CN110573151A - 用于治疗急性髓性白血病的方法、试剂和组合物 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种治疗患有特征在于10‑11易位(TET1)过表达的病症的受试者的方法，该方法包括对所述受试者施用有效量的具有式I的化合物(即式(I))或其可药用盐，其中：R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自H、羟基、烷基、烷氧基、胺、卤素和三氟甲基，并且其中R1、R2、R3、R4和R5中任何两个相邻的基团可共同形成杂环；R6是H或羟基；和R7选自H、式(II)和式(III)，其中R8是C或O。本申请还提供了通过施用有效量的式I化合物和包含式I化合物的药物组合物而在受试者中选择性抑制TET1的转录和/或降低5‑羟基甲基胞嘧啶水平的方法。

Description

用于治疗急性髓性白血病的方法、试剂和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求与2017年4月26日提交的美国临时专利申请序列号62/490,184的优先权，该申请在此通过引用以其整体并入。
政府权利
本发明是在National Institutes of Health(美国国立卫生研究院)授予的R01CA-211614、R01 CA-178454和R01 CA-182528的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定权利。
技术领域
本公开涉及癌症治疗领域。更具体而言，本公开涉及用于治疗与10-11易位1(TET1)相关的癌症(特别是急性髓性白细胞(AML))的苯并二氧杂环戊烯化合物及其组合物和方法。
背景技术
急性髓性白血病(AML)是造血系统恶性肿瘤中最常见和致命的形式之一。尽管通过采用标准化疗，风险分层和治疗适应策略(treatment-adapted strategy)而有所改善，仍仅有35％-40％的青年AML患者(年龄<60)和5％-15％的老年AML患者(年龄≥60)能生存5年以上。许多AML亚型(诸如，MLL-重排型AML)通常与不良结果相关。此外，现在的治疗通常涉及使用多周期大剂量阿糖胞苷(Ara-C)进行缓解后的强化治疗，这会损害患者的生存质量。AML的发病率随着年龄持续升高，而大部分老年患者不能承受强化化疗，并且生存率非常差。因此，迫切需要使用较少强化治疗但具有更高治愈率的改善的治疗策略。
10-11易位(TET)蛋白质(包括TET1/2/3)被认为能够转化5-甲基胞嘧啶(5mC)为5-羟基甲基胞嘧啶(5hmC)，导致DNA去甲基化。TET家族的创始成员TET1首先被鉴定为是与AML中t(10；11)(q22；q23)相关的MLL基因的融合伴侣。与在各种实体肿瘤中报道的所有三种TET基因的下调和潜在肿瘤抑制作用以及在造血系统恶性肿瘤中观察到的TET2的阻遏和肿瘤抑制作用相反，本发明人最近发现TET1在MLL-重排型AML中显著上调，并且在MLL-融合-诱发的白血病的发展中具有重要的致癌作用。Zhao等人的独立研究证实了Tet1在髓性恶性肿瘤的发展中的重要致癌作用(Zhao,et al。,Zhao,et al。,Combined Loss of TET1 andTet2 Promotes B Cell,but Not Myeloid Malignancies,in Mice,Cell Rep 13：1692-1704(2015))。考虑到Tet1表达的敲除仅对包括造血作用在内的正常发育具有极小影响的事实，TET1因此是有吸引力的AML治疗靶点。仍然需要针对急性髓性白血病(AML)的有效疗法。
发明内容
因此，通过一系列体外药物筛选和体内临床前动物模型试验，已鉴定了一类苯并二氧杂环戊烯化合物是有效的抑制剂，其显著且选择性地抑制具有高水平TET1表达的AML细胞(即，高TET1型AML细胞)的活力并显著抑制小鼠中高TET1型AML的进展。这些化合物直接结合STAT3/5作为STAT抑制剂，由此抑制TET1转录和TET1信号传导，导致有效的抗-白血病作用。
在一个实施方式中，提供了一种治疗急性髓性白血病的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用有效量的具有下式的化合物或其可药用盐：
其中：
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自H、羟基、烷基、烷氧基、胺、卤素和三氟甲基，并且其中R1、R2、R3、R4和R5中任何两个相邻的基团可共同形成杂环；
R6是H或羟基；和
R7选自H、其中R8是C或O。
在另一个实施方式中，提供了一种药物组合物，其包含：(a)有效量的式I化合物或其可药用盐；和(b)至少一种可药用载体。
通过阅读以下详细描述和所附如权利要求，这些和其他目的、特征、实施方式和优点对于本领域普通技术人员变得显而易见。
附图简述
图1.NSC-311068和NSC-370284抑制具有高TET1水平的AML细胞的活力。(a-b)将包括MONOMAC-6、THP-1、KOCL-48和KASUMI-1的高TET1型AML细胞系连同低TET1型对照细胞系(即，NB4)一起用NSC-311068(a)或NSC-370284(b)以所示剂量(0、50、200、500nM)处理。在处理后48小时通过MTS分析细胞活力。(c)NSC-311068和NSC-370284在AML细胞系中对TET1表达的抑制。细胞用DMSO或者300nM NSC-311068或NSC-370284处理。在处理后48小时通过qPCR检测TET1表达水平。(d)NSC-311068和NSC-370284(均为300nM)在THP-1(左图)和MONOMAC-6(右图)细胞中抑制总体5hmC水平。(e,f)用DMSO或者25nM NSC-311068或NSC-370284处理MONOMAC-6、THP-1和KOCL-48细胞。在处理后24小时检测TET1表达水平(e)和细胞活力(f)。*，P<0.05，双尾t-检验。MM6，MONOMAC-6。误差线表示一式三份实验的SD。
图2.NSC-311068和NSC-370284在体内对AML的治疗作用。(a)给药NSC-311068或NSC-370284抑制了MLL-AF9-AML。向二次BMT的受体小鼠移植从原发性MLL-AF9 AML小鼠收集的白血病BM母细胞。在白血病发作后，用DMSO(对照；n＝5)、2.5mg/kg NSC-311068(n＝5)或NSC-370284(n＝7)治疗受体小鼠，每日1次腹膜内注射(i.p.)，进行10日。显示了Kaplan-Meier曲线。通过对数秩检验(log-rank test)测定P值。(b)对经治疗的或对照白血病小鼠的小鼠外周血(PB)和BM进行的Wright-Giemsa染色或者对小鼠脾脏和肝脏进行的苏木精和曙红(H&E)染色。(c,d)经治疗的或对照白血病小鼠的BM母细胞中的Tet1/2/3基因表达水平(c)或Tet1蛋白水平(d)。*，P<0.05，双尾t-检验。误差线表示一式三份实验的SD。(e)NSC-311068和NSC-370284对AE9a-AML小鼠模型的作用。对二次BMT的受体小鼠移植从原发性AE9a-AML小鼠收集的白血病BM母细胞。在白血病发作后，用DMSO(对照；n＝5)，2.5mg/kgNSC-311068(n＝6)或NSC-370284(n＝6)治疗受体小鼠，每日1次腹膜内注射，进行10日。显示了Kaplan-Meier曲线。通过对数秩检验测定P值。
图3.STAT3和STAT5是NSC-370284在AML中的潜在直接靶标。(a)通过IPA鉴定的上层网络，涉及携带THP-1NSC-370284-耐药性克隆中重复突变的所有14个基因。带有突变的基因以粗体标记。(b)STAT3和/或STAT5的敲除降低了TET1水平。MONOMAC-6、THP-1和NB4细胞用对照siRNA(siNC)、siSTAT3、siSTAT5或siSTAT3与siSTAT5的组合电穿孔。在转染后48小时通过qPCR检测TET1表达水平。(c)设计用于ChIP-qPCR分析以识别STAT3和STAT5在TET1启动子和其他区域上的潜在结合位点的四个基因组位点。(d-h)MONOMAC-6细胞(d-g)用DMSO对照或500nM NSC-370284处理。在药物处理之后48小时进行ChIP-qPCR测定。显示了STAT3、STAT5或IgG在TET1启动子区域和其他区域的富集。NB4细胞(h)用作负对照物。(i)DNA(上图)或NSC-370284(下图)与DNA-结合结构域(DBD)(其在STAT3和STAT5蛋白之间保守)的预期结合，来自对PDB ID 1bg1的使用MolSoft ICM的对接研究。(j)STAT3和NSC-370284之间的缔合，通过NMR化学位移扰动(CSP)测定。与化合物370284形成的复合物在STAT3的Ile残基处以1:2的蛋白:配体摩尔比引发大量的CSP(红色峰：游离STAT3；绿色峰：STAT3-NSC-370284复合物)。CSP发生在邻近DNA结合位点(I464)的残基处以及位于或靠近DBD的残基处。(k)NSC-370284抑制STAT3与TET1 CpG岛之间的结合，其通过EMSA测定。*，P<0.05；**，P<0.01，双尾t-检验。误差线表示一式三份实验的SD。
图4.UC-514321(NSC-370284的结构类似物)在治疗AML中的作用。(a)NSC-370284和UC-514321的结构。(b-e)NSC-370284、UC-514321和其他JAK/STAT途径抑制剂(即，帕克替尼(Pacritinib)、KW-2449、Stattic和sc-355979)对AML细胞系MONOMAC-6(b)、THP-1(c)、KASUMI1(d)和NB4(e)的活力的作用。细胞用所示剂量的药物处理。在处理后48小时通过MTS检测细胞活力。误差线表示一式三份实验的SD。(f,g)UC-514321相对于NSC-370284在体内治疗高TET1型AML中的增强治疗作用。向二次BMT受体小鼠移植具有MLL-AF9(f)或AML-ETO9a(g)的原发性白血病BM细胞。在白血病发作后，受体小鼠用DMSO(对照)(n＝5)、2.5mg/kg NSC-370284(n＝6)或UC-514321(n＝6)治疗，每日1次腹膜内注射，进行10日。显示了Kaplan-Meier曲线。通过对数秩检验测定P值。(h,i)NSC-370284和UC-514321在治疗MLL-AF10AML(h)和FLT3-ITD/NPM1mut AML(i)中的治疗作用。向二次BMT受体小鼠移植具有MLL-AF10或FLT3-ITD/NPM1mut原发性白血病BM细胞。在白血病发作后，受体小鼠用DMSO(对照)(对于每个模型，n＝6)、2.5mg/kg NSC-370284(n＝5)或UC-514321(n＝5)治疗，每日1次腹膜内注射，进行10日。显示了Kaplan-Meier曲线。通过对数秩检验测定P值。(j)在使用或不使用药物治疗的情况下对MLL-AF9 AML二次BMT受体的小鼠PB和BM进行的Wright-Giemsa染色或者对小鼠脾脏和肝脏进行的H&E染色。
