CN110577580B - 一种多发性骨髓瘤治疗疫苗 - Google Patents

一种多发性骨髓瘤治疗疫苗 Download PDF

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Abstract

提供了一种新的多发性骨髓瘤治疗疫苗及在多发性骨髓瘤治疗中的用途。

Description

一种多发性骨髓瘤治疗疫苗
技术领域
本发明涉及一种多发性骨髓瘤治疗疫苗及其用途。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞病，其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞，而浆细胞是B淋巴细胞发育到最终功能阶段的细胞。因此多发性骨髓瘤可以归到B淋巴细胞淋巴瘤的范围。目前WHO将其归为B细胞淋巴瘤的一种，称为浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤。其特征为骨髓浆细胞异常增生伴有单克隆免疫球蛋白或轻链(M蛋白)过度生成，极少数患者可以是不产生M蛋白的未分泌型MM。临床表现多样，主要有贫血、骨痛、肾功能不全、感染、出血、神经症状、高钙血症、淀粉样变等。由于正常免疫球蛋白的生成受抑，因此容易出现各种细菌性感染。多发性骨髓瘤起病徐缓，早期无明显症状，容易被误诊，发病率估计为2～3/10万，男女比例为1.6∶1，大多患者年龄＞40岁。
传统大剂量化疗及自体干细胞移植提高了患者的生存率，近十年来新型药物的出现也极大地延长了患者的OS，然而化疗毒性作用及移植相关死亡率也不容忽视，在现有的治疗手段下，大部分MM患者最终会复发耐药而死亡，因此亟需寻找新的治疗方法。肿瘤免疫治疗在控制骨髓瘤方面有极好的前景，可能为MM患者提供除传统化疗之外的新的治疗选择，治疗性疫苗可通过诱导免疫应答以清除骨髓瘤细胞，着眼于研发可产生骨髓瘤特异性免疫的肿瘤疫苗具有良好的市场和社会效益。
发明内容
本发明提供了一种新的多发性骨髓瘤治疗疫苗及其用途。
为实现上述目的，本发明首先提供了一种结构I所示的化合物，该化合物所成的可药用的盐、溶剂化物、螯合物或非共价复合物，基于该化合物基础上的药物前体，或上述形式的任意混合物。
ρ-Glu-Leu-Ala-Gly-Ile-Gly-Ile-Leu-Thr-Val-AA1(R)-AA2
结构I
结构I的AA1为Lys，或为Dap，或为Orn，或为Dab，或为Dah，或为不存在；
结构I的AA2为NH2，或为OH；
结构I的R：为HO2C(CH2)n1CO-(γGlu)n2-(PEGn3(CH2)n4CO)n5-，或为不存在；
其中：n1为10至20的整数；
n2为1至5的整数；
n3为1至30的整数；
n4为1至5的整数；
n5为1至5的整数；
本发明还提供了包括根据本发明化合物的药物组合物，以及提供了本发明化合物的药物组合物用于制备治疗疾病的药物用途。
作为优选，所述药物组合物在制备多发性骨髓瘤治疗药物中的用途。
本发明所涉及到的更多内容在以下有详细描述，或者有些也可以在本发明的实施例中体会。
除非另有所指，本文中所用来表示不同成分的数量、反应条件，在任意情况下都可解读为“大致的”、“大约的”意思。相应的，除有明确的特指外，在下述以及权利要求中所引用的数字参数都是大致的参数，在各自的实验条件下由于标准误差的不同，有可能会得到不同的数字参数。
本文中，当一个化合物的化学结构式和化学名称有分歧或疑义时，以化学结构式确切定义此化合物。本文所描述的化合物有可能含有一个或多个手性中心，和/或者双键以及诸如此类的结构，也可能存在立体异构体，包括双键的异构体(比如几何异构体)、旋光对映异构体或者非对映异构体。相应的，在本文描述范围内的任意化学结构，无论是部分或整体结构中含有上述类似结构，都包括了此化合物的所有可能的对映异构体和非对映异构体，其中也包括了单纯的任一种立体异构体(如单纯的几何异构体、单纯的对映异构体或者单纯的非对映异构体)以及这些异构体的任意一种混合物。这些消旋异构体和立体异构体的混合物由本领域技术人员利用不停的分离技术或手性分子合成的方法也可进一步被拆分成其组成成分的对映异构体或立体异构体。
结构式I的化合物包含了，但并不仅限于，这些化合物的光学异构体、消旋体和/或其他的混合物。上述情况下，其中单一的对映异构体或非对映异构体，如有旋光的异构体，可以用不对称合成的方法或消旋体拆分的方法获得。消旋体的拆分可用不同的方法实现，如常规的用助拆分的试剂重结晶，或用色谱方法。另外，结构式I的化合物也包含了带双键的顺式和/或反式的异构体。
本发明所述化合物包含但不限于，结构式I所示化合物以及他们所有的在药学上可用的不同形式。这些化合物的药学上可用的不同形式包括各种可药用的盐、溶剂化物、络合物、螯合物、非共价的复合物、基于上述物质基础上的药物前体和上述这些形式的任意混合物。
上述所述药物前体包括含在所述化合物内，如结构式I所示化合物的酯或者酰胺衍生物。
本发明提供的结构I所示的化合物性质稳定，是一种多发性骨髓瘤治疗疫苗。
具体实施方式
