，反映采血时的被检验者的中性粒细胞的活性。
图8表示对血浆中MPO活性(mU/mL)与刺激时MPO活性(峰面积×107)的相关关系进行解析的结果。图8(A)是对治疗前的相关关系进行解析的结果，图8(B)是对介入治疗1个月后的相关关系进行解析的结果。如图8所示，治疗前显示负相关，而治疗1个月后显示正相关。可以认为该结果表明在治疗前的被检验者中，即使在不利用中性粒细胞刺激剂进行刺激的状态下，MPO活性也为高值，被过度活化，并且对于中性粒细胞刺激剂的反应性(感受性)钝化，表明处于因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的状态。
髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰面积通常反映中性粒细胞的活性，在峰面积小的情况下，中性粒细胞的活性稳定(非氧化应激状态)，另外，在极低的情况下，判断自然免疫活性下降。另一方面，根据图8所示的结果可以认为，即使在峰面积小的情况下，在指标时间大时，中性粒细胞反而被过度活化(对于刺激剂的感受性下降)。即，通过一并评价指标时间和峰面积，能够多方面地评价中性粒细胞的活性。
Claims (6)
1.一种方法，其特征在于：
所述方法是评价中性粒细胞的活性的方法，
包括基于根据添加有中性粒细胞刺激剂的生物体试样的髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的测定结果导出的指标，评价中性粒细胞的活性的工序，
所述指标是从添加所述中性粒细胞刺激剂的时刻起到髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻为止的时间。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
进行所述评价的工序包括将所述时间与基准值比较，在所述时间大于所述基准值时，评价为中性粒细胞的感受性下降的步骤。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述生物体试样是含有全血的试样。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于：
进行所述评价的工序还包括基于髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰面积评价中性粒细胞的活性的步骤。
5.一种方法，其特征在于：
所述方法是收集用于判断对象是否罹患因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的疾病、或者是否处于因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的状态的数据的方法，
包括根据添加有中性粒细胞刺激剂的生物体试样的髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的测定结果来导出所述数据的工序，
所述数据是从添加所述中性粒细胞刺激剂的时刻起到髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻为止的时间，
所述生物体试样是从所述对象获取的生物体试样。
6.一种方法，其特征在于：
所述方法是收集用于判断对象的因中性粒细胞的过度的活化而造成的伴随氧化应激的疾病或状态的治疗效果的数据的方法，
包括根据添加有中性粒细胞刺激剂的生物体试样的髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的测定结果来导出所述数据的工序，
所述数据是从添加所述中性粒细胞刺激剂的时刻起到髓过氧化物酶活性或超氧化物产生活性的峰向上升起的时刻为止的时间，
所述生物体试样是从治疗后的所述对象获取的生物体试样。
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