CN110542641A - 从花粉中分选2n花粉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从花粉中分选2n花粉的方法，所述方法包括：步骤一、取花粉样品，制备花粉悬浮液；步骤二、将所述花粉悬浮液上样至流式细胞仪进行分选。本发明将流式细胞术应用到2n花粉的中，巧妙的解决了2n花粉分选效率低、操作复杂的问题。进一步地配合采用合适流式细胞仪的分选环境温度、湿度以及参数值的设定，能够降低流式细胞仪的分选误差。
Description
技术领域
本发明涉及生物育种技术领域，特别是涉及一种从花粉中分选2n花粉的方法。
背景技术
流式细胞术(flow cytometry，FCM)是指利用流式细胞仪快速定量分析细胞群的物理化学特征以及根据这些物理化学特征精确分选的技术，主要分为流式分析和流式分选两部分，目前广泛应用于基础医学和生物学研究的各个领域。而流式细胞术在植物方面的应用起步较晚，主要集中在流式分析方面，包括细胞核DNA含量分析、倍性分析、染色体结构分析、细胞周期分析等方面。在流式分选方面，分选染色体和原生质体然后结合其它基因组、转录组和蛋白组等分析手段进行研究的应用比较多。目前在国内外均未发现有利用流式细胞术分析、分选花粉的相关报道。
多倍体育种是植物育种的重要手段，常用的多倍体育种途径有体细胞加倍、2n配子(又称未减数分裂配子)产生和融合两种方法。但是，体细胞加倍容易产生嵌合体和混倍体，导致植株同质性增加而出现衰退现象，在长期繁殖过程中可能会恢复为原来的倍性。而利用2n配子创制的多倍体稳定好，杂合性高，因此成为育种学家较为青睐的一种多倍体育种方法。
2n配子包括2n雄配子(又称2n花粉)和2n雌配子。创制2n花粉进行杂交是获得多倍体的一个重要方法，在收获诱导的花粉后，进行人工授粉前，需要对花粉中所含的2n花粉比例进行统计。2n花粉的获得率普遍偏低，为了提高创制多倍体的效率，必须将2n花粉与正常花粉进行分离，达到较高比例后再进行人工授粉。据报道，未减数的2n花粉直径是正常花粉的1.28～1.30倍，因此根据花粉直径大小，分离2n花粉的方法主要有：筛选法、速度沉降法和静电花粉分选法，但这些方法均具有筛选效率低，成本高，操作复杂等缺点。
因此，亟待提供一种简单、高效的2n花粉的分选方法。
发明内容
基于此，本发明的主要目的是提供一种从花粉中分选2n花粉的方法。该方法将流式细胞术成功地应用到花粉分选中，能够简单、高效的将2n花粉从花粉样品中分选出来。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的主要目的是提供一种从花粉中分选2n花粉的方法，所述方法包括：
步骤一、取花粉样品，制备花粉悬浮液；
步骤二、将所述花粉悬浮液上样至流式细胞仪进行分选。
在其中一个实施例中，步骤二中，所述分选的环境温度控制在18℃-22℃。
在其中一个实施例中，步骤二中，所述分选的环境湿度控制在46％-50％。
在其中一个实施例中，制备所述花粉悬浮液采用的溶剂为质量百分数为0.6％-1.5％的蔗糖水溶液。
在其中一个实施例中，制备所述花粉悬浮液采用的溶剂为质量百分数为0.8％-1.3％的蔗糖水溶液。
在其中一个实施例中，步骤二中，分选所得产物收集于所述流式细胞仪分选仓内的上样管中，所述上样管的内壁采用质量百分数为0.6％-1.5％的蔗糖水溶液进行预先润洗。
在其中一个实施例中，步骤二中，上样前，对所述花粉悬浮液进行间断吸打。
在其中一个实施例中，步骤二中，分选的时间控制在50min以内。
在其中一个实施例中，所述方法还包括对所述分选所得产物中的2n花粉进行鉴别的步骤。
在其中一个实施例中，步骤二中，所述流式细胞仪选用GFP作为荧光标记。
在其中一个实施例中，步骤二中，所述流式细胞仪的实验方案及参数设置为：
在第1个坐标中，用GFP-H以对数形式为横坐标，SSC-H以线性形式为纵坐标，GFP电压(PMT)范围控制在24.62-50.86；SSC电压(PMT)范围控制在24.20-29.07，调节阈值(ThreShold)范围控制在130-3372，以去除非花粉的杂质信号；
