CN110520148A - 甲状旁腺激素与退行性椎间盘疾病的再生 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗具有IVD退化和/或LDD的症状的受试者中的IVD退化和/或LDD的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。还提供了使用本发明的方法来使IVD退化减少和使IVD再生。

Description

甲状旁腺激素与退行性椎间盘疾病的再生

相关申请的引用

本申请要求于2017年2月1日提交的美国临时专利申请第62/453,044号的权益，为了所有目的在此将该申请通过引用并入，如同在本文完全陈述一样。

对以电子形式提交的材料的通过引用的并入

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式经由EFS-Web提交并且在此通过引用以其全部内容并入。创建于2018年2月1日的所述ASCII副本被命名为P13213-03_ST25.txt，并且大小为6,378字节。

政府利益的声明

本发明根据由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号AR 063943进行，具有政府支持。政府在本发明中具有某些权利。

发明背景

腰椎间盘疾病(LDD)也被称为椎间盘(IVD)退化(degeneration)，或退行性椎间盘疾病或退行性椎间盘紊乱(DDD)，长期以来已经被记载为一种衰老的疾病，并且是最常见的肌肉骨骼紊乱之一。早在青少年时期就已经检测到退化，并且在60％的70岁老人中检测到严重退化。具有相关的下背痛的人的数目在全世界是流行病的比例，高达80％的个体在其一生中被影响，并且是残疾的主要原因。LDD强加了巨大的社会经济负担，仅在美国每年就超过$1000亿，并且花费比中风、呼吸道感染、糖尿病、冠状动脉疾病和类风湿疾病的组合花费更高。

尽管LDD的发病率和重要性，但对其病理生理学了解甚少，并且不存在有效的疾病改良治疗(disease-modifying treatment)。椎间盘(IVD)在宏观上可以被分为两个组成部分；被称为纤维环(AF)的胶原纤维的外部网络、被纤维环(AF)围绕的水合的位于中央的髓核(NP)。NP由脊索来源的细胞组成，这些细胞被形成细胞外基质(ECM)的丰富的蛋白聚糖(主要是聚集蛋白聚糖和胶原)包围。NP起吸收沿脊柱传递的轴向压缩力的功能。ECM是支持用于椎间盘内稳态(homeostasis)的NP细胞的重要要素。蛋白聚糖具有水结合能力，提供对压缩回复力，同时胶原赋予拉伸强度。

具有ECM蛋白II型胶原的突变的个体具有严重的IVD退化。遗传研究已经报道了LDD和编码ECM的组分(特别是IX型胶原、聚集蛋白聚糖和软骨中间层蛋白(CILP))的基因之间的关联。CILP直接与TGF-β1结合以抑制TGF-β1诱导的软骨ECM蛋白合成。NP细胞分泌TGF-β，TGF-β诱导结缔组织生长因子(CTGF/CCN2)的转录以增加软骨和椎间盘中的细胞外基质合成。因此，TGF-β活性对于椎间盘细胞外蛋白表达和功能至关重要。

甲状旁腺激素(PTH)，一种FDA-批准的用于骨质疏松症的合成代谢治疗剂(therapy)，刺激骨重塑。PTH通常与1型PTH受体(PTH1R)结合，并且刺激腺苷酸环化酶用于形成环腺苷一磷酸(cAMP)。增加的cAMP水平活化蛋白激酶A(PKA)以诱导cAMP反应结合蛋白(CREB)的磷酸化，该cAMP反应结合蛋白(CREB)是参与PTH介导的基因表达的转录因子。PTH还通过经由替代途径协调(orchestrating)局部因子包括TGF-β的信号传导来调控骨骼内稳态。尽管充分记载了PTH参与骨骼组织内稳态和钙代谢，但缺乏关于其在椎间盘退化中的作用的数据。

尽管DDD的发病率和重要性，但迄今，目前不存在阻止退化的进展或恢复椎间盘功能的有效治疗。疼痛的症状缓解和手术诸如金标准脊柱融合是现在广泛采用的用于DDD的治疗，尽管这些治疗策略存在若干缺点和障碍。被用于减轻症状的许多方法是不清楚的或对椎间盘完整性实际上是破坏性的。尽管近年来通过将细胞或生物材料注射到椎间盘空间中，以及用生物工程化椎间盘替代方面已经做出了大量努力，但无一真正允许骨架重建，这些研究也没有揭露奠定椎间盘组织的内稳态和复原的机制。

因此，仍然存在未被满足的对开发用于治疗和逆转患者中的DDD的更有效的方法的需求。

发明概述

根据本发明的一个或更多个实施方案，本发明人研究了间歇性PTH(intermittentPTH)(iPTH，例如每日注射)对LDD的潜在影响。发现在小鼠的衰老期间，iPTH通过活化ECM中的潜伏TGF-β来有效地减轻椎间盘退化。PTH诱导NP细胞表达整联蛋白αvβ6，整联蛋白αvβ6活化TGF-β-CCN2-基质蛋白信号传导级联。因此，PTH是椎间盘内稳态和功能在衰老期间的天然调控物。这些发现提供了PTH信号传导通过NP细胞活化合成代谢活性的新型机制，以及其用于减轻LDD和相关紊乱的用途。

根据一个实施方案，本发明提供了一种用于治疗具有IVD退化和/或LDD的症状的受试者中的IVD退化和/或LDD的方法，该方法包括向受试者施用有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