图5.NSC-370284和UC-514321在高TET1型AML及其抗-白血病作用中作为TET1-转录抑制剂的功能是TET1-依赖性的。(a)NSC-370284和UC-514321抑制TET1而非TET2或TET3的转录。MONOMAC-6细胞用DMSO对照、500nM NSC-370284或UC-514321处理48小时。显示了基因表达水平。(b)NSC-370284和UC-514321在TET1的下游基因靶中的作用。(c)NSC-370284和UC-514321在MONOMAC-6细胞中抑制总体5hmC水平。(d)STAT3和UC-514321之间的缔合，通过NMR CSP测定。(e-h)MONOMAC-6细胞用DMSO对照、500nM NSC-370284或UC-514321处理。在药物处理之后48小时进行ChIP-qPCR测定。显示了STAT3、STAT5或者IgG在TET1启动子区域和其他区域中的富集。(i-l)NSC-370284和UC-514321的功能取决于Tet1表达。用MLL-AF9对野生型或TET1-/-小鼠的BM祖细胞进行逆转录病毒转导。感染的细胞用NSC-370284、UC-514321和其他JAK/STAT途径抑制剂(即，帕克替尼、KW-2449、Stattic和sc-355979)以所示剂量(i,j)或以特定剂量(即，500nM；k,l)处理48小时。显示了相对细胞活力。(m)用MLL-AF9对Cre-TET1fl/fl小鼠BM祖细胞进行逆转录病毒转导。经转导的细胞用聚肌胞(poly：C)诱导7日，随后用500nM NSC-370284、UC-514321或者DMSO对照处理48小时。显示了相对细胞活力。(n-o)THP-1(n)和MONOMAC-6(o)细胞用基于pLenti-puro载体的Tet1构建物的慢病毒感染。将用或不用多西环素诱导的细胞用250nM NSC-370284、UC-514321或DMSO对照处理24小时。显示了相对细胞活力。*，P<0.05；**，P<0.01，双尾t-检验。误差线表示一式三份实验的SD。
图6.NSC-370284或UC-514321与柔红霉素(DNR)和Ara-C在体外和体内治疗高TET1型AML中的协同作用。(a)耐NSC-370284的AML细胞对DNR敏感。将THP-1NSC-370284-耐药性克隆中的三种(DRC-1-3)和亲本对照用DNR以所示剂量处理。在处理后48小时检测细胞活力。(b,c)THP-1(b)和Kasumi-1(c)细胞用DMSO(对照)、25nM NSC-370284(上图)或UC-514321(下图)和/或100nM DNR处理。显示了药物处理后48小时的相对细胞活力。误差线表示一式三份实验的SD。(d)NSC-370284或UC-514321与标准化疗组合的协同治疗。向二次BMT受体小鼠移植原发性MLL-AF9白血病BM细胞。在白血病发作后，小鼠用DMSO(对照)、仅"5+3"方案(即，50mg/kg Ara-C的日剂量进行5日，并且在Ara-C治疗的最初3日同时给予3mg/kgDNR的日剂量)或者"5+3"方案结合10日NSC-370284或UC-514321治疗来治疗，每日1次，腹膜内注射2.5mg/kg。每组包含5-9只小鼠。显示了Kaplan-Meier曲线。通过对数秩检验测定P值。(e)对用“5+3”单独或组合疗法治疗的MLL-AF9二次BMT受体的小鼠PB和BM进行的Wright-Giemsa染色或者对小鼠脾脏和肝脏进行的H&E染色。
图7.TET1在TCGA数据库中的表达谱。通过cBioPortal网站分析TET1基因表达水平。
图8.对在NCI-60样本集中显示出药物反应与TET1水平之间呈正相关的前20种化合物的细胞活力筛选。MONOMAC-6(MMC6)、THP-1、KOCL-48和KASUMI-1细胞各自用前20种候选化合物以所示剂量处理48小时。显示了热图(a)和剂量曲线(b-e)。
图9.TET1在t(8；21)AML中的高表达和致癌作用。(a-c)t(8；21)AML和其他AML亚型或正常对照(NC)样品之间的TET1表达的比较。(a)在109个样品的内部(in-house)数据组中，包含30个t(8；21)样品，12个MLL-重排(MLL)样品，27个inv(16)样品，31个t(15；17)AML样品，以及9个正常对照(NC)样品。(b)在518个样品的荷兰数据组(GSE14468)中，包含38个t(8；21)样品，19个MLL-重排样品，42个inv(16)样品，25个t(15；17)样品，214个正常核型(NK)样品，以及180个其他AML样品。(c)在179个样品的TCGA数据组中，包含7个t(8；21)样品，11个MLL-重排样品，11个inv(16)样品，16个t(15；17)样品，75个正常核型(NK)样品，以及59个其他AML样品。使用双尾t-检验计算P值。条形显示中值。(d)Tet1敲除抑制了t(8；21)融合-诱导的细胞转化。用MSCV-PIG-AE(AE)或者MSCV-PIG-AE9a(AE9a)转导的野生型或TET1-/-小鼠BM祖细胞的集落形成/重铺测定。用MSCV-PIG转导的野生型细胞用作负对照物。**，P<0.01，双尾t-检验。
图10.NSC-370284通过靶定STAT3/5调节TET1表达。(a)将THP-1亲本细胞或代表性的耐药克隆(即，DRC-1、2、3)用NSC-370284以所示剂量处理48小时。显示了相对细胞活力。(b)THP-1亲本细胞或耐药克隆用DMSO对照或500nM NSC-370284处理48小时。显示了TET1转录物水平。(c)用MSCV-PIG-JAK1A839G突变体(Mut)或MSCV-PIG载体(对照)转导并随后用DMSO或NSC-370284(50nM)处理48小时的MLL-AF9-AML细胞的相对活力。(d)用pLJM1-MSH3V600I或pLJM1-EGFP对照转导并随后用DMSO或NSC-370284(50nM)处理48小时的THP-1细胞的相对活力。(e-h)MONOMAC-6、THP-1和NB4细胞用对照siRNA(siNC)、siSTAT3或者siSTAT5转染。在转染后48小时通过qPCR检测STAT5(e)、STAT3(f)、TET2(g)和TET3(h)的表达水平。(i)THP-1细胞用对照siRNA(siNC)、siTET1、siJAK1或siSTAT5转染。在转染后48小时通过qPCR检测基因表达水平。MONOMAC-6细胞用DMSO对照或500nM NSC-370284处理。(j)在药物处理后48小时进行ChIP-qPCR测定。显示了TET1或IgG在JAK1启动子区域和其他区域中的富集。(k)MONOMAC-6细胞用250nM NSC-370284处理0分钟、15分钟、30分钟、2小时和24小时。随后检测蛋白质水平。(l,m)THP-1细胞用DMSO或25nM NSC-370284处理24小时。通过qPCR检测TET1、HIF2α、IL2RA和FRA2(l)的表达水平。通过ChIP-qPCR测定检测STAT5在TET1(位点2；CpG)、HIF2α、IL2RA和FRA2(m)的启动子上的富集。*，P<0.05；**，P<0.01，双尾t-检验。误差线表示一式三份实验的SD。
图11.30种NSC-370284类似物对MONOMAC-6细胞活力的作用。MONOMAC-6细胞用30种候选类似物以所示剂量独立处理48小时。显示了相对细胞活力(与DMSO处理的对照组相比)的热图。
图12.NSC-370284或UC-514321-处理的AML细胞和对照(DMSO-处理的)细胞之间的5hmC富集的比较。(a)用NSC-370284或UC-514321或者DMSO(对照)处理的ML-2AML细胞中整个基因组上的5hmC峰数的比较。显示了不同IDR截断值的5hmC峰数。(b)5hmC富集区域上的读取密度。生成了5hmC富集区域的统一目录。显示了通过5hmC-Seal样品的每百万映射读取的外显子模型的每千碱基读数(RPKM)减去输入样品的RPKM来排序的热图。(c)所有RefSeq基因上的读取密度。显示了所有RefSeq基因座和5kb侧翼区域(减去输入值)的5hmC读取密度变化的热图。
图13.与NSC-370284和UC-514321不同，一组JAK/STAT抑制剂的作用是TET1-依赖性较低的。(a-d)野生型或TET1-/-小鼠的祖细胞用MLL-AF9进行逆转录病毒转导。感染细胞用200nM JAK/STAT抑制剂(包括帕克替尼(a)、KW-2449(b)、Stattic(c)或sc-355979(d))独立处理48小时。显示了相对细胞活力。(e)用MLL-AF9对Cre-TET1fl/fl小鼠BM祖细胞进行逆转录病毒转导。转导细胞用聚肌胞诱导7日，并随后用500nM NSC-370284、UC-514321或者DMSO对照处理48小时。显示了细胞活力(标准化为用DMSO对照处理的无诱导的Cre-TET1fl/fl)。'K，P<0.05；'K'K，P<0.01，双尾t-检验
图14.AML细胞和正常造血干/祖细胞(HSPC；在本文中，c-Kit+BM祖细胞)之间的NSC-370284和UC-514321的作用的比较。将具有MLL-AF9融合(MA9-AML)或FLT3-ITD/NPM1mut的白血病小鼠的BM细胞和来自6只健康供体小鼠的c-Kit+HSPC在液体培养基中培养。细胞用50nM NSC-370284、UC-514321或者作为对照的DMSO处理。在细胞接种或药物处理之后3日进行MTS(a)、凋亡测定(b)和qPCR(c)。误差线表示一式三份实验的SD。
图15.NSC-370284和UC-514321的急性毒性曲线。对野生型小鼠(每组n＝5)注射DMSO(对照)、2.5mg/kg NSC-370284或UC-514321，每日1次腹膜内注射，进行10日。在最后一次施用之后24小时，分析体重(a)，脾脏重量(b)，肝脏重量(c)，全外周血白细胞(PB WBC)计数(d)，BM Mac1+Gr1+(e)，Mac1+Gr1-(f)，Mac1-Gr1+(g)，和c-Kit+(h)种群。
图16.NSC-370284和UC-514321的长期毒性曲线。对野生型C57BL/6小鼠(每组n＝5)注射DMSO(对照)、2.5mg/kg NSC-370284或UC-514321，每日1次腹膜内注射，进行10日。在最后一次注射之后200日，分析体重(a)，脾脏重量(b)，肝脏重量(c)，全外周血白细胞计数(d)，BM Mac1+Gr1+(e)，Mac1+Gr1-(f)，Mac1-Gr1+(g)，和c-Kit+(h)种群。
图17.腹膜内注射之后的UC-514321的血液浓度。误差线表示一式三份实验的SD。
图18.标准化疗试剂对于THP-1NSC-370284-耐药性克隆的细胞活力的作用。三种代表性的THP-1NSC-370284-耐药性克隆(DRC-1-3)和亲本对照用阿糖胞苷(AraC)(a)、全反式视黄酸(ATRA)(b)、氮杂胞苷(AZA)(c)和地西他滨(DAC)(d)以所示剂量处理。在处理后48小时检测细胞活力。误差线表示一式三份实验的SD。
发明详述
在本文件中阐述了当前公开的主题的一个或多个实施方式的细节。在研究了本文提供的信息之后，对本文件中描述的实施方式以及其他实施方式的修改对本领域普通技术人员将是显而易见的。
尽管相信本领域的普通技术人员能够良好理解以下术语，但陈述定义以有利于对当前公开的主题的解释。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开主题所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示成分、性质(例如反应条件)等的所有数字均应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示。在本说明书和权利要求书中提出的数值参数是近似值，其可以根据试图通过当前公开的主题获得的期望特性而变化。