在第2个坐标中，用FSC-H以线性形式为横坐标，SSC-H以线性形式为纵坐标，FSC电压(PMT)范围控制在0.5-8.5，设门选中花粉信号群；
在第3个坐标中，用SSC-W以线性形式为横坐标，SSC-H以线性形式为纵坐标，设门选中明显成群的花粉信号群，以去除SSC-W右侧未成群的花粉粘连体；
在第4个坐标中，用GFP-A以对数形式为横坐标，SSC-A以线性形式为纵坐标，再次设门选中花粉信号群，以去除非花粉的杂质；
在第5个坐标轴中，用FCS-A以线性形式为横坐标，GFP-A以对数形式为纵坐标，根据花粉直径大小，可分为不同大小的花粉信号群。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明将流式细胞术应用到2n花粉的分选中，巧妙的解决了2n花粉筛选效率低、操作复杂的问题，实现了2n花粉的简单、高效分选。进一步地配合采用合适流式细胞仪的分选环境温度、湿度、参数设置值，能够降低流式细胞仪的分选误差。
附图说明
图1为利用流式细胞仪分选2n花粉实验方案模板；图中从上到下、左至右依次对应第1、2、3、4、5个坐标；
图2为用流式细胞仪分选产物中的花粉图片；图A为分选出的大花粉，图B为分选出的正常花粉；
图3为流式细胞仪分选得到的大花粉图片，箭头所指为2n花粉；
图4为本发明实施例1分选产物的发芽力情况图；
图5为对比例1分选2n花粉实验方案模板；图中从上到下、从左至右依次对应第1、2、3、4、5个坐标。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本实施例提供一种从花粉中分选2n花粉的方法，所述方法包括：
步骤一、取花粉样品，制备花粉悬浮液。
在一个实施例中，制备花粉悬浮液采用的溶剂为质量百分数为0.6％-1.5％的蔗糖水溶液。
本实施例采用0.6％-1.5％的蔗糖溶液作为溶剂制备花粉悬浮液，能够提高分选所得产物中2n花粉的活力。
优选地，本实施例采用0.8％-1.3％的蔗糖溶液作为溶剂制备花粉悬浮液。
步骤二、将所述花粉悬浮液上样至流式细胞仪进行分选。
在一个实施例中，分选的环境温度控制在18℃-22℃。
在一个实施例中，分选的环境湿度控制在46％-50％。
在一个实施例中，分选所得产物收集于流式细胞仪分选仓内的上样管中，上样管的内壁采用质量百分数为0.6％-1.5％的蔗糖水溶液进行预先润洗。通过采用蔗糖水溶液进行润洗，能够提高分选所得产物中2n花粉的活力。
在一个实施例中，分选的时间控制在50min以内。
在一个实施例中，上样前，对所述花粉悬浮液进行间断吸打。
通过控制分选时间及在上样前对花粉悬浮液进行吸打，能够显著降低花粉粘连情况，提升分选产物中2n花粉的比例。
在一个实施例中，流式细胞仪选用GFP作为荧光标记。可以理解的是，本实施例的荧光标记不限于GFP。
在一个实施例中，流式细胞仪的实验方案及参数设置包括：
在第1个坐标中，用GFP-H以对数形式为横坐标，SSC-H以线性形式为纵坐标；调节GFP的PMT值为24.62-50.86，调节SSC的PMT值为24.20-29.07，，调节阈值为ThreShold＝130-3372；在第2个坐标中，用FSC-H以线性形式为横坐标，SSC-H以线性形式为纵坐标，调节FSC的PMT值为0.5-8.5，设门选中信号群；
在第3个坐标中，用SSC-W以线性形式为横坐标，SSC-H以线性形式为纵坐标，设门选中明显成群的信号群，去除SSC-W大的未成群的信号；
在第4个坐标中，用GFP-A以对数形式为横坐标，SSC-A以线性形式为纵坐标；
在第5个坐标轴中，用FCS-A以线性形式为横坐标，GFP-A以对数形式为纵坐标。
通过上述参数设置，本实施例方法能够检测出花粉样品中的大花粉比例。
在一个实施例中，本实施例的方法还包括对所述分选所得产物中的2n花粉进行鉴别的步骤。
实施例1
本实施例提供一种从花粉中分选2n花粉的方法。具体操作过程如下：
1材料与方法
