CN110573607B - 多能干细胞测定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测从多能干细胞(PSC)分化的细胞培养物中残留的未分化PSC的方法，该方法包括：在涂覆有层粘连蛋白‑521和E‑钙粘蛋白的基底上在包含ROCK抑制剂的培养基中培养该细胞；对所培养的细胞中残留的未分化PSC的标记物的表达进行定量；并且将在所培养的细胞中的该标记物表达与在包含已知比例的PSC的参比细胞培养物中的标记物表达进行比较，其中该细胞培养物中的标记物表达低于该参比细胞培养物中的标记物表达表明所培养的细胞中不存在残留的未分化PSC或者所培养的细胞中残留的未分化PSC的存在比例低于在该参比细胞培养物中PSC的该已知比例。本发明还涉及一种用于制造治疗组合物的方法和一种用于治疗或预防受试者的病症的方法。

Description

多能干细胞测定
技术领域
本发明涉及一种用于检测从多能干细胞(PSC)分化的细胞培养物中残留的未分化PSC的方法。
背景技术
多能干细胞(PSC)(特别地人PSC)，其包括胚胎干细胞(ESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)，提供了开发新的基于细胞的治疗产品的机会。
iPSC的分化衍生物在多种疾病应用(例如肝硬化、帕金森病、年龄相关的黄斑变性、心脏局部缺血、糖尿病、移植物抗宿主病)中具有治疗功效。
然而，包含PSC衍生细胞的治疗组合物在临床试验中的使用提出了若干挑战，特别地在最终产品中存在残留的未分化PSC(其具有已知的肿瘤形成潜力)。这样的挑战尤其与需要高剂量的分化的PSC衍生细胞的疗法有关。
因此，需要用于检测从PSC衍生细胞培养物中残留的未分化PSC的方法或改进的方法，以用于当生产包含PSC衍生细胞的治疗组合物时的质量控制中。
本说明书中提及的任何出版物均通过引用并入本文。但是，如果本文提及任何出版物，则这一参考并不构成承认该出版物构成澳大利亚或任何其他国家的本领域的一般常识的一部分。
发明内容
诸位发明人已经通过开发用于检测PSC衍生细胞培养物中残留的未分化PSC的方法，解决了在制造包含PSC衍生细胞的治疗组合物中的质量控制的这种需要。该方法依赖于扩增单一化的未分化PSC的细胞培养方案，以增加对残留的未分化PSC的灵敏性(真阳性)和特异性(真阴性)。
因此，第一方面提供了用于检测从PSC分化的细胞培养物中残留的未分化的多能干细胞(PSC)的方法，该方法包括：
在涂覆有层粘连蛋白-521和E-钙粘蛋白的基底上在包含Rho关联的含卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)抑制剂的培养基中培养该细胞；
对所培养的细胞中残留的未分化PSC的标记物的表达进行定量；并且
将在所培养的细胞中的该标记物表达与在包含已知比例的PSC的参比细胞培养物中的标记物表达进行比较，
其中该细胞培养物中的标记物表达低于该参比细胞培养物中的标记物表达表明所培养的细胞中不存在残留的未分化PSC或者所培养的细胞中残留的未分化PSC的存在比例低于在该参比细胞培养物中PSC的该已知比例。
诸位发明人提出这一方法提供了改进的质量控制手段，并且是依赖于PSC衍生细胞的疗法的安全性和因此先进性的重要贡献。
因此，在一个实施方案中，该方法进一步包括将其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例的细胞培养物配制成治疗组合物。该方法可以进一步包括通过向受试者给予治疗组合物来治疗或预防该受试者的病症。
第二方面提供了用于制造治疗组合物的方法，该方法包括将细胞(其中当通过第一方面的方法检测时残留的未分化PSC不存在或低于已知比例)的培养物配制成组合物(用于向受试者治疗性给予)。
第三方面提供了用于治疗或预防受试者的病症的方法，该方法包括向受试者给予：
其中当通过第一方面的方法检测时残留的未分化PSC不存在或低于已知比例的细胞培养物；或
当通过第二方面的方法制造时的治疗组合物。
第三方面的替代性形式提供了其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例的细胞培养物在制造用于治疗或预防受试者的病症的药物(如治疗组合物)中的用途，其中在从PSC分化的细胞培养物中残留的未分化PSC通过第一方面的方法进行检测。
第三方面的另一种替代性形式提供：
其中当通过第一方面的方法检测时残留的未分化PSC不存在或低于已知比例的细胞培养物；或
当通过第二方面的方法制造时的治疗组合物，
用于在治疗或预防受试者的病症中使用。
将要预防或治疗的病症可能是骨囊肿、骨肿瘤、骨折、软骨缺损、骨关节炎、韧带损伤、成骨不全、骨坏死、骨质疏松症、再生障碍性贫血、移植物抗宿主病(GvHD)、骨髓增生异常综合症、1型糖尿病、2型糖尿病、自身免疫性肝炎、肝硬化、肝功能衰竭、扩张型心肌病、心力衰竭、心肌梗死、心肌缺血、克罗恩病、溃疡性结肠炎、灼伤、大疱性表皮松解症、红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、系统性硬化症、支气管肺发育异常、慢性阻塞性气道疾病、肺气肿、肺纤维化、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默病、脑损伤、共济失调、退行性椎间盘疾病、多系统萎缩症、多发性硬化症、帕金森病、视网膜色素变性、罗姆伯格病(Romberg’s disease)、脊髓损伤、卒中、肌肉营养不良、肢体缺血、肾损伤、狼疮性肾炎、子宫内膜异位以及骨髓或实体器官移植并发症。
第四方面提供了用于检测从PSC分化的细胞培养物中残留的未分化PSC的试剂盒，该试剂盒包含：
层粘连蛋白-521；和
E-钙粘蛋白；和
ROCK抑制剂。
在一个实施方案中，该试剂盒根据第一方面的方法使用。
附图说明
图1是人层粘连蛋白-521α链的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
图2是人层粘连蛋白-521β链的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图3是人层粘连蛋白-521γ链的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
图4是人E-钙粘蛋白的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图5是人LIN28(LIN28A)的示例性编码核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。
图6是人OCT4(POU5F1)的示例性编码核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。
图7是人SOX2的示例性编码核苷酸序列(SEQ ID NO:7)。
图8是人FOXD3的示例性编码核苷酸序列(SEQ ID NO:8)。
图9是人NANOG的示例性编码核苷酸序列(SEQ ID NO:9)。
图10是人PODXL的示例性编码核苷酸序列(SEQ ID NO:10)。
图11是人REX1(ZFP42)的示例性编码核苷酸序列(SEQ ID NO:11)。
图12是人SSEA1(FUT4)的示例性编码核苷酸序列(SEQ ID NO:12)。
图13是人DPPA2的示例性编码核苷酸序列(SEQ ID NO:13)。
图14是人DPPA3的示例性编码核苷酸序列(SEQ ID NO:14)。
具体实施方式
本文公开了一种用于检测从PSC衍生细胞培养物中残留的未分化PSC的方法，其中该PSC衍生细胞旨在用于治疗性给予至受试者。因此，本发明提供了改进的质量控制和风险最小化(例如，来自此类残留的未分化PSC的肿瘤形成的风险)的方法。
该方法依赖于在支持PSC克隆生长的条件下扩增未分化PSC的特定培养条件，然后对基因(其在PSC中高度表达但在已经历分化的PSC衍生细胞中不表达或仅以最低水平表达)的表达进行定量。培养条件可以选择性地支持PSC在单细胞水平上的扩增。在一个实施方案中，PSC可以在支持从单细胞悬浮液的PSC生长的条件下培养。此类培养条件是本领域已知的并且包括如本文所述的层粘连蛋白-521和E-钙粘蛋白，以及可商购获得的系统，该系统包括Cellartis iPSC单细胞克隆DEF-CS培养基试剂盒、GibcoTMStemFlexTM培养基、和与在玻连蛋白上的单细胞生长相结合的PluriQTMG9TM克隆培养基。
在测试培养物中的标记物表达等于或低于在具有已知比例的未分化PSC的参比培养物中的标记物表达表明测试培养物包含比参比培养物更低比例的未分化PSC。
重要的是，该方法可以检测以低的总细胞数比例(例如0.001％或10ppm)存在于PSC衍生细胞的培养物中残留的未分化PSC。
除非在本说明书中另外定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义，并且参考已出版的文本。
应当注意的是，术语“一个”或“一种”是指一个/种或多个/种，例如，“一个分子”应当理解为代表一个或多个分子。因此，术语“一个/一种(a或an)”、“一个/一种或多个/多种(one or more)”以及“至少一个/一种(at least one)”在本文中可以互换使用。
在本发明的随附权利要求书和描述中，除了除了除非由于表达语言或必要的暗示而使上下文另外要求之外，词语“包含(comprise)”或变化如“包含(comprises或comprising)”是以包括意义使用的，即用于指明在本发明的各种实施方案中存在所陈述的特征但是不排除存在或加入另外的特征。
如本文所用的术语“约”考虑了给定数字的一系列值(该数字的±25％大小)。在其他实施方案中，术语“约”考虑了给定数字的一系列值(该数字的±20％、±15％、±10％或±5％大小)。例如，在一个实施方案中，“约3克”表示2.7克至3.3克的值(即3克±10％)等。
类似地，在其他实施方案中，时间段可以在该时间段的±25％、±20％、±15％、±10％或±5％之间变化。例如，“一天”可以包括约18小时至约30小时的时段。表示多天时段的时间段可以是“一天”的倍数，例如，两天可以跨越约36小时至约60小时的时段等。在其他实施方案中，时间变化可以被减少，例如，其中：第1天是从第0天起24±3小时；第2天是从第0天起48±3小时；第3天是从第0天起72±3小时；第4天是从第0天起96±3小时；第5天是从第0天起120小时±3小时，依此类推。在一些实施方案中，约3天是3天±1天，并且约5天是5天±1天。
如本文所用，“多能干细胞”或“PSC”是指具有无限繁殖其自身并分化成任何其他细胞类型的能力的细胞。存在两种主要类型的多能干细胞：胚胎干细胞(ESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)。
如本文所用，“胚胎干细胞”或“ESC”是指从已经完成体外受精疗法并且具有多余胚胎的患者同意捐献的五至七日龄胚胎中分离的细胞。ESC的使用在某种程度上受到关于从人类胚胎中提取细胞的伦理问题的阻碍。
适合用于制造治疗组合物的人PSC包括H1和H9人ESC。
如本文所用，“诱导的多能干细胞”或“iPSC”是指从成体细胞衍生的ESC样细胞。iPSC具有与ESC非常相似的特征，但避免了与ESC相关的伦理问题，因为iPSC不是衍生自胚胎。相反，iPSC通常衍生自完全分化的成体细胞，该成体细胞已被“重新编程”回到多能状态。
适合用于制造治疗组合物的人iPSC包括但不限于从纤维母细胞衍生的iPSC 19-9-7T、MIRJT6i-mND1-4和MIRJT7i-mND2-0、以及从骨髓单核细胞衍生的iPSC BM119-9。其他合适的iPSC可以从美国威斯康星州麦迪逊(Madison,WI,USA)的Cellular DynamicsInternational(CDI；Nasdaq：ICEL)获得。
如本文所用，“分化”是指细胞从一种细胞类型变为另一种细胞类型的过程，特别地是细胞的不太特化的类型变成细胞的更特化的类型。
如本文所用，术语“从……衍生”可以涵盖将PSC“分化”成另一种细胞类型。
因此，“未分化PSC”是尚未分化成另一种细胞类型的PSC。关于本公开文本，未分化PSC存在于以其他方式分化的PSC的群体内。
如本文所用，“培养基(medium)”或其复数“培养基(media)”是指设计用于支持细胞的生长(包括扩增和分化)的液体或胶体。细胞在体外的这种生长(包括扩增和分化)被称为“培养”细胞或细胞“培养”。
然而，由于毒性代谢物浓度增加、营养素浓度降低、以及对于分裂细胞的细胞数量增加，细胞不能无限地保持在培养物中。如本文所用，“传代”是指用与原始培养物相比更新的营养素浓度、没有毒性代谢物和任选地更低的细胞密度产生新的细胞培养物的过程。
细胞培养物(例如将要通过本发明方法测试的PSC衍生细胞培养物)的传代次数，可以是1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、21次、22次、23次、24次、或25次。优选地，传代次数是10次或更少次。更优选地，传代次数是5次或6次。在一个实施方案中，PSC衍生细胞在经历本发明方法之前已经历了5次传代。
在一个实施方案中，PSC衍生细胞是间充质干(或基质)细胞(MSC)。
在一个实施方案中，ESC衍生细胞是MSC。
在优选的实施方案中，iPSC衍生细胞是MSC，其也可以被称为iPSC-MSC。
如本文所用，“间充质干细胞”或“MSC”是指可以从各种组织(包括骨髓、脂肪组织(脂肪)、胎盘和脐带血)中分离的特定干细胞类型。MSC可以分化成骨细胞(bone cell或osteocyte)、软骨细胞(cartilage cell或chondrocyte)、脂肪细胞(fat cell或adipocyte)和其他种类的结缔组织细胞(如肌腱中的那些)。
根据本公开文本，MSC可以经由具有间充质母细胞(MCA)潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞从PSC形成。“具有间充质母细胞(MCA)潜能的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞”是指表达典型的原条和侧板/胚胎外中胚层基因的细胞。这些细胞具有响应于FGF2在无血清培养基中形成间充质母细胞(MCA)和成血管细胞集落的潜能。术语EMHlin-表示缺乏CD31、VE-钙粘蛋白内皮标记物、CD73和Cd105间充质/内皮标记物以及CD43和CD45造血谱系标记物的表达。
如本文所用，“间充质(mesenchyme或mesenchymal)”是指衍生自中胚层并且分化成造血组织(淋巴和循环系统)以及结缔组织(如骨和软骨)的胚胎结缔组织。然而，MSC不分化成造血细胞。
MSC分泌生物活性分子，如细胞因子、趋化因子和生长因子，并且具有调节免疫系统的能力。已显示MSC促进再生和对免疫系统产生影响而不依赖于移植。换言之，MSC本身可能不一定会被纳入宿主中-相反，它们可能发挥它们的作用并且然后在短时期内被消除。然而，MSC在给予和迁移之后可以被移植到受损组织中。
MSC目前正处于用于治疗各种病症、疾病和失调(包括移植物抗宿主病)的临床试验中。
MSC特别地通过抑制T细胞来发挥免疫调节/免疫抑制作用的能力被认为是MSC在各种病症、疾病和失调(包括移植物抗宿主病、免疫失调(包括自身免疫失调)、心血管机能失调、矫形外科失调和移植实体器官的排斥)中发挥治疗效果的核心。一些具体的例子包括骨囊肿、骨肿瘤、骨折、软骨缺损、骨关节炎、韧带损伤、成骨不全、骨坏死、骨质疏松症、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症、1型糖尿病、2型糖尿病、自身免疫性肝炎、肝硬化、肝功能衰竭、扩张型心肌病、心力衰竭、心肌梗死、心肌缺血、克罗恩病、溃疡性结肠炎、灼伤、大疱性表皮松解症、红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、系统性硬化症、支气管肺发育异常、慢性阻塞性气道疾病、肺气肿、肺纤维化、ALS、阿尔茨海默病、脑损伤、共济失调、退行性椎间盘疾病、多系统萎缩症、多发性硬化症、帕金森病、视网膜色素变性、罗姆伯格病(Romberg’s disease)、脊髓损伤、卒中、肌肉营养不良、肢体缺血、肾损伤、狼疮性肾炎、子宫内膜异位以及骨髓或实体器官移植并发症。
MSC被认为在损伤愈合中发挥关键作用，并且已被证明可有效治疗如下中的组织损伤和退行性疾病，包括在消化性系统中(例如在肝硬化和肝功能衰竭中)、在肌肉骨骼系统中、在牙周组织中、在糖尿病严重肢体缺血中、在骨坏死中、在灼伤相关失调中、在心肌梗死中、在角膜损伤中、在脑中、在脊髓中、在肺部中、和在治疗辐射暴露中。
MSC在免疫失调(包括移植物抗宿主病)、系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩病、多系统萎缩症、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症和卒中中已显示出治疗效果。
已显示MSC对T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞发挥免疫抑制活性。虽然不希望受理论束缚，但潜在的机制可能包括免疫抑制介质，例如一氧化氮、吲哚胺2,3-双加氧酶、前列腺素E2、肿瘤坏死因子诱导基因6蛋白、CCL-2、和程序性死亡配体1。这些介质以低水平表达直至被例如炎症性细胞因子如IFNγ、TNFα和IL-17刺激。
iPSC衍生的MSC(iPSC-MSC)与直接来源的MSC(即衍生自诸如骨髓、脐带血、脂肪组织等组织)相比具有独特的优势，因为iPSC的体外扩增可以提供几乎无限的MSC供应。
可以根据实施例1生产iPSC-MSC。
PSC能够分化成内胚层、外胚层和中胚层中的任何一种的任何细胞类型。PSC经历分化成多能祖细胞，该多能祖细胞进一步分化成功能细胞。因此，以上对MSC的描述是示例性的并且不应被解释为限制，并且PSC衍生细胞的其他例子可以包括：造血干细胞，其产生所有类型的血细胞，包括红细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、和血小板；脑中的神经干细胞，其产生三种主要细胞类型：神经细胞(神经元)和两大类非神经细胞(星形胶质细胞和少突胶质细胞)；消化道内层中的上皮干细胞，其产生吸收细胞、杯状细胞、Paneth细胞和肠内分泌细胞；以及皮肤干细胞，其出现在表皮基底层时产生角质细胞，并且出现在毛囊的基部时产生毛囊和表皮两者。
如本文所用，“基底”是适合用于培养PSC和/或从PSC衍生细胞的任何材料。例子包括塑料培养器皿，如培养皿、多孔板和烧瓶。
本文描述的所有蛋白质是本领域技术人员已知的并且可商购获得。
层粘连蛋白-521是由人PSC分泌的异源三聚体蛋白。层粘连蛋白-521包含五个α链、两个β链和一个γ链(即α5β2γ1)。在一个实施方案中，该α链、该β链和该γ链分别具有SEQ ID NO:1、2和3(图1、2和3)所呈现的氨基酸序列。
E-钙粘蛋白是与上皮细胞功能相关的钙依赖性细胞粘附蛋白。在一个实施方案中，人E-钙粘蛋白具有SEQ ID NO:4(图4)所呈现的氨基酸序列。
在执行本发明方法时，可以将基底使用约0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、或10μg/mL，和/或约0.1μg/cm2、0.2μg/cm2、0.3μg/cm2、0.4μg/cm2、0.5μg/cm2、0.6μg/cm2、0.7μg/cm2、0.8μg/cm2、0.9μg/cm2、1μg/cm2、2μg/cm2、3μg/cm2、4μg/cm2、5μg/cm2、6μg/cm2、7μg/cm2、8μg/cm2、9μg/cm2、或10μg/cm2的层粘连蛋白-521涂覆。
可以将基底使用约0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、或10μg/mL，和/或约0.01μg/cm2、0.05μg/cm2、0.1μg/cm2、0.2μg/cm2、0.25μg/cm2、0.3μg/cm2、0.4μg/cm2、0.5μg/cm2、0.6μg/cm2、0.7μg/cm2、0.8μg/cm2、0.9μg/cm2、1μg/cm2、2μg/cm2、3μg/cm2、4μg/cm2、5μg/cm2、6μg/cm2、7μg/cm2、8μg/cm2、9μg/cm2、或10μg/cm2的E-钙粘蛋白涂覆。
在优选的实施方案中，将基底使用10μg/mL和2μg/cm2的层粘连蛋白-521以及使用1.1μg/mL和0.22μg/cm2的E-钙粘蛋白涂覆。
Rho关联的含卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)主要涉及通过作用于细胞骨架来调节细胞的形状和运动。因此，“ROCK抑制剂”抑制这一功能，并且出于本发明的目的，“ROCK抑制剂”增强iPSC的存活。
