CN110533772A - 基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法、系统、装置，旨在解决由于ATUM‑SEM由于连续超薄切片收集难度大导致获取的三维图像库在三维重建时轴向精度低的问题。本系统方法包括获取生物组织的序列切片集合；通过刻蚀方法逐次减薄切片厚度并获取对应厚度值和对应生物组织切片图像，构建每一个序列切片对应的生物组织切片图像集；分别对每一个生物组织切片图像集中的生物组织切片图像进行配准；将配准后的生物组织切片图像集进行整体配准，得到三维图像库。本发明降低了连续超薄切片收集的难度，提高了获取的三维图像库在三维重建时的轴向精度。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法、系统、装置。
背景技术
借助于仪器仪表行业和计算机技术的快速发展，生物组织微观重建技术在近些年的发展非常迅速。近一个多世纪以来，在科技快速发展的同时，包括人类在内的整个地球生物界都面临越来越多的威胁，如各种新型疾病的出现、物种的加速消失等。虽然近些年生物医学领域对于个别疾病的研究取得了重大进展，但对于整个地球生物界面临的威胁而言，这样的进展远远不够。只有从最基本层面，即微观尺度上，将生物体的结构、功能以及二者的相互关系研究透彻，我们才能找到从根本上治疗疾病的方法，并能以此预测并预防一些新型疾病的出现。
随着电子显微镜在生物医学研究中的广泛应用，虽然从分辨率方面比传统的光学显微镜提高了2～3个数量级，但电子显微镜对所观察样品的制备要求也更高。自从Watson在1958年首先提出铅化合物可以增加超薄切片中细胞超微结构的反差以来，目前国内外多采用Reynolds在1963年提出的柠檬酸铅作为常规铅染液。但多年来，超薄切片的铅污染却是许多实验室普遍存在的问题，它直接影响着切片的质量和电镜观察效果，原因在于过去所用的铅染液在接触空气中的二氧化碳后易产生碳酸铅沉淀污染切片。而且铅染液不能长期贮存，否则污染会更加严重。为了解决这个问题，Hanaichi等在1986年改进了铅染液配方和染色方法并取得了一定效果。近几年来，德国马克普朗克神经生物学研究所和美国哈佛大学针对生物组织样品扫描电子显微镜SEM成像的制备方法进行了进一步改进，虽然对SEM图像衬度有较大提升，但对于算法自动识别图像中生物组织微观结构还有一定距离。
基于上述生物样品制备技术的发展，生物医学领域主要发展了四种微观尺度上三维图像库获取技术。第一种是序列切片透射电镜成像方法，即ssTEM，该方法先用切片机对生物组织样品块切片，并将序列切片收集在单孔铜网上并根据切片的顺序编号，然后利用TEM成像。第二种是连续样品表面扫描电镜成像方法，即SBEM，这种方式是在扫描电镜内部内置了高精度的钻石刀，通过钻石刀对样品表面进行间歇性等厚度切削，每次切削后利用SEM对暴露出的样品表面进行成像。第三种是聚焦离子束-扫描电镜方式，即FIB-SEM，该方式用FIB的离子束对样品表面进行切削后再利用电子束进行成像。第四种是自动卷带超薄切片机扫描电镜成像方式，即ATUM-SEM，该方法通过自动切片、收集系统将超薄切片收集到专用条带上，然后放入SEM中进行成像。ssTEM是四种微观重建方式中X/Y向分辨率最高的一种，这得益于TEM本身的高分辨率，其余三种方式都是利用SEM成像。但由于切片是收集在单孔铜网上，并且受制于TEM的视场大小，所以这种方式只适用于体量较小的生物组织微观重建，一般在临床医学方面应用较多。SBEM和FIB-SEM方式由于采用的是对生物组织样品块切削后原位拍照，故其后续图像配准的难度和工作量都大大降低。这两种方式采用的都是对块体断面进行背散射电子成像，并且为了尽可能减少电子束对样品块表面造成的损伤，否则会改变样品块表面的物理化学特性进而影响后续钻石刀或离子束对其进行进一步的切削，拍照时通常选用较低的电压和比较小的图像获取时间，所以得到的图像一般分辨率和信噪比均较差。此外，由于SBEM和FIB-SEM方式对样品而言是破坏性的，所以在进行一些珍贵生物样本或大体量样本的三维重建时，对系统的稳定性要求非常高，尤其是钻石刀的洁净度和FIB离子源的稳定性方面。ATUM-SEM方式的最大优点有三个，一是在拍照前就可以确定序列切片的连续性，二是可获得大体量微观重建所需的三维图像库，三是切片可以重复使用，即当出现个别切片所拍照片满足不了三维重建需要时可以重新拍摄。简而言之，ATUM-SEM方式可以确保生物组织三维重建图像数据的完整性。但ATUM-SEM也有它的缺点，包括大体量连续超薄切片收集难度大并且成本高、获取的三维图像库在三维重建时Z向分辨率低、后期数据配准难度大。对于ATUM-SEM方式，目前最小的Z向连续切片厚度为30nm(X/Y为横向，Z为竖向，即轴向)，由于连续超薄切片对于设备本身及收片环境的要求非常高，目前国际上只有哈佛大学Jeff Lichtman可以实现30nm切片的连续收集，但需要频繁更换超薄切片所用的钻石刀，成本非常高。相比其他三种三维图像库获取技术，由于ATUM-SEM方式可用于大体量微观重建领域，因此被越来越多的科学家认可，但是亟需解决该方式由于连续超薄切片收集难度大导致获取的三维图像库在三维重建时轴向精度低的问题。