1.1供试材料
用于分析、分选的材料为申请人于2019年春季通过4种处理方法诱导的龙眼属间杂种花粉，品种为以龙眼‘石硖’为母本，荔枝‘紫娘喜’为父本杂交的属间杂种‘石紫19’，母树种植于华南农业大学果园。
1.2流式细胞仪软件操作
调节流式细胞仪环境温度为20℃，湿度为48％。
仪器启动，并进行C&ST质控(检测仪器状态，保证仪器各激光器运行正常)和DropDelay流程(保证仪器分选准确)。
(1)新建一个实验，选中GFP荧光，设定坐标参数(图1，表1)：
在第1个坐标中，用GFP-H以对数形式为横坐标，SSC-H以线性形式为纵坐标；调节GFP的PMT值为40.05，调节SSC的PMT值为28.04；调节阈值为ThreShold＝1038，GFP值小于设定阈值的微粒视其为杂质去除，GFP值大于设定阈值的微粒视为花粉保留。
在第2个坐标中，用FSC-H以线性形式为横坐标，SSC-H以线性形式为纵坐标，调节FSC的PMT值为2.5，设门选中信号群。
在第3个坐标中，用SSC-W以线性形式为横坐标，SSC-H以线性形式为纵坐标，设门选中明显成群的信号群，去除SSC-W右侧未成群的信号(粘连体)。
在第4个坐标中，用GFP-A以对数形式为横坐标，SSC-A以线性形式为纵坐标，以热点图的形式展现，设门选中信号群，并适当去除靠左边GFP-A偏小的信号，使选中的信号保证为花粉信号。
在第5个坐标轴中，用FCS-A以线性形式为横坐标，GFP-A以对数形式为纵坐标，此时若能分出两个信号群，则左边的为正常花粉信号群，右边的为体积偏大的大花粉信号群。
表1.花粉分选模板坐标设定参数
(2)采用质量百分数为1％蔗糖水溶液做溶剂制备花粉悬浮液，待上样。上样前，隔段时间吸打一次。
(3)取两支上样管分别加4ml质量百分数为1％的蔗糖水溶液，润洗管壁1min后吸取多余蔗糖水溶液，使管内剩余0.5ml，将上样管放入流式细胞仪分选仓中用于分别盛装分选的大花粉及正常花粉，选中“Purely”模式开始分选。
1.3分选速率、分选效果、分选效率及花粉的2n花粉率的统计
(1)分选速率的统计
以流式细胞仪导出的分选报告为数据，计算流式细胞仪的花粉分选速率，该分选速率包括正常花粉的分选速率和大花粉的分选速率。
计算公式：分选速率(个/min)＝分选花粉总数(个)/所用分钟数(min)。
(2)分选效果的检测
分别将分选出来的正常花粉、大花粉转移至1.5ml离心管中，10000rpm离心5min，去掉上清液，用移液枪吸取花粉悬液于载玻片上，滴一滴醋酸洋红，利用显微镜(20×)镜检，随机选取10个视野，用显微镜微尺测量每个花粉的最大直径，每种类型的花粉至少测量100个。
(3)分选效率的统计
因分选出来大花粉不一定100％为2n花粉，因此需要统计分选的大花粉中2n花粉所占的比例。
统计方法：分别以直径大于或等于正常花粉直径1.28倍作为2n花粉的最低直径标准，统计分选出的大花粉中真正的2n花粉所占比例。
计算公式：2n花粉分选效率(％)＝分选出大花粉中真正的2n花粉的个数/分选出大花粉总数×100％。
(4)花粉的大花粉率统计方法
流式细胞仪分析数据中的大花粉率为基础，乘以分选效率即为花粉的2n花粉率。
2结果与分析
2.1分选速率
在整个实验操作过程中，共分选了560236个花粉，正常花粉的平均分选速率为7843个/min，最快分选速率为18182个/min，大花粉的分选速率与样品的大花粉比率有关，一般样品花粉中大花粉比例越高，分选速率越快，本申请中大花粉平均分选速率为708个/min，大花粉的最大分选速率为17667个/min。见表2。
表2.利用流式细胞仪分选花粉的分选速率
2.2分选效果
针对通过流式细胞仪分选出的正常花粉及大花粉，通过显微镜微尺测量它们的直径，其中：通过流式细胞仪分选出的正常花粉统计了201个，平均直径为20.38μm；通过流式细胞仪分选出的大花粉统计了561个，平均直径为26.17μm，大花粉平均直径是正常花粉的1.28倍(表3)。从图2可以看出筛选出的大花粉的体积明显比正常花粉大。