在一个实施方案中，ROCK抑制剂是Y27632(目录号：129830-38-2)。可以用于本发明方法中的ROCK抑制剂的其他例子是AS 1892802(目录号：928320-12-1)、Fasudil盐酸盐(目录号：105628-07-7)、GSK 269962(目录号：850664-21-0)、GSK 429286(目录号：864082-47-3)、H 1152二盐酸盐(目录号：871543-07-6)、Glycyl-H 1152二盐酸盐(目录号：913844-45-8)、HA1100盐酸盐(目录号：155558-32-0)、OXA06二盐酸盐、RKI 1447二盐酸盐、SB772077B二盐酸盐(目录号：607373-46-6)、SR 3677二盐酸盐(目录号：1072959-67-1)、和TC-S 7001(目录号：867017-68-3)。
其中培养细胞的ROCK抑制剂浓度可以是例如约0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、或100μM。
优选地，ROCK抑制剂是Y27632，并且其中培养细胞的Y27632浓度是约10μM。
根据本发明方法，为了在涂覆有层粘连蛋白-521和E-钙粘蛋白(E-cadherin)的基底上在包含Rho关联的含卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)抑制剂的培养基中培养细胞，必须将细胞接种在该基底上。在基底上的细胞接种密度可以是约1x102个细胞/cm2、2x102个细胞/cm2、3x102个细胞/cm2、4x102个细胞/cm2、5x102个细胞/cm2、6x102个细胞/cm2、7x102个细胞/cm2、8x102个细胞/cm2、9x102个细胞/cm2、1x103个细胞/cm2、2x103个细胞/cm2、3x103个细胞/cm2、4x103个细胞/cm2、5x103个细胞/cm2、6x103个细胞/cm2、7x103个细胞/cm2、8x103个细胞/cm2、9x103个细胞/cm2、1x104个细胞/cm2、2x104个细胞/cm2、3x104个细胞/cm2、4x104个细胞/cm2、5x104个细胞/cm2、6x104个细胞/cm2、7x104个细胞/cm2、8x104个细胞/cm2、9x104个细胞/cm2、1x105个细胞/cm2、2x105个细胞/cm2、3x105个细胞/cm2、4x105个细胞/cm2、5x105个细胞/cm2、6x105个细胞/cm2、7x105个细胞/cm2、8x105个细胞/cm2、9x105个细胞/cm2、1x106个细胞/cm2、2x106个细胞/cm2、3x106个细胞/cm2、4x106个细胞/cm2、5x106个细胞/cm2、6x106个细胞/cm2、7x106个细胞/cm2、8x106个细胞/cm2、9x106个细胞/cm2。在一些实施方案中，接种密度可以是约1.1x104个细胞/cm2、1.2x104个细胞/cm2、1.3x104个细胞/cm2、1.4x104个细胞/cm2、1.5x104个细胞/cm2、1.6x104个细胞/cm2、1.7x104个细胞/cm2、1.8x104个细胞/cm2、或1.9x104个细胞/cm2。在优选的实施方案中，接种密度是约1.3x104个细胞/cm2。
作为本发明方法的一部分，可以在对所培养的细胞中的标记物表达进行定量之前，将细胞培养约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更长时间。优选地，在对所培养的细胞中的标记物表达进行定量之前，将细胞培养约5天。
作为本发明方法的一部分，可以在对所培养的细胞中的标记物表达进行定量之前，将细胞在ROCK抑制剂的存在下培养约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更长时间。
在ROCK抑制剂的存在下培养细胞之后，可以在对所培养的细胞中的标记物表达进行定量之前，将细胞在ROCK抑制剂不存在的情况下进一步培养。在一个实施方案中，在对所培养的细胞中的标记物表达进行定量之前，将细胞在ROCK抑制剂不存在的情况下进一步培养约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更长时间。
在优选的实施方案中，在对所培养的细胞中的标记物表达进行定量之前，将细胞在ROCK抑制剂的存在下培养约3天，然后在ROCK抑制剂不存在的情况下进一步培养约2天。
总之，已经证明在涂覆有层粘连蛋白-521和E-钙粘蛋白的基底(如塑料培养器皿)上扩增PSC衍生细胞(如MSC)支持在PSC衍生细胞的群体内停留的单一化的未分化PSC的扩增，然而同时，ROCK抑制剂增强PSC的存活。
如本文所用，“标记物表达”是指在残留的未分化PSC中表达但在PSC衍生细胞中不表达或仅以较低水平表达的基因。这样的基因可以是编码的或非编码的，例如mRNA、微小RNA或非编码RNA。
其表达可以根据本发明方法定量的标记物包括LIN28(LIN28A)、OCT4(POU5F1)、SOX2、FOXD3、NANOG、PODXL(其蛋白质同种型通过抗体TRA-1-60和TRA-1-81检测)、REX1(ZFP42)、SSEA1(FUT4)、SSEA4、DPPA2和DPPA3。优选地，标记物表达是LIN28表达。LIN28基因编码LIN28蛋白，该LIN28蛋白是促进PSC的多能性并且在PSC中高度表达、但响应于分化而被下调的一种RNA结合蛋白。
可以将“标记物表达”定量为蛋白质或mRNA表达。优选地，将标记物表达定量为mRNA表达。
标记蛋白可以通过涉及凝胶电泳(例如Western印迹或二维凝胶电泳)、光密度测定法、荧光、发光、放射性、阵列和/或质谱法的过程来定量。
标记mRNA可以通过涉及凝胶电泳(例如Northern印迹)、光密度测定法、荧光、发光、放射性、阵列和/或聚合酶链式反应(PCR)的过程来定量。PCR通常依赖于逆转录以从标记mRNA产生标记cDNA。
优选地，使用PCR对标记物表达进行定量。优选地，使用定量逆转录PCR(qRT-PCR)对标记物表达进行定量。优选地，qRT-PCR是实时qRT-PCR，其中mRNA被逆转录成cDNA模板，并且该cDNA模板指数地扩增并以实时的方式通过荧光定量。
定量标记物表达可以是相对的或绝对的。
在一个实施方案中，定量标记物表达是相对的并且依赖于测量定量循环(Cq)，该定量循环是荧光信号越过qRT-PCR测定的阈值的循环。Cq与mRNA表达成反比。
标记物表达的相对定量依赖于测试细胞培养物中的标记物表达与在一种或多种参比培养物(即对照)中的标记物表达的比较。
“参比培养物”可以是阳性对照或阴性对照。当参比培养物是阳性对照时，参比细胞培养物包含PSC。优选地，这样的参比培养物包含已知比例的PSC。也就是说，参比培养物用已知比例的未分化PSC“加标”，从而使得能够进行测试培养物与参比培养物之间的比较。在这一实施方案中，定量可以是相对的(例如使用Cq作为定量的单元)和绝对的(例如将Cq应用于已知量)。这也可以被称为半定量的。因此，正在被测试的细胞培养物中的标记物表达低于参比细胞培养物中的标记物表达表明所培养的细胞中不存在残留的未分化PSC。可替代地，正在被测试的细胞培养物中的标记物表达低于参比细胞培养物中的标记物表达表明所培养的细胞中存在残留的未分化PSC，但存在的比例低于参比细胞培养物中的PSC的已知比例。
参比培养物中的PSC的已知比例可以是细胞总数的0.000001％、0.000005％、0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、或0.01％。在优选的实施方案中，参比培养物中的PSC的已知比例是细胞总数的0.001％。
在一些实施方案中，标记物表达是“归一化的”，其补偿动力学内和动力学间的变化(样品与样品之间的变化以及运行与运行之间的变化)。当使用qRT-PCR对基因表达进行定量时，归一化数据特别有用。不同的归一化方法对于本领域技术人员而言是已知的，包括归一化至一种或多种不受调节的或组成型“管家”基因，例如GAPDH、ACTB、LDHA、NONO、PGK1或PPIH，以及归一化至总RNA。在一个实施方案中，将标记物表达归一化至GAPDH表达。
PCR需要核苷酸引物。本领域技术人员将理解如何设计用于PCR和qRT-PCR的引物，以及用于qRT-PCR的引物/探针组合。一些基因的引物是可商购获得的。一些基因的引物/探针组合也是可商购获得的。例如，以下基因表达测定是可商购获得的，全部都具有目录号4331182：人LIN28(LIN28A)测定Hs00702808_s1；人OCT4(POU5F1)测定Hs04260367_gH；人SOX2 Hs01053049_s1；人FOXD3测定Hs00255287_s1；人NANOG测定Hs04399610_g1；人PODXL(其蛋白质同种型通过抗体TRA-1-60和TRA-1-81检测)测定Hs01574644；人REX1(ZFP42)测定Hs01938187_s1；人SSEA1(FUT4)测定Hs01106466_s1；人DPPA2测定Hs00414515_m1和人DPPA3测定Hs01931905_g1。
本领域技术人员可以使用在线工具容易地设计引物或者引物/探针组合，例如，引物/探针组合可以使用工具如Custom测定设计工具或GenScript Real-timePCR/>引物设计工具来进行定制设计。引物可以使用工具如Primer3Plus或PrimerQuest工具来设计。这些工具仅是例子，并且本领域技术人员可容易地获得更多的工具。
可替代地或另外地，可以从第一原理(其包括以下考虑因素)容易地设计引物或者引物/探针组合。
PCR涉及如下的循环：使双链靶DNA变性；使引物与单链DNA的互补区域退火；通过DNA聚合酶的作用延伸DNA；并且重复，通常持续约50个循环。这些步骤对温度敏感，并且通常分别在94℃、60℃和70℃下进行。良好的引物设计对于成功反应至关重要。重要的设计考虑因素包括：
1.引物长度，通常为18-22bp；
2.引物熔解温度(Tm)，通常在52℃-58℃范围内；
3.引物退火温度(Ta)；
4.GC含量，通常为40％-60％；
5.GC夹(GC clamp)，即位于引物3'末端最后5个碱基内的G或C碱基；
6.引物和模板二级结构，即分子间或分子内相互作用，例如发夹、自身二聚体或交叉二聚体；
7.二核苷酸重复；
8.单个碱基的长串联重复(long run)；
9. 3'端稳定性；
10.交叉同源性/特异性；
11.扩增子长度，qRT-PCR通常为约100bp，以及标准PCR通常为约500bp；
12.产物的Tm；
13.引物对Tm，通常<5℃。
引物Tm可以如下进行计算：
Tm(K)＝{ΔH/ΔS+R ln(C)}，或Tm(℃)＝{ΔH/ΔS+R ln(C)}-273.15，其中
ΔH(千卡/摩尔)：H是焓，并且ΔH是焓的变化。
ΔS(千卡/摩尔)：S是熵，并且ΔS是熵的变化。
ΔS(盐校正)＝ΔS(1M NaCl)+0.368x N x ln([Na+])，其中
N是引物中核苷酸对的数目(引物长度-1)
[Na+]是以mM计的盐当量
[Na+]计算：
[Na+]＝单价离子浓度+4x Mg2+
引物Ta可以如下进行计算：
Ta＝0.3x Tm(引物)+0.7Tm(产物)–14.9
人LIN28(LIN28A)、人OCT4(POU5F1)、人SOX2、人FOXD3、人NANOG、人PODXL、人REX1(ZFP42)、人SSEA1(FUT4)、人DPPA2和人DPPA3的编码核苷酸序列的例子分别提供在图5至14和SEQ ID NO:5至14中。本领域技术人员可以使用这些序列来设计引物以及引物/探针组合。
qRT-PCR依赖于荧光来对基因表达例如标记物表达进行定量。这样的荧光可以包括(1)嵌入任何双链DNA(即扩增的PCR产物)的非特异性荧光染料，或(2)仅在探针与其互补序列杂交之后发荧光的标记有荧光报告基因的序列特异性寡核苷酸探针。第一种类型的荧光的一个例子是Green(目录号163795-75-3)。通常，第二种类型包含共价附接到探针3'末端的淬灭剂，该淬灭剂将荧光报告基因淬灭直到在扩增期间淬灭剂从探针中释放出来。
在一个实施方案中，用于检测在从本文公开的PSC分化的细胞培养物中残留的未分化PSC的方法可以进一步包括产生报告在PSC衍生细胞培养物中检测到的残留的未分化PSC的比例的报告。
在一个实施方案中，用于检测在从本文公开的PSC分化的细胞培养物中残留的未分化PSC的方法可以进一步包括将PSC衍生细胞(其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例)的培养物配制成用于向受试者给予的治疗组合物。该方法可以进一步包括通过向受试者给予PSC衍生细胞(其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例)的培养物或包含此类PSC衍生细胞的治疗组合物来治疗或预防受试者的病症。该病症可能是骨囊肿、骨肿瘤、骨折、软骨缺损、骨关节炎、韧带损伤、成骨不全、骨坏死、骨质疏松症、再生障碍性贫血、移植物抗宿主病(GvHD)、骨髓增生异常综合症、1型糖尿病、2型糖尿病、自身免疫性肝炎、肝硬化、肝功能衰竭、扩张型心肌病、心力衰竭、心肌梗死、心肌缺血、克罗恩病、溃疡性结肠炎、灼伤、大疱性表皮松解症、红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、系统性硬化症、支气管肺发育异常、慢性阻塞性气道疾病、肺气肿、肺纤维化、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默病、脑损伤、共济失调、退行性椎间盘疾病、多系统萎缩症、多发性硬化症、帕金森病、视网膜色素变性、罗姆伯格病(Romberg’s disease)、脊髓损伤、卒中、肌肉营养不良、肢体缺血、肾损伤、狼疮性肾炎、子宫内膜异位以及骨髓或实体器官移植并发症。
如本文所用，术语“病症”包括病症、疾病或失调、及其症状。
如本文所用，术语“治疗组合物”是指如本文所述的已经配制用于向受试者给予的PSC衍生细胞。优选地，治疗组合物是无菌的。这可以通过无菌过滤膜进行过滤容易地实现。优选地，治疗组合物是无热原质的。
如本文所用，“配制”是指将其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例的细胞培养物与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，并且维持细胞活力。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对受体受试者无毒，并且可以包括：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
如对于正在治疗的特定适应症而言有必要时，所配制的药物组合物也可以包含其他活性化合物，优选地具有互补活性且彼此不产生不利影响的那些活性化合物。该组合物可以包含细胞毒性剂、细胞因子和/或生长抑制剂。此类分子适合地以对预期目的有效的量组合存在。
PSC衍生细胞(其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例)或包含此类PSC衍生细胞的治疗组合物可以在病症出现之前、期间或之后给予。在一个实施方案中，在炎症期间给予PSC衍生细胞或治疗组合物。可以将PSC衍生细胞(a)作为预防措施、(b)一旦诊断出病症、(c)当其他治疗失败时、和/或(d)当病症进展到预定义的严重程度时给予。
在一个实施方案中，将PSC衍生细胞(其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例)或包含此类PSC衍生细胞的治疗组合物在给予之前进行预处理。预处理可以使用生长因子或通过基因编辑进行，例如，其中生长因子可以引发PSC衍生细胞，并且基因编辑可以赋予PSC衍生细胞新的治疗特性。
本领域技术人员将理解，向受试者给予治疗有效量的PSC衍生细胞(其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例)或包含此类PSC衍生细胞的治疗组合物的确切方式，将由医学从业者根据待治疗或预防的病症自行决定。给予的模式(包括剂量、与其他药剂的组合、给予的时间和频率等)，可以受到受试者对PSC衍生细胞或治疗组合物治疗的可能响应性的诊断以及受试者的病症和病史的影响。
PSC衍生细胞(其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例)将以符合良好医学实践的方式配制、给药和给予。在这种情况下需要考虑的因素包括正在治疗或预防的特定病症、正在治疗的特定受试者、受试者的临床状态、给予的部位、给予的方法、给予的时间安排、可能的副作用和医学从业人员已知的其他因素。PSC衍生细胞(其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例)或包含此类PSC衍生细胞的治疗组合物将要给予的治疗有效量，将取决于此类考虑因素。
PSC衍生细胞(其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例)或包含此类PSC衍生细胞的治疗组合物可以全身地或外周地给予，例如通过途径包括静脉内(IV)、动脉内、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下(SC)、关节内、滑膜内、鞘内、冠状动脉内、经心内膜、手术植入、局部和吸入(例如肺内)。最优选地，静脉内给予PSC衍生细胞或治疗组合物。PSC衍生细胞或治疗组合物可以与生物相容性材料的支架组合给予。
术语“治疗有效量”是指PSC衍生细胞(其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例)或包含此类PSC衍生细胞的治疗组合物有效治疗受试者的病症的量。
术语“治疗(treat、treating或treatment)”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者，其中目的是预防或改善受试者的病症、疾病或失调，或者减缓(减轻)受试者的病症、疾病或失调的进展。需要治疗的受试者包括已经患有病症、疾病或失调的那些受试者以及将要预防病症、疾病或失调的那些受试者。
术语“预防(preventing、prevention)”、“预防性(prophylactic或preventative)”是指防止发生，或阻止、抵抗或保护免于病症、疾病或失调的发生，包括异常或症状。需要预防的受试者可能易于发生病症、疾病或失调。
术语“改善(ameliorate或amelioration)”是指减少、降低或消除病症、疾病或失调，包括异常或症状。需要治疗的受试者可能已经患有病症、疾病或失调，或者可能易于患有病症、疾病或失调，或者可能是其中将要预防病症、疾病或失调的受试者。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物。哺乳动物可以是灵长类动物(特别是人)，或者可以是家养动物、动物园动物或伴侣动物。尽管特别考虑到本文公开的方法及其产生的MSC或MSC群体适合用于人的医学治疗，但它们也适用于兽医治疗，包括治疗家养动物(如马、牛和绵羊)、伴侣动物(如狗和猫)、或动物园动物(如猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄动物)。
本文还公开了其中当通过第一方面的方法检测时残留的未分化PSC不存在或低于已知比例的细胞培养物。
本文还公开了当通过第二方面的方法制造时的治疗组合物。
本文还公开了用于检测从PSC分化的细胞培养物中残留的未分化多能干细胞(PSC)的试剂盒，该试剂盒包含：
层粘连蛋白-521；和
E-钙粘蛋白；和
ROCK抑制剂。
在一个实施方案中，ROCK抑制剂是本文公开的ROCK抑制剂。
在一个实施方案中，该试剂盒进一步包含PCR引物和任选地PCR探针，该PCR探针用于对在所培养的细胞中残留的未分化PSC的标记物表达进行定量。PCR引物和探针对残留的未分化PSC的标记物具有特异性。在一个实施方案中，PCR引物和/或探针是本文公开的PCR引物和/或探针。
在一个实施方案中，试剂盒包含用于PCR(任选地qRT-PCR)的即用型组合物，称为“主混合物(master mix)”，该主混合物包含除DNA模板和引物以外的用于PCR的组分、以及任选地探针。组分可以包括缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、Mg2+和聚合酶。主混合物可商购获得，例如2XGE主混合物。
在另一个实施方案中，该试剂盒进一步包含培养基。在一个实施方案中，培养基是本文公开的培养基。在一个实施方案中，培养基包含ROCK抑制剂。