如本文所用，术语“约”在涉及质量、重量、时间、体积、pH、尺寸、浓度或百分比的值或量时，旨在包含相对于指定值的如下变化：在一些实施方式中±20％，在一些实施方式±10％，在一些实施方式中±5％，在一些实施方式中±1％，在一些实施方式中±0.5％，并且在一些实施方式中±0.1％，因为这样的变化适合于进行所公开的方法。
应当理解，在本说明书全文中给出的每个最大数值限制包括每个较低的数值限制，视为这些较低的数值限制在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每个最小数值限制将包括每个更高的数值限制，视为这些更高的数值限制在本文中明确地写出一样。在本说明书全文中给出的每个数值范围包括落入该较宽数值范围内的每个较窄数值范围，视为这些较窄数值范围均在本文中明确写出一样。
如本文所用，“有效量”是指引起所需的生物反应的物质(例如，治疗化合物和/或组合物)的量。在一些实施方式中，物质的有效量是当施用给患有或易患疾病、病症和/或病况的受试者时足以治疗、诊断、预防和/或延迟和/或减轻该疾病、病症和/或病况的一种或多种症状的量。本领域普通技术人员会理解的是，物质的有效量可取决于诸如以下的因素而变：所需的生物学终点、要被递送的物质、目标细胞或组织等。例如，治疗疾病、病症和/或病况的制剂的有效量是减轻、缓解、恢复、抑制、预防疾病、病症和/或病况的一种或多种症状或特征，延迟其发作；降低其严重程度；和/或减少其发病率的量。此外，可在治疗方案中经由单一剂量或经由多个剂量施用有效量。在一些实施方式中，当单独剂量或组合物包含在治疗方案背景下作为有效剂量的量时，其被认为包含有效量。本领域普通技术人员将会意识到，当一个剂量或量被施用给患者群时，如果其被证实或已被证实显示统计学显著的有效性，则可认为其是有效的；为使一个量被认为如本文所述为有效的，不需要在特定的个体患者中实现特定结果。
如本文所用，术语“烷基”是指具有单个基团和1-12个碳原子的直链或支链饱和脂族烃基(即，C1-C12烷基)。烷基的非限制性实例包括甲基、丙基、异丙基、丁基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基等。支链烷基表示一个或多个诸如甲基、乙基或丙基的烷基基团替代了链烷基链的-CH2-基团中的一个或两个氢。在一些实施方式中，烷基是C1-C6烷基或C1-C4烷基。在其它实施方式中，烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
烷基基团可任选为未取代的或被一个或多个烷基基团取代基(其可为相同或不同的)取代(“取代烷基”)。术语“烷基基团取代基”包括但不限于烷基、取代烷基、卤素、羟基、羧基、氧代等。沿烷基链可任选插入一个或多个氧、硫或者取代或未取代氮原子，其中氮取代基为氢或烷基。
“烷氧基”是指其中烷基基团如上文所述的烷基–O–基团。如本文所用，术语“烷氧基”可以指例如以下中的一个或多个：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基等。在一些实施方式中，烷氧基是C1-C12烷氧基、C1-C6烷氧基或者C1-C4烷氧基。
如本文所用，术语“胺”包含伯胺、仲胺和叔胺。
如本文所用，术语“卤素”是指氟、氯、溴和碘基团。
“杂环”表示在环中具有一个或多个杂原子(非碳原子)的环状碳环。环可为饱和的、部分饱和的和不饱和的，并且杂原子可选自氮、硫和氧。饱和杂环的实例包括：包含1-4个氮原子的饱和3-6元杂单环基团，诸如，吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶子基、哌嗪基；包含1-2个氧原子的饱和3-6元杂单环基团，诸如，四氢呋喃、四氢吡喃基、二氧杂环戊烷和二氧杂环己烷；包含1-2个氧原子和1-3个氮原子的饱和3-6元杂单环基团，诸如，吗啉基；包含1-2个硫原子和1-3个氮原子的饱和3-6元杂单环基团，诸如，噻唑烷基。部分饱和杂环的实例包括呋喃基、吡啶基、咪唑基、噻吩基、吡咯基、嘧啶基、唑、二氧杂环戊烯等。
当使用术语“独立选自”时，所提到的取代基(例如，R基团，诸如，基团R1和R2)可相同或不同。例如，R1和R2可均为相同取代基，或者R1和R2可各自为选自特定组的不同取代基。
如本文所用，术语“可药用赋形剂”表示本领域技术人员已知的/与选择使用的特定活性剂的物理和化学特性相容的任何生理学惰性、药理学非活性的材料。可药用赋形剂包括但不限于聚合物、树脂、增塑剂、填料、润滑剂、稀释剂、粘合剂、崩解剂、溶剂、助溶剂、缓冲系统、表面活性剂、防腐剂、增甜剂、增味剂、药品级染料或颜料以及粘度剂。
特征在于TET1过表达的病况包括与较高水平的TET1信使RNA或TET1蛋白质相关的病况。在一些实施方式中，较高的TET1表达是由致癌的信号传导(诸如，STAT3/5-相关的信号传导)诱导的。在一些实施方式中，特征在于TET1过表达的病况包括与正常对照细胞相比具有较高TET1表达的造血系统恶性肿瘤。
如本文所用，术语“造血系统恶性肿瘤”是指造血系统和淋巴组织的恶性肿瘤。实例包括但不限于淋巴瘤、白血病、髓性增生性肿瘤、浆细胞恶液质、组织细胞瘤和树突状细胞肿瘤。在一些实施方式中，造血系统恶性肿瘤包括白血病，诸如，急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMoL)等。在其它实施方式中，造血系统恶性肿瘤包括淋巴瘤，诸如，霍奇金淋巴瘤、非-霍奇金淋巴瘤等。在一些实施方式中，造血系统恶性肿瘤包括骨髓瘤，诸如，多发性骨髓瘤。在一个具体实施方式中，造血系统恶性肿瘤是AML，包括高TET1型AML。
如本文所用，术语“过表达”或“过表达的”是指以高于基因产物正常内源性表达的水平表达的基因产物。
高TET1型急性髓性白血病(高TET1型AML)是指其中白血病细胞相对于正常造血系统细胞显示升高或高水平TET1表达的AML。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减轻或消除受试者(包括哺乳动物)的疾病、病症和/或其症状的方法。在一些实施方式中，受试者是人类受试者。
如本文所用，“抗癌剂”是指可用于治疗癌症的化合物或化疗剂。在一些实施方式中，抗癌剂是一线化疗剂或通常被视为指定癌症类型的标准治疗或首选施用治疗的药剂。在一些实施方式中，第二种抗癌剂是用于治疗AML的化疗剂，其选自阿糖胞苷、克拉屈滨、氟达拉滨、托泊替康、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、地西他滨、阿扎胞苷、全反式维甲酸、三氧化二砷、奥星-吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)、米哚妥林、奈拉滨、氯法拉滨、达沙替尼、伊马替尼、帕纳替尼、JQ1、甲氨蝶呤、皮质类固醇、二盐酸组胺、白介素2及其组合。
化合物和治疗方法
DNA甲基胞嘧啶双加氧酶10-11易位1(TET1)是AML中的关键癌蛋白。通过一系列数据分析和药物筛选，在本文中公开了一类选择性抑制TET1转录和5-羟基甲基胞嘧啶(5hmC)修饰的化合物。这些化合物在具有高水平的Tet1表达的AML(即，高TET1型AML(TET1-highAML)，包括携带t(11q23)/MLL-重排的AML和t(8；21)AML)中有效抑制细胞活力。
尽管Tet1表达的敲除对包括造血功能在内的正常发育仅显示非常小的作用，然而最近的研究证实，TET1通过促进致癌靶点(例如，HOXA9、MEIS1和PBX3等)的表达和抑制肿瘤抑制靶点的(例如，miR-22)的表达而在AML中起关键的致癌作用。因此，靶向TET1的信号传导是治疗高TET1型AML的有前途的治疗策略。为了靶向具有催化活性的关键致癌蛋白，最常用的方法之一是干扰致癌蛋白的催化活性，诸如，抑制FLT3的激酶活性的FLT3抑制剂奎比替尼(Quizartinib)和阻断STAT3的二聚的STAT抑制剂Stattic等。然而，如许多临床报告中所显示的，用催化活性抑制剂治疗通常导致目标致癌蛋白的异常上调或者触发基因突变，最终导致耐药性。溴结构域和超末端(BET)抑制剂JQ1作为靶向c-Myc信号传导的有效策略是一种替代策略，其抑制TET1信号传导而不是直接靶向TET1酶活性。有效靶向致癌基因或致癌蛋白的表达(即，转录、翻译或降解)的任何药物能极大地避免因目标致癌基因上调或组成型激活的基因突变所致的耐药性。另外，先前有报道称TET1能将多梳蛋白募集到mir-22基因的启动子区域并抑制这种关键的肿瘤抑microRNA的初级转录，并且这种转录抑制与TET1的酶活性无关。因此，在这一治疗AML的研究中选择抑制TET1表达的抑制剂而不是寻找直接靶向TET1酶活性的抑制剂，后者不能完全抑制TET1的功能。
通过对癌细胞样品的NCI-60集合中的20,602种化合物的细胞反应以及TET1水平进行相关性分析，然后对AML细胞中的位于前列的药物候选物进行MTS测定，鉴定了两种候选化合物(NSC-311068和NSC-370284)，它们各自抑制AML细胞活力和TET1表达：
重要地，NSC-311068和尤其是NSC-370284均显示体内治愈AML的显著治疗作用。UC-514321是NSC-370284的一种结构类似物，在体外和体内显示比NSC-370284更强力的抗-白血病活性：
从机理上将，公开的TET1-信号传导抑制剂直接靶向STAT3/5，后者是TET1转录的直接上游调节剂。明显地，与现有的JAK/STAT抑制剂(例如，帕克替尼、KW-2449、Stattic和sc-355979)相比，化合物(NSC-370284和UC-514321)显示了高得多的选择性以及靶向高TET1型AML的更高效力，这可能是因为我们的TET1-信号传导抑制剂的独特性质，因为其直接结合到STAT3/5的DNA-结合结构域(DBD)，干扰STAT3/5与TET1启动子区域的结合，从而抑制TET1的转录。另外，NSC-370284和UC-514321均显示与柔红霉素在体外和体内治疗高TET1型AML细胞的协同作用。值得注意的是，耐NSC-370284的THP-1AML细胞对柔红霉素的敏感性甚至高于亲本THP-1细胞。综上所述，这些发现突出了靶向AML中的TET1(一种涉及DNA去甲基化的关键的致癌表观遗传调节剂)的治疗潜力。数据还显示，STAT3和STAT5是TET1的直接上游调节剂，并且是抑制TET1信号传导的合适靶标。数据显示，应用选择性地并有效地靶向STAT/TET1信号传导的小分子化合物(特别是与标准化疗试剂相结合时)是治疗高TET1型AML(其占所有AML案例的约30％，并且包括MLL-重排型AML和t(8；21)AML)的有效的新治疗策略。另外，这些有效抑制剂还可在基础和翻译研究中用作工具化合物以选择性靶向STAT/TET1信号传导轴和全面抑制5hmC。
结构分析显示了NSC-370284与STAT3或STAT5的保守DBD的可能的直接结合。使用NMR化学位移扰动(CSP)来识别这样的结合和结合位点。与化合物NSC-370284形成的复合物在STAT3的异亮氨酸(Ile)残基处以1:2的蛋白:配体摩尔比诱导大量CSP。
根据化合物NSC-370284的结构，使用BioVia Pipeline Pilot(版本8.5.0.200)对辛辛那提大学化合物库进行了结构类似物开发，该库收集约360,000种化合物。选择30种结构最相似的化合物研究构效关系(SAR)(表A和B)。本文中公开的表A的化合物与NSC-370284具有共同的芳基胺苯并二氧杂环戊烯核心骨架，区别主要在胺取代基和芳基取代基上。
因此，本文中提供了患有特征在于TET1过表达的病症的受试者的方法，其包括对所述受试者施用有效量的具有下式的化合物或者其可药用盐：
其中：