表3.分选后所得大花粉和正常花粉的平均直径大小
2.3分选效率
参考前人的报道，以流式细胞仪分选出的正常花粉平均直径的1.28倍为2n花粉直径的标准时，2n花粉的最小直径为26.08μm，统计该直径标准下的2n花粉的个数为289个，占总大花粉数的51.52％。
表4.流式细胞仪分选出的大花粉中的真正大花粉比例
2.4花粉中2n花粉比例统计
从流式细胞仪分析数据可以得到四种处理的‘石紫19’花粉的大花粉率依次为1.14％、21.55％、3.72％、19.69％。但所检测的大花粉并不完全是2n花粉，因此要结合流式细胞仪的分选效率进行计算，得到的2n花粉比例才比较准确。
以流式细胞仪分选出的正常花粉平均直径的1.28倍为2n花粉直径标准时，四种花粉的2n花粉率依次为0.59％、11.10％、1.92％、10.14％(表5)。
表5.在不同2n花粉直径标准下各处理花粉的实际大花粉直径
本实施例利用流式细胞仪检测法检测样品中的2n花粉比例速度快，上样后，1min之内便能得到结果。通过上样前对花粉悬浮液进行吸打及控制分选时间，能够显著降低沉聚的花粉量，提升分选产物中2n花粉的比例。
从表6可以看到，利用流式细胞仪检测法统计各处理花粉的2n花粉率与利用显微镜直径测量法及四分体异常分体比例统计法所得到的结果基本一致，证明利用流式细胞仪检测法统计花粉中的2n花粉率的结果可靠。
表6.利用三种不同方法统计各处理花粉的2n花粉率情况
本实施例利用流式细胞仪筛选出来的大花粉直径明显比正常的花粉的平均直径大，在显微镜下观察也很看到比较高比例的2n花粉，说明该方法是有效的。
利用流式细胞仪筛选花粉速度快，达7843个/min，速度快，因花粉自带的GFP荧光，无需染色，同时以蔗糖水溶液为悬浮液保证筛选后花粉的活性，最终筛选出来的大花粉中真实2n花粉比例达到51.52％，相对于筛选前的花粉最少提高了5倍，达到人工授粉所需的2n花粉比例。因此，利用流式细胞仪筛选2n花粉在育种应用中是可行的。
分选后所得的花粉悬浮液体积较小，适合应用点授的方法进行人工授粉，不适合用喷授的方法，避免浪费2n花粉。
另外，本实施例还对分选所得产物的花粉发芽率进行了检测，结果表明，其发芽率可达到79.61％，参见图4。
实施例2
本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处包括：
(1)采用流式细胞仪分选2n花粉的环境温度为18℃，湿度为46％。
(2)采用的溶剂为质量百分数为0.6％的蔗糖水溶液。
(3)流式细胞仪实验方案的参数值设定为：
阈值(ThreShold)：130；GFP电压(PMT)24.62；SSC电压(PMT)：24.20；FSC电压(PMT)：0.50。
结果参见表7。根据表7，本实施例所得结果与传统分选方法差异不显著。并且，本实施例所得2n花粉的活性很好，发芽率达到71.88％。
表7.利用三种不同方法统计各处理花粉的2n花粉率情况
实施例3
本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处包括：
(1)采用流式细胞仪分选2n花粉的环境温度为22℃，湿度为50％。
(2)采用的蔗糖水溶液的质量百分数为1.5％。
(3)流式细胞仪实验方案的参数值设定为：
阈值(ThreShold)：3372；GFP电压(PMT)50.86；SSC电压(PMT)：29.07；FSC电压(PMT)：8.5。
结果参见表8。根据表8，本实施例所得结果与传统分选方法差异不显著。并且本实施例所得2n花粉的活性很好，发芽率到达75.14％。
表8.利用三种不同方法统计各处理花粉的2n花粉率情况
对比例1
本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的差别主要在于采用流式细胞仪分选2n花粉的环境温度、湿度以及流式细胞仪实验方案的参数值设定的不同。本对比例具体采用的温度为25℃、湿度为60％；流式细胞仪实验方案的参数值设定为：