根据一个实施方案，本发明提供了一种用于治疗具有IVD退化和/或LDD的症状的受试者中的IVD退化和/或LDD的方法，该方法包括向受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含PTH或其功能片段或类似物以及药学上可接受的载体。

根据一个实施方案，本发明提供了一种用于使受试者中的老化的IVD再生的方法，该方法包括向受试者施用有效量的PTH或其功能片段或类似物。

根据另一个实施方案，本发明提供了一种用于使受试者中的老化的IVD再生的方法，该方法包括向受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物以及药学上可接受的载体。

根据一个实施方案，本发明提供了一种用于治疗受试者中的椎间盘(IVD)退化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

根据另一个实施方案，本发明提供了一种用于治疗受试者中的椎间盘(IVD)退化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物以及药学上可接受的载体。

根据一个实施方案，本发明提供了一种用于增加受试者的IVD中的髓核(NP)和/或纤维环(AF)和/或软骨终板(EP)的总组织体积的方法，该方法包括向受试者施用有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

根据又另一个实施方案，本发明提供了一种用于减少受试者的IVD的NP细胞凋亡的方法，该方法包括向受试者施用有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

根据仍另一个实施方案，本发明提供了一种增加受试者的IVD的NP细胞中的活性TGF-β的水平的方法，该方法包括向受试者施用有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

附图简述

图1A-图1I示出了衰老期间减少的IVD体积和TGF-β活性。(A)2月龄的小鼠和18月龄的小鼠的IVD的3D传播相衬微断层摄影术(propagation phase contrast micro-tomography)(PPCT)图像。比例尺，500μm。(B)IVD高度和体积的定量分析。(C)3D上表面和下表面PPCT图像，示出2月龄的小鼠和18月龄的小鼠的IVD的五个区域中的厚度分布，以及(D)对(C)的定量分析。比例尺，颜色代码指示从蓝色(100μm)至红色(800μm)的厚度程度。C：中央区域，R：右侧区域，A：前部区域，L：左侧区域，P：后部区域。(E、F)：示出髓核(NP)区的IVD组织切片的番红-O染色图像(E)，以及2月龄的小鼠和18月龄的小鼠的NP区域中的细胞数目和IVD组织学评分的定量分析(F)。比例尺，100μm。(G)IVD切片的免疫染色图像，示出了NP区域中的聚集蛋白聚糖(ACAN)、CCN2的表达和pSmad2/3阳性细胞。比例尺，200μm。(H)对以下的定量分析：ACAN阳性面积占总IVD面积的百分比和CCN2阳性面积以及NP区(Ar)中的pSmad2/3阳性细胞。比例尺，50μm。(I)蛋白印迹分析，示出了2月龄的小鼠和18月龄的小鼠的NP组织中的pSmad2水平。将所有数据示出为平均值±s.d。*P<0.05,**P<0.01,n＝8只/组。通过学生t-检验确定统计学显著性。

图2A-图2I示出了PTH在NP细胞中直接诱导cAMP产生和CREB磷酸化。(A)小鼠IVD切片的免疫染色图像，示出了NP细胞中的PTH1R(棕色)与作为阴性对照(NC)的IgG抗体。比例尺，100μm。(B)蛋白印迹分析，示出了NP细胞和AF细胞与作为阴性对照(NC)的HEK293细胞和作为阳性对照(PC)的UMR-106成骨细胞样细胞中的PTH1R表达。(C)使用NotoCre；ROSA26-GFP小鼠的脊索来源的NP细胞中的PTH1R表达(上方为黄色)的谱系映射。比例尺，20μm(上方)和50μm(下方)。NP细胞对脊索来源(绿色)和PTH1R受体(红色)的存在呈阳性染色。脊索来源的细胞(绿色)和PTH1R阳性细胞(红色)在椎间盘组织共定位的NP区域(黄色)内大量染色。(D)用PTH治疗的NP细胞中的细胞cAMP水平的ELISA分析。(E)IVD切片的免疫染色，示出了在不同的时间点用PTH治疗的NP区域中的pCREB阳性细胞。比例尺，100μm。(F)pCREB阳性细胞对用PTH治疗的总NP细胞的百分比。(G)用PTH治疗的NP细胞中pCREB水平的蛋白印迹分析。(H)不同年龄的人类NP样本中PTH1R表达的蛋白印迹分析。(I)来自年轻患者和年老患者的NP组织中的PTH1R mRNA水平的qRTPCR，以倍数变化示出。将所有数据示为平均值±s.d。*P<0.05,**P<0.01,n＝8只/组。通过学生t-检验确定统计学显著性。