本发明公开了一种多发性骨髓瘤治疗疫苗及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进相关参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中涉及的英文缩写所对应的中文名称见下表所示：
英文缩写 中文名称 英文缩写 中文名称
Fmoc 9-芴甲氧羰基 OtBu 叔丁氧基
tBu 叔丁基 Boc 叔丁氧羰酰基
Trt 三苯甲基 Ile 异亮氨酸
Ala 丙氨酸 Leu 亮氨酸
Glu 谷氨酸 Thr 苏氨酸
Gly 甘氨酸 Val 缬氨酸
Dap 2，3-二氨基丙酸 Dab 2，4-二氨基丁酸
Orn 鸟氨酸 Dah 2，7-二氨基庚酸
实施例1化合物1的制备
ρ-Glu-Leu-Ala-Gly-Ile-Gly-Ile-Leu-Thr-Val-OH
1、肽树脂的合成
使用Fmoc-Val-Wang树脂为载体树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与下表所示的保护氨基酸偶联，制得肽树脂。本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸如下所示：
接肽顺序n＝ 保护氨基酸
1 Fmoc-Val-Wang树脂
2 Fmoc-Thr(tBu)
3 Fmoc-Leu
4 Fmoc-Ile
5 Fmoc-Gly
6 Fmoc-Ile
7 Fmoc-Gly
8 Fmoc-Ala
9 Fmoc-Leu
10 ρ-Glu
(1)接入主链第2个保护氨基酸
取0.03mol第2个保护氨基酸和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。
取0.01mol的Fmoc-Val-Wang树脂(取代值约0.5mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。
将活化后的第2个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，再加入0.003molDMAP/DMF溶液，偶联反应6小时，过滤洗涤，得含2个保护氨基酸的树脂。
(2)接入主链第3～10个保护氨基酸
采用上述接入主链第2个保护氨基酸同样方法，依次接入上述对应的第3～10个保护氨基酸，得含主链10个氨基酸的树脂。
2、粗品的制备
取上述肽树脂，加入体积比为TFA∶水∶EDT＝95∶5∶5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为粗品。
3、纯品的制备
取上述粗品，加水搅拌溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用。采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/ 水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，30mm*250mm的色谱柱流速为20mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得纯化中间体浓缩液；
纯化中间体浓缩液用0.45μm滤膜滤过备用，采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，30mm*250mm的色谱柱流速为20mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到纯品醋酸水溶液，冷冻干燥，得纯品4.1g，纯度为98.6％，总收率为42.3％。分子量为967.6(100％M+H)。
实施例2化合物2的制备
ρ-Glu-Leu-Ala-Gly-Ile-Gly-Ile-Leu-Thr-Val-Lys-OH
制备方法同实施例2，使用的保护氨基酸如下表：
接肽顺序n＝ 保护氨基酸
1 Fmoc-Lys(Boc)-Wang树脂
2 Fmoc-Thr(tBu)
3 Fmoc-Leu
4 Fmoc-Ile
5 Fmoc-Gly
6 Fmoc-Ile
7 Fmoc-Gly
8 Fmoc-Ala
9 Fmoc-Leu
10 ρ-Glu
得纯品4.7g，纯度为97.9％，总收率为42.9％。分子量为1095.6(100％M+H)。
实施例3化合物3的制备
ρ-Glu-Leu-Ala-Gly-Ile-Gly-Ile-Leu-Thr-Val- Lys(AEEA-AEEA-γGlu-18烷二酸))-OH
1、肽树脂的合成
使用Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂为载体树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与下表所示的保护氨基酸偶联，制得肽树脂。本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸如下所示：
接肽顺序n＝ 保护氨基酸