对脑功能的破译需要在多个层次上解析脑网络系统的联结方式与规则，构建全尺度的脑图谱，最终得到可实现脑网络功能的“线路设计图”，这是脑科学的战略制高点。全脑神经联接图谱为类脑计算和脑机智能技术提供创新架构和模拟的基础，对未来智能产业的发展将有重大的贡献。在健康保障方面，全脑神经联接图谱为认知相关脑疾病的诊治，可提供精确的细胞和环路靶点。通过对脑网络图谱与重大脑疾病机理研究的结合，反过来将促进脑发育和脑功能基本工作原理的认识，推动脑科学和智能技术的发展。为了更好的理解“大脑是如何工作的”，美国和欧盟相继推出了各自的“脑计划”，但就目前国内外报道的生物三维图像库获取技术而言，完成大体量生物组织(如鼠脑或人脑)高空间分辨率三维重建仍然面临诸多挑战。寻找一种能快速获取到衬度一致性好、组织结构边缘锐度理想、空间分辨率高的大体量生物组织电子显微图像的方法是生物医学研究领域一直努力的目标。因此，本发明针对ATUM-SEM亟需解决的问题，提出了一种基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法。
发明内容
为了解决现有技术中的上述问题，即为了解决ATUM-SEM由于连续超薄切片收集难度大导致获取的三维图像库在三维重建时轴向精度低的问题，本发明第一方面，提出了一种基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法，该方法包括：
步骤S10，获取生物组织的序列切片集合；
步骤S20，对所述序列切片集合中每一个序列切片，通过刻蚀方法逐次减薄切片厚度并获取对应厚度值和对应生物组织切片图像，构建每一个序列切片对应的生物组织切片图像集；
步骤S30，分别对每一个所述生物组织切片图像集中的生物组织切片图像进行配准，得到配准后的生物组织切片图像集；
步骤S40，基于所述序列切片集合中各序列切片对应的配准后的生物组织切片图像集进行生物组织切片图像的整体配准，得到配准后的生物组织切片三维图像库。
在一些优选的实施方式中，步骤S20中“通过刻蚀方法逐次减薄切片厚度并获取对应厚度值和对应生物组织切片图像，构建每一个序列切片对应的生物组织切片图像集”，其方法为：
步骤S21，通过原子力显微镜AFM获取序列切片的切片厚度，并通过扫描电子显微镜SEM获取第一生物组织切片图像；
步骤S22，采用离子束刻蚀机IBE对序列切片进行刻蚀减薄处理，并通过反应离子刻蚀机RIE进行表面膜结构显著化刻蚀处理，得到第二序列切片；对所述第二序列切片，通过步骤S21的方法获取切片厚度和第二生物组织切片图像；
步骤S23，采用步骤S22的方法重复进行刻蚀，并获取每次刻蚀后的切片厚度和对应的生物组织切片图像，直至切片厚度值小于预设厚度值；
步骤S24，对各生物组织切片图像按其对应的切片厚度大小顺次排列，构建序列切片对应的生物组织切片图像集。
在一些优选的实施方式中，步骤S30中“分别对每一个所述生物组织切片图像集中的生物组织切片图像进行配准”，其方法为：
以每一个所述生物组织切片图像集中的第一幅切片图像为基准，通过sift特征点匹配算法和仿射变换算法得到该生物组织切片图像集中其他切片图像到第一幅切片图像的仿射变换矩阵；
基于所述仿射变换矩阵对所述生物组织切片图像集中其他切片图像进行形变。
在一些优选的实施方式中，步骤S40中“基于所述序列切片集合中各序列切片对应的配准后的生物组织切片图像集进行生物组织切片图像的整体配准”，其方法为：
依次通过sift特征点匹配算法得到所述序列切片集合中第i个配准后的生物组织切片图像集的最后一幅切片图像与第i+1个配准后的生物组织切片图像集中的第一幅切片图像的对应点；i表示下标值；
基于所述对应点，采用薄板样条变换算法对所述第一幅切片图像进行非线性形变；
以非线性形变后的第一幅切片图像为基准，通过步骤S30的方法对第i+1个配准后的生物组织切片图像集中的切片图像进行配准。
在一些优选的实施方式中，述扫描电子显微镜SEM在对所述生物组织序列切片成像时，其参数设定范围为：加速电压为2kV～5kV、电子束流为1.0nA～5nA、Pixelsize(扫描电子显微镜成像时单像素的尺寸大小)为10nm～20nm、Dwelltime(扫描电子显微镜成像时电子束在单个像素上停留的时间)为1000ns～3000ns。