图3A-图3S描绘了iPTH通过诱导整联蛋白αvβ6表达以活化TGF-β而减轻椎间盘退化。(A)用iPTH(1-34)或媒介物40μg/kg18月龄的小鼠的每日注射(每周5天，持续8周)的IVD的3D PPCT图像。比例尺，500μm。(B)小鼠IVD高度和IVD体积的定量分析。(C、D)示出具有iPTH或媒介物的IVD的五个区域的厚度分布的3D PPCT图像和定量分析。颜色代码指示从蓝色(100μm)至红色(800μm)的厚度程度。(E、F)小鼠腰椎的MRI扫描，示出了具有iPTH或媒介物的18月龄的小鼠的椎间盘(黄色箭头)与2月龄的小鼠的MRI扫描相比的信号强度，以及对椎间盘信号强度的定量测量(F)。比例尺，1mm。(G、H)示出具有iPTH或媒介物的18月龄的小鼠的NP区域的IVD切片的番红-O染色图像(G)，以及NP区域中的细胞数目和IVD组织学评分的定量分析(H)。比例尺，100μm。(I)示出NP区中的ACAN、CCN2的表达和pSmad2/3阳性细胞的IVD切片的免疫染色图像。比例尺，200μm。(J)对以下的定量分析：ACAN阳性面积占总IVD面积(Ar)的百分比、CCN2阳性面积和pSmad2/3阳性细胞的数目。(K、L)来自具有iPTH或媒介物的18月龄的小鼠的NP组织的总TGF-β水平和活性TGF-β水平的ELISA分析。(M)示出来自用PTH或媒介物注射的18月龄的小鼠的NP组织中的pSmad2水平与来自2月龄的NP组织的pSmad2水平相比的蛋白印迹分析。(N)示出来自用PTH或媒介物注射的18月龄的小鼠的IVD组织中的多种整联蛋白表达的免疫染色图像以及定量分析(O)。比例尺50μm。(P)来自用PTH或媒介物注射的18月龄的小鼠的NP组织中的多种整联蛋白的mRNA水平的qRT-PCR分析。结果以倍数变化报告。(Q)18月龄的小鼠的NP细胞中的整联蛋白β6表达在PTH注射(PTH1-34,100nM)后的不同的时间点的蛋白印迹分析。(R、S)用β6整联蛋白启动子中的4个不同的潜在pCREB结合位点(引物1、2、3和4)的染色质免疫沉淀测定。将所有数据报告为平均值±s.d。*P<0.05,**P<0.01,n＝8只/组。通过单向ANOVA和学生t-检验确定统计学显著性。

图4A-图4M示出了PTH1R敲除小鼠中特别是NP细胞中的椎间盘退化的加速。(A)免疫染色图像，示出了相对于其野生型同窝小鼠(PTH1R^+/+)，PTH1R缺陷小鼠(PTH1R^-/-)的NP组织中无PTH1R表达。IVD(上方)；NP(下方)。比例尺50μm。(B)与PTH1R^+/+小鼠相比不同年龄的PTH1R^-/-小鼠中IVD厚度分布的3D PPCT图像。比例尺，颜色代码指示从蓝色(100μm)至红色(800μm)的厚度程度。(C)与PTH1R^+/+小鼠相比不同年龄的PTH1R^-/-小鼠中的IVD体积的定量分析。(D、E)用于测试6月龄和12月龄的PTH1R缺陷小鼠的脊柱柔韧性的3D有限元分析模型的图像。(D)将L3的上表面和L4的下表面用刚性杆固定以模拟IVD的载荷以便测量柔韧性。(E)对于每个模型，施加扭矩载荷以模拟四个不同方向上的运动：背屈、前屈、左侧屈和右侧屈测量。(F)6月龄和12月龄的PTH1R缺陷小鼠的脊柱柔韧性的定量分析。(G)通过切除第三腰椎棘突和第四腰椎棘突连同从第二腰椎至第五腰椎的棘上韧带和棘间韧带产生的不稳定的脊柱模型的示意性表示。(H)PTH1R缺陷小鼠的IVD厚度分布在手术后不同的时间点与PTH1R^+/+小鼠的IVD厚度分布相比的3D PPCT图像。(I)对(H)的IVD体积的定量分析。(J)示出具有iPTH或媒介物的12月龄的PTH1R缺陷小鼠或PTH1R^+/+小鼠的IVD厚度分布的3D PPCT图像。(K)对(J)中的IVD体积的定量分析。来自用iPTH或媒介物治疗的PTH1R缺陷小鼠的NP组织中的pSmad2/3、CCN2和ACAN的蛋白印迹分析。(M)来自具有iPTH或媒介物的PTH1R缺陷小鼠或PTH1R^+/+小鼠的NP组织中的CCN2和ACAN的mRNA表达水平的qRT-PCR分析。结果以倍数变化报告。*P<0.05,**P<0.01,n＝8只/组。通过单向ANOVA和学生t-检验确定统计学显著性。所有数据报告为平均值±s.d。

图5A-图5N示出了PTH和机械应力刺激的PTH1R向NP细胞的原纤毛的转运。(A)乙酰化的α-微管蛋白(绿色)和DAPI(蓝色)的免疫染色，示出了来自PTH1R缺陷小鼠或PTH1R^+/+小鼠的NP细胞的原纤毛的长度。(B)对(A)的原纤毛长度的定量测量。(C)乙酰化的α-微管蛋白或PTH1R的免疫染色，示出了PTH刺激的PTH1R向NP细胞的原纤毛的转运。(D)对(C)的纤毛中的PTH1R强度的定量分析。(E)DAPI、pCREB或乙酰化的α-微管蛋白的免疫染色，示出了在NP细胞的原纤毛处PTH刺激的CREB的磷酸化。(F)对(E)的纤毛中的pCREB强度的定量分析。(G、H)使用抗pCREB的抗体且用PTH1R印迹(G)或使用抗PTH1R的抗体且用pCREB印迹(H)的、来自用PTH或媒介物治疗的NP细胞的细胞裂解物的共免疫沉淀，示出了乙酰化的α-微管蛋白提取物中的PTH1R和pCREB之间的相互作用。(I)乙酰化的α-微管蛋白或PTH1R的免疫染色，示出了剪切应力刺激的PTH1R向NP细胞的原纤毛的转运。(J)对(I)的纤毛中的PTH1R强度的定量分析。(K)用苍白蛋白(pallidin)siRNA或对照siRNA处理的NP细胞的乙酰化的α-微管蛋白或PTH1R的免疫染色，示出了PTH刺激的PTH1R向NP细胞的原纤毛的转运被抑制。比例尺＝10μm。(L)对(K)的纤毛中的PTH1R强度的定量分析。(N)用苍白蛋白siRNA或对照siRNA处理的NP细胞中的PTH诱导的pCREB水平的蛋白印迹分析。*P<0.05，**P<0.01。n＝8只/组。通过单向ANOVA和学生t-检验确定统计学显著性。将所有数据报告为平均值±s.d。