1 Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂
2 Fmoc-Val
3 Fmoc-Thr(tBu)
4 Fmoc-Leu
5 Fmoc-Ile
6 Fmoc-Gly
7 Fmoc-Ile
8 Fmoc-Gly
9 Fmoc-Ala
10 Fmoc-Leu
11 ρ-Glu
侧链-1 Fmoc-AEEA
侧链-2 Fmoc-AEEA
侧链-3 Fmoc-γGlu-OtBu
侧链-4 18烷二酸单叔丁酯
(1)接入主链第2个保护氨基酸
取0.03mol第2个保护氨基酸和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。
取0.01mol的Fmoc-Val-Wang树脂(取代值约0.5mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。
将活化后的第2个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，再加入0.003molDMAP/DMF溶液，偶联反应6小时，过滤洗涤，得含2个保护氨基酸的树脂。
(2)接入主链第3～11个保护氨基酸
采用上述接入主链第2个保护氨基酸同样方法，依次接入上述对应的第3～11个保护氨基酸，得含主链11个氨基酸的树脂。
(3)接入侧链第1个保护氨基酸
取0.03mol侧链第3个保护氨基酸和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03molDIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。
取2.5mmol四三苯基膦钯和25mmol苯硅烷，用适量二氯甲烷溶解，去保护4小时，过滤洗涤，得到去Alloc的树脂备用。
将加入活化后的侧链第1个保护氨基酸液加入到已去Alloc的树脂，偶联反应60～300 分钟，过滤洗涤，得含侧链第1个保护氨基酸的树脂。
(4)接入侧链第2～4个保护氨基酸
采用上述接入主链第2个保护氨基酸同样方法，依次接入侧链对应的第2～4个保护氨基酸和单保护脂肪酸，得到肽树脂。
2、粗品的制备
取上述肽树脂，加入体积比为TFA∶水∶EDT＝95∶5∶5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为粗品。
3、纯品的制备
取上述粗品，加水搅拌溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用。采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/ 水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，30mm*250mm的色谱柱流速为20mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得纯化中间体浓缩液；
纯化中间体浓缩液用0.45μm滤膜滤过备用，采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，30mm*250mm的色谱柱流速为20mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到纯品醋酸水溶液，冷冻干燥，得纯品6.1g，纯度为95.9％，总收率为33.7％。分子量为1811.2(100％M+H)。
实施例4化合物4的制备
ρ-Glu-Leu-Ala-Gly-Ile-Gly-Ile-Leu-Thr-Val- Lys(PEG5CH2CO-γGlu-18烷二酸))-OH
制备方法同实施例2，使用的保护氨基酸如下表：
接肽顺序n＝ 保护氨基酸
1 Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂
2 Fmoc-Val
3 Fmoc-Thr(tBu)
4 Fmoc-Leu
5 Fmoc-Ile
6 Fmoc-Gly
7 Fmoc-Ile
8 Fmoc-Gly
9 Fmoc-Ala
10 Fmoc-Leu
11 ρ-Glu
侧链-1 Fmoc-PEG<sub>5</sub>CH<sub>2</sub>COOH
侧链-2 Fmoc-γGlu-OtBu
侧链-3 18烷二酸单叔丁酯
得纯品6.5g，总收率为36.2％。分子量为1798.4(100％M+H)。
实施例3活性的测定
一、DC细胞的制备及刺激特异性T细胞活化增殖
1、PBMNCs细胞的制备
采用健康供者或多发性骨髓瘤患者的外周血作为标本，从中分离PBMNCs细胞，其中一部分冻存，留作之后的T细胞增殖环节的T细胞来源使用，另一部分进行体外培养、诱导形成DC细胞。
2、DC细胞的制备
首先把PBMNCs放置于平底培养瓶，于孵箱中培养2小时以使DC前体细胞充分粘附至培养瓶底壁，其后将悬浮细胞去除，保留贴壁粘附的细胞作为DC前体细胞，于含有 GM-CSF、IL-4的细胞培养基中培养6天，得到非成熟DC细胞(immature Dendritic cells，imDCs)，再将imDCs更换至含有IL-6、PGE2、TNF-α、IL-4及GM-CSF的细胞培养基中培养2天，同时将imDC分组，并分别予试验药物(5.08×10-9mol/ml)，2天后收集各组诱导形成的成熟DC。