在一些优选的实施方式中，所述离子束刻蚀机IBE在刻蚀时，其参数设定范围为：阴极电流为2.0A～8.0A、弧极电压为10V～80V、屏栅电压为20V～500V、加速电压为50V～400V、中和电流为3.0A～5.0A、刻蚀本地真空为1.0×10-3Pa～5.0×10-4Pa、气体流量为0.1sccm～20sccm、样品台倾斜角度为20°～60°、刻蚀时间大于等于1s。
在一些优选的实施方式中，所述反应离子刻蚀机RIE在刻蚀时，其参数设定范围为：刻蚀功率为60W～120W、工作压力为5Pa～75Pa、刻蚀时间为10s～200s、工艺气体包括氩气和氧气，其中氩气为10sccm～50sccm，氧气为5sccm～15sccm。
在一些优选的实施方式中，若所述序列切片以玻片或塑料条带作为收片载体，在进行SEM观察前需对其表面进行镀碳处理，且塑料条带需用导电胶粘贴在表面平整的硅片或金属基底上。
本发明的第二方面，提出了一种基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取系统，该系统包括获取模块、刻蚀减薄模块、配准模块、输出模块；
所述的获取模块，配置为获取生物组织的序列切片集合；
所述的刻蚀减薄模块，配置为对所述序列切片集合中每一个序列切片，通过刻蚀方法逐次减薄切片厚度并获取对应厚度值和对应生物组织切片图像，构建每一个序列切片对应的生物组织切片图像集；
所述的配准模块，配置为分别对每一个所述生物组织切片图像集中的生物组织切片图像进行配准，得到配准后的生物组织切片图像集；
所述的输出模块，配置为基于所述序列切片集合中各序列切片对应的配准后的生物组织切片图像集进行生物组织切片图像的整体配准，得到配准后的生物组织切片三维图像库。
本发明的第三方面，提出了一种存储装置，其中存储有多条程序，所述程序应用由处理器加载并执行以实现上述的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法。
本发明的第四方面，提出了一种处理设置，包括处理器、存储装置；处理器，适用于执行各条程序；存储装置，适用于存储多条程序；所述程序适用于由处理器加载并执行以实现上述的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法。
本发明的有益效果：
本发明降低了连续超薄切片收集的难度，提高了获取的三维图像库在三维重建时的轴向精度。本发明通过不断对生物组织序列切片表面进行刻蚀减薄及膜结构刻蚀处理，降低生物组织序列切片的厚度，大大降低了连续超薄切片自动收集的难度。用扫描电子显微镜SEM观察得到不同轴向(Z向)深度的生物组织切片图像，将得到的生物组织切片图像分别进行配准，将配准后的生物组织切片图像集进行生物组织切片图像的整体配准，得到配准后的生物组织切片三维图像库，提高三维重建的轴向精度。同时，本发明用导电性、表面平整度更好的刚性基底收集生物组织切片，可以得到成像质量更高的SEM图像。
附图说明
通过阅读参照以下附图所做的对非限制性实施例所做的详细描述，本申请的其他特征、目的和优点将会变得更明显。
图1是本发明一种实施例的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法的流程示意图；
图2是本发明一种实施例的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取系统的框架示意图；
图3A是本发明实施例提供的小鼠脑皮层80nm厚度连续切片1在表面均匀减薄刻蚀前的SEM图像；
图3B是本发明实施例提供的小鼠脑皮层80nm厚度连续切片1表面均匀减薄刻蚀一次后拍摄的SEM图像；
图3C为本发明实施例提供的小鼠脑皮层80nm厚度连续切片1表面均匀减薄刻蚀两次后拍摄的SEM图像；
图3D为本发明实施例提供的小鼠脑皮层80nm厚度连续切片2在表面均匀减薄刻蚀前的SEM图像；
图3E为本发明实施例提供的小鼠脑皮层80nm厚度连续切片2表面均匀减薄刻蚀一次后拍摄的SEM图像；
图3F为本发明实施例提供的小鼠脑皮层80nm厚度连续切片2表面均匀减薄刻蚀两次后拍摄的SEM图像；
图4A为本发明实施例提供的大鼠脑海马区200nm厚度切片在表面均匀减薄刻蚀前的SEM图像；
图4B为本发明实施例提供的大鼠脑海马区200nm厚度切片表面均匀减薄刻蚀一次后拍摄的SEM图像；
图4C为本发明实施例提供的大鼠脑海马区200nm厚度切片表面均匀减薄刻蚀二次后拍摄的SEM图像；
图4D为本发明实施例提供的大鼠脑海马区200nm厚度切片表面均匀减薄刻蚀三次后拍摄的SEM图像；
图4E为本发明实施例提供的大鼠脑海马区200nm厚度切片表面均匀减薄刻蚀四次后拍摄的SEM图像；
图4F为本发明实施例提供的大鼠脑海马区200nm厚度切片表面均匀减薄刻蚀五次后拍摄的SEM图像；