图6A-图6H示出了原纤毛调控NP细胞中用于椎间盘合成代谢活性的PTH信号传导。(A)示出PTH对IVD的作用在IFT88^-/-小鼠中减弱的3D PPCT和免疫染色图像。PPCT比例尺，500μm。番红-O比例尺，100μm。(B)对IVD体积的定量分析以及(C)(A)的IVD组织学评分。(D)从用iPTH或媒介物注射的IFT88^-/-或IFT88^+/+小鼠分离的NP细胞中的pCREB在有剪切应力或没有剪切应力下的蛋白印迹分析。(E)用PTH或媒介物治疗的2月龄的IFT88^-/-或IFT88^+/+小鼠中用DAPI(蓝色)的pSmad2/3(棕色)、CCN2和ACAN(红色)的免疫染色。pSmad2/3和CCN2比例尺，50μm；ACAN比例尺，100μm。(F、G和H)对以下的定量分析：NP区域中pSmad2/3阳性细胞的百分比和CCN2阳性面积以及总IVD面积的ACAN阳性面积的百分比。*P<0.05,**P<0.01。n＝8只/组。通过单向ANOVA和学生t-检验确定统计学显著性。将所有数据报告为平均值±s.d。

图7A-图7D描绘了通过基于同步辐射的传播相衬微断层摄影术(PPCT)使椎间盘3D可视化。(A)中国的上海同步辐射装置(Shanghai Synchrotron Radiation Facility)(SSRF)以BL13W1生物医学光束线进行的PPCT扫描的示意性描绘。将样品固定在旋转台上。在单色同步辐射x-射线光束透射穿过样品后，通过位于距样品台相关距离处的图像检测器记录内部结构。(B)椎间盘的冠状面、横断面和矢状面视图通过PPCT检测；椎间盘的这些视图难以用常规μCT描绘。(C)(B)中标记的对应线的强度分布。蓝线(I、II和III)是指μCT，而红线(1、2、3)是指PPCT。(D)L3-L4区段的完整3D图像。椎(VB)、终板(EP)和IVD可以被单独和从多个角度可视化。可以使用不同的颜色代码定义3D厚度分布。比例尺＝500μm。

图8A-图8F示出了间歇性PTH对椎间盘形态的作用的剂量筛选。(A)在用20μg/kg/d、40μg/kg/d和80μg/kg/d的人类PTH(1-34)进行iPTH治疗后IVD的3D厚度分布。(B)对在iPTH治疗后IVD体积的定量分析。(C)在微结构处观察来自2月龄的小鼠和18月龄的小鼠在有PTH或没有PTH时L4椎的3D图像。(D)在iPTH治疗后对小梁骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数目(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)的定量分析。(E)L4椎的组织切片的βGal染色的图像。(F)示出随衰老而增加的βGal阳性细胞(在PTH注射后，βGal阳性细胞减少)的定量分析。*P<0.05,**P<0.01。通过单向ANOVA和学生t-检验确定统计学显著性。将所有数据报告为平均值±s.d。

图9A-图9C示出了用于IVD柔韧性测试的3D有限元分析模型。(A)将L3的上表面和L4的下表面用刚性杆固定以模拟IVD的载荷以便测量柔韧性。(B)对于每个模型，我们施加了扭矩载荷以模拟四个不同方向上的运动：背屈、前屈、左侧屈和右侧屈测量。(C)样品3D有限元模型。

发明详述

IVD可以被视为集成的功能性联合单元，其可以宏观地被分为至少三个不同的组成部分：1)脊索来源的髓核(NP)，代表位于中央的凝胶状同质物质(在青少年椎间盘(juvenile discs)中)；2)由间充质来源的纤维软骨细胞样细胞填充的纤维环(AF)，其由胶原原纤维的同心组织的层组成并且包含髓核；3)软骨终板(EP)，其将NP和AF与相邻的椎骨分离。对这三个结构之一的完整性和相互作用的任何干扰可能导致IVD单元的功能受损。NP被认为对产生和维持椎间盘的结构完整性是必须的，并且是在退化期间第一个被影响的结构。