阈值(ThreShold)：100；GFP电压(PMT)20.52；SSC电压(PMT)：20.24；FSC电压(PMT)：9.0。
此时坐标内出现很多杂质信号且信号群不稳定(图5)，分选结果参见表9。根据表9，本实施例所得结果与传统分选方法差异显著。这说明，采用的环境条件不适宜，以及参数值设定的不佳增加了流式细胞仪的分选误差。
表9.利用三种不同方法统计各处理花粉的2n花粉率情况
对比例2
本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的差别主要在于采用纯水代替蔗糖水溶液。
结果：本对比例分选所得2n花粉的活性较低，发芽率为45.45％。
综上，本发明将流式细胞术应用到2n花粉的中，巧妙的解决了2n花粉分选效率低、操作复杂的问题。进一步地配合采用合适流式细胞仪的分选环境温度、湿度以及参数值的设定，能够降低流式细胞仪的分选误差；同时，通过采用质量百分数为0.6％-1.5％的蔗糖水溶液作为溶剂悬浮花粉，能够确保分选所得2n花粉具备很好的活性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种从花粉中分选2n花粉的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤一、取花粉样品，制备花粉悬浮液；
步骤二、将所述花粉悬浮液上样至流式细胞仪进行分选。
2.根据权利要求1所述的从花粉中分选2n花粉的方法，其特征在于，步骤二中，所述分选的环境温度控制在18℃-22℃。
3.根据权利要求1所述的从花粉中分选2n花粉的方法，其特征在于，步骤二中，所述分选的环境湿度控制在46％-50％。
4.根据权利要求1至3任一项所述的从花粉中分选2n花粉的方法，其特征在于，步骤一中，制备所述花粉悬浮液采用的溶剂为质量百分数为0.6％-1.5％的蔗糖水溶液。
5.根据权利要求1至3任一项所述的从花粉中分选2n花粉的方法，其特征在于，制备所述花粉悬浮液采用的溶剂为质量百分数为0.8％-1.3％的蔗糖水溶液。
6.根据权利要求1至3任一项所述的从花粉中分选2n花粉的方法，其特征在于，步骤二中，分选所得产物收集于所述流式细胞仪分选仓内的上样管中，所述上样管的内壁采用质量百分数为0.6％-1.5％的蔗糖水溶液进行预先润洗。
7.根据权利要求1至3任一项所述的从花粉中分选2n花粉的方法，其特征在于，步骤二中，上样前，对所述花粉悬浮液进行吸打。
8.根据权利要求1至3任一项所述的从花粉中分选2n花粉的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述分选所得产物进行鉴别的步骤。
9.根据权利要求1至3任一项所述的从花粉中分选2n花粉的方法，其特征在于，步骤二中，所述流式细胞仪选用GFP作为荧光标记。
10.根据权利要求1至3任一项所述的从花粉中分选2n花粉的方法，其特征在于，步骤二中，所述流式细胞仪的实验方案及参数设置为：
在第1个坐标中，用GFP-H以对数形式为横坐标，SSC-H以线性形式为纵坐标，GFP电压范围控制在24.62-50.86；SSC电压范围控制在24.20-29.07，调节阈值范围控制在130-3372，以去除非花粉的杂质信号；
在第2个坐标中，用FSC-H以线性形式为横坐标，SSC-H以线性形式为纵坐标，FSC电压范围控制在0.5-8.5，设门选中花粉信号群；
在第3个坐标中，用SSC-W以线性形式为横坐标，SSC-H以线性形式为纵坐标，设门选中明显成群的花粉信号群，以去除SSC-W右侧未成群的花粉粘连体；
在第4个坐标中，用GFP-A以对数形式为横坐标，SSC-A以线性形式为纵坐标，再次设门选中花粉信号群，以去除非花粉的杂质；
在第5个坐标轴中，用FCS-A以线性形式为横坐标，GFP-A以对数形式为纵坐标，根据花粉直径大小，可分为不同大小的花粉信号群。
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|---|---|---|---|---|