图4G为本发明实施例提供的大鼠脑海马区200nm厚度切片表面均匀减薄刻蚀六次后拍摄的SEM图像。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与有关发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法，如图1所示，包括以下步骤：
步骤S10，获取生物组织的序列切片集合；
步骤S20，对所述序列切片集合中每一个序列切片，通过刻蚀方法逐次减薄切片厚度并获取对应厚度值和对应生物组织切片图像，构建每一个序列切片对应的生物组织切片图像集；
步骤S30，分别对每一个所述生物组织切片图像集中的生物组织切片图像进行配准，得到配准后的生物组织切片图像集；
步骤S40，基于所述序列切片集合中各序列切片对应的配准后的生物组织切片图像集进行生物组织切片图像的整体配准，得到配准后的生物组织切片三维图像库。
为了更清晰地对本发明基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法进行说明，下面结合附图对本发明方法一种实施例中各步骤进行展开详述。
步骤S10，获取生物组织的序列切片集合。
生物组织样品包括脑组织、肌肉组织、培养细胞等，生物组织样品通过一系列处理得到生物组织序列切片。具体处理步骤如下：
步骤S101，去除生物组织样本周围的空白树脂；
步骤S102，将去除完空白树脂的生物组织样本固定在超薄切片机上，用修块刀修整生物组织外树脂，得到目标生物组织；
步骤S103，使用清洁后的钻石刀或玻璃刀对进行目标生物组织切片，切片厚度大于30nm；
步骤S104，将水槽内的切片收集到玻片、硅片或塑料条带表面，切片收集可以采用手工收片方式或卷带式自动收集方式，在室温下等待切片充分干燥。
在实施例中，基于待重建的生物组织，得到生物组织的序列切片集合。即将得到的生物组织的切片按照序列进行排序。
步骤S20，对所述序列切片集合中每一个序列切片，通过刻蚀方法逐次减薄切片厚度并获取对应厚度值和对应生物组织切片图像，构建每一个序列切片对应的生物组织切片图像集。
步骤S21，通过原子力显微镜AFM获取序列切片的切片厚度，并通过扫描电子显微镜SEM获取第一生物组织切片图像。具体步骤如下：
步骤S211，用原子力显微镜AFM测量干燥后的切片厚度；
步骤S212，将切片放入扫描电子显微镜SEM，对切片表面进行预扫描(具体预扫描参数的设定参见表1)，如选用玻片或塑料条带作为收片载体，在进行SEM观察前需对其表面进行镀碳处理，且塑料条带需用导电胶粘贴在表面平整的硅片或金属基底上；
表1
| 加速电压 | 2kV～5kV |
| 电子束流 | 1.0nA～5nA |
| Pixelsize | 10nm～20nm |
| Dwelltime | 1000ns～3000ns |
其中，Pixelsize为扫描电子显微镜成像时单像素的尺寸大小，Dwelltime为扫描电子显微镜成像时电子束在单个像素上停留的时间，即获取单个像素所需的时间。
步骤213，用扫描电子显微镜SEM获取第一生物组织切片图像。
步骤S22，采用离子束刻蚀机IBE对序列切片进行刻蚀减薄处理，并通过反应离子刻蚀机RIE进行表面膜结构显著化刻蚀处理，得到第二序列切片；对所述第二序列切片，通过步骤S21的方法获取切片厚度和第二生物组织切片图像。具体步骤如下：
步骤S221，将表面收集有生物超薄切片的玻片、硅片或塑料条带放置于离子束刻蚀机样品腔室内，用导热硅脂将其固定在样品台上，关闭舱门并设置阴极电流、弧极电压、屏栅电压、加速电压、中和电流、刻蚀本地真空、气体流量、样品台倾斜角度、刻蚀时间等参数，具体参数的设定可参见表2。
表2
然后启动离子束刻蚀程序，刻蚀结束后离子源自动关闭。给样品室充气，取出所述经离子束刻蚀后的生物组织序列切片。
步骤S222，将所述经离子束刻蚀后的生物组织序列切片放置于等离子刻蚀机样品腔室内，用耐高温胶带将其固定在样品台上，关闭舱门并设置刻蚀功率、工艺气体种类及流量、工作压力、刻蚀时间等参数，具体参数的设定可参见表3。
表3
然后启动刻蚀程序。当选择较低的功率时，气体(可选择单一气体或混合气体)流量需适当增大，这样才能保证在刻蚀期间等离子体的稳定性。需要说明的是，气体可选择单一气态的气体或混合气体。刻蚀结束后，为样品腔室充气，取出所述经等离子刻蚀后的生物组织序列切片，从而得到第二序列切片。
步骤S223，用所述AFM测量第二序列切片厚度。将第二序列切片用真空吸附固定在AFM样品台上，在Tapping模式下，移动样品台，找到第二序列切片边缘，下针，设定测量区域大小和扫描频率，启动程序开始测量。
步骤S224，用所述SEM对第二序列切片进行成像。将第二序列切片放入SEM样品舱室，关上舱门，开始抽真空；待真空准备完成后，打开高压，对第二序列切片进行观察得到第二生物组织切片图像，第二生物组织切片图像即为第一次刻蚀后的生物组织切片图像。如选用玻片或塑料条带作为收片载体，在进行SEM观察前需对第二序列切片表面进行镀碳处理。