完全地起源于脊索原基的NP被AF包裹并且被EP夹在中间。NP退化的特征是细胞驱动的基质合成和降解之间的失衡。在生理学上，在青少年椎间盘中，NP细胞合成蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖和具有带负电荷的侧链的双糖链蛋白聚糖(biglycan)以保持大量的水来平衡来自EP的压缩应力。随着年龄的增加，焦磷酸钙二水合物晶体沉积物(代谢异常的一种明显表现)经常存在于具有退行性椎间盘疾病的老年患者的AF和软骨EP中。这使营养物通过毛细芽从EP扩散至NP受损，导致微环境因乳酸的积累变得越来越酸性。这降低了髓核细胞产生ECM的能力，但不抑制降解性酶(诸如MMP和ADAMTS)的产生。聚集蛋白聚糖的降解成为最显著的变化，导致NP中水含量的减少，使椎间盘空间变窄并且加速EP的硬化。这形成负反馈回路，并且加剧椎间盘退化。NP最终丧失其在椎体之间分配压缩力的能力，这些压缩力不均匀地传递至AF，产生压力增加的区域和微创伤(microtrauma)的风险。这种改变的力分布和微创伤导致沿AF的撕裂和裂隙(fissures)，并且最终导致椎间盘高度的损失。认为，成年人的椎间盘中的NP基质的维持依赖于软骨EP的功能完整性，并且产生ECM的细胞的损失导致IVD退化。

根据一个实施方案，本发明提供了一种用于治疗具有IVD退化和/或LDD的症状的受试者中的IVD退化和/或LDD的方法，该方法包括向受试者施用有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

根据一个实施方案，本发明提供了一种用于治疗具有IVD退化和/或LDD的症状的受试者中的IVD退化和/或LDD的方法，该方法包括向受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含PTH或其功能片段或类似物以及药学上可接受的载体。

根据一个实施方案，本发明提供了一种组合物，用于治疗受试者中的IVD退化和/或LDD，该组合物包含有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

根据一个实施方案，本发明提供了一种组合物，用于使受试者中的老化的椎间盘(IVD)再生，该组合物包含有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

根据一个实施方案，本发明提供了一种组合物，用于增加受试者的IVD中的髓核(NP)和/或纤维环(AF)和/或软骨终板(EP)的总组织体积，该组合物包含有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

根据一个实施方案，本发明提供了一种组合物，用于减少受试者的IVD中的NP细胞凋亡，该组合物包含有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

根据一个实施方案，本发明提供了一种组合物，用于增加受试者的IVD的NP细胞中活性TGF-β的水平，该组合物包含有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

根据一些实施方案，被施用至受试者的甲状旁腺激素可以呈组合物或溶液的形式，该组合物或溶液可以并入全长84个氨基酸形式的甲状旁腺激素，特别是通过肽合成重组地或通过从人类流体提取获得的人类形式，hPTH(1-84)。参见，例如，美国专利第5,208,041号，其通过引用并入本文。Kimura等人在Biochem.Biophys.Res.Comm.,114(2):493中报道了hPTH(1-84)的氨基酸序列。

在可选择的实施方案中，包含PTH的组合物或溶液还可以并入作为活性成分的人类PTH或根据Kimmel等人,Endocrinology,1993,32(4):1577报道的骨质疏松症的切除卵巢的大鼠模型中确定的具有人类PTH活性的大鼠PTH、猪PTH或牛PTH的功能片段或部分或片段的变体。

期望地，甲状旁腺激素功能片段或部分并入至少前28个N-末端残基，诸如PTH(1-28)、PTH(1-31)、PTH(1-34)、PTH(1-37)、PTH(1-38)和PTH(1-41)。呈PTH变体的形式的替代物并入改善PTH稳定性和半衰期的1个至5个氨基酸取代，诸如用改善PTH的抗氧化稳定性的亮氨酸或其他疏水性氨基酸替代在8位和/或18位处的甲硫氨酸残基，以及用改善PTH的抗蛋白酶稳定性的胰蛋白酶不敏感的氨基酸(诸如组氨酸或其他氨基酸)替代25-27区域中的氨基酸。其他合适的PTH的形式包括PTHrP、PTHrP(1-34)、PTHrp(1-36)和活化PTH1受体的PTH或PTHrp的类似物。这些PTH形式包含在本文中一般使用的术语“甲状旁腺激素”中。激素可以通过诸如在美国专利第4,086,196号和第5,556,940号中描述的已知的重组或合成方法来获得，这两篇美国专利通过引用并入本文。

在一个实施方案中，在本发明的方法中，PTH是还被称为特立帕肽(teriparatide)的人类PTH(1-34)。可以在本方法中使用的人类PTH(1-34)诸如重组人类PTH(1-34)(rhPTH(1-34))包括结晶形式的稳定溶液描述在美国专利6,590,081中，该美国专利通过引入并入本文。

术语“氨基酸”包括呈D或L形式的天然α-氨基酸(例如，Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)、以及β-氨基酸、合成和非天然氨基酸的残基。许多类型的氨基酸残基可用于多肽，并且本发明不限于天然的、遗传编码的氨基酸。可以在本文描述的肽中使用的氨基酸的实例可以例如在Fasman,1989,CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology,CRC Press,Inc.以及其中引用的参考文献中找到。大量氨基酸残基的另一个来源由RSP Amino Acids LLC的网站提供。

本文提及的“衍生物”包括PTH肽的部分(part)、片段和部分(portion)。衍生物还包括单个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加。同源物包括与天然存在的肽或蛋白质在功能上、结构上或立体化学上相似的肽。所有这样的同源物被本发明所预期。

类似物和模拟物包括分子，该分子包括包含非天然存在的氨基酸的分子或不包含氨基酸但在功能上与PTH肽表现相同的分子。天然产物筛选是用于鉴定类似物和模拟物的一种有用的策略。