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自H、羟基、烷基、烷氧基、胺、卤素和三氟甲基，并且其中R1、R2、R3、R4和R5中任何两个相邻的基团可共同形成杂环；
R6是H或羟基；和
R7选自H、其中R8是C或O。
在一些实施方式中，特征在于TET1过表达的病症是造血系统恶性肿瘤。在一个具体实施方式中，所述病症是急性髓性白血病(AML)。在更具体的实施方式中，所述病症是高TET1型AML。
在一些实施方式中，烷基包括直链或支链未取代或取代C1-C12烷基基团。在其它实施方式中，烷基包括直链或支链未取代或取代C1-C6烷基基团。在其它实施方式中，烷基包括直链或支链未取代或取代C1-C4烷基基团。在具体实施方式中，烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
在一些实施方式中，烷氧基包括直链或支链未取代或取代C1-C12烷氧基基团。在其它实施方式中，烷氧基包括直链或支链未取代或取代C1-C6烷氧基基团。在其它实施方式中，烷基包括直链或支链未取代或取代C1-C4烷氧基基团。在具体实施方式中，烷氧基选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。在更具体的实施方式中，烷氧基包括甲氧基和乙氧基。
在一些实施方式中，R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自H、羟基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、胺、卤素和三氟甲基。在一些实施方式中，任何两个相邻的R1、R2、R3、R4和R5可共同形成杂环。在这样的实施方式中，杂环可为5-或6元环。在具体实施方式中，由任何两个相邻的R1、R2、R3、R4和R5形成的杂环选自唑、二氧杂环戊烯和二氧杂环戊烷。
用于本文所公开的方法和组合物中的合适的式I化合物包括单独或组合形式的表A中所示的类似物集合中的任何类似物。在具体实施方式中，式I化合物是6-{[4-羟基-3,5-二(2-甲基-2-丙基)苯基](4-吗啉基)甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇(UC-514321)或6-(1-吡咯烷基(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇(NSC-370284)。
表A.式I化合物
本文中还提供了治疗患有特征在于TET1过表达的病况的受试者的方法，该方法包括对所述受试者施用有效量的表B中所示的化合物或其可药用盐。
表B.NSC-370284的其他类似物
在一些实施方式中，本文中所公开的式I或表B化合物与第二种抗癌剂一起施用以提供对癌细胞生长的协同或增强功效或抑制。例如，本公开的式I或表B化合物可与包括以下的化疗剂组合施用：例如，阿糖胞苷、克拉屈滨、氟达拉滨、托泊替康、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、地西他滨、阿扎胞苷、全反式维甲酸、三氧化二砷、奥星-吉妥珠单抗、米哚妥林、奈拉滨、氯法拉滨、达沙替尼、伊马替尼、帕纳替尼、JQ1、甲氨蝶呤、皮质类固醇、二盐酸组胺、白介素2及其组合。在一些实施方式中、式I或表B化合物与第二种抗癌剂共同施用。在一些实施方式中，“共同施用”表示式I或表B化合物与第二种抗癌剂在同一单元剂量中共同施用。在其它实施方式中，“共同施用”表示式I或表B化合物和第二种抗癌剂以单独的剂量形式同时或连续施用。
药物组合物
本文中提供了包含有效量的根据式I或式B的化合物或其可药用盐和可药用载体的组合物。
应意识到本文中所公开的式I或表B化合物可单独或作为药物组合物的一部分施用给患者或受试者。式I或表B化合物可经口、经直肠、肠胃外(静脉内、肌内或皮下)、脑池内、阴道内、腹膜内、膀胱内、局部(粉末、软膏或滴剂)或者作为口腔或鼻喷雾施用给患者。
适合用于肠胃外注射的包含本公开的式I或表B化合物的组合物可包含生理学可接受的无菌水性或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液以及用于重构为无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水，乙醇，多元醇(丙二醇，聚乙二醇，甘油等)，它们合适的混合物，植物油(诸如，橄榄油)和可注射有机酯如油酸乙酯。可保持合适的流动性，例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层，在分散液的情况下通过保持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂。
这些组合物还可包含佐剂，诸如，防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过多种抗菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)可确保防止微生物的作用。理想的还可以是包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。通过使用延迟吸收剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)可实现可注射药物形式的延长吸收。
口服使用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中，活性成分与至少一种惰性的常用赋形剂(或载体)混合，诸如，柠檬酸钠或磷酸二钙或(a)填料或增量剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(b)粘合剂，例如，羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(c)湿润剂，例如，甘油，(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯或树薯淀粉、海藻酸、某些复杂硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液阻滞剂，例如，石蜡，(f)加速吸收剂，例如，季铵化合物，(g)润湿剂，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，(h)吸附剂，例如，高岭土和膨润土，和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，或它们的混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。
类似类型的固体组合物也可用作软和硬填充明胶胶囊中的填料，使用诸如乳糖(lactose或milk sugar)以及高分子聚乙二醇等赋形剂。
诸如片剂、锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可被制备为具有包衣和外壳，诸如肠溶衣和本领域中公知的其他种类。它们可包含遮光剂，并且可为这样的组合物：其在肠道的特定部分以延迟方式释放活性化合物。可使用的包埋组合物的实例为聚合物质和蜡。活性化合物也可为微胶囊形式，根据需要含有上述赋形剂中的一种或多种。
用于口服施用的液体剂型包括可药用乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物之外，液体剂型可包含本领域中常用的惰性稀释剂(诸如，水或其它溶剂)、增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇1,3-丁二醇，二甲基甲酰胺，油(特别是，棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和去水山梨糖醇的脂肪酸酯或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂之外，组合物还可包括佐剂，诸如，润湿剂，乳化和悬浮剂，增甜剂、增味剂和增香剂。
除了活性化合物之外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和去水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶或者这些物质的混合物等。
用于直肠或阴道施用的组合物优选为栓剂，其可通过将本发明的化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体(诸如可可油、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，其在常温下为固体，但在体温下为液体，因此在直肠腔或阴道腔内融化并释放活性成分。
用于局部施用本发明的式I或表B化合物的剂型包括软膏、粉末、喷剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理学可接受的载体以及可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。眼部制剂、眼膏、粉末和溶液也在本发明的范围内。
此外，本发明的式I或表B化合物可作为未溶剂化形式或与可药用溶剂(诸如水、乙醇等)的溶剂化形式存在。通常，对于本公开的目的，溶剂化形式被认为等同于未溶剂化形式。式I或表B化合物的对映异构体和外消旋体也适合用于本文公开的组合物和方法中。
本发明的式I或表B化合物可以每日约1.5mg至约150mg范围内的剂量水平施用给患者；也可以施用更大量，诸如，每日约150mg至1g。式I或表B化合物的单位剂型为可作为单个剂量施用的量。对于具有约70kg体重的正常成年人来说，约0.2mg/kg体重/日至约2.0mg/kg体重/日范围内的剂量是合适的。然而，所使用的具体剂量可变。例如，剂量可取决于许多因素，包括患者需求、所治疗病况的严重程度和所使用化合物的药理学活性。特定患者最佳剂量的确定对于本领域技术人员来说是公知的。本发明的式I或表B化合物可在单个和/或多个剂量中提供。
本文中公开的式I或表B化合物使用普通技术人员已知的标准有机合成技术合成。
实施例
以下详述的方法和材料用以支持和说明本发明的特定方面和实施方式，并且不应被解释为限制其范围。
实施例1.化合物NSC-311068和NSC-370284有效抑制高TET1型AML细胞的活力
先前已报道了TET1在AML中的高表达和致癌作用。事实上。TET1的高表达不仅在AML中发现，而且也在包括子宫癌、神经胶质瘤等的多种肿瘤中(尤其是在睾丸生殖细胞恶性肿瘤中)发现(图7)。这表明TET1在其中TET1表达水平相对高的许多癌症中的潜在致癌作用。
为鉴定可能靶向TET1信号传导的化合物，检索了癌细胞样本NCI-60集合中的总共20,602种化合物的药物敏感性/基因表达数据库。内源性TET1的表达水平显示出与NCI-60组癌细胞对953种化合物的反应性呈显著正相关(r>0.2；P<0.05)。选择具有最高r值的前120种并检测其对高TET1型AML细胞系(即，MONOMAC-6/t(9；11))的细胞活力的作用。随后，将显示最显著抑制作用的前20种(表1)在三种其他的高TET1型AML细胞系(包括THP-1/t(9；11)、KOCL-48/t(4；11)和KASUMI-1/t(8；21)AML细胞)以及作为阳性对照物的MONOMAC-6细胞中进一步测试(图8a-e和表2)。
表1.
NCI-60集合中在药物反应和TET1水平方面显示正相关的前20种候选化合物
表2.