在另一个实施方案中，试剂盒进一步包含基底。这样的基底适合用于培养从PSC(其中将要检测残留的未分化PSC)分化的细胞。优选地，基底是塑料培养器皿(如培养皿)、多孔板或烧瓶。在一个实施方案中，基底涂覆有层粘连蛋白-521和E-钙粘蛋白。
在一个实施方案中，试剂盒包含在如下方法中使用该试剂盒的说明书，该方法包括：
在涂覆有层粘连蛋白-521和E-钙粘蛋白的基底上在包含ROCK抑制剂的培养基中培养该细胞；
对在所培养的细胞中的标记物表达进行定量；并且
将在所培养的细胞中的标记物表达与在包含已知比例的PSC的参比细胞培养物中的标记物表达进行比较，
其中该细胞培养物中的标记物表达低于该参比细胞培养物中的标记物表达表明所培养的细胞中不存在残留的未分化PSC或者所培养的细胞中残留的未分化PSC的存在比例低于在该参比细胞培养物中PSC的该已知比例。
在一个实施方案中，试剂盒包含根据第一方面的方法使用该试剂盒的说明书。
在另一个实施方案中，根据第一方面的方法使用试剂盒。这可以用术语“当使用时”表示。
在优选的实施方案中，iPSC-MSC在包含10μM Y27632、ROCK抑制剂的E8培养基中培养3天，然后在ROCK抑制剂不存在的情况下培养2天，并且将LIN28表达通过qRT-PCR定量并归一化至GAPDH表达，从而允许检测0.001％的残留的未分化的iPSC。
可能有助于理解本公开文本(特别是实施例)的其他定义包括以下内容。
a)基因表达(GE)测定(20X)：从Life Technologies获得的使用专有的Applied/>软件和试剂设计的一种实时qRT-PCR测定类型。将这些测定用于定量样品中的特定mRNA，并且可以作为预先设计或定制的测定获得。/>GE测定作为基因特异性引物和探针的20X混合物提供。
i)FAMTM/MGB-NFQ探针：共价附接至探针的5'末端的荧光报告基因分子(FAM：6-羧基荧光素)。MGB-NFQ是共价附接至/>探针的3'末端的小沟结合物非荧光淬灭剂(Minor Groove Binder-Non-Fluorescent Quencher)分子。在扩增期间，探针被切割，从而从淬灭剂中释放出报告基因。所得的荧光信号与样品中的mRNA浓度成比例。可以获得其他荧光染料代替FAMTM。通常将/>用于内源性对照基因(用于归一化)，如GAPDH。
b)2XGE主混合物：含有AmpliTaq/>DNA聚合酶(UP(超纯)，用于热启动激活)、dNTP与dTTP/dUTP和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)的掺合物(用于最小化携带PCR污染)、以及基于专有ROXTM染料的被动内部参比。
c)cDNA：互补DNA，其使用逆转录酶(RT)从mRNA逆转录而来。
d)mRNA：信使RNA。
e)gDNA：基因组DNA。
f)模板：预期通过PCR扩增的核酸靶标(例如，cDNA)。
g)总RNA：RNA物质(包括mRNA(约1％-5％)、核糖体RNA(rRNA)(约80％)、转移RNA(tRNA)和微小RNA(miRNA))的复杂混合物。确切的组合物取决于细胞类型而变化。
h)RNase：核糖核酸酶，是降解RNA并且非常难以灭活的一种酶。
i)内源性对照基因：在所有样品类型中表达的阳性对照基因。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶是用于归一化的常见内源对照基因。
j)靶基因：在干细胞与分化细胞(例如，iPSC与iPSC-MSC)中差异表达的目的基因，如LIN28。
k)+RT和-RT主混合物：含有将总RNA样品逆转录所需的试剂。-RT是含有总RNA的阴性对照，但缺乏逆转录酶。-RT样品测试总RNA样品的gDNA污染。
l)+/-RT反应混合物：l)+/-RT主混合物与各个总RNA样品或进行逆转录的对照的组合。
m)cDNA扩增混合物：2XGE主混合物与各个+/-RT反应混合物的组合。
n)GE测定混合物(例如，LIN28或GAPDH测定混合物)：20XGE测定与用于实时qRT-PCR的各个cDNA扩增混合物的组合。
o)无模板对照(NTC)：一种阴性对照(NEG)类型，其中在+/-RT cDNA反应中用水代替总RNA。用于检测核酸模板对试剂的污染。
p)SNP：单核苷酸多态性。
q)Cq：定量循环(例如，Cq(X))是荧光信号越过实时qPCR和qRT-PCR测定的阈值的循环。Cq与mRNA浓度成反比。随着Cq增加，mRNA浓度降低，反之亦然。“Cq(50)”表示运行了50个循环。“无Cq(50)”表示在50个循环中没有产生Cq值。
实施例
实施例1-iPSC-MSC的产生
材料
表1.试剂
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表1中列出的试剂是本领域技术人员已知的并且具有可接受的组成，例如IMDM和哈氏F12。GLUTAMAX包含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，通常在0.85％ NaCl中以200mM提供。GLUTAMAX在培养细胞裂解二肽键时释放L-谷氨酰胺。化学定义的脂质浓缩物包含花生四烯酸2mg/L、胆固醇220mg/L、DL-α-生育酚乙酸酯70mg/L、亚油酸10mg/L、亚麻酸10mg/L、肉豆蔻酸10mg/L、油酸10mg/L、棕榈酸10mg/L、棕榈油酸10mg/L、普朗尼克(pluronic)F-68 90g/L、硬脂酸10mg/L、TWEEN2.2g/L、和乙醇。H-1152和Y27632是高度有效力的、细胞可渗透的、选择性的ROCK(Rho关联的形成卷曲螺旋的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶)抑制剂。
表2.IF6S培养基(10X浓度)
表3.IF9S培养基(1X浓度；基于IF6S)
IF9S 数量 最终浓度
IF6S 5mL 1X
聚乙烯醇(PVA；20mg/mL) 25mL 10mg/mL
全铁转铁蛋白(10.6mg/mL) 50μL 10.6μg/mL
胰岛素 100μL 20μg/mL
胚胎转移级水 至50mL NA
表4.分化培养基(1X浓度；基于IF9S)
分化培养基 数量 最终浓度
IF9S 36mL 1X
FGF2 1.8μg 50ng/mL
LiCl(2M) 36μL 2mM
BMP4(100μg/mL) 18μL 50ng/mL
激活素A(10mg/mL) 5.4μL 1.5ng/mL
表5.间充质集落形成培养基(1X浓度)
M-CFM 数量 最终浓度
ES-CULT M3120 40mL 40％
STEMSPAN SFEM 30mL 30％
人内皮SFM 30mL 30％
GLUTAMAX 1mL 1X
L-抗坏血酸(250mM) 100μL 250μM
LiCl(2M) 50μL 1mM
1-硫代甘油(100mM) 100μL 100μM
FGF2 600ng 20ng/mL
表6.间充质无血清扩增培养基(1X浓度)
M-SFEM 数量 最终浓度
人内皮SFM 5L 50％
干细胞系II HSFM 5L 50％
GLUTAMAX 100mL 1X
1-硫代甘油 87μL 100μM
FGF2 100μg 10ng/mL
方法
1.在玻连蛋白涂覆的(0.5μg/cm2)塑料器皿上在E8完全培养基(DMEM/F12基础培养基+E8补充剂)+1μM H1152中将iPSC解冻。将铺板的iPSC在37℃、5％ CO2、20％ O2(含氧量正常)下孵育。
2.在玻连蛋白涂覆的(0.5μg/cm2)塑料器皿上在E8完全培养基(没有ROCK抑制剂)中扩增iPSC三代，并在开始分化过程之前在37℃、5％ CO2、20％ O2(含氧量正常)下孵育。
3.收获iPSC并在胶原蛋白IV涂覆的(0.5μg/cm2)塑料器皿上在E8完全培养基+10μM Y27632中将其以5x103个细胞/cm2作为单细胞/小集落接种，并且在37℃、5％ CO2、20％O2(含氧量正常)下孵育24h。
4.用分化培养基替代E8完全培养基+10μM Y27632，并在37℃、5％CO2、5％ O2(缺氧)下孵育48h。
5.将来自分化培养基贴壁培养的集落形成细胞收获作为单细胞悬浮液，转移至M-CFM悬浮培养并在37℃、5％ CO2、20％ O2(含氧量正常)下孵育12天。
6.收获集落(第0代)并在纤连蛋白/胶原蛋白I涂覆的(0.67μg/cm2纤连蛋白、1.2μg/cm2胶原蛋白I)塑料器皿上在M-SFEM中将其接种，并且在37℃、5％ CO2、20％ O2(含氧量正常)下孵育3天。
7.收获集落并在纤连蛋白/胶原蛋白1涂覆的塑料器皿上在M-SFEM中以1.3x104个细胞/cm2接种为单细胞(第1代)，并且在37℃、5％ CO2、20％ O2(含氧量正常)下孵育3天。
8.将其收获并在纤连蛋白/胶原蛋白1涂覆的塑料器皿上在M-SFEM中以1.3x104个细胞/cm2接种为单细胞(第2代)，并在37℃、5％ CO2、20％ O2(含氧量正常)下孵育3天。
9.将其收获并在纤连蛋白/胶原蛋白1涂覆的塑料器皿上在M-SFEM中以1.3x104个细胞/cm2接种为单细胞(第3代)，并在37℃、5％ CO2、20％ O2(含氧量正常)下孵育3天。
10.将其收获并在纤连蛋白/胶原蛋白1涂覆的塑料器皿上在M-SFEM中以1.3x104个细胞/cm2接种为单细胞(第4代)，并且在37℃、5％ CO2、20％ O2(含氧量正常)下孵育3天。
11.将其收获并在纤连蛋白/胶原蛋白1涂覆的塑料器皿上在M-SFEM中以1.3x104个细胞/cm2接种为单细胞(第5代)，并在37℃、5％ CO2、20％ O2(含氧量正常)下孵育3天。
12.将第5代(P5)iPSC-MSC作为单细胞收获并冷冻最终产物。
实施例2-通过qRT-PCR定量残留的未分化的干细胞
1)目的
本实施例方案描述了通过基因表达测定(qRT-PCR)定量残留的未分化的iPSC。尽管例示了使用LIN28表达在iPSC-MSC中检测未分化的iPSC，但该方案通常适用于使用在PSC中差异表达但在PSC衍生细胞中不表达的任何PSC标记的PSC衍生细胞的培养。该方案旨在用于对PSC衍生细胞(旨在用于配制成治疗组合物)进行质量控制。
2)材料
a)用于iPSC-MSC层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白扩增培养方案的材料：
i)LN521TM人rLaminin-521，Biolamina，目录号LN521-03
ii)E-钙粘蛋白(人重组)，Advanced BioMatrix，目录号5085-0.1MG
iii)达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(1X)(含有Mg2+和Ca2+)(DPBS++)(6x 500mL)，Corning/Mediatech，目录号21-030-CV，或等效物
iv)HyCloneTM达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(不含Mg2+和Ca2+)溶液(DPBS--)，GEHealthcare Life Sciences，目录号SH30028，或等效物
v)ROCK抑制剂Y27632，Sigma-Aldrich，目录号Y0503-1MG或Y0503-5MG
vi)Essential 8TM培养基(试剂盒)，Thermo Fisher Scientific，目录号A1517001
(1)Essential 8TM基础培养基(500mL)
(2)Essential 8TM补充剂(玻连蛋白)(10mL)
vii)TrypLETMSelect Enzyme(1X)，无酚红(100mL)，Thermo Fisher Scientific，目录号12563011
viii)二甲亚砜(DMSO)，Sigma-Aldrich，目录号D2650
ix)75cm2带通气盖的矩形斜颈细胞培养烧瓶，Corning LifeSciences，目录号353136，或等效物
x)细胞刮刀(25cm手柄和1.8cm刀片)，无菌，Corning Life Sciences，目录号353086，或等效物
xi)HyCloneTM0.4％台盼蓝，Thermo Fisher Scientific，目录号SV30084，或等效物
xii)带盖玻片的血细胞计数器，Reichert Right Line，或等效物
b)Protect Cell Mini Kit(50)：/>目录号74624。由两种产品组成：
i)细胞试剂(第1盒/共2盒)：为培养或分选细胞而设计。可以直接添加到培养基中的细胞中。捕捉基因表达模式，立即稳定总RNA。可以将样品存储在4℃、-20℃下或保存在-80℃下。
ii)Plus Mini Kit(第2盒/共2盒)：设计用于从各种样品类型中分离总RNA。“Plus”表示该试剂盒含有基因组DNA(gDNA)消除器柱和相关试剂。
c)QIAshredder(50)：目录号79654。需要将细胞裂解物均质化以进行RNA分离。
d)不含RNase的DNase套装(50prep)，目录号79254。用于使用RNA纯化试剂盒时进行膜上DNA酶处理。/>
e)乙醇(96％-100％)：Fisher BioReagents，分子生物学级，绝对纯(200Proof)，100mL，Fisher Scientific目录号BP2818100，或等效物。为 PlusMini Kit所必需。
f)UltraPureTM无DNase/RNase蒸馏水，Life Technologies，目录号10977-015，或等效物。
g)β-巯基乙醇(β-ME)，14.3M，Thermo Fisher Scientific，目录号BP176-100，或等效物。为Plus Mini Kit所必需以灭活RNase。
h)Safetec Green-ZTM生物危害流体控制粉末，Thermo Fisher Scientific，目录号19-023-901。用于处理细胞试剂(其是一种环境危害品)。
i)RNase AWAYTM去污试剂(250mL)，Life Technologies，目录号10328-011，或等效物。将即用型溶液施用于表面，如实验室工作台、移液管、玻璃器皿或塑料器皿。用Milli-Q水冲洗以清除RNase和DNA污染。
j)大容量RNA-to-cDNATM试剂盒(50)：Thermo Fisher Scientific，目录号4387406
k)SUPERase·InTMRNase抑制剂：Thermo Fisher Scientific，目录号AM2694
l)基因表达主混合物(2X)：Thermo Fisher Scientific，目录号4369016(1包，5mL：200x50μL Rxs)
m)RT-PCR级水：Thermo Fisher Scientific，目录号AM9935(10x1.5ml)(优选的)，或等效物。注意：AM9935经高压灭菌、膜过滤，并且未经DEPC处理。通过实时PCR测试AM9935的原核(16S rRNA)和真核(18S rRNA)基因组DNA污染。它经证实不含RNase，不含DNase，并且不含基因组DNA。
n)基因表达测定，其含有20X的引物和FAM/MGB-NFQ探针在TE中的即用型混合物。FAM是最常见的荧光报告基因。(1X＝250nM TaqMan探针+900nM的每种PCR引物(正向和反向))。以下目录号是指定制测定大小。光敏感性。优选地以一次性使用等分试样存储在-20℃下的1.5ml />不粘管中。
i)定制基因表达测定(20X，单管)，Thermo Fisher Scientific，定制的。(请注意，定制测定只能与FAM-MGB探针一起订购。)
(1)目录号4331348(小＝360rxn@20μL qRT-PCR)
(2)目录号4332078(中＝750rxn@20μL qRT-PCR)
ii)LIN28定制基因表达测定，Thermo Fisher Scientific；目录号：4331348；测定ID：AIVI48S；测定名称：LIN28.QRT-PCR；规模：S：360rxn；定制的。这是一种定制设计的测定，其具有已知的引物和探针序列，如在Kuroda等人(PLoS ONE 7,1-9(2012)Highly Sensitive In Vitro Methods for Detection of Residual UndifferentiatedCells in Retinal Pigment Epithelial Cells Derived from Human iPS Cells)中所披露的。LIN28探针序列(5'→3')CGCATGGGGTTCGGCTTCCTGTCC(SEQ ID NO:15)；LIN28正向引物序列(5'→3')CACGGTGCGGGCATCTG(SEQ ID NO:16)；LIN28反向引物序列(5'→3')CCTTCCATGTGCAGCTTACTC(SEQ ID NO:17)。/>
iii)内源性对照测定：这些测定已经被预先设计，并且可以进行清点。内源性对照可与FAM-MGB或VIC-MGB探针一起获得。优选地选择VIC-MGB探针来区分对照测定与有区别的测定。
(1)GAPDH基因表达测定(基因符号：GAPDH，hCG2005673)，LifeTechnologies；目录号：4448489；测定ID：Hs02758991_g1(VIC-MGB探针)；定制的。“最佳覆盖”测定选自多个预先设计的GAPDH测定。这种测定跨越内含子，并且因此不应检测基因组DNA。
o)不粘无RNase微量离心管(1.5mL)：Life Technologies，目录号AM12450。注意：AM12450 1.5ml管具有低结合表面，并且经证实不含RNase和DNase。优选地用于存储定制/>GE测定(20X)的等分试样和制备cDNA。
p)1.5mL螺旋盖微管(Sarstedt 72.692.005)：Fisher Scientific目录号50809238，或等效物；锥形底部，无菌，带有组装O型环盖。优选地用于制备cDNA扩增混合物。外部螺纹螺旋盖防止产生气溶胶，否则其可能导致PCR污染。
q)白色硬壳低剖面96孔带缘PCR板：Bio-Rad目录号HSP-9655。白板将减少背景噪音，并且增加透明96孔板和管上的荧光信号。不应使用带状管进行此程序。
r)Microseal‘B’粘贴封膜(100)：Bio-Rad目录号MSB-1001。这是推荐的用于硬壳96孔板的光学透明板密封件。
s)密封辊：Bio-Rad目录号MSR-0001。用于使用Microseal‘B’粘贴封膜将硬壳96孔板密封。
t)带有Bio-Rad CFX软件的Bio-Rad CFX96实时PCR检测系统(ID 0394)或等效物。
u)Eppendorf MiniSpin Plus微型离心机(ID 0569)或等效物。
v)Nanodrop 2000UV-可见光分光光度计(ID 0504)或等效物。
3)程序
a)使用残留的未分化的iPSC的选择性扩增制备用于qRT-PCR分析的P5 iPSC-MSC最终产物(1小瓶)。
i)这一程序在iPSC-MSC的背景中选择性地扩增未分化的iPSC，以便增加qRT-PCR对残留的未分化的iPSC的灵敏性。
ii)细胞培养基的制备：
(1)E8完全培养基(E8CM)的制备：
(a)在2℃-8℃下解冻E8补充剂。
(b)从500ml瓶中移除10ml E8基础培养基。
(c)向490ml E8基础培养基中添加10ml E8补充剂。混合均匀并存储在2℃-8℃。制备后2周到期。
(2)E8CM+10μM Y27632培养基的制备：
(a)通过向1mg Y27632中添加312μl DPBS--(不含Ca2+和Mg2+)来制备10mMY27632。等分并冷冻在-20℃下。
(b)向每ml的E8CM中添加1μl的10mM Y27632至终浓度10μM Y27632(例如向75mlE8CM中添加75μl的10mM Y27632)。存储在4℃下。制备后2周到期。
iii)冷冻培养基的制备(E8CM+20％ DMSO)：
(1)如下制备10ml冷冻培养基：将8ml E8CM与2ml DMSO合并。使用之前转移至4℃冷却。
(2)向每ml的E8CM中添加1μl的10mM Y27632至终浓度10μM Y27632(例如向75mlE8CM中添加75μl的10mM Y27632)。存储在4℃下。制备后2周到期。
iv)层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白涂层的制备(在DPBS++中)：
(1)在2℃-8℃下解冻层粘连蛋白-521和E-钙粘蛋白过夜。
(2)制备涂层材料(2x T75烧瓶需要30ml)：
(3)涂覆培养器皿(2x T75烧瓶)并在使用之前在2℃-8℃下存储至少过夜(1个月到期)。确保涂层溶液覆盖整个培养区域。
v)扩增培养物的制备
(1)接种之前最少1小时，从烧瓶中除去涂层材料，并且添加15ml E8CM+10μMY27632/T75。使在37℃下平衡。