3、DC刺激T细胞活化增殖
将成熟DC分别与等量同源的PBMNCs细胞共同培养9天，进行DC细胞刺激特异性T细胞活化增殖，收集各组T细胞。
二、T细胞相关指标检测
DC细胞刺激各组特异性T细胞活化、增殖过程结束后，将收集各组细胞并进行研究及比较各组：
1、CD8+T/CTL细胞活性
细胞毒性物质颗粒酶B的分泌水平，采用ELISA法检测。
经各组不同方式处理后，通过流式细胞分选法或免疫磁珠分离法分离出的CD3+CD8+T细胞，将与加载了抗原多肽的T2细胞共同孵育在适当体积的培养基中48小时。其中作为效应性T细胞的CD3+CD8+T细胞与作为靶细胞提呈抗原多肽的T2细胞的比例为 1∶5。T2细胞将会被事先与10μg/ml的试验药物共孵育以获得加载了抗原多肽的T2细胞。之后，上述细胞培养体系的上清液将被收集，其中分泌的颗粒酶B(Granzyme B)将采用ELISA 法定量检测。各组DC细胞与MNCs共培养刺激其中的T细胞活化增殖的培养体系上清液亦将被收集并采用ELISA法定量检测其中T细胞活性相关因子颗粒酶B的分泌释放水平。具体说来，上述检测的因子的特异性单克隆抗体将预先包被在一个ELISA用96孔板上。在阻断非特异性结合与洗涤的步骤之后，对照的重组蛋白或样本将被加入到板孔中，任何存在的细胞因子将与固定于孔底膜上的抗体结合，在洗涤以移除未结合的物质之后，一个对需检测的因子特异性的酶联单克隆抗体被加入孔中。在洗涤以移除任何未结合的酶联抗体试剂之后，底物溶液被加入孔中，导致了依据所需检测因子比例及量不同而展现出的不同程度的显色，颜色的密度由相应的ELISAReader与相应的软件在所选择的适当波长下进行检测与数据分析。
刺激出T细胞活性物质颗粒酶B的测定
Figure BSA0000190780880000091
Figure BSA0000190780880000101
2、特异性CD8+T/CTL细胞对表达HLA-A2及靶抗原HM1.24的人骨髓瘤U266细胞的特异性裂解杀伤效应
采用LDH法检测，同时设立无关肿瘤细胞HepG2细胞组进行实验，以作为CTL对骨髓瘤细胞特异性杀伤的对照
按效靶比40∶1将每组效应细胞(DC+PBMNCs共孵育9天后刺激形成的细胞)与靶细胞(HLA-A2+/HM1.24+的U266人多发性骨髓瘤细胞系)混合加入96孔板，同时设靶细胞最大释放、自然释放、培养液空白对照和体积纠正对照，37℃、5％CO2孵箱培养5h。在培养结束前45min，在靶细胞最大释放组和体积纠正对照组每孔加入NP40溶解液20μl。每孔吸出50μl上清转移入另一96孔板，每孔加底物重溶液50μl，避光室温孵育30min，加入50μl终止液，测490nm处的A值，按下列公式计算杀伤活性。同理设CTL对无关肿瘤细胞HepG2的裂解杀伤作用的检测组，以作为CTL特异性杀伤的对照。
Figure BSA0000190780880000102
对人骨髓瘤U266细胞的杀伤率
Figure BSA0000190780880000103
3、活化的特异性CD8+T/CTL细胞的数目
通过免疫磁珠法分离出各组CD8+T细胞，用IFN-γELISpot法检测。
各组增殖活化后的CD8+T细胞将被分选，与作为靶细胞的已加载了抗原多肽的T2细胞共培养以再次刺激之后，用ELISpot方法检测分泌IFN-γ的活化的抗骨髓瘤特异性CTL细胞数目。用IFN-γ捕获抗体5mg/L包被96孔PVDF滤膜板，4℃过夜。次日用不含血清RPMI1640洗2遍，后用含100mL/L FCS的RPMI1640液封闭，200μL/孔，室温2h；制备CD8+T细胞悬液，调整细胞密度为2×105/L，100μL/孔，加入板内；加入作为靶细胞的已负载抗原多肽的T2细胞，调整细胞密度为1×106/L，100μL/孔，每组3个复孔，同时设完全培养基阴性对照，37℃、5％CO2孵育48h。洗板，拍干后，每孔加入1mg/L生物素化IFN-γ检测抗体100μL，室温孵育2h；洗板拍干后，加入HRP-链霉亲和素100μL/ 孔，室温孵育1h；加入AEC底物显色，室温避光静置15-45min，待斑点形成适合的大小后，自来水冲洗以终止显色过程，晾干，ELISpot自动读板仪计数。
活化的抗原特异性T细胞数目
Figure BSA0000190780880000111
/>

Claims (3)

1.一种结构I所示的化合物：
ρ-Glu-Leu-Ala-Gly-Ile-Gly-Ile-Leu-Thr-Val-Lys(PEG5CH2CO-γGlu-18烷二酸)-OH
（I）。
2.一种权利要求1所述的化合物所成的可药用的盐。
3.一种权利要求1所述的化合物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的用途。
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