前20种候选化合物在MONOMAC-6、THP-1、KOCL-48和KASUMI-1细胞中的IC50
结果发现，TET1不仅如先前所报道的在MLL-重排型AML中而且在携带t(8；21)的AML中高表达；而且，Tet1表达的缺失也显著抑制了t(8；21)融合基因-诱导的小鼠骨髓(BM)祖细胞的集落形成/重铺能力(见图9)。结果显示NSC-311068和NSC-370284在抑制全部四种高TET1型AML细胞系的细胞活力方面表现出最显著的作用，但对NB4/t(15；17)AML细胞(对照细胞系，具有极低的TET1表达水平)的活力未显示显著抑制作用(图1a,b)。在NCI-60集合中，与整个NCI-60组相比，具有相对较高Tet1表达水平的细胞系在Tet1表达水平与NSC-311068和NSC-370284二者活性之间显示更明显的正相关，而具有较低Tet1表达水平的细胞系没有显示明显的正相关(NSC-311068)或者甚至负相关(NSC-370284)(图8c-d)。在高TET1型AML细胞中，NSC-311068和370284显著抑制Tet1表达水平(图1c)以及总体5hmC水平(图1d)。为排除非特异性毒性的可能性，将NSC-311068和NSC-370284的剂量减少到25nM，并在处理后24小时检测基因表达和细胞活力。低剂量短期处理再次导致TET1转录的显著下调，并伴有MONOMAC-6、THP-1和KOCL-48细胞活力的微降(图1e-f)。因此，NSC-311068和NSC-370284对Tet1表达的抑制作用不可能是因为非特异性毒性。
实施例2.NSC-311068和NSC-370284在体内抑制AML进展
随后用MLL-AF9 AML模型检测了NSC-311068和370284的潜在体内治疗作用。在二次BM移植(BMT)受体小鼠中用NSC-311068尤其是370284处理显著抑制了MLL-AF9-诱导的AML，将中位生存期从49日(对照)延长到94日(NSC-311068)或>200日(NSC-370284)(图2a)。值得注意的是，57％(7只中的4只)的NSC-370284处理小鼠被治愈，因为外周血(PB)、BM、脾脏和肝脏组织中的病理学形态全都转为正常(图2b)。分别通过qPCR(图2c)和蛋白印迹法(图2d)在RNA和蛋白质水平上验证了化合物对Tet1表达的体内下调。在另一个通过AML-ETO9a(AE9a)28诱导的AML模型中，NSC-311068和NSC-370284也表现出显著的治疗作用，并且分别将中位生存期从46日(对照)延长到95日(NSC-311068)和122日(NSC-370284)日(图2e)。有趣地，NSC-370284先前已被报道为与抗白血病活性相关的天然产物鬼臼毒素(PPT)的类似物。考虑到NSC-370284的体内治疗作用更好(图2a,b,e)，选择NSC-370284进行进一步研究。
实施例3.NSC-370284通过靶向STAT3/5抑制Tet1表达
为破译NSC-370284抑制TET1表达的分子机制，采纳Kapoor和同事_ENREF_31开发的策略来识别NSC-370284的直接靶蛋白。简言之，建立多重耐药性克隆并进行转录组测序以发现每个克隆中的突变；假设的是，药物靶标的信号传导的关键成分有很大机会携带耐药性克隆中的突变。为此，将THP-1AML细胞用高到中浓度的NSC-370284处理100日以上，并随后分离出一组独立的耐药性THP-1单克隆(见图10a中的代表)。在用NSC-370284处理之后，这些耐药性细胞没有显示Tet1表达的显著下调(图10b)。通过对NSC-370284-耐药性克隆中的6种进行RNA测序，在至少两个单独的克隆中的14个基因中发现了重复突变。使用创新途径测定(IPA)分析了14个突变基因之间的生物学关系(表3)。通过IPA根据费舍尔精确检验鉴定的前5种网络与癌症、血液病、免疫性疾病等相关(表4)。通过IPA鉴定的涉及全部14个基因的排名第1的网络与JAK/STAT5途径密切相关(图3a)。这些基因中的多个已被报道为与JAK/STAT信号传导相关。很可能这样的基因中的突变克服了NSC-370284-介导的对AML细胞活力/生长的抑制作用，从而为AML克隆赋予了耐药性。为测试这点，我们选择了JAK1和MSH3作为两种代表并克隆构建物，其携带在我们的耐药性THP-1细胞中检测出来的JAK1A893G突变或MSH3V600I突变(表3)。如所预期的，每种突变的强制表达至少部分逆转了NSC-370284对AML细胞活力的抑制作用(图10c-d)。
表3.
THP-1 NSC-370284-耐药性克隆中具有重复突变的基因
表4.
具有THP-1NSC-370284-耐药性克隆中的重复突变的基因的前5种信号传导通道和相关疾病
(a)与具有THP-1NSC-370284-耐药性克隆中的重复突变的基因相关的前5种经典通道
(b)与具有THP-1NSC-370284-耐药性克隆中的重复突变的基因相关的前5种疾病和病症
与此一致的是，经证明，在MONOMAC-6和THP-1细胞中敲除STAT3和/或STAT5导致TET1的下调，但没有TET2或TET3的下调(图3b和图10c-f)。通过检索UCSC基因组浏览器(https://genome.ucsc.edu/index.html)，发现STAT5具有推想结合位点(ttccctgaacagcttttaca tgtg(SEQ ID NO:1)；位于TET1基因的启动子区域内的共有结合基序：ttcnnngaa(SEQ ID NO:2)；图3c，位点4)，表明TET1可能是STAT蛋白的直接靶点。STAT3和STAT5在TET1基因座上的直接结合已通过染色体免疫沉淀(ChIP)-qPCR分析在MONOMAC-6细胞中进一步验证，这样的结合可被NSC-370284处理干扰(图3c-g)。在NB4细胞中，没有检测到STAT3或STAT5在TET1基因座上的显著结合(图3h)。JAK1已知是STAT途径的上游激活剂。令人惊奇地，TET1的敲除导致AML细胞中JAK1转录的减少(图10i)。ChIP-qPCR结果显示TET1直接结合到JAK1启动子(图10j)。以上发现表明JAK/STAT途径经由STAT3/5与TET1启动子的直接结合促进了TET1转录，并且TET1也结合到JAK1启动子并激活JAK1转录。这表明，在AML中的JAK1/STAT/TET1之间存在反馈环路。
结构分析显示了NSC-370284与STAT3或STAT5的保守DNA-结合结构域(DBD)的潜在直接结合(图3i)。可使用NMR化学位移扰动(CSP)来识别这样的结合以及结合位点。与化合物NSC-370284形成的复合物在STAT3的异亮氨酸(Ile)残基处以1:2的蛋白:配体摩尔比诱导大量CSP(图3j)。CSP发生在邻近DNA-结合位点(I464)附近的残基以及位于或邻近DBD的残基处(图3j)，表明化合物NSC-370284在DBD处或其附近结合STAT3。通过电泳迁移位移测定(EMSA)进一步验证了STAT3与TET1 CpG岛之间的缔合；NSC-370284几乎能完全阻断这种缔合(图3k)。为检测NSC-370284是否也抑制STAT3和STAT5的磷酸化，用NSC-370284对MONOMAC-6细胞进行一系列时间点的处理。蛋白印迹法显示STAT3和STAT5磷酸化水平没有显著变化(图10k)。NSC-370284可能主要与DNA竞争STAT结合，而非抑制STAT激活。
这些结果表明STAT3和STAT5是NSC-370284的直接靶点，其可干扰STAT3/5结合到TET1启动子区域，从而抑制TET1的转录。类似地，先前的研究也报道了化合物C48(NSC-370284的结构类似物)可直接结合到STAT3蛋白的DNA结合结构域，并导致凋亡和对肿瘤细胞生长的抑制。
值得注意的是，NSC-370284对其他STAT5靶基因(诸如，HIF2α/IL2RA和FRA2)的表达的抑制作用不像对TET1那样明显(图10l)。与在TET1启动子上的基础富集相比，STAT5在HIF2α、IL2RA或FRA2的启动子上的基础富集非常低；NSC-370284对这种缔合的破坏就没那么明显(图10m)。先前已经报道过，在没有细胞因子刺激(例如IL-2、IL-3或EPO)的情况下，STAT5与大多数靶基因启动子基础亲和力(如果有的话)非常弱。因此，这些结果表明STAT3/5在TET1启动子上的非常强的富集(图3e-g，3k；图10l-m)。而且，结果表明，与靶向STAT激酶活性的典型STAT抑制剂不同，NSC-370284可能主要通过在AML细胞中干扰STAT蛋白与对STAT具有相对较高基础亲和力的DNA区域(如TET1启动子)的结合来发挥其功能。
NSC-370284类似物UC-514321的增强的治疗效力
基于化合物NSC-370284的结构，使用BioVia Pipeline Pilot(版本8.5.0.200)，针对辛辛那提大学化合物库(约360,000种化合物)开发结构类似物。选择30种结构最相似的化合物以探索构效关系(SAR)(表A和B)。表A化合物与NSC-370284共有芳基胺苯并二氧杂环戊烯核心骨架，区别主要在于胺取代基和芳基取代基。MTS分析显示类似化合物之一即UC-514321，最显著地抑制MONOMAC-6细胞活力(图4a和图11)。与NSC-370284和其他JAK/STAT抑制剂(例如，帕克替尼、KW-2449、STAT3/5抑制剂Stattic或者STAT5抑制剂sc-355979)相比，UC-514321在抑制高TET1型AML(包括MONOMAC-6、THP-1和KASUMI-1)细胞的活力方面显示了增强的作用。类似于NSC-370284，UC-514321对低TET1型AML(即，NB4)细胞未显示抑制作用(图4e)。因此，UC-514321的抗肿瘤作用也是TET1-信号传导依赖性的。值得注意的是，STAT3/5特异性抑制剂Stattic和sc-355979对这些AML细胞的活力未显示显著的抑制作用，可能是因为其IC50值远高于500nM(我们所测试的最高浓度)。总体上，与其他JAK和/或STAT抑制剂相比，UC-514321在抑制高TET1型AML细胞的活力方面更有效和选择性更高。
另外，与亲代化合物(NSC-370284)相比，UC-514321也在AML小鼠模型中显示了提高的体内治疗作用。在MLL-AF9-AML小鼠中，UC-514321将中位生存期从49日(对照)延长到>200日，优于NSC-370284(图4f)。在AE9a-AML模型中，UC-514321治疗的小鼠的中位生存期为160日，远长于对照(46日)和NSC-370284(114日)治疗组(图4g)。因此，在两种AML动物模型中，UC-514321均将中位生存期延长超过3倍(图4f-g)。另外，还在两种其他AML模型(即，MLL-AF10 AML和FLT3-ITD/NPM1mut AML)中测试了NSC-370284和UC-514321的治疗作用。NSC-370284将MLL-AF10白血病小鼠的中位生存期从35日延长到>50日，并且将FLT3-ITD/NPM1mut白血病小鼠的中位生存期从21日延长到34日。UC-514321显示了甚至更好的治疗作用，因为其将MLL-AF10和FLT3-ITD/NPM1mut白血病小鼠的中位生存期均延长到>50日(图4i,j)。值得注意的是，用UC-514321治疗治愈了66.7％(6只中的4只)的MLL-AF9 AML小鼠(图4f,h)，并且没有一只用UC-514321-治疗的FLT3-ITD/NPM1mut AML接受者在50日内发展为全面AML(图4j)。
为测定UC-514321功能的基础机制是否类似于NSC-370284，进行了一系列机理研究。如所预期，类似于NSC-370284，UC-514321在MONOMAC-6细胞中显著抑制TET1的表达，但不抑制TET2或TET3的表达，并且下调TET1的推想靶基因(例如，HOXA7、HOXA10、MEIS1、PBX3和FLT3等)和上调负靶标(例如，miR-22)(图5a,b)。值得注意的是，与NSC-370284相比，UC-514321对基因表达中的变化表现出增强的作用(图5a,b)。NSC-370284和UC-514321均显著降低总体5hmC水平(图5c)，并且在AML细胞中使用全基因组5hmC-测序进一步证实了它们的抑制作用。我们发现NSC-370284和UC-514321处理在全基因组中均导致5hmC峰值富集降低了约75％(图12a-c)。类似于NSC-370284(图3j)，在邻近于DNA结合表面的残基(I431)处以及接近或位于DBD中的残基处也观察到了UC-514321处理诱导的最大CSP(图5d)。与此不同，Stattic和sc-355979靶向STAT SH2结构域。因此，NSC-370284和UC-514321在位于或邻近DNA结合表面的残基处诱导CSP，因此其可能干扰STAT蛋白与DNA的结合。通过ChIP-qPCR分析进一步证实了这一点。在MONOMAC-6细胞中，UC-514321处理也导致了对STAT3/5与TET1启动子的结合的显著抑制，甚至比NSC-370284在CpG区域处的抑制更显著(图5e-h)。
在用MLL-AF9转导的野生型小鼠BM祖细胞中，用NSC-370284或UC-514321处理导致对细胞活力的显著抑制，并且在缺乏Tet1的对应细胞中没有观察这样的抑制(图5i-l)。其它JAK/STAT抑制剂(即，帕克替尼、KW-2449、Stattic和sc-355979)在野生型和Tet1缺乏型细胞之间在影响细胞活力方面没有显著区别(图5i,j和图13a-d)。此外，在来自条件性TET1敲除小鼠的MLL-AF9-转导的BM祖细胞中，NSC-370284和UC-514321在抑制具有诱导的Tet1缺乏的细胞的活力方面也没有显著作用(图5m和图13e)。此外，创建载有pLenti-puro的TET1构建物并将其转导入THP-1和MONOMAC-6细胞中，这表明Tet1的异位表达足以逆转NSC-370284和UC-514321的抑制作用并恢复AML细胞的活力(图5n-o)。结合NSC-370284对高TET1型AML细胞系的选择性作用(图1b)，以上结果表明NSC-370284和UC-514321的抗-白血病作用是TET1-信号传导依赖性的。
实施例5.NSC-370284和UC-514321在健康小鼠中显示无明显毒性
首先在体外进行细胞活力和凋亡测定以评估NSC-370284和UC-514321对正常造血干/祖细胞(HSPC；在本文中我们使用c-Kit+BM细胞)的作用。显著地，用NSC-370284或UC-514321处理极大地抑制了AML细胞的活力，但不抑制正常HSPC的活力(图14a)。此外，所述化合物显著增加了AML细胞的凋亡，但不增加正常HSPC的凋亡(图14b)。因此，这两种化合物对正常HSPC未显示明显毒性。这与内源性Tet1表达模式是一致的，因为具有MLL-AF10或FLT3-ITD/NPM1mut的AML细胞与正常HSPC相比具有相对较高的Tet1表达水平(图14c)。