(2)在37℃水浴中解冻P5 iPSC-MSC。
(3)将小瓶的内容物转移到含有9ml的E8CM+10μM Y27632的15ml管中。
(4)以200x g离心5分钟。
(5)抽吸上清液，并且将沉淀重悬于5ml E8CM+10μM Y27632中。
(6)使用血细胞计数器计数细胞。估计浓度为5x106个细胞/5ml＝1x106个细胞/ml。建议在台盼蓝中的稀释度为1:2。计算存活力百分比。
(7)计算以1.3x104个细胞/cm2或1x106个细胞/T75接种每个T75烧瓶所需的细胞数目。
(8)用计算数目的细胞接种层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白涂覆的烧瓶。
(9)按以下时间表向细胞补料：
(a)第1天-没有补料。
(b)第2天-向每个T75烧瓶补料15ml E8CM+10μM Y27632。
(c)第3天-没有补料。
(d)第4天和第5天-向每个T75烧瓶补料15ml E8CM(不含Y27632)。
(10)每天检查培养物是否有微生物污染迹象(例如，浊度)。丢弃任何受污染的培养物，并从步骤3)a)重新开始。
vi)收获(接种后第6天)
(1)注意：细胞很难从层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白涂覆的培养器皿上分离开来。建议使用细胞刮刀使所有细胞分离。平均收获密度为4x104个细胞/cm2或3x106个细胞/T75烧瓶。如果从单个T75烧瓶(<2x10e6个细胞)收获的细胞数目不足，则可能需要收获第二个T75。
(2)抽吸生长培养基，并用10ml DPBS--冲洗烧瓶。
(3)向T75烧瓶中添加8ml TrypLE。在37℃下孵育15分钟。
(4)稳固地轻敲烧瓶以移动细胞并转移到50ml锥形管中(约8ml)。
(5)向烧瓶中添加8ml E8CM+10μM Y27632，上下吸移，并与50ml管中的细胞悬浮液合并(总共16ml)。
(6)向烧瓶中添加8ml E8CM+10μM Y27632，并使用无菌一次性细胞刮刀轻轻刮下细胞。通过用培养基冲洗刮过的表面来收集细胞，并与细胞悬浮液合并(总共24ml)。
(7)在向烧瓶中添加另外的8ml E8CM+10μM Y27632之后重复刮擦。如上所述收集细胞悬浮液(总共32ml)。
(8)以200x g离心细胞10分钟。抽吸上清液。
(9)将细胞沉淀重悬于E8CM+10μM Y27632中并对细胞计数。建议重悬浮体积为2ml，估计浓度为3x106个细胞/2ml＝1.5x106个细胞/ml。建议在台盼蓝中的稀释度为1:2。为了准确计数，可能需要使用1ml移液管尖端将细胞分离为单细胞。
(a)使用血细胞计数器对细胞计数。
(b)所需的存活力百分比为≥70％。所需的产量为≥2x106个细胞。
(10)以200x g旋转细胞10分钟。抽吸上清液。
(11)以2x106个细胞/ml将细胞沉淀重悬于E8CM中。
vii)在分析之前冷冻细胞。
(1)添加等体积的冷冻培养基(E8CM，含20％ DMSO)至终浓度为1x106个细胞/ml。
(2)向每个冷冻管中添加1ml细胞悬浮液。
(3)立即将冷冻管转移至-80℃冰箱。
(4)第二天转移至液氮罐中。
b)制备用于Plus Mini Kit的试剂：
i)缓冲液RPE洗涤溶液的制备：
(1)如瓶上所示，向缓冲液RPE浓缩物中添加100％乙醇(即，对于50prepProtect Cell Mini Kit，添加44mL)。
ii)70％乙醇的制备：
(1)将7mL的100％乙醇与3mL无核酸酶的水合并。在制备后一个月到期。
iii)制备用于总RNA分离的裂解缓冲液：
(1)使用化学通风橱，在使用之前向每1mL缓冲液RLT Plus添加10μLβ-巯基乙醇(β-ME)。
iv)制备不含RNase的DNase用于不含RNase的DNase套装：
(1)使用无菌针头和注射器向冻干的DNase中添加指定量的无RNase水(即，550μL)。通过颠倒轻轻重悬DNase。不要涡旋。将重构的DNase以20μL等分试样存储在-20℃下，优选地在不粘无RNase微量离心管中。重构的RNase在制备后九个月到期。将剩余的试剂盒组分存储在2℃-8℃。
c)使用细胞试剂制备所培养的细胞以用于总RNA分离。
i)细胞试剂立即稳定处理细胞中的总RNA，保留基因表达谱。在培养基存在或不存在的情况下，将试剂直接添加到细胞中。还可以使用修改的方案制备在DMSO中的冷冻细胞。
(1)推荐的细胞数目是每个总RNA小量制备1-2x106个细胞。在不改变试剂体积的情况下，这可以增加到每个小量制备最多5x106个细胞。对于较大的细胞数目，按照制造商的方案处理多个小量制备或使用RNA中量制备程序。
(2)使用1mL样品与5mL细胞试剂的比例。
ii)制备适当数量的15mL管(含有5mL细胞试剂)。
iii)冷冻细胞：将冷冻细胞小瓶置于干冰上以防止解冻。在添加试剂之前不要解冻细胞。一次处理一个小瓶以最大限度地保护RNA。
(1)将约750μL的细胞试剂从一个15mL管转移到含有约1mL冷冻培养基的冷冻细胞冷冻管中。对于其他情景根据需要调节体积。不要装得太多。
(a)使用高质量低保留的移液吸头以防止移液损失。
(2)立即涡旋混合物约10秒。将部分解冻的混合物快速转移回含有细胞试剂的相同15mL管中。
(3)重复步骤3)c)iii)(1)和3)c)iii)(2)直至混合物完全解冻。这将需要3-4次重复。
(4)通过涡旋混匀，直至样品均匀。
iv)立即进行总RNA分离或将制备的样品保存在细胞试剂中。将样品存储在2℃-8℃下持续最多4周，或保存在-20℃或-80℃下。
d)制备用于总RNA分离的细胞裂解物。
i)如果是冷冻的，在室温下解冻细胞混合物而不混合。
ii)将细胞混合物以4000rpm离心5分钟(Sorvall ID 0018或等效物)以收集细胞和可能已形成的任何沉淀物。应该形成可见的白色沉淀。
iii)尽可能多地将上清液移至废物容器中。轻弹管或涡旋使沉淀松开。这对于下一步骤中的完全溶解非常重要。
(1)向沉淀中添加350μL新鲜制备的缓冲液RLT Plus+β-ME。剧烈涡旋1-2分钟，直至沉淀完全溶解。如果需要，可以将裂解物存储在-80℃。在使用之前在室温下解冻并涡旋。
e)使用Plus Mini Kit分离总RNA。所有步骤均在室温下进行。从以下冷冻保存的样品中分离总RNA。在30μL无核酸酶水中洗脱。
#1：iPSC-MSC(非扩增的)(参比培养)
#2：iPSC-MSC(扩增的)(参比培养)
#3：iPSC-MSC加0.001％iPSC加标(非扩增的)(参比培养)
#4：iPSC-MSC加0.001％iPSC加标(扩增的)(参比培养)
#5：iPSC-MSC P5最终产物(未扩增的)
#6：iPSC-MSC P5最终产物(扩增的)
i)将裂解物转移至QIAshredder。全速离心2分钟以剪切裂解物并使其均质化。可以在收集管的底部形成薄的圆形沉淀。
ii)将均质化的裂解物转移至组装的gDNA消除器旋转柱，从而避免任何沉淀材料。全速离心30秒。如果必要，重复直到所有裂解物都通过旋转柱。
iii)向流出物中添加350μL 70％乙醇并通过移液混匀。不要离心。立即将混合物与可能形成的任何沉淀物一起转移至组装的旋转柱中。
iv)轻轻关闭盖子并全速离心15秒。丢弃来自收集管的流出物。现在RNA与旋转柱结合。
v)膜上DNase处理：
(1)为了最大限度地去除基因组DNA，用无RNase的DNase处理结合的RNA。
(a)将350μL缓冲液RW1添加到旋转柱上。轻轻关闭盖子，并全速离心15秒。丢弃来自收集管的流出物。
(b)对于每个样品，将20μL重构的DNase、140μL缓冲液RDD和2μL SUPERase合并。InTM。通过吸移轻轻混合并将全部合并到一个管中。不要涡旋。
(c)将80μL DNase混合物直接吸移到膜的中心上。在室温下孵育20分钟。
(d)向旋转柱添加350μL缓冲液RW1。轻轻关闭盖子，并全速离心15秒。丢弃来自收集管的流出物。
vi)向旋转柱添加500μL缓冲液RPE。轻轻关闭盖子，并全速离心15秒。丢弃来自收集管的流出物。
vii)通过向旋转柱添加500μL缓冲液RPE来重复洗涤。轻轻关闭盖子，并全速离心2分钟。
viii)将旋转柱转移到新鲜的2mL收集管中。全速离心1分钟以去除任何残留的洗涤溶液。
ix)将旋转柱转移至1.5mL收集管中。直接向膜添加30μL无RNase的水。轻轻关闭盖子并全速离心1分钟以洗脱RNA。
x)丢弃旋转柱并将管盖上。将管标记上日期和样品ID。
xi)将每个总RNA样品的体积归一化至30μL。
(1)将10-100μL移液管设置为30μL并测量洗脱液体积。
(2)如果体积小于30μL，则添加来自试剂盒无核酸酶的水至最终体积30μL。
(3)现在将样品归一化至起始细胞数目。
xii)使用Nanodrop 2000确定每个样品的总RNA浓度。
(1)在启动软件之前用Milli-Q水清洗样品基座，以去除来自先前使用的任何潜在污染。
(2)一旦软件初始化后，取消选中340nm基线校正框。
(3)用Milli-Q水将仪器清零。
(4)测试Milli-Q水样品以确保背景为零。如果有必要，用Milli-Q水重新清洁样品基座。
(5)使用单次测定确定每个样品的总RNA浓度。
(6)计算总RNA产量和每个细胞的产量。
(7)计算每个样品的1.0-2.0μg总RNA的体积。(每个cDNA反应可以逆转录最多2.0μg总RNA)。
(8)总RNA浓度必须≥100ng/μL，以满足每10μL(最大体积)逆转录1μg总RNA的要求。如果有必要，从新鲜的细胞小瓶中重新分离总RNA。
每1x106个冷冻保存的iPSC-MSC的预期总RNA产量为约5-10μg。这相当于每个细胞约5-10pg总RNA。
xiii)进行cDNA合成或将总RNA在-20℃下存储最多1年。
f)使用高容量RNA-to-cDNATM试剂盒制备cDNA。
i)对于每个总RNA样品，使用1μg总RNA/22μL RT来制备cDNA+/-RT。包括H2O(NTC)+/-RT对照(N＝14)。
ii)在冰上解冻试剂盒组分。
iii)取决于待分析的总RNA样品的数量，在冰上制备一个+RT和一个-RT主混合物。-RT样本用作阴性对照，缺乏逆转录酶。通过用RT-PCR级水替代总RNA来包括H2O(NTC)+/-RT对照。
iv)对于每个总RNA样品，在冰上制备单独的+/-RT反应混合物。
(1)总RNA的最大体积为10μL/22μL+/-RT。总RNA的体积将取决于总RNA浓度而变化。
(2)通过从10μL中减去总RNA体积来计算每个管的RT-PCR级水的体积。
(3)将适当体积的RT-PCR级水吸移到每个管中。对于+/-RT H2O对照使用10μL。
(4)向每个管中添加适当体积的总RNA。
(5)向每个管中添加12μL的+RT或-RT主混合物，并通过吸移轻轻混合。
v)在37℃下孵育60分钟。
vi)在95℃下加热灭活5分钟。
vii)短暂离心管以收集cDNA。
viii)使用校准的10-100μL移液管来测量cDNA体积。
(1)将移液管设置为cDNA反应体积(20-22μL)并测量cDNA体积。
(2)用无核酸酶的水将cDNA体积调节至100μL。这将稀释抑制剂并为多个qRT-PCR测定提供足够的cDNA。
ix)通过涡旋混合并短暂旋转样品。
x)进行qRT-PCR或存储在-20℃下。
g)qRT-PCR(基因表达测定)
i)对于每个cDNA(N＝14)，对于LIN28和GAPDH(每个N＝3)，每20μL qRT-PCR扩增50ng cDNA(总RNA当量)。使用50个循环进行qRT-PCR。(方案文件：TaqMan qRT-PCR AssaysCq(50).prcl)。
ii)取决于重复的数量和要进行的GE测定的数量，为每个+RT和-RTcDNA制备cDNA扩增混合物。
(1)每个反应推荐的最大cDNA量为100ng(总RNA当量)。
iii)取决于GE测定和重复的数量，为每种cDNA制备GE测定混合物。将为每种cDNA和每个/>GE测定制备一个GE测定混合物。
iv)将20μL每个GE测定混合物转移至白色CFX96板中并用光学板密封件密封。
v)在具有板适配器(ID#0018)的离心机中以400rpm将板离心1分钟，以将内容物收集到孔的底部。
vi)小心地将板放入热循环仪中，小心不要弄乱孔的内容物。
vii)使用附接的计算机上的Bio-Rad CFX ManagerTM软件运行Bio-Rad CFX96实时PCR检测系统的程序。使用以下热循环参数：
(1)在50.0℃下2分钟(UNG孵育；最佳尿嘧啶-N-糖基化酶活性所需；降解先前扩增的掺入dUTP的PCR产物以减少PCR污染)。
(2)在95℃下10分钟(热启动：AmpliTaqUP聚合酶激活)。
(3)[在95℃下15秒(变性)+在60℃下1分钟(退火/延伸)+板读取]-重复49次持续50个循环(扩增和实时检测)。
viii)将样品体积设置为20μL。
ix)估计运行时间应为01:59:00h。
x)在运行期间读取所有孔和所有通道，以确保在运行期间收集所有数据。
(1)位于板布局上方的预览设置应为：
(a)荧光团：FAM、HEX、Texas Red、Cy5、Quasar 705(稍后可以添加VIC)
(b)板类型：BR白色
(c)扫描模式：所有通道
xi)所有孔均应标记为“Unk”，表示在运行期间软件认为所有孔都是未知的。在运行完成之后将设置实际的板布局。
xii)单击“下一步”以移至“开始运行”选项卡。在“注释”部分中输入有关运行的标识信息。
xiii)单击“开始运行”按钮以开始qRT-PCR。
h)数据分析
i)数据分析窗口将在运行结束时打开。
(1)将qRT-PCR数据报告为Cq值(即Cq(50))。
ii)单击窗口顶部右侧的“板设置”按钮。
(1)选择“查看/编辑板”。按照“板加载指南”设置带有样品信息的板。
(a)清除任何空的孔。
(b)不要选中“排除分析中的孔”。必须分析所有数据。
(2)单击“确定”并保存文件。
iii)单击窗口顶部附近的“定量”选项卡。
iv)检查以下设置：
(1)Cq确定模式：单阈值
(2)基线设置：减去基线的曲线拟合
(3)分析模式：荧光团
v)从“工具”菜单生成包含以下章节和相关子章节的报告：标题、运行设置、定量和QC参数。
(1)取消选择“基因表达”选项、“等位基因分型”和“终点”，因为这些部分不相关。
vi)通过选择“导出”>“将所有数据表导出到Excel”来导出数据进行分析。这将提供电子表格格式的数据。
vii)使用电子表格分析数据。
(1)报告“N/A”为“无Cq(50)”。
(2)对于每个LIN28和GAPDH+/-RT数据集，计算平均的Cq(50)和相对标准偏差％(RSD或变异系数(CV))。
(3)通过从平均LIN28 Cq(50)(N＝3)减去平均GAPDH Cq(50)(N＝3)来将平均Cq(50)值归一化。
(4)对于所有样品，计算平均GAPDH Cq(50)和％RSD。
(5)将样品#2(iPSC-MSC(扩增的))和#4(iPSC-MSC加0.001％iPSC加标(扩增的))的归一化的平均Cq(50)值进行比较。将样品#4(iPSC-MSC加0.001％iPSC加标(扩增的))和#6(iPSC-MSC P5最终产物(扩增的))的归一化的平均Cq(50)值进行比较。
4)接受标准
a)样品#2(iPSC-MSC(扩增的))的归一化的平均Cq(50)值必须大于样品#4(iPSC-MSC加0.001％iPSC加标(扩增的)的归一化的平均Cq(50)值。这表明可以在背景之上检测到0.001％iPSC加标(扩增的)。
表7iPSC-MSC P5最终产物的参比培养的预期的平均归一化Cq(50)值。
样品# 加标 扩增 预期的平均归一化Cq(50)*
1 无 无 15.16±0.29
2 无 有 19.85±0.17
3 0.001％iPSC 无 14.93±0.06
4 0.001％iPSC 有 13.86±0.07
*归一化的LIN28 Cq(50)＝(LIN28 Cq(50)–GAPDH Cq(50))+/-标准偏差(N＝3x3)
b)所有样品的GAPDH Cq(50)％RSD必须为≤5％。所有平均Cq(50)值和归一化Cq(50)值的％RSD必须为≤5％。
c)对于所有重复，H2O(NTC)对照(+/-RT)不得在50个扩增循环内产生可检测的扩增信号。
i)如果任何H2O(NTC)对照(+/-RT)被分配了Cq(50)值，则重复来自步骤3)g)的qRT-PCR测定。这表明试剂被模板DNA污染了。
实施例3-根据实施例2进行的方案的结果
表8.对于参比培养和iPSC-MSC P5最终产物，根据实施例2进行的方案的平均归一化Cq(50)值。
实施例4-通过qRT-PCR定量残留的未分化干细胞
本实施例描述了本质上通过实施例2的方案(但是LIN28被OCT4(POU5F1)替代)来定量残留的未分化的iPSC。预期结果与实施例2、表7以及实施例3、表8一致。
实施例5-通过qRT-PCR定量残留的未分化干细胞
本实施例描述了本质上通过实施例2的方案(但是LIN28被SOX2替代)来定量残留的未分化的iPSC。预期结果与实施例2、表7以及实施例3、表8一致。
实施例6-通过qRT-PCR定量残留的未分化干细胞
本实施例描述了本质上通过实施例2的方案(但是LIN28被FOXD3替代)来定量残留的未分化的iPSC。预期结果与实施例2、表7以及实施例3、表8一致。
实施例7-通过qRT-PCR定量残留的未分化干细胞
本实施例描述了本质上通过实施例2的方案(但是LIN28被NANOG替代)来定量残留的未分化的iPSC。预期结果与实施例2、表7以及实施例3、表8一致。
实施例8-通过qRT-PCR定量残留的未分化干细胞
本实施例描述了本质上通过实施例2的方案(但是LIN28被PODXL替代)来定量残留的未分化的iPSC。预期结果与实施例2、表7以及实施例3、表8一致。
实施例9-通过qRT-PCR定量残留的未分化干细胞
本实施例描述了本质上通过实施例2的方案(但是LIN28被REX1(ZFP42)替代)来定量残留的未分化的iPSC。预期结果与实施例2、表7以及实施例3、表8一致。
实施例10-通过qRT-PCR定量残留的未分化干细胞
本实施例描述了本质上通过实施例2的方案(但是LIN28被SSEA1(FUT4)替代)来定量残留的未分化的iPSC。预期结果与实施例2、表7以及实施例3、表8一致。
实施例11-通过qRT-PCR定量残留的未分化干细胞
本实施例描述了本质上通过实施例2的方案(但是LIN28被SSEA4替代)来定量残留的未分化的iPSC。预期结果与实施例2、表7以及实施例3、表8一致。
实施例12-通过qRT-PCR定量残留的未分化干细胞
本实施例描述了本质上通过实施例2的方案(但是LIN28被DPPA2替代)来定量残留的未分化的iPSC。预期结果与实施例2、表7以及实施例3、表8一致。
实施例13-通过qRT-PCR定量残留的未分化干细胞
本实施例描述了本质上通过实施例2的方案(但是LIN28被DPPA3替代)来定量残留的未分化的iPSC。预期结果与实施例2、表7以及实施例3、表8一致。
序列表
<110> Cynata治疗有限公司
<120> 多能干细胞测定
<130> P104383.PCT
<150> AU 2016904679
<151> 2016-11-16
<160> 14
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 3695
<212> PRT
<213> 智人
<400> 层粘连蛋白-521 α链
Met Ala Lys Arg Leu Cys Ala Gly Ser Ala Leu Cys Val Arg Gly Pro
1 5 10 15
Arg Gly Pro Ala Pro Leu Leu Leu Val Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala
20 25 30
Ala Arg Ala Arg Glu Glu Ala Gly Gly Gly Phe Ser Leu His Pro Pro
35 40 45
Tyr Phe Asn Leu Ala Glu Gly Ala Arg Ile Ala Ala Ser Ala Thr Cys
50 55 60
Gly Glu Glu Ala Pro Ala Arg Gly Ser Pro Arg Pro Thr Glu Asp Leu
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Tyr Cys Lys Leu Val Gly Gly Pro Val Ala Gly Gly Asp Pro Asn Gln
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Gly Thr Tyr Gln Gly Gly Gly Val Cys Ile Asp Cys Gln His His Thr
385 390 395 400
