CN110531076A - 一种检测药物镇痛评价过程中cox-2酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测药物镇痛评价过程中COX‑2酶活性的方法,其特征在于,该方法包括:对药物进行抑制COX‑2酶的活性检测;将所述COX‑2酶的活性检测结果进行数据处理与效价计算以确定药物的镇痛效果。利用本发明所提供的基于生物效价中药质量评价方法可进行对具有相应靶点的中西镇痛药物或活性组分,如桂枝茯苓制剂或其提取物等进行质量评价,并更好地控制药物的质量,确保临床用药的有效性。
Description
技术领域
本发明属于中药质量控制与评价技术领域,特别涉及一种检测药物镇痛评价过程中COX-2酶活性的方法。
背景技术
现代医学所谓的疼痛,是一种复杂的生理心理活动,是临床上最常见的症状之一。它包括伤害性刺激作用于机体所引起的痛感觉,以及机体对伤害性刺激的痛反应(躯体运动性反应和/或内脏植物性反应,常伴随有强烈的情绪色彩)。痛经属于疼痛的一种,其中,原发性痛经(primary dysmenorrhea)即功能性痛经,是指月经期疼痛,常呈痉挛性,集中在下腹部,其他症状包括头痛乏力、头晕、恶心呕吐、腹泻、腰腿痛,在年轻女性中十分常见,影响女性生理周期的生活质量,流行病学研究表明,原发性痛经是目前妇科最常见的疾病,国外报道妇女原发性痛经的比例43-90%,国内报道痛经发病率33.1%,其中原发性痛经占53.2%。
目前西医对痛经机理有一定的认识,但并不明确,西药多采用非甾体抗炎药或者避孕药来缓解痛经产生的疼痛,治疗效果较差,且具有较强的副作用。相较于西药,中药治疗痛经更具有优势—治疗效果好且副作用较小。然而,目前针对中药的质量控制水平较低,主要利用化学分析方法或显微鉴别方法对其药材、原料药、成品进行质量控制与评价。
与西药相比,由于中药成分非常复杂,其质量评价标准一直是困扰中药现在化和国家化的核心,而建立相对完善的质量评价标准的关键是建立科学、可靠的质量控制与评价方法。现阶段中药质量的控制与评价以化学成分的定性和定量分析方法为主要手段,随着中药研究的不断深入,发现这种模式在中药质量控制和评价体系中逐渐显现出了非常大的局限性。例如,某单一指标化合物成分含量高,并不能代表其整体药物质量好,更不能反映其整体药物更有效。通过控制复方中药中某些单一指标性化合物的作为药物质量标准的一项指标,虽然对指标性成分的量进行的准确的控制,但是难以保证中药中所有成分的稳定性和均一性,更不能反映中药整体的生物效应,保证其临床疗效的一致性。
但是,目前生物效价测定法在中草药领域的研究成果报道很少。因此,有必要构建一种基于生物效价的质量评价方法,其评价指标可直接关联治疗痛经等疼痛的临床疗效。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种基于生物效价治疗疼痛类疾病的质量评价方法。本发明提出了一种检测药物镇痛评价过程中COX-2酶活性的方法,其特征在于,该方法包括:
对药物进行抑制COX-2酶的活性检测;
将所述COX-2酶的活性检测结果进行数据处理与效价计算以确定药物的镇痛效果。
具体地,所述药物可以是桂枝茯苓胶囊。
优选地,所述COX-2酶的活性为利用荧光方法测定。
优选地,所述镇痛为治疗痛经尤其是原发性痛经引起的疼痛。
本发明还提出了一种检测药物镇痛效果评价基准的方法,其特征在于,该方法包括:
以合格药物(可选地为市售的已通过检验的产品)配制的溶液作为供试品溶液;
对所述供试品溶液进行抑制COX-2酶的活性测试;
对所述活性测试的结果进行数据处理与效价计算,得到合格药物的效价作为评价基准。
进一步地,所述检测药物镇痛效果评价基准的方法还包括:
以COX-2抑制剂作为对照品配制对照品溶液;其中,所述COX-2抑制剂优选自塞来昔布;