为评估NSC-370284和UC-514321在体内对正常组织(尤其是造血系统)的潜在毒性，将NSC-370284或UC-514321注射给正常C57BL/6小鼠，并在连续施用10日NSC-370284或UC-514321之一后评估潜在的急性毒性(24小时)或长期(200日)毒性。评估体重、脾脏和肝脏重量、白细胞(WBC)计数、全外周血谱系以及BM细胞的粒细胞(Mac1+Gr1+)、单核细胞(Mac1+Gr1-)和祖细胞(c-Kit+)系，没有观察到急性或长期毒性的证据(图15、16和表5)。
表5.
在连续施用10日之后NSC-370284和UC-514321对小鼠血细胞分化的急性或长期作用
(a)NSC-370284和UC-514321对小鼠血细胞分化的急性作用(最后一次施用后24小时)。
(b)NSC-370284和UC-514321对小鼠血细胞分化的长期作用(最后一次施用后200日)。
注：正常C57BL/6小鼠用PBS(对照)、2.5mg/kg NSC-370284或UC-514321治疗，腹膜内注射，每日1次，进行10日。显示了在所示时间点收集的数据(即，在化合物或DMSO对照(DMSO)的最后一次腹膜内注射之后24小时(a)或200日(b))。WBC＝白细胞；NE＝中性粒细胞；LY＝淋巴细胞；MO＝单核细胞；EO＝嗜酸粒细胞；BA＝嗜碱细胞；RBC＝红细胞；PLT＝血小板。显示了平均值±标准差。
NSC-370284和UC-514321在小鼠中的最大耐受量是65～85.6mg/kg(表6)。LD50为约123mg/kg(表6)。UC-514321药代动力学特性的分析显示该化合物在小鼠血液中的半衰期为11.02小时(表7；图17)。
表6.NSC-370284和UC-514321的最大耐受剂量(MTD)和半数致死量(LD50)。
表7.UC-514321的血液药代动力学参数(数据以平均值±SD提供).
实施例6.与标准化疗的协同作用
使用药物长期治疗可能导致患者的耐药性，因此经常需要组合治疗。为治疗已对抑制剂耐药的AML细胞，调查了一组一线AML化疗药(包括柔红霉素(DNR)、阿糖胞苷(AraC)、全反式视黄酸(ATRA)、氮杂胞苷(AZA)和地西他滨(DAC))对亲本THP-1细胞和三种NSC-370284-耐药性克隆的作用(图6a和图18a-d)。令人惊讶的是，所有3种耐药性克隆都比亲本对照对DNR敏感得多(图6a)。NSC-370284或UC-514321与DNR协同作用抑制THP-1和KASUMI-1细胞的活力(图6b,c)。NSC-370284或514321与标准化疗(即“5+3”方案)之间的协同作用在体内得到了进一步验证。即使以相对低的剂量施用，NSC-370284+DNR/AraC或UC-514321+DNR/AraC的组合治疗在治愈MLL-AF9 AML中也显示出更好的治疗效果，因为组合施用治愈了83.3％(6只中的5只)的AML小鼠(图6d,e)。
通过对NSC-370284耐药性克隆和亲本细胞的RNA-测序数据的分析，我们发现已知与药物反应(尤其是对拓扑异构酶II抑制剂(如DNR)的反应)有关的几个基因簇都富集在NSC-370284耐药性细胞中。这些基因簇包括JAK/STAT信号传导、G2M检查点、MYC靶和E2F靶等。潜在的DNR敏化机制可能是通过靶向G2M检查点。经证明，CDC25(G2M检查点控制的关键磷酸酶)的过表达可以使肿瘤细胞对多柔比星的治疗明显敏感。RNA-测序数据显示，相对于亲本细胞，NSC-370284耐药性AML克隆中CDC25的水平增加。相对于NSC-370284处理的样品，对照样品中G2M检查点基因簇的富集也是一致的。正如其他人先前报道的那样，JAK/STAT途径的激活可能直接或间接地导致G2M检查点异常。因此，很可能NSC-370284耐药性克隆中G2M检查点的失调至少部分解释了为什么与亲本AML细胞相比，耐药性克隆对DNR治疗更敏感。总体而言，NSC-370284或UC-514321与DNR的结合代表了一种有前途的治疗策略，不仅可以以相对低剂量有效治疗高TET1型AML患者，而且还可以避免发生对NSC-370284或UC-514321的耐药。
实施例7.材料和方法
小鼠的饲养、监测和终点处理
从Jackson Lab(Bar Harbor,ME,USA)或Harlan Laboratories,Inc(Indianapolis,IN,USA)购买C57BL/6(CD45.2)，B6.SJL(CD45.1)小鼠。雄性和雌性小鼠均用于实验。所有实验室小鼠均饲养在辛辛那提大学或芝加哥大学的动物设施中。研究方案中所有对小鼠进行的实验均得到辛辛那提大学或芝加哥大学的机构动物护理和使用委员会(IACUC，Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。所有方法均按照相关准则和规定执行。如先前所述进行了小鼠的饲养、监测和处理(Jiang,X.,et al.,miR-22has a potent anti-tumour role with therapeutic potential in acute myeloidleukaemia,Nat Commun 7:11452(2016)；Jiang,X.,et al.,Eradication of AcuteMyeloid Leukemia with FLT3 Ligand-Targeted miR-150Nanoparticles,Cancer Res76；4470-80(2016)；Jiang,X.,et al..Blockade of miR-150Maturation by MLL-Fusion/MYC/LIN-28Is Required for MLL-Associated Leukemia,Cancer Cell 22；524-35(2012))。在所有实验中均进行随机化、分配隐藏和盲态结果评估。
小鼠骨髓移植(BMT)后进行药物治疗
如前所述进行二次小鼠BMT。在白血病发作后(当小鼠的移植成活率(CD45.1)超过20％和/或白细胞计数高于4x109/L时，通常为移植后10日)，对受体小鼠注射DMSO对照、2.5mg/kg NSC-311068、NSC-370284或UC-514321，每日1次腹膜内注射，进行10日。对于“5+3”和NSC-370284或UC-514321组合治疗实验，在AML发作后，受体小鼠仅用PBS对照或者单独用NSC-370284或UC-514321治疗，每日1次腹膜内注射，进行10日，或与“5+3”治疗一起进行治疗。对于“5+3”治疗，将AraC(阿糖胞苷，Bedford Laboratories)和DNR(柔红霉素，Sigma-Aldrich)用PBS重构，过滤并以等分试样在-20℃存储。“5+3”治疗方案由5个连续的50mg/kgAraC日剂量以及在治疗的最初3日中的每日3mg/kg DNR组成。药物通过尾静脉和腹膜内注射递送。治疗期间每日量取体重，并再次计算剂量以确保小鼠每次治疗时接收到一致剂量的50mg/kg AraC和3mg/kg DNR。
细胞培养和药物处理
从ATCC(Manassas,VA)购买MONOMAC-6、THP-1、KOCL-48、KASUMI-1、ML-2和NB4细胞并如前所述培养(Jiang,X.,et al.Blockade of miR-150 Maturation by MLL-Fusion/MYC/LIN-28 Is Required for MLL-Associated Leukemia.Cancer Cell 22,524-535(2012)；Li,Z.,et al.miR-196b directly targets both HOXA9/MEIS1 oncogenes andFAS tumour suppressor in MLL-rearranged leukaemia.(Li,Z.,et al.,miR-196bdirectly targets both HOXA9/MEIS1 oncogenes and FAS tumour suppressor in MLL-rearranged leukaemia,Nat Commun 2:688(2012))。每年使用PCR支原体检测试剂盒(PromoKine)对所有细胞系进行支原体污染检测，并证明其是支原体阴性的。每年通过STR分析对所有细胞系进行身份验证。
细胞转染和逆转录病毒感染
使用Amaxa Nucleofector Technology(Amaxa Biosystems,Berlin,Germany)，用Cell Line Nucleofector试剂盒V，按照T-037操作将siRNAs转染到MONOMAC-6细胞中。在转染后48小时进行实验。如前所述进行小鼠BM祖细胞的逆转录病毒感染，进行了一些改动。简言之，使用Effectene转染试剂(Qiagen,Valencia,CA)将逆转录病毒载体与pCL-Eco包装载体(IMGENEX,San Diego,CA)共同转染到HEK293T细胞中以制成逆转录病毒。在经过5天的5-氟尿嘧啶(5-FU)处理后，从4至6周龄的C57BL/6、TET1-/-或Cre-TET1fl/fl供体小鼠组收获BM细胞，并且用小鼠谱系细胞耗减试剂盒(Miltenyi Biotec Inc.,Auburn,CA)对原始造血祖细胞进行富集。将富集的造血祖细胞的等分试样与聚凝胺一起添加到细胞培养板中的逆转录病毒上清液中，以2,000g于32℃离心2小时(即，旋转接种)，随后用新鲜培养基替换培养基并于37℃温育20小时。次日，重复一次相同操作。使经感染的细胞在包含10ng/mL鼠重组IL-3、10ng/mL IL-6、100ng/mL鼠重组SCF(R&D Systems,Minneapolis,MN)和1.0mg/mlG418的RPMI 1640培养基中生长。在感染后7日进行实验。
RNA提取和定量RT-PCR
用miRNeasy提取试剂盒(Qiagen)提取总RNA，并将其用作用于定量RT-PCR(qPCR)分析的模板。
细胞凋亡、活力和增殖测定
如前文所述进行这些实验(Jiang,X.,et al.,Blockade of miR-150Maturationby MLL-Fusion/MYC/LIN-28Is Required for MLL-Associated Leukemia,Cancer Cell22:524-35(2012)；Li,Z.,et al.,miR-196b directly targets both HOXA9/MEIS1oncogenes and FAS tumour suppressor in MLL-rearranged leukaemia,Nat Commun 2:688(2012))，使用ApoLive-Glo多用检测试剂盒或CellTiter 96AQueous非放射性细胞增殖检测试剂盒(Promega,Madison,WI)。
NMR化学位移扰动(CSP)
如前所述制备用于NMR研究的特定的Ile-甲基标记的STAT3(Byrd,J.C.,etal.Repetitive cycles of high-dose cytarabine benefit patients with acutemyeloid leukemia and inv(16)(p13q22)or t(16；16)(p13；q22):results from CALGB8461.(Namanja,A.T.,et al.,Allosteric Communication across STAT3 DomainsAssociated with STAT3 Function and Disease-Causing Mutation,J Mol Biol 428:579-89(2016))。对于每种化合物，表达STAT3并新鲜纯化，并且获得参考光谱。随后，在与游离STAT3(参考)样品相同的缓冲液中制备STAT3与每种化合物的复合物，并获取STAT3的二维(2D)1H-13C-HMQC光谱。蛋白质样品包含20μM STAT3。将两种化合物分别添加至40μM的最终浓度。所有2D1H-13C HMQC光谱于35℃在配有冷冻探头的Bruker Ascend 700光谱仪上以2048x128复数点收集。用Sparky程序(T.D.Goddard和D.G.Kneller,SPARKY 3,Universityof California,San Francisco)分析光谱。
染色质免疫沉淀-qPCR(ChIP-qPCR)
如前所述进行ChIP测定(Barry,S.P.,et al.,STAT3 modulates the DNA damageresponse pathway,Int J Exp Pathol 91:506-14(2010))，使用SABiosciencesCorporation的ChampionChIP单日试剂盒(Qiagen，Frederick，MD)，遵循生产商的说明。将来自MONOMAC-6细胞的染色质交联，超声处理到～500bp的平均尺寸，并随后用抗STAT3(Santa Cruz,Dallas,TX)、STAT5(BD Biosciences,San Jose,CA)或者IgG(Abcam,Cambridge,MA)的抗体免疫沉淀。如前所述使用靶向TET1启动子的引物通过实时qPCR将纯化的DNA扩增(Huang,H.,et al.,TET1 plays an essential oncogenic role in MLL-rearranged leukemia,Proc Natl Acad Sci USA 110:11994-99(2013))。qPCR引物的序列为：位点1：正向：5'-ACTTTGACCTCCCAAAGTGCTGGA-3'(SEQ ID NO:3)，反向：5'-ACCTGAGTGATGCTGAGACTTCCT-3'(SEQ ID NO:4)；位点2：正向：5'-TTTGGGAACCGACTCCTCACCT-3'(SEQ ID NO:5)，反向：5'-TCGGGCAAACTTTCCAACTCGC-3'(SEQID NO:6)；位点3正向：5'-ACGCTGGGCATTTCTGATCCACTA-3'(SEQ ID NO:7)，反向：5'-TATTGTGCAGCTCGTTTAGTGCCC-3'(SEQ ID NO:8)；位点4正向：5'-CCATCTCCCGACACACA-3'(SEQ ID NO:9)；反向：5'-TTGGCAGTGACCTTGAGA-3'(SEQ ID NO:10)。
电泳迁移位移测定(EMSA)