步骤S23，采用步骤S22的方法重复进行刻蚀，并获取每次刻蚀后的切片厚度和对应的生物组织切片图像，直至切片厚度值小于预设厚度值。
循环执行步骤S22的方法，直至生物组织的序列切片的厚度小于预设厚度值。本实施例中优选的预设厚度小于等于10纳米，也可以根据实际的应用从场景设定厚度。
步骤S24，对各生物组织切片图像按其对应的切片厚度大小顺次排列，构建序列切片对应的生物组织切片图像集。
步骤S30，分别对每一个所述生物组织切片图像集中的生物组织切片图像进行配准，得到配准后的生物组织切片图像集。
在本实施例中，以每一个所述生物组织切片图像集中的第一幅切片图像为模板，通过sift特征点匹配和仿射变换得到该生物组织切片图像集中其他切片图像到第一幅切片图像的仿射变换矩阵。基于所述仿射变换矩阵对所述生物组织切片图像集中其他切片图像进行形变，得到配准后的生物组织切片图像集。
步骤S40，基于所述序列切片集合中各序列切片对应的配准后的生物组织切片图像集进行生物组织切片图像的整体配准，得到配准后的生物组织切片三维图像库。
在本实施例中，依次通过sift特征点匹配算法得到所述序列切片集合中第i个配准后的生物组织切片图像集的最后一幅切片图像与第i+1个配准后的生物组织切片图像集中的第一幅切片图像的对应点。
基于所述对应点，采用薄板样条变换方法获取所述最后一幅切片图像对所述第一幅切片图像的非线性形变，基于所述非线性形变，对第i+1个配准后的生物组织切片图像集中的切片图像进行形变，得到配准后的生物组织切片三维图像库。
为了更清楚的展示本发明的技术效果，下面基于本发明的方法分别对小鼠脑皮层80nm厚度连续切片1和2以及大鼠脑海马区200nm厚度切片进行减薄刻蚀。
图3A和3D为小鼠脑皮层80nm厚度连续切片1和2在表面均匀减薄刻蚀前的SEM图像。
基于图3A和3D，利用修块机对小鼠脑皮层样品块进行粗修，去除空白树脂，然后固定在超薄切片机上，用修块刀精细修整大鼠脑组织外树脂，得到大鼠脑组织，然后使用清洁后的钻石刀进行超薄切片，厚度为80nm，用ATUM将水槽内的连续超薄切片收集到塑料条带表面，室温下等待切片充分干燥后，用双面碳导电胶带将表面收集有序列超薄切片的塑料条带粘贴在刚性、平整、导电性好的硅片或金属基底上。用AFM测量切片厚度，然后用镀膜仪在粘贴好的切片及条带表面镀一层碳膜，然后将所述切片放入SEM样品舱室中，观察确定图像采集区域并对该区域进行电子束预扫描(具体参数见表4)。预扫描结束后，用SEM对预扫描区域进行拍照，即得到小鼠脑皮层切片在表面均匀减薄刻蚀前的SEM图像。
表4
| 加速电压 | 3kV |
| 电子束流 | 1.0nA |
| Pixelsize | 15nm |
| Dwelltime | 1000ns |
将小鼠脑皮层切片放置于离子束刻蚀机样品腔室内，用导热硅脂带将其固定在样品台上，关闭舱门，开始抽真空。按表5参数设置阴极电流、弧极电压、屏栅电压、加速电压、中和电流、刻蚀本地真空、气体流量、样品台倾斜角度、刻蚀时间，然后启动刻蚀程序。刻蚀结束后，离子源自动关闭，启动自动开舱门程序，取出小鼠脑皮层切片。
表5
| 阴极电流 | 7.0A |
| 弧极电压 | 60V |
| 屏栅电压 | 450V |
| 加速电压 | 300V |
| 中和电流 | 2.0A |
| 刻蚀本地真空 | 5.0×10<sup>-4</sup>Pa |
| 气体流量 | 60sccm |
| 样品台倾斜角度 | 40° |
| 刻蚀时间 | 30s |
将从离子束刻蚀机中取出的小鼠脑皮层切片放置于等离子刻蚀机样品腔室内，用耐高温胶带将其固定在样品台上，关闭舱门。按表6设置刻蚀功率、工艺气体种类及流量、工作压力、刻蚀时间，然后启动刻蚀程序。待刻蚀结束后，将样品腔室的真空放掉，取出小鼠脑皮层切片。
表6
经过离子束减薄刻蚀和等离子显著化刻蚀处理后，得到第一次刻蚀后的小鼠脑皮层切片。
用AFM测量第一次刻蚀后的小鼠脑皮层切片厚度，用镀膜仪在第一次刻蚀后的小鼠脑皮层切片表面镀一层碳膜，然后将所述切片放入SEM观察，即得到小鼠脑皮层切片经过一次表面均匀减薄刻蚀后的SEM图像。具体可参照如图3B和3E所示分别为小鼠脑皮层连续切片1和2经过一次表面均匀减薄刻蚀后的SEM图像。
重复上述步骤，分别利用表5和表6参数，将第一次刻蚀后的小鼠脑皮层切片依次进行离子束减薄刻蚀和等离子显著化刻蚀处理，得到第二次刻蚀后的小鼠脑皮层切片。用AFM测量第二次刻蚀后的小鼠脑皮层切片厚度，用镀膜仪在第二次刻蚀后的小鼠脑皮层切片表面镀一层碳膜，然后将所述切片放入SEM观察，即得到小鼠脑皮层切片经过两次表面均匀减薄刻蚀后的SEM图像。具体可参照如图3C和3F所示分别为小鼠脑皮层连续切片1和2经过两次表面均匀减薄刻蚀后的SEM图像。
对上述图3A至3F进行配准，即可得到小鼠脑皮层切片拍摄区域的SEM三维图像。