Thr Gly Val Asn Cys Glu Arg Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Ser Pro
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Asn His Pro Leu Asp Ser Pro His Val Cys Arg Arg Cys Asn Cys Glu
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Ser Asp Phe Thr Asp Gly Thr Cys Glu Asp Leu Thr Gly Arg Cys Tyr
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Ser Ala Ala Gly Thr Gln Gly Asn Ala Cys Arg Lys Asp Pro Arg Val
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Ser Pro Gly Val Ala Asp Asp Arg Cys Asp Pro Asp Thr Gly Gln Cys
545 550 555 560
Arg Cys Arg Val Gly Phe Glu Gly Ala Thr Cys Asp Arg Cys Ala Pro
565 570 575
Gly Tyr Phe His Phe Pro Leu Cys Gln Leu Cys Gly Cys Ser Pro Ala
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Gly Thr Leu Pro Glu Gly Cys Asp Glu Ala Gly Arg Cys Leu Cys Gln
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Gly Phe Pro Asn Cys Gln Ala Cys Thr Cys Asp Pro Arg Gly Ala Leu
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Asp Gln Leu Cys Gly Ala Gly Gly Leu Cys Arg Cys Arg Pro Gly Tyr
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Thr Gly Thr Ala Cys Gln Glu Cys Ser Pro Gly Phe His Gly Phe Pro
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Ser Cys Val Pro Cys His Cys Ser Ala Glu Gly Ser Leu His Ala Ala
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Cys Asp Pro Arg Ser Gly Gln Cys Ser Cys Arg Pro Arg Val Thr Gly
690 695 700
Leu Arg Cys Asp Thr Cys Val Pro Gly Ala Tyr Asn Phe Pro Tyr Cys
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Glu Ala Gly Ser Cys His Pro Ala Gly Leu Ala Pro Val Asp Pro Ala
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Leu Pro Glu Ala Gln Val Pro Cys Met Cys Arg Ala His Val Glu Gly
740 745 750
Pro Ser Cys Asp Arg Cys Lys Pro Gly Phe Trp Gly Leu Ser Pro Ser
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Asn Pro Glu Gly Cys Thr Arg Cys Ser Cys Asp Leu Arg Gly Thr Leu
770 775 780
Gly Gly Val Ala Glu Cys Gln Pro Gly Thr Gly Gln Cys Phe Cys Lys
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Pro His Val Cys Gly Gln Ala Cys Ala Ser Cys Lys Asp Gly Phe Phe
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820 825 830
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Asp His Tyr Leu Pro Asp Leu His His Leu Arg Leu Glu Leu Glu Glu
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Glu Phe Glu Asn Phe Ser Trp Arg Gly Tyr Ala Gln Met Ala Pro Val
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Gln Pro Arg Ile Val Ala Arg Leu Asn Leu Thr Ser Pro Asp Leu Phe
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Arg Val Ser Val Arg Glu Glu Gly Arg Ser Ala Thr Cys Ala Asn Cys
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Thr Ala Gln Ser Gln Pro Val Ala Phe Pro Pro Ser Thr Glu Pro Ala
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Phe Ile Thr Val Pro Gln Arg Gly Phe Gly Glu Pro Phe Val Leu Asn
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Pro Gly Thr Trp Ala Leu Arg Val Glu Ala Glu Gly Val Leu Leu Asp
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Tyr Val Val Leu Leu Pro Ser Ala Tyr Tyr Glu Ala Ala Leu Leu
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Gln Leu Arg Val Thr Glu Ala Cys Thr Tyr Arg Pro Ser Ala Gln
1025 1030 1035
Gln Ser Gly Asp Asn Cys Leu Leu Tyr Thr His Leu Pro Leu Asp
1040 1045 1050
Gly Phe Pro Ser Ala Ala Gly Leu Glu Ala Leu Cys Arg Gln Asp
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His Pro Pro Leu Ile Thr Cys Thr Gly Ser Asp Val Asp Val Gln
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Leu Gln Val Ala Val Pro Gln Pro Gly Arg Tyr Ala Leu Val Val
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Glu Tyr Ala Asn Glu Asp Ala Arg Gln Glu Val Gly Val Ala Val
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Pro Cys Leu Tyr Ser Thr Leu Cys Arg Gly Thr Ala Arg Asp Thr
1145 1150 1155
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Val Ser Cys Ile Ser Ser His Gly Ala Phe Gly Pro Asn Ser Ala
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1220 1225 1230
Leu Arg Asp Cys Gln Val Ile Pro Leu Pro Pro Gly Leu Pro Leu
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Tyr Ser Phe Gly Tyr Leu Arg Glu Glu Pro Leu Asp Lys Ser Tyr
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Asp Phe Ile Ser His Cys Ala Ala Gln Gly Tyr His Ile Ser Pro
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Ser Ser Ser Ser Leu Phe Cys Arg Asn Ala Ala Ala Ser Leu Ser
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Leu Phe Tyr Asn Asn Gly Ala Arg Pro Cys Gly Cys His Glu Val
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Gly Ala Thr Gly Pro Thr Cys Glu Pro Phe Gly Gly Gln Cys Pro
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Ser Ser Ser Tyr Thr Arg Gln Glu Phe Val Asp Met Glu Gly Trp
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Ser Ala Val Phe Leu Arg Arg Val Ala Leu Glu Val Ala Ser Pro
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Cys Lys Pro Gly Tyr Ala Gly Ala Ser Cys Glu Arg Cys Ala Pro
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Gly Phe Phe Gly Asn Pro Leu Val Leu Gly Ser Ser Cys Gln Pro
1955 1960 1965
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2000 2005 2010
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Gly Thr Glu Ala Cys Asp Pro His Ser Gly His Cys Leu Cys Lys
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Pro Ala Ala Glu Gly Ser Glu Cys His Pro Gln Ser Gly Gln Cys
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Gly Ile Asn Ala Ser Ser Met Ala Trp Ala Arg Leu His Arg Leu
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Gly Pro Arg His Glu Thr Ala Gln Gln Leu Glu Val Leu Glu Gln
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Gln Ser Thr Ser Leu Gly Gln Asp Ala Arg Arg Leu Gly Gly Gln
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Ala Val Gly Thr Arg Asp Gln Ala Ser Gln Leu Leu Ala Gly Thr
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Glu Ala Thr Leu Gly His Ala Lys Thr Leu Leu Ala Ala Ile Arg
2270 2275 2280
Ala Val Asp Arg Thr Leu Ser Glu Leu Met Ser Gln Thr Gly His
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Leu Gly Leu Ala Asn Ala Ser Ala Pro Ser Gly Glu Gln Leu Leu
2300 2305 2310
Arg Thr Leu Ala Glu Val Glu Arg Leu Leu Trp Glu Met Arg Ala
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Arg Asp Leu Gly Ala Pro Gln Ala Ala Ala Glu Ala Glu Leu Ala
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2390 2395 2400
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Leu Ser Arg Asp Asn Ala Thr Leu Gln Ala Thr Leu His Ala Ala
2420 2425 2430
Arg Asp Thr Leu Ala Ser Val Phe Arg Leu Leu His Ser Leu Asp
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Gln Ala Lys Glu Glu Leu Glu Arg Leu Ala Ala Ser Leu Asp Gly
2450 2455 2460
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2540 2545 2550
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2555 2560 2565
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Gly Leu Val Trp Ala Ala Leu Gln Gly Ala Arg Thr Gln Leu Arg
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2600 2605 2610
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Ile Ala His Ala Lys Ala Val Ala Ala Glu Ala Gln Asp Thr Ala
2630 2635 2640
Thr Arg Val Gln Ser Gln Leu Gln Ala Met Gln Glu Asn Val Glu
2645 2650 2655
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2825 2830 2835
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2900 2905 2910
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2930 2935 2940
Ser Tyr Leu Asp Gly Thr Gly Phe Ala Arg Ile Ser Phe Asp Ser
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Pro
<210> 4
<211> 555
<212> PRT
<213> 智人
<400> E-钙粘蛋白
Met Asp Trp Val Ile Pro Pro Ile Ser Cys Pro Glu Asn Glu Lys Gly
1 5 10 15
Pro Phe Pro Lys Asn Leu Val Gln Ile Lys Ser Asn Lys Asp Lys Glu
20 25 30
Gly Lys Val Phe Tyr Ser Ile Thr Gly Gln Gly Ala Asp Thr Pro Pro
35 40 45
Val Gly Val Phe Ile Ile Glu Arg Glu Thr Gly Trp Leu Lys Val Thr
50 55 60
Glu Pro Leu Asp Arg Glu Arg Ile Ala Thr Tyr Thr Leu Phe Ser His
65 70 75 80
Ala Val Ser Ser Asn Gly Asn Ala Val Glu Asp Pro Met Glu Ile Leu
85 90 95
Ile Thr Val Thr Asp Gln Asn Asp Asn Lys Pro Glu Phe Thr Gln Glu
100 105 110
Val Phe Lys Gly Ser Val Met Glu Gly Ala Leu Pro Gly Thr Ser Val
115 120 125
Met Glu Val Thr Ala Thr Asp Ala Asp Asp Asp Val Asn Thr Tyr Asn
130 135 140
Ala Ala Ile Ala Tyr Thr Ile Leu Ser Gln Asp Pro Glu Leu Pro Asp
145 150 155 160
Lys Asn Met Phe Thr Ile Asn Arg Asn Thr Gly Val Ile Ser Val Val
165 170 175
Thr Thr Gly Leu Asp Arg Glu Ser Phe Pro Thr Tyr Thr Leu Val Val
180 185 190
Gln Ala Ala Asp Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Thr Ala
195 200 205
Val Ile Thr Val Thr Asp Thr Asn Asp Asn Pro Pro Ile Phe Asn Pro
210 215 220
Thr Thr Tyr Lys Gly Gln Val Pro Glu Asn Glu Ala Asn Val Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Leu Lys Val Thr Asp Ala Asp Ala Pro Asn Thr Pro Ala Trp
245 250 255
Glu Ala Val Tyr Thr Ile Leu Asn Asp Asp Gly Gly Gln Phe Val Val
260 265 270
Thr Thr Asn Pro Val Asn Asn Asp Gly Ile Leu Lys Thr Ala Lys Gly
275 280 285
Leu Asp Phe Glu Ala Lys Gln Gln Tyr Ile Leu His Val Ala Val Thr