使用EMSA测定试剂盒(Signosis,Santa Clara,CA)根据生产商的说明(有少许改动)进行EMSA检测。简言之，将纯化的STAT3蛋白质与生物素标记的TET1-CPG探针(热探针)和/或冷探针一起温育，随后在非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质/DNA复合物。使用抗生蛋白链菌素-HRP轭合物和化学发光底物检测条带。TET1-CPG探针的序列为：正向：5'生物素-CCGGTAGGCGTCCTCCGCGACCCGC-3'(SEQ ID NO:11)；反向：5'生物素-GCGGGTCGCGGAGGACGCCTACCGG-3'(SEQ ID NO:12)。
蛋白印迹法
细胞用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并用含有5mM EDTA、PMSF、抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液(Pierce,Rockford,IL)破裂。将细胞提取物以10,000g微量离心20分钟，并收集上清液。通过SDS-PAGE解析细胞裂解物，并转移至PVDF膜上。将膜在含0.1％Tween 20的Tris缓冲盐水中用5％脱脂奶封闭1小时，并在4℃与抗Tet1抗体(GT1462,GeneTex,Irvine,CA)或抗肌动蛋白抗体(8H10D10,Cell SingalingTechnology Inc.,Danvers,MA)一起温育过夜。将膜用包含0.1％Tween-20的Tris缓冲盐水洗涤30分钟，与偶联至辣根过氧化物酶的合适的第二抗体一起温育1小时，并使用化学发光底物显影。
5hmC标记反应和斑点印迹法
如前所述进行5-羟基甲基胞嘧啶(5-hmC)标记反应和5hmC斑点印迹法(Huang,H.,et al.TET1 plays an essential oncogenic role in MLL-rearranged leukemia.ProcNatl Acad Sci U S A 110,11994-11999(2013))。简言之，将三个jia超声处理的基因组DNA(100-500bp)片段在包含50mM Hepes缓冲液(pH 7.9)、25mM MgCl2、100jiM UDP-6-N3-Glc和1jiMβ-葡萄糖基转移酶(f3-GT)的溶液中于37℃温育1小时。通过向纯化的DNA溶液中添加150jiM二苯并环辛炔改性生物素并将反应混合物于37℃温育2小时来进行来进行CLICK。将600ng标记的基因组DNA样品点样在Amersham Hybond-N+膜(GE Healthcare，Little Chalfont，UK)上。通过Stratagene UV Stratalinker 2400(自交联)将DNA固定在膜上。随后将膜用5％BSA封闭，并与亲和素-HRP(1:40,000)(Bio-Rad,Hercules,CA)一起温育，随后通过增强化学发光来可视化。
5hmC-Seal文库构建
将从ML-2细胞提取的100ng基因组DNA在55℃在50jiL标记缓冲液中片段化。将经片段化的DNA用Zymo DNA清洁和浓缩试剂盒(Zymo Research,Tustin,CA)纯化。然后，在含有上述片段化DNA、100μM N3-UDP-Glc、1μM β-GT的25jiL葡萄糖基化缓冲液(50mM HEPES缓冲液pH 8.0，25mM MgCl2)中进行选择性5hmC化学标记，并在37℃温育2小时，在45μL ddH2O中纯化后，添加1.5μL DBCO-PEG4-生物素(Click Chemistry Tools,4.5mM，存储在DMSO中)并在37℃温育2小时。在室温，将生物素标记的DNA用5μL C1抗生蛋白链菌素珠(LifeTechnologies，Carlsbad,CA)下拉(pull down)15分钟。接下来，使用Nextera DNA样品制备试剂盒(Illumina,San Diego,CA)对捕获的DNA片段进行13个PCR扩增循环。通过1.0XAMPure XP珠纯化所得的扩增产物。通过直接PCR从片段化DNA制备输入文库，无需化学标记和捕获。文库通过Qubit荧光计(Life Technologies)定量，并在Illumina HiSEQ4000测序仪上测序，具有配对末端50bp读数。
统计软件和统计分析
用Ingenuity Pathwy Analysis(Qiagen)分析基因网络。用Molsoft ICM-Pro(Molsoft L.L.C.,San Diego,CA)进行蛋白质-DNA/化合物结合的建模。以WinSTAT(R.Fitch Software)、GraphPad Prism 5.00版本(GraphPad Software,San Diego,CA)和/或Partek Genomics Suite(Partek Inc)进行t-检验、Kaplan-Meier法和对数秩检验等。小于0.05的P-值被认为是统计学显著的。对于5hmC测序分析，使用Bowtie程序将Illumina测序读取映射到UCSC hg19人类参考基因组。仅保留唯一影射的读取以用于后续数据分析。使用Samtools去除PCR重复。使用MACS识别每个样品中5hmC峰，并且使用0.01的IDR截断值过滤高置信度峰。使用HOMER将来自不同样品的峰合并在5hmC富集区域的统一目录中。为使IGV中的测序信号可视化，通过deepTools使用RPKM标准化方法生成BigWig文件。所有数据均符合测试的假设值，各组之间的变异是可接受的，并且各组之间的差异相似。
数据可用性
本研究中引用的数据可在The Gene Expressoin Omnibus中获得。5hmC测序数据可以GSE97407获得(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？token＝etodaoikjtwnpgb&acc＝GSE97407)。

Claims (20)

1.一种治疗患有特征在于10-11易位1(TET1)过表达的病症的受试者的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的具有下式的化合物或其可药用盐：
其中：
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自H、羟基、烷基、烷氧基、胺、卤素和三氟甲基，并且其中R1、R2、R3、R4和R5中任何两个相邻的基团可共同形成杂环；
R6是H或羟基；和
R7选自H、其中R8是C或O。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述特征在于TET1过表达的病症包括造血系统恶性肿瘤。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述造血系统恶性肿瘤是急性髓性白血病(AML)。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述病症包括高TET1型AML。
5.如权利要求1所述的方法，其中R1、R2、R3、R4和R5中任何两个相邻的基团共同形成选自唑、二氧杂环戊烯和二氧杂环戊烷的杂环。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述烷基包括直链或支链C1-C12烷基，并且其中烷氧基包括直链或支链C1-C12烷氧基。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自下组：
6-{1-吡咯烷基[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[4-吗啉基(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2-羟基-3-甲氧基苯基)(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[1-吡咯烷基(2,4,6-三甲氧基苯基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-((4-(二甲基氨基)苯基)(4-吗啉基)甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2-甲氧基苯基)(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{哌啶子基[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-((2,4-二甲氧基苯基)-4-吗啉基甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
2-[1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基(4-吗啉基)甲基]-4-甲基苯酚；
6-[(2,3-二甲氧基苯基)(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{吗啉代[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{[4-羟基-3,5-二(2-甲基-2-丙基)苯基](4-吗啉基)甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[4-吗啉基(2,3,4-三甲氧基苯基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(4-氟苯基)(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{[4-(二甲基氨基)苯基](1-吡咯烷基)甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-(3,4,5-三甲氧基苄基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{[4-(二甲基氨基)苯基](1-哌啶基)甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-((2-羟基苯基)(4-吗啉基)甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2,3-二甲氧基苯基)(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2-羟基-3-甲氧基苯基)(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2,4-二甲氧基苯基)(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2-甲氧基苯基)(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2,4-二甲氧基苯基)(1-哌啶基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；和
6-(1-吡咯烷基(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自下组：
6-{[4-羟基-3,5-二(2-甲基-2-丙基)苯基](4-吗啉基)甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；和
6-(1-吡咯烷基(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇。
9.如权利要求1所述的方法，还包括对所述受试者施用第二种抗癌剂。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述第二种抗癌剂，其选自阿糖胞苷、克拉屈滨、氟达拉滨、托泊替康、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、地西他滨、阿扎胞苷、全反式维甲酸、三氧化二砷、奥星-吉妥珠单抗、米哚妥林、奈拉滨、氯法拉滨、达沙替尼、伊马替尼、帕纳替尼、JQ1、甲氨蝶呤、皮质类固醇、二盐酸组胺、白介素2及其组合。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述第二种抗癌剂与根据式I的化合物共同施用。
12.一种有效用于治疗急性髓性白血病(AML)的药物组合物，其包括：
(a)有效量的具有下式的化合物或其可药用盐：
其中：
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自H、羟基、烷基、烷氧基、胺、卤素和三氟甲基，并且其中R1、R2、R3、R4和R5中任何两个相邻的基团可共同形成杂环；
R6是H或羟基；和
R7选自H、其中R8是C或O；和
(b)至少一种可药用载体。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其中R1、R2、R3、R4和R5中任何两个相邻的基团共同形成选自唑、二氧杂环戊烯和二氧杂环戊烷的杂环。
14.如权利要求12所述的药物组合物，其中烷基包括直链或支链C1-C12烷基，并且其中烷氧基包括直链或支链C1-C12烷氧基。
15.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述化合物选自下组：
6-{1-吡咯烷基[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[4-吗啉基(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2-羟基-3-甲氧基苯基)(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[1-吡咯烷基(2,4,6-三甲氧基苯基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-((4-(二甲基氨基)苯基)(4-吗啉基)甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2-甲氧基苯基)(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{哌啶子基[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-((2,4-二甲氧基苯基)-4-吗啉基甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
2-[1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基(4-吗啉基)甲基]-4-甲基苯酚；