图4A为本发明实施例二提供的大鼠脑海马区200nm厚度切片在表面均匀减薄刻蚀前的SEM图像。
基于图4A，利用修块机对大鼠脑海马区样品块进行粗修，去除空白树脂，然后固定在超薄切片机上，用修块刀精细修整大鼠脑海马区组织外树脂，得到大鼠脑海马区组织。然后使用清洁后的钻石刀进行超薄切片，厚度为200nm。最后将水槽内的超薄切片收集到硅片表面，室温下等待切片充分干燥后，用AFM测量切片厚度。然后将所述切片放入SEM样品舱室中，观察确定图像采集区域并对该区域进行电子束预扫描(具体参数见表7)。预扫描结束后，用SEM对预扫描区域进行拍照，即得到大鼠脑海马区切片在表面均匀减薄刻蚀前的SEM图像。
表7
将所述大鼠脑海马区切片放置于离子束刻蚀机样品腔室内，用导热硅脂带将其固定在样品台上，关闭舱门，开始抽真空。按表8参数设置阴极电流、弧极电压、屏栅电压、加速电压、中和电流、刻蚀本地真空、气体流量、样品台倾斜角度、刻蚀时间，然后启动刻蚀程序。刻蚀结束后，离子源自动关闭，启动自动开舱门程序，取出大鼠脑海马区切片切片。
表8
| 阴极电流 | 5.0A |
| 弧极电压 | 30V |
| 屏栅电压 | 100V |
| 加速电压 | 350V |
| 中和电流 | 4.5A |
| 刻蚀本地真空 | 3.0×10<sup>-4</sup>Pa |
| 气体流量 | 7.5sccm |
| 样品台倾斜角度 | 50° |
| 刻蚀时间 | 120s |
将从离子束刻蚀机中取出的大鼠脑海马区切片放置于等离子刻蚀机样品腔室内，用耐高温胶带将其固定在样品台上，关闭舱门。按表9设置刻蚀功率、工艺气体种类及流量、工作压力、刻蚀时间，然后启动刻蚀程序。待刻蚀结束后，将样品腔室的真空放掉，取出大鼠脑海马区切片。
表9
经过离子束减薄刻蚀和等离子显著化刻蚀处理后，得到第一次刻蚀后的大鼠脑海马区切片。
用AFM测量第一次刻蚀后的大鼠脑海马区切片厚度，然后将切片放入SEM观察，即得到大鼠脑海马区切片经过一次表面均匀减薄刻蚀后的SEM图像。具体可参照如图4B所示为大鼠脑海马区切片经过一次表面均匀减薄刻蚀后的SEM图像。
重复上述步骤，分别利用表8和表9参数，将第一次刻蚀后的大鼠脑海马区切片依次进行离子束减薄刻蚀和等离子显著化刻蚀处理，得到第二次刻蚀后的大鼠脑海马区切片。用所述AFM测量第二次刻蚀后的大鼠脑海马区切片厚度，然后将所述切片放入SEM观察，即得到大鼠脑海马区切片经过两次表面均匀减薄刻蚀后的SEM图像。具体可参照如图4C所示为大鼠脑海马区切片经过两次表面均匀减薄刻蚀后的SEM图像。
图4D为大鼠脑海马区切片经过三次表面均匀减薄刻蚀后的SEM图像。
图4E为大鼠脑海马区切片经过四次表面均匀减薄刻蚀后的SEM图像。
图4F为大鼠脑海马区切片经过五次表面均匀减薄刻蚀后的SEM图像。
图4G为大鼠脑海马区切片经过六次表面均匀减薄刻蚀后的SEM图像。
将上述图4A至4G进行配准，即可得到大鼠脑海马区切片拍摄区域的SEM三维图像。
本发明第二实施例为实施例一提供的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法的一种分解方法，应用于单一的生物组织切片。所述方法包括：
步骤A10，获取生物组织的切片；
步骤A20，基于所述切片，通过刻蚀方法逐次减薄切片厚度并获取对应厚度值和对应生物组织切片图像，构建对应的生物组织切片图像集；
步骤A30，对所述生物组织切片图像集中的生物组织切片图像进行配准，得到配准后的三维图像。
本发明第三实施例的一种基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取系统，如图2所示，包括：获取模块100、刻蚀减薄模块200、配准模块300、输出模块400；
所述的获取模块100，配置为获取生物组织的序列切片集合；
所述的刻蚀减薄模块200，配置为对所述序列切片集合中每一个序列切片，通过刻蚀方法逐次减薄切片厚度并获取对应厚度值和对应生物组织切片图像，构建每一个序列切片对应的生物组织切片图像集；
所述的配准模块300，配置为分别对每一个所述生物组织切片图像集中的生物组织切片图像进行配准，得到配准后的生物组织切片图像集；
所述的输出模块400，配置为基于所述序列切片集合中各序列切片对应的配准后的生物组织切片图像集进行生物组织切片图像的整体配准，得到配准后的生物组织切片三维图像库。
所述技术领域的技术人员可以清楚的了解到，为描述的方便和简洁，上述描述的系统的具体的工作过程及有关说明，可以参考签署方法实施例中的对应过程，在此不再赘述。