290 295 300
Asn Val Val Pro Phe Glu Val Ser Leu Thr Thr Ser Thr Ala Thr Val
305 310 315 320
Thr Val Asp Val Leu Asp Val Asn Glu Ala Pro Ile Phe Val Pro Pro
325 330 335
Glu Lys Arg Val Glu Val Ser Glu Asp Phe Gly Val Gly Gln Glu Ile
340 345 350
Thr Ser Tyr Thr Ala Gln Glu Pro Asp Thr Phe Met Glu Gln Lys Ile
355 360 365
Thr Tyr Arg Ile Trp Arg Asp Thr Ala Asn Trp Leu Glu Ile Asn Pro
370 375 380
Asp Thr Gly Ala Ile Ser Thr Arg Ala Glu Leu Asp Arg Glu Asp Phe
385 390 395 400
Glu His Val Lys Asn Ser Thr Tyr Thr Ala Leu Ile Ile Ala Thr Asp
405 410 415
Asn Gly Ser Pro Val Ala Thr Gly Thr Gly Thr Leu Leu Leu Ile Leu
420 425 430
Ser Asp Val Asn Asp Asn Ala Pro Ile Pro Glu Pro Arg Thr Ile Phe
435 440 445
Phe Cys Glu Arg Asn Pro Lys Pro Gln Val Ile Asn Ile Ile Asp Ala
450 455 460
Asp Leu Pro Pro Asn Thr Ser Pro Phe Thr Ala Glu Leu Thr His Gly
465 470 475 480
Ala Ser Ala Asn Trp Thr Ile Gln Tyr Asn Asp Pro Thr Gln Glu Ser
485 490 495
Ile Ile Leu Lys Pro Lys Met Ala Leu Glu Val Gly Asp Tyr Lys Ile
500 505 510
Asn Leu Lys Leu Met Asp Asn Gln Asn Lys Asp Gln Val Thr Thr Leu
515 520 525
Glu Val Ser Val Cys Asp Cys Glu Gly Ala Ala Gly Val Cys Arg Lys
530 535 540
Ala Gln Pro Val Glu Ala Gly Leu Gln Ile Pro
545 550 555
<210> 5
<211> 4024
<212> DNA
<213> 智人
<400> LIN28（LIN28A）编码
caccgctatt gtgcggggga agatgtagca gcttcttctc cgaaccaacc ctttgccttc 60
ggacttctcc ggggccagca gccgcccgac caggggcccg gggccacggg ctcagccgac 120
gaccatgggc tccgtgtcca accagcagtt tgcaggtggc tgcgccaagg cggcagaaga 180
ggcgcccgag gaggcgccgg aggacgcggc ccgggcggcg gacgagcctc agctgctgca 240
cggtgcgggc atctgtaagt ggttcaacgt gcgcatgggg ttcggcttcc tgtccatgac 300
cgcccgcgcc ggggtcgcgc tcgacccccc agtggatgtc tttgtgcacc agagtaagct 360
gcacatggaa gggttccgga gcttgaagga gggtgaggca gtggagttca cctttaagaa 420
gtcagccaag ggtctggaat ccatccgtgt caccggacct ggtggagtat tctgtattgg 480
gagtgagagg cggccaaaag gaaagagcat gcagaagcgc agatcaaaag gagacaggtg 540
ctacaactgt ggaggtctag atcatcatgc caaggaatgc aagctgccac cccagcccaa 600
gaagtgccac ttctgccaga gcatcagcca tatggtagcc tcatgtccgc tgaaggccca 660
gcagggccct agtgcacagg gaaagccaac ctactttcga gaggaagaag aagaaatcca 720
cagccctacc ctgctcccgg aggcacagaa ttgagccaca atgggtgggg gctattcttt 780
tgctatcagg aagttttgag gagcaggcag agtggagaaa gtgggaatag ggtgcattgg 840
ggctagttgg cactgccatg tatctcaggc ttgggttcac accatcaccc tttcttccct 900
ctaggtgggg ggaaagggtg agtcaaagga actccaacca tgctctgtcc aaatgcaagt 960
gagggttctg ggggcaacca ggagggggga atcaccctac aacctgcata ctttgagtct 1020
ccatccccag aatttccagc ttttgaaagt ggcctggata gggaagttgt tttcctttta 1080
aagaaggata tataataatt cccatgccag agtgaaatga ttaagtataa gaccagattc 1140
atggagccaa gccactacat tctgtggaag gagatctctc aggagtaagc attgtttttt 1200
tttcacatct tgtatcctca tacccacttt tgggataggg tgctggcagc tgtcccaagc 1260
aatgggtaat gatgatggca aaaagggtgt ttgggggaac agctgcagac ctgctgctct 1320
atgctcaccc ccgccccatt ctgggccaat gtgattttat ttatttgctc ccttggatac 1380
tgcaccttgg gtcccacttt ctccaggatg ccaactgcac tagctgtgtg cgaatgacgt 1440
atcttgtgca ttttaacttt ttttccttaa tataaatatt ctggttttgt atttttgtat 1500
attttaatct aaggccctca tttcctgcac tgtgttctca ggtacatgag caatctcagg 1560
gatagccagc agcagctcca ggtctgcgca gcaggaatta ctttttgttg tttttgccac 1620
cgtggagagc aactatttgg agtgcacagc ctattgaact acctcatttt tgccaataag 1680
agctggcttt tctgccatag tgtcctcttg aaaccccctc tgccttgaaa atgttttatg 1740
ggagactagg ttttaactgg gtggccccat gacttgattg ccttctactg gaagattggg 1800
aattagtcta aacaggaaat ggtggtacac agaggctagg agaggctggg cccggtgaaa 1860
aggccagaga gcaagccaag attaggtgag ggttgtctaa tcctatggca caggacgtgc 1920
tttacatctc cagatctgtt cttcaccaga ttaggttagg cctaccatgt gccacagggt 1980
gtgtgtgtgt ttgtaaaact agagttgcta aggataagtt taaagaccaa tacccctgta 2040
cttaatcctg tgctgtcgag ggatggatat atgaagtaag gtgagatcct taacctttca 2100
aaattttcgg gttccaggga gacacacaag cgagggtttt gtggtgcctg gagcctgtgt 2160
cctgccctgc tacagtagtg attaatagtg tcatggtagc taaaggagaa aaagggggtt 2220
tcgtttacac gctgtgagat caccgcaaac ctaccttact gtgttgaaac gggacaaatg 2280
caatagaacg cattgggtgg tgtgtgtctg atcctgggtt cttgtctccc ctaaatgctg 2340
ccccccaagt tactgtattt gtctgggctt tgtaggactt cactacgttg attgctaggt 2400
ggcctagttt gtgtaaatat aatgtattgg tctttctccg tgttctttgg gggttttgtt 2460
tacaaacttc tttttgtatt gagagaaaaa tagccaaagc atctttgaca gaaggttctg 2520
caccaggcaa aaagatctga aacattagtt tggggggccc tcttcttaaa gtggggatct 2580
tgaaccatcc tttcttttgt attccccttc ccctattacc tattagacca gatcttctgt 2640
cctaaaaact tgtcttctac cctgccctct tttctgttca cccccaaaag aaaacttaca 2700
cacccacaca catacacatt tcatgcttgg agtgtctcca caactcttaa atgatgtatg 2760
caaaaatact gaagctagga aaaccctcca tcccttgttc ccaacctcct aagtcaagac 2820
cattaccatt tctttctttc tttttttttt ttttttaaaa tggagtctca ctgtgtcacc 2880
caggctggag tgcagtggca tgatcggctc actgcagcct ctgcctcttg ggttcaagtg 2940
attctcctgc ctcagcctcc tgagtagctg ggatttcagg cacccgccac actcagctaa 3000
tttttgtatt tttagtagag acggggtttc accatgttgt ccaggctggt ctggaactcc 3060
tgacctcagg tgatctgccc accttggctt cccaaagtgc tgggattaca ggcatgagcc 3120
accatgctgg gccaaccatt tcttggtgta ttcatgccaa acacttaaga cactgctgta 3180
gcccaggcgc ggtggctcac acctgtaatc ccagcacttt ggaaggctga ggcgggcgga 3240
tcacaaggtc acgagttcaa aactatcctg gccaacacag tgaaaccccg tctctactaa 3300
aatacaaaaa aattagccgg gtgtggtggt gcatgccttt agtcctagct attcaggagg 3360
ctgaggcagg ggaatcgctt gaacccgaga ggcagaggtt gcagtgagct gagatcgcac 3420
cactgcactc cagcctggtt acagagcaag actctgtctc aaacaaaaca aaacaaaaca 3480
aaaacacact actgtatttt ggatggatca aacctcctta attttaattt ctaatcctaa 3540
agtaaagaga tgcaattggg ggccttccat gtagaaagtg gggtcaggag gccaagaaag 3600
ggaatatgaa tgtatatcca agtcactcag gaacttttat gcaggtgcta gaaactttat 3660
gtcaaagtgg ccacaagatt gtttaatagg agacgaacga atgtaactcc atgtttactg 3720
ctaaaaacca aagctttgtg taaaatcttg aatttatggg gcgggagggt aggaaagcct 3780
gtacctgtct gtttttttcc tgatcctttt ccctcattcc tgaactgcag gagactgagc 3840
ccctttgggc tttggtgacc ccatcactgg ggtgtgttta tttgatggtt gattttgctg 3900
tactgggtac ttcctttccc attttctaat cattttttaa cacaagctga ctcttccctt 3960
cccttctcct ttccctggga aaatacaatg aataaataaa gacttattgg tacgcaaact 4020
gtca 4024
<210> 6
<211> 1430
<212> DNA
<213> 智人
<400> OCT4（POU5F1）编码
agagaggggt tgagtagtcc cttcgcaagc cctcatttca ccaggccccc ggcttggggc 60
gccttccttc cccatggcgg gacacctggc ttcggatttc gccttctcgc cccctccagg 120
tggtggaggt gatgggccag gggggccgga gccgggctgg gttgatcctc ggacctggct 180
aagcttccaa ggccctcctg gagggccagg aatcgggccg ggggttgggc caggctctga 240
ggtgtggggg attcccccat gccccccgcc gtatgagttc tgtgggggga tggcgtactg 300
tgggccccag gttggagtgg ggctagtgcc ccaaggcggc ttggagacct ctcagcctga 360
gggcgaagca ggagtcgggg tggagagcaa ctccgatggg gcctccccgg agccctgcac 420
cgtcacccct ggtgccgtga agctggagaa ggagaagctg gagcaaaacc cggaggagtc 480
ccaggacatc aaagctctgc agaaagaact cgagcaattt gccaagctcc tgaagcagaa 540
gaggatcacc ctgggatata cacaggccga tgtggggctc accctggggg ttctatttgg 600
gaaggtattc agccaaacga ccatctgccg ctttgaggct ctgcagctta gcttcaagaa 660
catgtgtaag ctgcggccct tgctgcagaa gtgggtggag gaagctgaca acaatgaaaa 720
tcttcaggag atatgcaaag cagaaaccct cgtgcaggcc cgaaagagaa agcgaaccag 780
tatcgagaac cgagtgagag gcaacctgga gaatttgttc ctgcagtgcc cgaaacccac 840
actgcagcag atcagccaca tcgcccagca gcttgggctc gagaaggatg tggtccgagt 900
gtggttctgt aaccggcgcc agaagggcaa gcgatcaagc agcgactatg cacaacgaga 960
ggattttgag gctgctgggt ctcctttctc agggggacca gtgtcctttc ctctggcccc 1020
agggccccat tttggtaccc caggctatgg gagccctcac ttcactgcac tgtactcctc 1080
ggtccctttc cctgaggggg aagcctttcc ccctgtctcc gtcaccactc tgggctctcc 1140
catgcattca aactgaggtg cctgcccttc taggaatggg ggacaggggg aggggaggag 1200
ctagggaaag aaaacctgga gtttgtgcca gggtttttgg gattaagttc ttcattcact 1260
aaggaaggaa ttgggaacac aaagggtggg ggcaggggag tttggggcaa ctggttggag 1320
ggaaggtgaa gttcaatgat gctcttgatt ttaatcccac atcatgtatc acttttttct 1380
taaataaaga agcctgggac acagtagata gacacactta aaaaaaaaaa 1430
<210> 7
<211> 2520
<212> DNA
<213> 智人
<400> SOX2编码
ggatggttgt ctattaactt gttcaaaaaa gtatcaggag ttgtcaaggc agagaagaga 60
gtgtttgcaa aagggggaaa gtagtttgct gcctctttaa gactaggact gagagaaaga 120
agaggagaga gaaagaaagg gagagaagtt tgagccccag gcttaagcct ttccaaaaaa 180
taataataac aatcatcggc ggcggcagga tcggccagag gaggagggaa gcgctttttt 240
tgatcctgat tccagtttgc ctctctcttt ttttccccca aattattctt cgcctgattt 300
tcctcgcgga gccctgcgct cccgacaccc ccgcccgcct cccctcctcc tctccccccg 360
cccgcgggcc ccccaaagtc ccggccgggc cgagggtcgg cggccgccgg cgggccgggc 420
ccgcgcacag cgcccgcatg tacaacatga tggagacgga gctgaagccg ccgggcccgc 480
agcaaacttc ggggggcggc ggcggcaact ccaccgcggc ggcggccggc ggcaaccaga 540
aaaacagccc ggaccgcgtc aagcggccca tgaatgcctt catggtgtgg tcccgcgggc 600
agcggcgcaa gatggcccag gagaacccca agatgcacaa ctcggagatc agcaagcgcc 660
tgggcgccga gtggaaactt ttgtcggaga cggagaagcg gccgttcatc gacgaggcta 720
agcggctgcg agcgctgcac atgaaggagc acccggatta taaataccgg ccccggcgga 780
aaaccaagac gctcatgaag aaggataagt acacgctgcc cggcgggctg ctggcccccg 840
gcggcaatag catggcgagc ggggtcgggg tgggcgccgg cctgggcgcg ggcgtgaacc 900
agcgcatgga cagttacgcg cacatgaacg gctggagcaa cggcagctac agcatgatgc 960
aggaccagct gggctacccg cagcacccgg gcctcaatgc gcacggcgca gcgcagatgc 1020