在肽合成期间并入非天然氨基酸和衍生物的实例包括，但不限于使用以下：正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。本文预期的已知的非天然氨基酸的部分列表在表1中示出。

表1：非天然氨基酸

本文预期的本主题的肽的类似物包括对侧链的修饰、在肽合成期间并入非天然氨基酸和/或其衍生物、和使用交联剂以及对肽分子或其类似物施加构象限制的其他方法。

本发明预期的侧链修饰的实例包括氨基基团的修饰，诸如通过与醛反应随后用NaBH₄还原的还原烷基化；用乙酰亚胺甲酯(methylacetimidate)的脒化(amidination)；用乙酸酐的酰化；用氰酸酯的氨基基团的氨基甲酰化；用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)的氨基基团的三硝基苄基化；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐的氨基基团的酰化；以及用吡哆醛-5-磷酸随后用NaBH₄进行还原的赖氨酸的吡哆醛化(pyridoxylation)。

精氨酸残基的胍基团可以通过与试剂诸如2,3-丁二酮、苯甲酰甲醛(phenylglyoxal)和乙二醛形成杂环缩合产物来修饰。

羧基基团可以通过经由O-酰基异脲形成进行碳二亚胺活化随后通过后续衍生化成，例如对应的酰胺来修饰。

巯基基团可以通过诸如以下的方法来修饰：用碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化；过甲酸氧化成磺丙氨酸；用其他硫醇化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其他被取代的马来酰亚胺反应；使用4-氯汞苯甲酸酯、4-氯汞苯磺酸、氯化苯汞、2-氯汞基-4-硝基苯酚和其他汞类形成汞衍生物；在碱性pH用氰酸酯的氨基甲酰化。

色氨酸残基可以通过例如用N-溴代琥珀酰亚胺进行的氧化或用2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰卤进行的吲哚环的烷基化来修饰。在另一方面，酪氨酸残基可以通过用四硝基甲烷进行的硝化来改变，以形成3-硝基酪氨酸衍生物。

组氨酸残基的咪唑环的修饰可以通过用碘乙酸衍生物进行的烷基化或用焦碳酸二乙酯进行的N-乙酯基化来完成。

交联剂可以被用于例如，使用同-双官能交联剂诸如具有(CH₂)_n间隔基团(n＝1至n＝6)的双官能酰亚胺酯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯和异-双官能试剂来稳定3D构象，该异-双官能试剂通常包含氨基反应性部分诸如N-羟基琥珀酰亚胺和另一个基团特异性反应性部分诸如马来酰亚胺或二硫代部分(SH)或碳二亚胺(COOH)。此外，肽可以通过例如以下在构象上被限制：并入C_α-甲基氨基酸和N_α-甲基氨基酸、在氨基酸的C_α原子和C_β原子之间引入双键以及通过引入共价键，诸如在N末端和C末端之间、在两个侧链之间或在侧链和N末端或C末端之间形成酰胺键来形成环状肽或类似物。

本发明还预期了天然存在的肽(Pep)部分的小的化学类似物。化学类似物可以不一定衍生自肽本身，但可以共享某些构象相似性。可选择地，化学类似物可以被专门地设计成模拟肽的某些物理化学性质。化学类似物可以化学地合成，或可以在例如天然产物筛选之后被检测到。

甲状旁腺激素是FDA批准的用于骨质疏松症的合成代谢治疗剂，并且能够直接地作用于分泌成骨细胞的骨基质，并且其调控骨骼内稳态的功能是熟知的。甲状旁腺，PTH的主要产生部位，在两栖动物中进化并且表示水生生物向陆生生物的转变，水生脊椎动物开始适应陆生运动。已经示出PTH活化静息细胞以获得骨骼完整性并且用于重塑，诸如将衬覆细胞(lining cell)转化为活性成骨细胞，并且协调局部因子的信号传导，所述局部因子包括(但不限于)TGFβ、Wnts、BMP和IGF-1。因此，PTH调控微环境中的细胞活性，包括MSC、T细胞和其他PTH应答细胞的那些细胞活性，以使对组织内稳态的系统控制完整。此外，在PTH刺激的骨重塑中，小血管在空间上更紧密地重新定位于新骨形成的部位。血管的更紧密的靠近允许用于骨骼组织内稳态特别是用于非血管系统的IVD的营养物的有效递送。

根据一个实施方案，本发明提供了一种用于使受试者中老化的椎间盘(IVD)再生的方法，该方法包括向受试者施用有效量的PTH或其功能片段或类似物。

关于亲本PTH多肽，功能部分可以包含例如约90％、95％或更多的PTH多肽。

PTH的功能部分可以在该部分的氨基末端或羧基末端处或在两个末端处包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸不存在于PTH多肽的氨基酸序列中。期望地，另外的氨基酸不干扰功能部分的生物功能。

本发明的范围中包括本文描述的本发明的多肽和蛋白质的功能变体。如本文使用的术语“功能变体”是指与PTH多肽或蛋白质具有实质的或显著的序列同一性或相似性的PTH多肽或蛋白，该功能变体保持了其是变体的PTH多肽或蛋白质的生物活性。提及亲本PTH多肽或蛋白质，功能变体可以例如在氨基酸序列中与PTH多肽或蛋白质至少约30％、50％、75％、80％、90％、98％或更多地相同。