需要说明的是，上述实施例提供的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取系统，仅以上述各功能模块的划分进行举例说明，在实际应用中，可以根据需要而将上述功能分配由不同的功能模块来完成，即将本发明实施例中的模块或者步骤再分解或者组合，例如，上述实施例的模块可以合并为一个模块，也可以进一步拆分成多个子模块，以完成以上描述的全部或者部分功能。对于本发明实施例中涉及的模块、步骤的名称，仅仅是为了区分各个模块或者步骤，不视为对本发明的不当限定。
本发明第四实施例的一种存储装置，其中存储有多条程序，所述程序适用于由处理器加载并实现上述的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法。
本发明第五实施例的一种处理装置，包括处理器、存储装置；处理器，适于执行各条程序；存储装置，适于存储多条程序；所述程序适于由处理器加载并执行以实现上述的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法。
所述技术领域的技术人员可以清楚的了解到，未描述的方便和简洁，上述描述的存储装置、处理装置的具体工作过程及有关说明，可以参考签署方法实例中的对应过程，在此不再赘述。
本领域技术人员应该能够意识到，结合本文中所公开的实施例描述的各示例的模块、方法步骤，能够以电子硬件、计算机软件或者二者的结合来实现，软件模块、方法步骤对应的程序可以置于随机存储器(RAM)、内存、只读存储器(ROM)、电可编程ROM、电可擦除可编程ROM、寄存器、硬盘、可移动磁盘、CD-ROM、或技术领域内所公知的任意其它形式的存储介质中。为了清楚地说明电子硬件和软件的可互换性，在上述说明中已经按照功能一般性地描述了各示例的组成及步骤。这些功能究竟以电子硬件还是软件方式来执行，取决于技术方案的特定应用和设计约束条件。本领域技术人员可以对每个特定的应用来使用不同方法来实现所描述的功能，但是这种实现不应认为超出本发明的范围。
术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不是用于描述或表示特定的顺序或先后次序。
术语“包括”或者任何其它类似用语旨在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备/装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其它要素，或者还包括这些过程、方法、物品或者设备/装置所固有的要素。
至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征作出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤S10，获取生物组织的序列切片集合；
步骤S20，对所述序列切片集合中每一个序列切片，通过刻蚀方法逐次减薄切片厚度并获取对应厚度值和对应生物组织切片图像，构建每一个序列切片对应的生物组织切片图像集；
步骤S30，分别对每一个所述生物组织切片图像集中的生物组织切片图像进行配准，得到配准后的生物组织切片图像集；
步骤S40，基于所述序列切片集合中各序列切片对应的配准后的生物组织切片图像集进行生物组织切片图像的整体配准，得到配准后的生物组织切片三维图像库。
2.根据权利要求1所述的一种基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法，其特征在于，步骤S20中“通过刻蚀方法逐次减薄切片厚度并获取对应厚度值和对应生物组织切片图像，构建每一个序列切片对应的生物组织切片图像集”，其方法为：
步骤S21，通过原子力显微镜AFM获取序列切片的切片厚度，并通过扫描电子显微镜SEM获取第一生物组织切片图像；
步骤S22，采用离子束刻蚀机IBE对序列切片进行刻蚀减薄处理，并通过反应离子刻蚀机RIE进行表面膜结构显著化刻蚀处理，得到第二序列切片；对所述第二序列切片，通过步骤S21的方法获取切片厚度和第二生物组织切片图像；
步骤S23，采用步骤S22的方法重复进行刻蚀，并获取每次刻蚀后的切片厚度和对应的生物组织切片图像，直至切片厚度值小于预设厚度值；
步骤S24，对各生物组织切片图像按其对应的切片厚度大小顺次排列，构建序列切片对应的生物组织切片图像集。
3.根据权利要求1所述的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法，步骤S30中“分别对每一个所述生物组织切片图像集中的生物组织切片图像进行配准”，其方法为：
以每一个所述生物组织切片图像集中的第一幅切片图像为基准，通过sift特征点匹配算法和仿射变换算法得到该生物组织切片图像集中其他切片图像到第一幅切片图像的仿射变换矩阵；
基于所述仿射变换矩阵对所述生物组织切片图像集中其他切片图像进行形变。