对该对照品溶液进行抑制COX-2酶的活性测试。
具体地,所述药物优选为桂枝茯苓胶囊;所述镇痛优选为治疗痛经尤其是原发性痛经引起的疼痛。
本发明还提出了如前任一方法得到的所述评价基准在评价药品镇痛效果上的应用。
本发明还提出了一种对药物镇痛效果检测的方法,其特征在于,该方法包括:
以合格药物(可选地为市售的已通过检验的产品)配制的溶液作为供试品溶液;
对所述供试品溶液进行抑制COX-2酶的活性测试;
对所述活性测试的结果进行数据处理与效价计算,测到合格药物的效价建立评价基准;
将待测药物制备成待测溶液进行抑制COX-2酶的活性测试,并利用所述评价基准进行检验。
优选地,所述对药物镇痛效果检测的方法包括:
以桂枝茯苓胶囊市售品配制的溶液作为供试品溶液;
以塞来昔布作为对照品配制对照品溶液;
对所述供试品溶液以及对照品溶液进行抑制COX-2酶的活性测试;
对所述活性测试的结果进行数据处理与效价计算,建立评价基准;
将待测药物制备成待测溶液进行抑制COX-2酶的活性测试,并利用所述评价基准对待测药物治疗痛经的效果进行检验。
本发明的有益效果至少包括:
1、利用本发明所提供的基于生物效价中药质量评价方法可进行对具有相应靶点的中西镇痛药物或活性组分,如桂枝茯苓制剂或其提取物等等进行质量控制和评价;
2、利用本发明更好的控制桂枝茯苓制剂等中药镇痛药物的质量,并可将其抑制COX-2生物活性控制在合理范围内,确保临床用药的有效性。
附图说明
图1为本发明中桂枝茯苓胶囊样品对COX2抑制作用的量-效关系图;
图2为本发明中本发明中桂枝茯苓胶囊样品浓度与抑制率线性关系图。
具体实施方式
本发明主要建立了基于荧光检测人源重组的COX-2酶活的药物生物评价方法。为了更好的便于理解本发明,下面将以桂枝茯苓对痛经的治疗为例来说明本发明,这些实施例仅起说明性作用,并不局限与本发明的应用范围。
现行桂枝茯苓制剂的质量控制和评价方法多以化学指标成分的定性和定量分析为主,然而,这种化学检测方法无法与临床疗效相关联,因此不能真正的有效评价药物的临床质量。为解决以上问题,有必要提供一种基于生物效价测定桂枝茯苓制剂治疗痛经类疾病的质量评价方法。疼痛尤其是月经期间痛经的产生与前列腺素(PGs)量相关性很强,绝大部分女性痛经是PGs依赖内源性PGE2和PGF2α升高并刺激子宫强烈收缩,血管痉挛,进而造成子宫缺血、缺氧状态引起子宫内压暂时升高而间接产生痉挛性疼痛。而前列腺素的合成过程中有一个关键氧化酶—环氧化酶2(即COX-2),桂枝茯苓制剂可通过抑制COX-2活性,阻断前列腺素的合成,从而降低子宫内前列腺素含量水平,发挥镇痛的作用。COX-2酶活与痛经临床评价指标疼痛存在很强的相关性,因此可以通过测定桂枝茯苓制剂对COX-2活性的抑制率,表征该药物的生物效应。
复方中药成分比较复杂,往往通过多靶点、多途径发挥整体调节作用,更能够切中疾病复杂病理的改变,从而改善或治愈的作用。针对中药的这种特点,本发明提出的生物效价评价的质量控制方法,可以基于中药复杂成分的整体进行质量控制和评价,为药物的开发和临床用药质量控制及疗效体现提供了重要参考依据。该质量控制方法可以从不同途径反映桂枝茯苓制剂对于改善痛经生物活性的强弱,体现药物发挥作用的整体效应,其与临床疗效的有效性关联,可清楚地反映出药物作用的病理环节,为临床用药提供可靠依据。
本发明中,除特别指出,本发明提供的技术方案中所用药品、试剂、仪器均可由常规渠道或市场购得。下列实施例中未提到的具体实验方法,通常按照常规试验方法进行。
为了便于理解本发明,下面提供相关字母缩写所指代的含义:
COX-2:环氧化酶-2
DMSO:二甲基亚砜
荧光检测人源重组的COX-2酶活的生物评价方法
试验仪器:荧光酶标仪
试验材料:
桂枝茯苓胶囊,江苏康缘药业股份有限公司