agcccatgca ccgctacgac gtgagcgccc tgcagtacaa ctccatgacc agctcgcaga 1080
cctacatgaa cggctcgccc acctacagca tgtcctactc gcagcagggc acccctggca 1140
tggctcttgg ctccatgggt tcggtggtca agtccgaggc cagctccagc ccccctgtgg 1200
ttacctcttc ctcccactcc agggcgccct gccaggccgg ggacctccgg gacatgatca 1260
gcatgtatct ccccggcgcc gaggtgccgg aacccgccgc ccccagcaga cttcacatgt 1320
cccagcacta ccagagcggc ccggtgcccg gcacggccat taacggcaca ctgcccctct 1380
cacacatgtg agggccggac agcgaactgg aggggggaga aattttcaaa gaaaaacgag 1440
ggaaatggga ggggtgcaaa agaggagagt aagaaacagc atggagaaaa cccggtacgc 1500
tcaaaaagaa aaaggaaaaa aaaaaatccc atcacccaca gcaaatgaca gctgcaaaag 1560
agaacaccaa tcccatccac actcacgcaa aaaccgcgat gccgacaaga aaacttttat 1620
gagagagatc ctggacttct ttttggggga ctatttttgt acagagaaaa cctggggagg 1680
gtggggaggg cgggggaatg gaccttgtat agatctggag gaaagaaagc tacgaaaaac 1740
tttttaaaag ttctagtggt acggtaggag ctttgcagga agtttgcaaa agtctttacc 1800
aataatattt agagctagtc tccaagcgac gaaaaaaatg ttttaatatt tgcaagcaac 1860
ttttgtacag tatttatcga gataaacatg gcaatcaaaa tgtccattgt ttataagctg 1920
agaatttgcc aatatttttc aaggagaggc ttcttgctga attttgattc tgcagctgaa 1980
atttaggaca gttgcaaacg tgaaaagaag aaaattattc aaatttggac attttaattg 2040
tttaaaaatt gtacaaaagg aaaaaattag aataagtact ggcgaaccat ctctgtggtc 2100
ttgtttaaaa agggcaaaag ttttagactg tactaaattt tataacttac tgttaaaagc 2160
aaaaatggcc atgcaggttg acaccgttgg taatttataa tagcttttgt tcgatcccaa 2220
ctttccattt tgttcagata aaaaaaacca tgaaattact gtgtttgaaa tattttctta 2280
tggtttgtaa tatttctgta aatttattgt gatattttaa ggttttcccc cctttatttt 2340
ccgtagttgt attttaaaag attcggctct gtattatttg aatcagtctg ccgagaatcc 2400
atgtatatat ttgaactaat atcatcctta taacaggtac attttcaact taagttttta 2460
ctccattatg cacagtttga gataaataaa tttttgaaat atggacactg aaaaaaaaaa 2520
<210> 8
<211> 2078
<212> DNA
<213> 智人
<400> FOXD3编码
atgaccctct ccggcggcgg cagcgccagc gacatgtccg gccagacggt gctgacggcc 60
gaggacgtgg acatcgatgt ggtgggcgag ggcgacgacg ggctggaaga gaaggacagc 120
gacgcaggtt gcgatagccc cgcggggccg ccggagctgc gcctggacga ggcggacgag 180
gtgcccccgg cggcacccca tcacggacag cctcagccgc cccaccagca gcccctgaca 240
ttgcccaagg aggcggccgg agccggggcc ggaccggggg gcgacgtggg cgcgccggag 300
gcggacggct gcaagggcgg tgttggcggc gaggagggcg gcgcgagcgg cggcgggcct 360
ggcgcgggca gcggttcggc gggaggcctg gccccgagca agcccaagaa cagcctagtg 420
aagccgcctt actcgtacat cgcgctcatc accatggcca tcctgcagag cccgcagaag 480
aagctgaccc tgagcggcat ctgcgagttc atcagcaacc gcttccccta ctacagggag 540
aagttccccg cctggcagaa cagcatccgc cacaacctct cactcaacga ctgcttcgtc 600
aagatccccc gcgagccggg caacccgggc aagggcaact actggaccct ggacccgcag 660
tccgaggaca tgttcgacaa cggcagcttc ctgcggcgcc ggaaacgctt caagcgccac 720
cagcaggagc acctgcgcga gcagacggcg ctcatgatgc agagcttcgg cgcttacagc 780
ctggcggcgg cggccggcgc cgcgggaccc tacggccgcc cctacggcct gcaccctgcg 840
gcggcggccg gtgcctattc gcacccggca gcggcggcgg ccgcggctgc tgcggcggcg 900
ctccagtacc cgtacgcgct gccgccggtg gcaccggtgc tgcctcccgc tgtgccgctg 960
ctgccctcgg gcgagctggg ccgcaaagcg gccgccttcg gctcacagct cggcccgggc 1020
ctgcagctgc agctcaatag cctgggcgcc gccgcggccg ctgcgggcac agcgggcgcc 1080
gcgggcacca ccgcgtcgct catcaagtcc gagccaagcg cgcggccgtc gttcagcatc 1140
gagaacatca taggtggggg ccccgcggct cctgggggct cggcggtggg cgctggggtc 1200
gccggcggca ctgggggttc agggggcggc agcacggcgc agtcgtttct gcggccaccc 1260
gggaccgtgc agtcggcagc gctcatggcc acccaccaac cgctgtcgct gagccggacg 1320
actgccacca tcgcgcccat tcttagcgtg ccactctccg gacagtttct gcagcccgca 1380
gcctcggccg ccgccgctgc tgcggccgcc gctcaagcca aatggccggc gcaataggga 1440
cgcgccaatg gccgggaccc agggtccggc ggcggcctcg agcaacaaat gcacctccag 1500
gctgcgcgcc ctgtcccaag cccggtcccg gtcccgctgc ccaatcctgg actctgcctc 1560
tccccaattt cctttcccct gagcccccaa cgcctacctt ccgcggcctc catcccctcg 1620
cgcacaccta agctggtcga gcaaactcac cgcgcgcccg ccggggatag ctttccatac 1680
aggtaaaacc gaaaaccgaa ttttccaaaa atgcaccccg acggcgcctg ctcttagtac 1740
cgtggggatg ggagggaaat tctttgtata tatttgtaaa aaaattattg actttccttt 1800
tggggttttt atttttttaa gaaaaaacaa attccgtaga tttagagctc tgaactttca 1860
ttttttttga aggttcactc tccgaagttt tatctgagaa aagaatgtat agagacgttg 1920
ggagatttta aatataaaaa attttcaaaa aggcaaaaag tgtcattcta ttataaaagt 1980
ctgtttatat atgaatgaat atatatggta ttctaaatgt tattccatcg tgttgtacac 2040
aactttgtaa ataaattttt aaaatgccaa aaaaaaaa 2078
<210> 9
<211> 2103
<212> DNA
<213> 智人
<400> NANOG编码
ttcattataa atctagagac tccaggattt taacgttctg ctggactgag ctggttgcct 60
catgttatta tgcaggcaac tcactttatc ccaatttctt gatacttttc cttctggagg 120
tcctatttct ctaacatctt ccagaaaagt cttaaagctg ccttaacctt ttttccagtc 180
cacctcttaa attttttcct cctcttcctc tatactaaca tgagtgtgga tccagcttgt 240
ccccaaagct tgccttgctt tgaagcatcc gactgtaaag aatcttcacc tatgcctgtg 300
atttgtgggc ctgaagaaaa ctatccatcc ttgcaaatgt cttctgctga gatgcctcac 360
acggagactg tctctcctct tccttcctcc atggatctgc ttattcagga cagccctgat 420
tcttccacca gtcccaaagg caaacaaccc acttctgcag agaagagtgt cgcaaaaaag 480
gaagacaagg tcccggtcaa gaaacagaag accagaactg tgttctcttc cacccagctg 540
tgtgtactca atgatagatt tcagagacag aaatacctca gcctccagca gatgcaagaa 600
ctctccaaca tcctgaacct cagctacaaa caggtgaaga cctggttcca gaaccagaga 660
atgaaatcta agaggtggca gaaaaacaac tggccgaaga atagcaatgg tgtgacgcag 720
aaggcctcag cacctaccta ccccagcctt tactcttcct accaccaggg atgcctggtg 780
aacccgactg ggaaccttcc aatgtggagc aaccagacct ggaacaattc aacctggagc 840
aaccagaccc agaacatcca gtcctggagc aaccactcct ggaacactca gacctggtgc 900
acccaatcct ggaacaatca ggcctggaac agtcccttct ataactgtgg agaggaatct 960
ctgcagtcct gcatgcagtt ccagccaaat tctcctgcca gtgacttgga ggctgccttg 1020
gaagctgctg gggaaggcct taatgtaata cagcagacca ctaggtattt tagtactcca 1080
caaaccatgg atttattcct aaactactcc atgaacatgc aacctgaaga cgtgtgaaga 1140
tgagtgaaac tgatattact caatttcagt ctggacactg gctgaatcct tcctctcccc 1200
tcctcccatc cctcatagga tttttcttgt ttggaaacca cgtgttctgg tttccatgat 1260
gcccatccag tcaatctcat ggagggtgga gtatggttgg agcctaatca gcgaggtttc 1320
tttttttttt tttttcctat tggatcttcc tggagaaaat actttttttt tttttttttt 1380
tgaaacggag tcttgctctg tcgcccaggc tggagtgcag tggcgcggtc ttggctcact 1440
gcaagctccg tctcccgggt tcacgccatt ctcctgcctc agcctcccga gcagctggga 1500
ctacaggcgc ccgccacctc gcccggctaa tattttgtat ttttagtaga gacggggttt 1560
cactgtgtta gccaggatgg tctcgatctc ctgaccttgt gatccacccg cctcggcctc 1620
cctaacagct gggatttaca ggcgtgagcc accgcgccct gcctagaaaa gacattttaa 1680
taaccttggc tgccgtctct ggctatagat aagtagatct aatactagtt tggatatctt 1740
tagggtttag aatctaacct caagaataag aaatacaagt acaaattggt gatgaagatg 1800
tattcgtatt gtttgggatt gggaggcttt gcttattttt taaaaactat tgaggtaaag 1860
ggttaagctg taacatactt aattgatttc ttaccgtttt tggctctgtt ttgctatatc 1920
ccctaatttg ttggttgtgc taatctttgt agaaagaggt ctcgtatttg ctgcatcgta 1980
atgacatgag tactgcttta gttggtttaa gttcaaatga atgaaacaac tatttttcct 2040
ttagttgatt ttaccctgat ttcaccgagt gtttcaatga gtaaatatac agcttaaaca 2100
taa 2103
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<211> 6007
<212> DNA
<213> 智人
<400> PODXL编码
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aaaaaaa 6007
<210> 11
<211> 2660
<212> DNA
<213> 智人
<400> REX1（ZFP42）
agtttctcct ttgttttacg tttgggagga ggtggcattg gaaatagcag agtgcttcgc 60
ggtaacaggg gttggagtgc aatggtgtga tctcagctca ctgcaacccc tgcctcccag 120
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aattaaaaat atacttcatg gttcatgtca tagccctaga gaatgaaaaa tttgcagtag 2460
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<211> 6063
<212> DNA
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<400> SSEA1（FUT4）编码
aatccctccc tccggcgggc gtcgctggcg ggtggctagg cccaacggca ggaagccgac 60
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ttgagactgt gctatggaac caatcttgaa catacatgca ttgacttgac aagttactga 3240
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aagtcttttc ctagcagtaa tttaggggag acagaggagt ttcatgtaaa gagcatgcag 5100
tttggagtca gaacctgggt atgactctgt ggccttgatg aagcaagtta cttaaactct 5160
tgagttttag ctttctcctt tacaatgcat gaatgcctat ccccctacaa aacaaagatt 5220
aaatgtgatg atgtatgcca aggtgctttg tatattgtaa agtgctatat aattataaga 5280
tgttctaaat tttcaaggat ctaaaccagg gattggcaaa cgtttttcca gggagtaaat 5340
attttacgct ttgcatatat aatttatgga ggtgttgaga ggatagatta gacacttgaa 5400
gtactcagga tagtgcctgg catgtaggaa gcacctggaa aatattcgct gtgattacca 5460
tcagtccatt ttaccgagga aggagccaag gtccaggccc actgaaggac ttgcataaca 5520
ttacaatagc agtggcagaa ccagccatgc ttctgcaaat cacaacctct ttgagcctct 5580
gtcacctgaa ctgcaaaatg agtgggttag acaaaatcat ctgttgggac ctcctagttc 5640
cacgtgctat cattctacta actggcaccc taaggttgaa agtgcttatc tgctttccaa 5700
tgtggcttcc ttacagtctg gaactgacaa tatgcaggag cagtaaactg gcagaaaacc 5760
aggaatcaga gaaagaaaat ataatttaac tttaaagatg taaattatat atatagtata 5820
ttatatatat ttttaaagct ttatatgcct caaatatcag ggaaaggagc caagtccttg 5880
gtatttagtt tggtgaatac ttgcattgaa tacatgtcaa gatgtcaagt catttttgaa 5940
tgtgtctcag ggatttctat gctacacatt cttttaacaa atcaagtatt tatgtacaca 6000
tgttcagatt ttttgacaaa atgattaaaa taatgagatg gaaaatgaaa aaaaaaaaaa 6060
aaa 6063
<210> 13
<211> 1393
<212> DNA
<213> 智人
<400> DPPA2编码
agccctttgt ttatggcctg atctagctaa ggcttctaga cttcaggagc ttaagaatcg 60
tccggagggc tgggcgtggc ggtgcaggcc tgtagtccca cccactccga aggctgcgga 120