| CN112226401A (zh) * | 2020-06-02 | 2021-01-15 | 北京林业大学 | 杨树2n花粉的诱导和分离纯化方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09113436A (ja) * | 1995-10-23 | 1997-05-02 | Sanyo Electric Co Ltd | 粒子検出方法 |
| JP2001242065A (ja) * | 2000-03-02 | 2001-09-07 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 花粉検出装置 |
| CN102783416A (zh) * | 2012-07-25 | 2012-11-21 | 陕西天正达生物科技股份有限公司 | 基于细胞流式技术的芦笋抗性超雄多倍化育种方法 |
| CN105181560A (zh) * | 2014-03-06 | 2015-12-23 | 安弗西斯股份公司 | 用于确定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法 |
| CN109182254A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-11 | 广西大学 | 一种水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法 |
-
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09113436A (ja) * | 1995-10-23 | 1997-05-02 | Sanyo Electric Co Ltd | 粒子検出方法 |
| JP2001242065A (ja) * | 2000-03-02 | 2001-09-07 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 花粉検出装置 |
| CN102783416A (zh) * | 2012-07-25 | 2012-11-21 | 陕西天正达生物科技股份有限公司 | 基于细胞流式技术的芦笋抗性超雄多倍化育种方法 |
| CN105181560A (zh) * | 2014-03-06 | 2015-12-23 | 安弗西斯股份公司 | 用于确定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法 |
| CN109182254A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-11 | 广西大学 | 一种水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MICKAEL BOURGE,ET AL.: "Flow cytometry as tool in plant sciences, with emphasis on genome size and ploidy level assessment", 《GENETICS & APPLICATIONS》 * |
| 彭博 等: "果树2n配子研究进展", 《华北农学报》 * |
| 胡凤荣 等: "利用GiemsaC带和45SrDNA FISH的方法鉴定百合杂种", 《南京林业大学学报（自然科学版）》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112226401A (zh) * | 2020-06-02 | 2021-01-15 | 北京林业大学 | 杨树2n花粉的诱导和分离纯化方法 |
Also Published As
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