环氧化酶-2(COX-2)抑制剂筛选试剂盒,碧云天,Item No.S0168公司新采购的试剂盒
COX-2 Assay Buffer(试剂缓存液),Cayman,Item No.S0168-1
COX-2 Probe(探针),碧云天,Item No.S0168-2,600ul
COX-2 Cofactor(辅因子工作液)(50×),碧云天,Item No.S0168-3,20ul
COX-2 Substrate(底物)(50×),碧云天,Item No.S0168-4
Substrate Buffer(底物缓存液),碧云天,Item No.S0168-5
rhCOX-2(25×)(人重组COX-2),碧云天,Item No.S0168-6,22ul
Celecoxib(100μM)(塞来昔布),碧云天,Item No.S0168-7
96孔细胞板(Corning 3925black plate,black bottom)
塞来昔布:碧云天生物技术有限公司
样品配置:
试剂准备:酶解冻至常温离心混匀备用;Probe、Cofactor(50×)、Substrate(50×)的DMSO解冻(可37℃水浴0.5-2min)至室温,避光保存备用(长期-20℃避光保存)。
Cofactor工作液:Cofactor(50×)适量,用assaybuffer稀释50倍,4℃保存当日备用。
COX-2工作液:rhCOX-2(25×)适量,用assay buffer稀释25倍,冰浴保存1h内备用。
Substrate工作液:Substrate(50×)适量,加等体积的Substrate buffer稀释,涡旋混匀,混合物再用超纯水稀释125倍,冰浴保存1h内备用。
阳性药溶液配制:取COX-2抑制剂为阳性对照品,用DMSO为溶剂进行溶解配制成浓度为0.3429ug/ml的溶液,反应体系中的终浓度为0.019μg/ml(50nM),所述COX-2抑制剂可选用塞来昔布。
供试品溶液配制:取桂枝茯苓胶囊内容物适量,用适量比例的溶剂(DMSO)进行提取,密封,混匀,37℃水浴30min,7000g离心2min,上清过0.22μm滤膜,滤液作为母液,浓度记为1。
稀释方法:取桂枝茯苓胶囊母液,DMSO稀释256倍得到桂枝茯苓胶囊-a,母液稀释312倍得到桂枝茯苓胶囊-b,母液稀释624倍得到桂枝茯苓胶囊-c,母液稀释1204倍得到桂枝茯苓胶囊-d。
分组情况:
表1 COX酶抑制剂筛选反应体系(90μl)
实验方法:
采用96孔细胞板,按各孔安排,加入assaybuffer、Cofactor工作液(震荡)、COX-2工作液(震荡)、COX-2工作液(震荡)、样品溶液,排枪混匀,25℃孵育5min;再放入冰上(4℃冰箱)孵育10min,降温;各孔加Probe工作液5μl,排枪混匀;各孔加低温Substrate工作液5μl,尽量在低温环境下操作,排枪混匀;
加工作液后立即37℃测定荧光,激发波长为560nm,发射波长为590nm(每30s测1次,连续15min)。
采用GraphPad Prism的“剂量反应-抑制”模型并采用下述公式计算药物对COX-2酶活性的抑制率,绘制量-效曲线,预测IC50。
COX-2的抑制率(%)=(RFU样品-RFU空白对照)/(RFU初始酶活-RFU空白对照)*100%结果分析:
表2各剂量桂枝茯苓对COX酶的抑制率
如图1以及表2所示,基于DMSO提取的桂枝茯苓胶囊样品对COX2抑制作用的量-效关系考察结果,选择S型曲线的中段,即1/128(252.4μg/ml)-1/1024(31.55μg/ml)浓度范围的浓度和抑制率进行线性相关性分析,三次重复试验结果均表明桂枝茯苓胶囊在1/128(252.4μg/ml)-1/1024(31.55μg/ml)浓度范围内,浓度与抑制率呈现良好的线性相关(如图2)。