4.根据权利要求2所述的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法，其特征在于，步骤S40中“基于所述序列切片集合中各序列切片对应的配准后的生物组织切片图像集进行生物组织切片图像的整体配准”，其方法为：
依次通过sift特征点匹配算法得到所述序列切片集合中第i个配准后的生物组织切片图像集的最后一幅切片图像与第i+1个配准后的生物组织切片图像集中的第一幅切片图像的对应点；i表示下标值；
基于所述对应点，采用薄板样条变换算法对所述第一幅切片图像进行非线性形变；
以非线性形变后的第一幅切片图像为基准，通过步骤S30的方法对第i+1个配准后的生物组织切片图像集中的切片图像进行配准。
5.根据权利要求2中所述的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法，其特征在于，所述扫描电子显微镜SEM在对所述生物组织序列切片成像时，其参数设定范围为：加速电压为2kV～5kV、电子束流为1.0nA～5nA、Pixelsize(扫描电子显微镜成像时单像素的尺寸大小)为10nm～20nm、Dwelltime(扫描电子显微镜成像时电子束在单个像素上停留的时间)为1000ns～3000ns。
6.根据权利要求2所述的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法，其特征在于，所述离子束刻蚀机IBE在刻蚀时，其参数设定范围为：阴极电流为2.0A～8.0A、弧极电压为10V～80V、屏栅电压为20V～500V、加速电压为50V～400V、中和电流为3.0A～5.0A、刻蚀本地真空为1.0×10-3Pa～5.0×10-4Pa、气体流量为0.1sccm～20sccm、样品台倾斜角度为20°～60°、刻蚀时间大于等于1s。
7.根据权利要求2所述的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法，其特征在于，所述反应离子刻蚀机RIE在刻蚀时，其参数设定范围为：刻蚀功率为60W～120W、工作压力为5Pa～75Pa、刻蚀时间为10s～200s、工艺气体包括氩气和氧气，其中氩气为10sccm～50sccm，氧气为5sccm～15sccm。
8.根据权利要求1所述的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法，其特征在于，若所述序列切片以玻片或塑料条带作为收片载体，在进行SEM观察前需对其表面进行镀碳处理，且塑料条带需用导电胶粘贴在表面平整的硅片或金属基底上。
9.一种基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取系统，其特征在于，该系统包括获取模块、刻蚀减薄模块、配准模块、输出模块；
所述的获取模块，配置为获取生物组织的序列切片集合；
所述的刻蚀减薄模块，配置为对所述序列切片集合中每一个序列切片，通过刻蚀方法逐次减薄切片厚度并获取对应厚度值和对应生物组织切片图像，构建每一个序列切片对应的生物组织切片图像集；
所述的配准模块，配置为分别对每一个所述生物组织切片图像集中的生物组织切片图像进行配准，得到配准后的生物组织切片图像集；
所述的输出模块，配置为基于所述序列切片集合中各序列切片对应的配准后的生物组织切片图像集进行生物组织切片图像的整体配准，得到配准后的生物组织切片三维图像库。
10.一种存储装置，其中存储有多条程序，其特征在于，所述程序应用由处理器加载并执行以实现权利要求1-8任一项所述的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法。
11.一种处理设置，包括处理器、存储装置；处理器，适用于执行各条程序；存储装置，适用于存储多条程序；其特征在于，所述程序适用于由处理器加载并执行以实现权利要求1-8任一项所述的基于生物组织序列切片刻蚀减薄的三维图像库获取方法。
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| US20160247661A1 (en) * | 2015-02-24 | 2016-08-25 | Fei Company | Pattern matching using a lamella of known shape for automated s/tem acquisition and metrology |
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2019
- 2019-08-23 CN CN201910785748.XA patent/CN110533772B/zh active Active
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