gggaggatca acttgagtct gggaactcag ccaggaattc aagaccagcc tgggcaacac 180
agtgaggccc cctacccaca tcctctccgt ccccgcaatc tccttccatc ccagggtgtt 240
gctgaaaatg tcagatgcaa atttggatag cagcaagaag aatttcttgg agggggaagt 300
agatgatgag gaaagtgtga ttttgacact ggtgccagtt aaagatgacg caaatatgga 360
acaaatggaa ccaagcgttt cttcaacttc tgatgtcaaa ctggagaagc ctaagaaata 420
caatccaggt catctacttc aaacaaatga gcaatttaca gctccacaaa aagctagatg 480
caaaatacca gcccttccct tgccgaccat tttgcctccc attaataagg tgtgtcggga 540
cactttgcgg gactggtgtc aacaactcgg tttgagtact aatggcaaga aaatcgaagt 600
ttatctgagg cttcataggc atgcttaccc tgaacaacgg caagatatgc ctgaaatgtc 660
acaagagacc agattacagc gatgttcgag gaaacgcaag gcagtgacca agagagcaag 720
gcttcagaga agttatgaga tgaatgagag agcagaagag accaatacag ttgaagtgat 780
aacttcagca ccgggagcca tgttggcatc atgggcaaga attgctgcaa gagctgttca 840
gcctaaggct ttgaattcat gttccattcc tgtttctgtt gaggcctttt tgatgcaagc 900
ctctggcgtc aggtggtgtg tggtccatgg cagacttctc tcggcagaca caaagggttg 960
ggtacgcctg cagtttcatg caggtcaggc ctgggtgcct accactcaca ggaggatgat 1020
ttctctcttc ttgttacctg cctgcatttt cccatcccca ggcatagaag ataatatgtt 1080
atgccccgac tgtgctaaga ggaataagaa gatgatgaaa agattaatga cagtagagaa 1140
gtagcagcaa cctgtttgaa tacaatgtac taaaggaggg atgtactttc agatcatgta 1200
acctattacg aaggagtgga agaggagaca atttgaatga atcctcatga tctacaaaac 1260
aaaatcatag tgactaggac tccacagtga agatggttga ctagtgacac agccccatct 1320
aaagaatccc tttctgtatg tctgaaaacc cattaaaata aagtcactgc aattggcctt 1380
gtaaaaaaaa aaa 1393
<210> 14
<211> 1079
<212> DNA
<213> 智人
<400> DPPA3编码
tggagctccg gttttcagcc tctttccggg ctacctggta gcaatttgag gctctgtcat 60
cagtttctgc tacgtttcaa agatcctgga gaagcctagt gttgtgtcaa gacgccgatg 120
gacccatcac agtttaatcc aacctacatc ccagggtctc cacaaatgct caccgaagaa 180
aattcccggg acgattcagg ggcctctcaa atctcctccg agacgttgat aaagaacctt 240
agtaacttga ctatcaacgc tagtagcgaa tctgtttccc ctctatcgga agctttactc 300
cgtcgagagt ctgtaggagc agcagtcctc agggaaatcg aagatgagtg gctttacagc 360
aggagaggag taagaacatt gctgtctgtg cagagagaaa agatggcaag attgagatac 420
atgttactcg gcggagttcg tacgcatgaa agaagaccaa caaacaagga gcctaaggga 480
gttaagaagg aatcaagacc attcaaatgt ccctgcagtt tctgcgtgtc taatggatgg 540
gatccttctg agaatgctag aatagggaat caagacacca agccacttca gccataaatc 600
ttattcttgc accttttttt cttggtagta attttatata gcaggttgag aaagctactc 660
tatgctagta tagactatac accaataatt ttgataatga gttctaggat gtatttttct 720
tgtatctttt tcttcctact atgatactag taattcataa gggatctgtg taatctgaat 780
gtatttgaat aactttagct ctactgtttg atttgaccca aagaagccaa gatgatataa 840
gtattcccat gtgtcttaga agcccaaagt cagtgagatg aaacccaaca tcaagaaatt 900
gaagcaaagt tacttatgga taaagaaagc attaggtagt tgggctatag cataattaga 960
ttttctggct ttcaaaaatt tggattgcaa tcacagcaaa ctttgttatt tttacagttt 1020
tcagtacaaa agtgtttata tagaaacaat aaagttgaca tttgagtacc ttttaaaaa 1079

Claims (21)

1.一种用于从多能干细胞(PSC)分化的细胞的培养物中定量残留的未分化PSC的方法，该方法包括：
在涂覆有层粘连蛋白-521和E-钙粘蛋白的基底上在包含Rho关联的含卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)抑制剂Y27632的培养基中培养包含存在所述未分化PSC的分化细胞，其中所述存在的未分化PSC被选择性扩增；
对包含存在所述未分化PSC的所培养的、分化的细胞中残留的未分化PSC的标记物的表达进行定量；并且
将包含存在所述未分化PSC的所培养的、分化的细胞中的该标记物表达与在用包含已知比例的未分化PSC“加标”的参比细胞培养物中的标记物表达进行比较，
其中该包含存在所述未分化PSC的分化细胞的培养物中的标记物表达低于该用包含已知比例的未分化PSC“加标”的参比细胞培养物中的标记物表达表明：所培养的分化的细胞中不存在残留的未分化PSC或者所培养的细胞中残留的未分化PSC的存在比例低于在该参比细胞培养物中未分化的PSC的该加标已知比例。
2.权利要求1的方法，其中该标记物表达是LIN28、OCT4、SOX2、FOXD3、NANOG、PODXL、REX1、SSEA1、SSEA4、DPPA2或DPPA3表达。
3.权利要求1或2的方法，其中将该细胞在约10μM Y27632中培养。
4.权利要求1或2的方法，该方法包括将该细胞在包含Y27632的该培养基中培养约3天。
5.权利要求4的方法，其还包括将该细胞在包含Y27632的该培养基中培养之后，在不包含ROCK抑制剂的培养基中培养约2天。
6.权利要求1或2的方法，其中通过聚合酶链式反应(PCR)对该标记物表达进行定量。
7.权利要求6的方法，其中该PCR是定量实时PCR(qRT-PCR)。
8.权利要求7的方法，其中该qRT-PCR包含由5'→3'序列CGCATGGGGTTCGGCTTCCTGTCC(SEQ ID NO:15)组成的探针、由5'→3'序列CACGGTGCGGGCATCTG(SEQ ID NO:16)组成的引物、和由5'→3'序列CCTTCCATGTGCAGCTTACTC(SEQ ID NO:17)组成的引物。
9.权利要求1或2的方法，其中将该标记物表达归一化。
10.权利要求9的方法，其中将该标记物表达归一化至GAPDH表达。
11.权利要求1或2的方法，其中该已知比例是0.001％。
12.权利要求1或2的方法，其中该PSC是iPSC。
13.权利要求1或2的方法，其中该分化的细胞是MSC。
14.权利要求13的方法，其中将该MSC在E8完全培养基中培养。
15.权利要求1或2的方法，其还包括将其中残留的未分化PSC不存在或低于该加标的已知比例的该分化细胞的培养物配制成治疗组合物。
16.一种用于制造治疗组合物的方法，该方法包括将其中当通过权利要求1至14中任一项的方法检测时残留的未分化PSC不存在或低于加标的已知比例的分化细胞的培养物配制成用于向受试者治疗性给予的组合物。
17.其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例的细胞培养物在制造用于治疗或预防受试者的病症的药物中的用途，其中在从PSC分化的该细胞培养物中残留的未分化PSC是通过权利要求1至14中任一项的方法检测的。
18.权利要求17的用途，其中该病症选自骨囊肿、骨肿瘤、骨折、软骨缺损、骨关节炎、韧带损伤、成骨不全、骨坏死、骨质疏松症、再生障碍性贫血、移植物抗宿主病(GvHD)、骨髓增生异常综合症、1型糖尿病、2型糖尿病、自身免疫性肝炎、肝硬化、肝功能衰竭、扩张型心肌病、心力衰竭、心肌梗死、心肌缺血、克罗恩病、溃疡性结肠炎、灼伤、大疱性表皮松解症、红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、系统性硬化症、支气管肺发育异常、慢性阻塞性气道疾病、肺气肿、肺纤维化、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默病、脑损伤、共济失调、退行性椎间盘疾病、多系统萎缩症、多发性硬化症、帕金森病、视网膜色素变性、罗姆伯格病、脊髓损伤、卒中、肌肉营养不良、肢体缺血、肾损伤、狼疮性肾炎、子宫内膜异位以及骨髓或实体器官移植并发症。
19.一种用于检测从PSC分化的细胞培养物中残留的未分化PSC的试剂盒，该试剂盒包含：
层粘连蛋白-521；和
E-钙粘蛋白；和
ROCK抑制剂Y27632；和
PCR引物和任选地PCR探针，该PCR探针用于对在所培养的细胞中残留的未分化PSC的标记物表达进行定量。
20.权利要求19的试剂盒，其还包含培养基，该培养基任选地包含Y27632。
21.权利要求19或20的试剂盒，其还包含基底，该基底任选地涂覆有该层粘连蛋白-521和该E-钙粘蛋白。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3743531A1 (en) * 2018-01-22 2020-12-02 Sistemic Scotland Ltd Cell contamination assay
TW202045716A (zh) 2019-02-28 2020-12-16 澳大利亞商辛那塔治療有限公司 用於改善間葉幹細胞之血管生成潛力的方法
JP2023516672A (ja) * 2020-03-02 2023-04-20 ノヴォ ノルディスク アー／エス 汚染性残留未分化多能性幹細胞を検出するための多能性マーカーの使用
CN111996241A (zh) * 2020-08-13 2020-11-27 北京呈诺医学科技有限公司 一种使用ESRG基因作为通用标记基因的iPSC残留检测方法
AU2022232596A1 (en) * 2021-03-08 2023-10-19 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Markers specific for pluripotent stem cells, and methods of using the same
CN113355433B (zh) * 2021-06-02 2022-07-19 呈诺再生医学科技(珠海横琴新区)有限公司 一种基于单细胞测序数据分析的iPSC残留检测方法
CN115992210A (zh) * 2021-10-18 2023-04-21 珠海横琴爱姆斯坦生物科技有限公司 一种高灵敏度检测细胞群中极少量杂细胞的方法
CN114150074A (zh) * 2021-12-20 2022-03-08 安徽中盛溯源生物科技有限公司 Tdgf1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用
CN114164258B (zh) * 2021-12-22 2022-08-19 北京泽辉辰星生物科技有限公司 一种多能性基因表达水平检验方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013041961A1 (en) * 2011-09-22 2013-03-28 Karl Tryggvason Cell culture substrate comprising a laminin and a cadherin
WO2014037807A2 (en) * 2012-09-07 2014-03-13 Biolamina Ab Stem cell bank
WO2015065537A1 (en) * 2013-11-01 2015-05-07 Janssen Biotech, Inc. Suspension and clustering of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cells
CN105814192A (zh) * 2013-10-09 2016-07-27 加利福尼亚大学董事会 哺乳动物视网膜干细胞产生方法和应用
EP3059307A1 (en) * 2015-02-20 2016-08-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of a laminin for differentiating pluripotent cells into hepatocyte lineage cells

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1412479A4 (en) 2001-07-12 2004-07-28 Geron Corp CELLS WITH CARDIOMYOCYTE GENERATION PRODUCED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS
KR101921350B1 (ko) * 2010-12-17 2018-11-22 바이오라미나 에이비 인간 다능성 줄기세포를 유지하기 위한 시스템
WO2013192005A2 (en) 2012-06-14 2013-12-27 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells
KR101516352B1 (ko) * 2013-04-19 2015-05-04 차의과학대학교 산학협력단 인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013041961A1 (en) * 2011-09-22 2013-03-28 Karl Tryggvason Cell culture substrate comprising a laminin and a cadherin
CN104364263A (zh) * 2011-09-22 2015-02-18 卡尔·特吕格瓦松 含有层粘连蛋白和钙粘蛋白的细胞培养基底
WO2014037807A2 (en) * 2012-09-07 2014-03-13 Biolamina Ab Stem cell bank
CN105814192A (zh) * 2013-10-09 2016-07-27 加利福尼亚大学董事会 哺乳动物视网膜干细胞产生方法和应用
WO2015065537A1 (en) * 2013-11-01 2015-05-07 Janssen Biotech, Inc. Suspension and clustering of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cells
EP3059307A1 (en) * 2015-02-20 2016-08-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of a laminin for differentiating pluripotent cells into hepatocyte lineage cells

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
" A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system";Tano K等;《PLoS One》;20141027;第9卷(第10期);e110496 *
"A High Proliferation Rate is Critical for Reproducible and Standardized Embryoid Body Formation from Laminin-521-Based Human Pluripotent Stem Cell Cultures";Dziedzicka D等;《Stem Cell Rev Rep.》;20160831;第12卷(第6期);721-730 *
"An Engineered N-Cadherin Substrate for Differentiation, Survival, and Selection of Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Progenitors";Haque A等;《PLoS One》;20150831;第10卷(第8期);e0135170 *
"Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment";Rodin, S等;《Nat Commun》;20140127;第5卷;3195 *
"Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum";Nagaoka M等;《BMC Dev Biol.》;20100630;第10卷;60 *
"Highly sensitive droplet digital PCR method for detection of residual undifferentiated cells in cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells";Kuroda T等;《Regen Ther》;20151027;第2卷;17-23 *
"Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells";Kuroda T等;《PLoS One》;20121231;第7卷(第5期);e37342 *
"ROCK inhibition enhances the recovery and growth of cryopreserved human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells";Claassen DA等;《Mol Reprod Dev》;20090831;第76卷(第8期);722-732 *
"两种化学小分子诱导猪胚胎成纤维细胞重编程为脂肪细胞";朱建国;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20120915(第9期);D050-30 *

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