本发明以桂枝茯苓胶囊为例,并用COX-2作为痛经疼痛的生物活性作用靶点,通过与阳性药做对照,作出桂枝茯苓胶囊抑制COX-2活性的量效关系,并通过将桂枝茯苓胶囊浓度在COX-2抑制率量效关系的浓度上下限控制在合理的范围之内及量效曲线的相似性,IC50浓度等,来对桂枝茯苓胶囊进行生物效价的质量控制。
本发明所使用的中成药桂枝茯苓胶囊(江苏康缘药业股份有限公司)源自本公司自产产品,其中具体实施例选取桂枝茯苓制胶囊进行质量评价,但本发明仅是示范性的例举,并不限于胶囊剂型,也不限于桂枝茯苓胶囊。
由上可见,由于中药治疗痛经有效,疼痛评价多为主观指标,缺少客观指标。但本发明很好地克服了上述缺陷,所使用的生物效价检定法可以准确、快速地检测桂枝茯苓制剂(治疗痛经药品)对COX2酶活性的抑制率,对药品进行统一的生物效价标示。在药品生产过程中的中间产物,成品,药材的质量与产地、采收季节等环节,生物效价检测都可以成为质量控制的手段之一。本发明所述的质量评价方法可以作为传统化学检测手段的有效补充,直接反应临床有效性,是一种真正符合中医药传统理论、体现中药临床应用特点,保证中药安全有效的质量控制与评价方法。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测药物镇痛评价过程中COX-2酶活性的方法,其特征在于,该方法包括:对药物进行抑制COX-2酶的活性检测;将所述COX-2酶的活性检测结果进行数据处理与效价计算以确定药物的镇痛效果。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述药物选自桂枝茯苓胶囊。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述COX-2酶的活性为利用荧光方法测定。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述镇痛为治疗痛经引起的疼痛。
5.一种检测药物镇痛效果评价基准的方法,其特征在于,该方法包括:
以合格药物配制的溶液作为供试品溶液;
对所述供试品溶液进行抑制COX-2酶的活性测试;
对所述活性测试的结果进行数据处理与效价计算,得到合格药物的效价作为评价基准。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,该方法还包括:
以COX-2抑制剂作为对照品配制对照品溶液;其中,所述COX-2抑制剂选自塞来昔布;
对该对照品溶液进行抑制COX-2酶的活性测试。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述药物选自桂枝茯苓胶囊;所述镇痛为治疗痛经引起的疼痛。
8.权利要求5-7任一方法得到的所述评价基准在评价药品镇痛效果上的应用。
9.一种对药物镇痛效果检测的方法,其特征在于,该方法包括:
以合格药物配制的溶液作为供试品溶液;
对所述供试品溶液进行抑制COX-2酶的活性测试;
对所述活性测试的结果进行数据处理与效价计算,测到合格药物的效价建立评价基准;
将待测药物制备成待测溶液进行抑制COX-2酶的活性测试,并利用所述评价基准进行检验。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,该方法包括:
以桂枝茯苓胶囊市售品配制的溶液作为供试品溶液;
以塞来昔布作为对照品配制对照品溶液;
对所述供试品溶液以及对照品溶液进行抑制COX-2酶的活性测试;
对所述活性测试的结果进行数据处理与效价计算,建立评价基准;
将待测药物制备成待测溶液进行抑制COX-2酶的活性测试,并利用所述评价基准对待测药物治疗痛经的效果进行检验。
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