6-[(2,3-二甲氧基苯基)(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{吗啉代[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{[4-羟基-3,5-二(2-甲基-2-丙基)苯基](4-吗啉基)甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[4-吗啉基(2,3,4-三甲氧基苯基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(4-氟苯基)(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{[4-(二甲基氨基)苯基](1-吡咯烷基)甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-(3,4,5-三甲氧基苄基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{[4-(二甲基氨基)苯基](1-哌啶基)甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-((2-羟基苯基)(4-吗啉基)甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2,3-二甲氧基苯基)(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2-羟基-3-甲氧基苯基)(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2,4-二甲氧基苯基)(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2-甲氧基苯基)(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2,4-二甲氧基苯基)(1-哌啶基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；和
6-(1-吡咯烷基(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇。
16.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述化合物选自下组：
6-{[4-羟基-3,5-二(2-甲基-2-丙基)苯基](4-吗啉基)甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；和
6-(1-吡咯烷基(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇。
17.如权利要求12所述的药物组合物，还包括选自阿糖胞苷、克拉屈滨、氟达拉滨、托泊替康、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、地西他滨、阿扎胞苷、全反式维甲酸、三氧化二砷、奥星-吉妥珠单抗、米哚妥林、奈拉滨、氯法拉滨、达沙替尼、伊马替尼、帕纳替尼、JQ1、甲氨蝶呤、皮质类固醇、二盐酸组胺、白介素2及其组合的第二种抗癌剂。
18.一种选择性抑制受试者的TET1转录和/或降低5-羟基甲基胞嘧啶水平的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的具有下式的化合物或其可药用盐：
其中：
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自H、羟基、烷基、烷氧基、胺、卤素和三氟甲基，并且其中R1、R2、R3、R4和R5中任何两个相邻的基团可共同形成杂环；
R6是H或羟基；和
R7选自H、其中R8是C或O。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述化合物选自下组：
6-{1-吡咯烷基[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[4-吗啉基(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2-羟基-3-甲氧基苯基)(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[1-吡咯烷基(2,4,6-三甲氧基苯基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-((4-(二甲基氨基)苯基)(4-吗啉基)甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2-甲氧基苯基)(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{哌啶子基[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-((2,4-二甲氧基苯基)-4-吗啉基甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
2-[1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基(4-吗啉基)甲基]-4-甲基苯酚；
6-[(2,3-二甲氧基苯基)(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{吗啉代[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{[4-羟基-3,5-二(2-甲基-2-丙基)苯基](4-吗啉基)甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[4-吗啉基(2,3,4-三甲氧基苯基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(4-氟苯基)(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{[4-(二甲基氨基)苯基](1-吡咯烷基)甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-(3,4,5-三甲氧基苄基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-{[4-(二甲基氨基)苯基](1-哌啶基)甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-((2-羟基苯基)(4-吗啉基)甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2,3-二甲氧基苯基)(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基(4-吗啉基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2-羟基-3-甲氧基苯基)(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2,4-二甲氧基苯基)(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2-甲氧基苯基)(1-吡咯烷基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；
6-[(2,4-二甲氧基苯基)(1-哌啶基)甲基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；和
6-(1-吡咯烷基(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述化合物选自下组：
6-{[4-羟基-3,5-二(2-甲基-2-丙基)苯基](4-吗啉基)甲基}-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇；和
6-(1-吡咯烷基(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基)-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-醇。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110935027A (zh) * 2019-12-24 2020-03-31 沈阳药科大学 三氧化二砷与flt3抑制剂的药物组合物及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110573151A (zh) * 2017-04-26 2019-12-13 辛辛那提大学 用于治疗急性髓性白血病的方法、试剂和组合物
CN113149972B (zh) * 2021-04-09 2022-09-13 四川大学 2-(芳基(氮杂环烷-1-基)甲基)苯酚衍生物及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070123491A1 (en) * 2003-04-24 2007-05-31 Biovitrum Ab Podophyllotoxin derivatives as igf-1r inhibitors
US20130156795A1 (en) * 2009-09-01 2013-06-20 Antonio Iavarone Methods for inhibition of cell proliferation, synergistic transcription modules and uses thereof
WO2015168621A1 (en) * 2014-05-02 2015-11-05 Oncoethix Sa Method of treating acute myeloid leukemia and/or acute lymphoblastic leukemia using thienotriazolodiazepine compounds

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA95978C2 (ru) 2006-10-02 2011-09-26 Оцука Фармас'Ютікел Ко., Лтд. Ингибитор активации stat3/5
WO2011066864A1 (en) 2009-12-03 2011-06-09 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Method and compositions for inhibition of macrophage migration inhibitory factor (mif)
WO2012065139A2 (en) 2010-11-11 2012-05-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Entpd5 inhibitors
WO2014113495A1 (en) 2013-01-15 2014-07-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Activation or reactivation of ache
KR102302830B1 (ko) 2014-03-17 2021-09-15 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 1,3-벤조디옥솔 유도체
CN110573151A (zh) * 2017-04-26 2019-12-13 辛辛那提大学 用于治疗急性髓性白血病的方法、试剂和组合物
WO2019025424A1 (en) * 2017-08-04 2019-02-07 Universitat Autonoma De Barcelona COMPOUNDS FOR TREATING SYNUCLEINOPATHIES

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070123491A1 (en) * 2003-04-24 2007-05-31 Biovitrum Ab Podophyllotoxin derivatives as igf-1r inhibitors
US20130156795A1 (en) * 2009-09-01 2013-06-20 Antonio Iavarone Methods for inhibition of cell proliferation, synergistic transcription modules and uses thereof
WO2015168621A1 (en) * 2014-05-02 2015-11-05 Oncoethix Sa Method of treating acute myeloid leukemia and/or acute lymphoblastic leukemia using thienotriazolodiazepine compounds

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG HAO ET AL: "TET1 plays an essential oncogenic role in MLL-rearranged leukemia", 《PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA》 *
JANENDRA K.BATRA: "Methylenedioxy-benzopyran analogs of podophyllotoxin, a new synthetic class of antimitotic agents that inhibit tubulin polymerization", 《BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY》 *
NLM: "《pubchem》", 26 March 2005 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110935027A (zh) * 2019-12-24 2020-03-31 沈阳药科大学 三氧化二砷与flt3抑制剂的药物组合物及其应用

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