功能变体可以例如包含具有至少一个保守氨基酸取代的PTH多肽或蛋白质的氨基酸序列。保守氨基酸取代是本领域中已知的，并且包括其中具有某些物理性质和/或化学性质的一种氨基酸被具有相同的化学性质或物理性质的另一种氨基酸交换的氨基酸取代。例如，保守氨基酸取代可以是酸性氨基酸被取代为另一种酸性氨基酸(例如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸被取代为具有非极性侧链的另一种氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)、碱性氨基酸被取代为另一种碱性氨基酸(Lys、Arg等)、具有极性侧链的氨基酸被取代为具有极性侧链的另一种氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)等。

功能变体还可以包括PTH多肽的延伸物(extension)。例如，PTH多肽的功能变体可以包括来自PTH多肽的N-末端或C-末端的1个、2个、3个、4个和5个另外的氨基酸。

可选择地或另外地，功能变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸取代的PTH多肽或蛋白质的氨基酸序列。在此情况中，优选的是，非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能变体的生物活性。优选地，非保守氨基酸取代增强功能变体的生物活性，使得与PTH多肽或蛋白质相比，功能变体的生物活性增加。

PTH多肽或蛋白质可以基本上由本文描述的一个或更多个指定的氨基酸序列组成，使得功能变体的其他组分，例如其他氨基酸，不实质性地改变功能变体的生物活性。

在本发明的方法中使用的本发明的PTH多肽(包括功能部分和功能变体)可以包含代替一种或更多种天然存在的氨基酸的合成氨基酸。这样的合成氨基酸是本领域中已知的，并且包括，例如，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-羟基脯氨酸和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。

在本发明的方法中使用的PTH多肽和蛋白质(包括功能部分和功能变体)可以被糖基化、酰胺化、羧基化、磷酸化、酯化、N-酰化、经由例如二硫桥的环化、或被转化成酸加成盐和/或任选地被二聚化或多聚化、或被缀合。

当在本发明中使用的PTH多肽和蛋白质(包括功能部分和功能变体)呈盐的形式时，优选地，多肽呈药学上可接受的盐的形式。合适的药学上可接受的酸加成盐包括衍生自以下的那些酸加成盐：无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸，以及有机酸，诸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如，对甲苯磺酸。

在本发明的方法中使用的PTH多肽和/或蛋白质(包括其功能部分和功能变体)可以通过本领域已知的方法获得。从头合成多肽和蛋白质的合适的方法在参考文献，诸如Chan等人,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2005；Peptide and Protein Drug Analysis,编著.Reid,R.,MarcelDekker,Inc.,2000；EpitopeMapping,编著.Westwoood等人,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2000；以及美国专利第5,449,752号中描述。此外，多肽和蛋白质可以使用本文描述的核酸使用标准重组方法来重组地产生。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版编著,Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harbor,NY 2001；以及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,NY,1994。此外，本发明的PTH多肽和蛋白质中的一些(包括其功能部分和功能变体)可以从诸如植物、细菌、昆虫、哺乳动物，例如大鼠、人类等来源分离和/或纯化。分离和纯化的方法是本领域中熟知的。可选择地，本文描述的PTH多肽和/或蛋白质(包括其功能部分和功能变体)可以由公司，诸如Synpep(Dublin,CA)、Peptide Technologies Corp.(Gaithersburg,MD)和Multiple PeptideSystems(San Diego,CA)商业地合成。在此方面，PTH多肽和蛋白质可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。

本发明的范围中包括缀合物，例如，生物缀合物，其包括PTH多肽或蛋白质(包括其任何功能部分或变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞、宿主细胞群体、或抗体、或其抗原结合部分中的任何一个。缀合物以及合成缀合物的方法通常是本领域已知的(参见，例如，Hudecz,F.,Methods Mol.Biol.298:209-223(2005)和Kirin等人,Inorg Chem.44(15):5405-5415(2005))。

根据一个实施方案，本发明提供了一种用于治疗受试者中的IVD退化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的PTH或其功能片段或类似物。

如本文使用的，术语“IVD退化”或“退行性椎间盘疾病”可以意指IVD空间变窄，或NP和AF之一或两者中的细胞外基质和细胞数目减少，并且还可以意指NP和EP中的基质产生的代谢衰竭。在一些实施方案中，退化可以包括减少NP和AF中的pSmad2/3+细胞的数目。

如本文使用的，术语“治疗”以及由其产生的词语包括诊断和预防以及紊乱再缓解(remitative)治疗。此外，由本发明的方法提供的治疗或预防可以包括治疗或预防被治疗或预防的疾病的一种或更多种状况或症状，例如腹泻。此外，出于本文的目的，“预防”可以包括延迟疾病或其症状或状况的发作。

如本文使用的，术语“受试者”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目(orderRodentia)的哺乳动物，诸如小鼠和仓鼠，以及兔形目(order Logomorpha)的哺乳动物，诸如兔。优选的是，哺乳动物来自食肉目(order Carnivora)，包括猫科动物(Felines)(猫)和犬科动物(Canines)(犬)。更优选的是，哺乳动物来自偶蹄目(order Artiodactyla)，包括牛科动物(Bovines)(牛)和猪科动物(Swines)(猪)，或是奇蹄目(order Perssodactyla)，包括马科动物(Equines)(马)。最优选的是，哺乳动物是灵长目(order Primates)、猿目(order Ceboids)或猴目(order Simoids)(猴)或类人目(order Anthropoids)(人类和猿)。特别优选的哺乳动物是人类。

根据一个实施方案，本发明提供了一种用于增加受试者的IVD中的髓核(NP)和/或纤维环(AF)和/或软骨终板(EP)的总组织体积的方法，该方法包括向受试者施用有效量的PTH或其功能片段或类似物。

根据又另一个实施方案，本发明提供了一种用于减少受试者的IVD的NP细胞凋亡的方法，该方法包括向受试者施用有效量的PTH或其功能片段或类似物。

根据仍另一个实施方案，本发明提供了一种用于增加受试者的IVD的NP细胞中活性TGF-β的水平的方法，该方法包括向受试者施用有效量的PTH或其功能片段或类似物。

待在治疗上使用的PTH或其功能片段或类似物的有效量将取决于，例如，治疗(therapeutic)目标和治疗(treatment)目标、施用途径、经历治疗或疗法的受试者的年龄、状况和体重、以及被提供给受试者的辅助(auxiliary)或辅助(adjuvant)疗法。因此，对于医生，根据需要调整剂量并且改变施用途径以获得最佳治疗效果将是必要的和常规的。根据上文提及的因素，PTH或其功能片段或类似物的典型的每日剂量可以在从约0.1mg/kg至高达约100mg/kg或更高，优选地从约0.1mg/kg/天至约10mg/kg/天的范围内。通常，临床医师将施用PTH或其功能片段或类似物，直到达到实现期望的效果的剂量。该疗法的进展容易通过常规测定来监测。

用于PTH肽或其衍生物的施用的剂量范围是大到足以产生其中恶性疾病的症状被改善的期望的效果的那些剂量范围。剂量不应太大以至于导致不良副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随患者的年龄、状况、性别、疾病的程度而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在任何并发症的事件中，剂量可以由个别医师调整。

作为非限制性实例，对受试者的治疗可以以PTH肽或其衍生物的一次性剂量或周期性剂量以每天约0.1mg/kg至100mg/kg诸如0.1mg/kg、0.5mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg，在以下时间使用单个剂量或重复的剂量提供：第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天、第20天、第21天、第22天、第23天、第24天、第25天、第26天、第27天、第28天、第29天、第30天、第31天、第32天、第33天、第34天、第35天、第36天、第37天、第38天、第39天或第40天中的至少一天，或可选择地或另外地，第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第7周、第8周、第9周、第10周、第11周、第12周、第13周、第14周、第15周、第16周、第17周、第18周、第19周、第20周、第21周、第22周、第23周、第24周、第25周、第26周、第27周、第28周、第29周、第30周、第31周、第32周、第33周、第34周、第35周、第36周、第37周、第38周、第39周、第40周、第41周、第42周、第43周、第44周、第45周、第46周、第47周、第48周、第49周、第50周、第51周或第52周中的至少一周，或可选择地或另外地，第1年、第2年、第3年、第4年、第5年、第6年、第7年、第8年、第9年、第10年、第11年、第12年、第13年、第14年、第15年、第16年、第17年、第18年、第19年或第20年中的至少一年，或其任何组合。

具体地，PTH肽或其衍生物可以在几周的进程内一天至少施用一次。在一个实施方案中，药物组合物在几周至几个月内一天至少施用一次。在另一个实施方案中，药物组合物在4周至8周内一周施用几次，诸如例如，一周2次、3次、4次、5次。在又另一个实施方案中，药物组合物在四周或更长时间内一周施用一次。

根据另一个实施方案，本发明提供了一种用于使受试者中的老化的IVD再生的方法，该方法包括向受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物以及药学上可接受的载体。

根据一个实施方案，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含上文描述的在此处之前的多肽以及药学上可接受的载体。

根据另一个实施方案，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含在此处之前的上文描述的多肽和第二治疗剂、以及药学上可接受的载体。

关于本文描述的肽组合物，药学上可接受的载体可以是任何那些常规使用的载体，并且仅受物理化学因素(诸如溶解度和缺乏与一种或更多种活性化合物的反应性)和施用途径的限制。本文描述的载体，例如媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂，是本领域技术人员熟知的并且对公众是容易地可得的。优选的是，载体是化学上对一种或更多种活性剂是惰性的载体，以及在使用条件下很少有或没有有害副作用或毒性的载体。载体的实例包括可溶性载体诸如可以是生理学上可接受的已知的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)，以及固体组合物诸如固态载体或乳胶珠。

本文使用的载体或稀释剂可以是用于固体制剂的固体载体或稀释剂、用于液体制剂的液体载体或稀释剂、或其混合物。

固体载体或稀释剂包括但不限于树胶、淀粉(例如，玉米淀粉、预胶化淀粉)、糖(例如，乳糖、甘露醇、蔗糖、右旋糖)、纤维素材料(例如，微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如，聚甲基丙烯酸酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石或其混合物。

对于液体制剂，药学上可接受的载体可以是例如水性溶液或非水性溶液或悬浮液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。水性载体包括例如水、醇溶液/水性溶液、环糊精、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。

肠胃外媒介物(用于皮下、静脉内、动脉内或肌肉内注射)包括例如氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液和不挥发性油。适合于肠胃外施用的制剂包括例如可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和致使制剂与所预期的接受者的血液等渗的溶质的水性和非水性的等渗无菌注射溶液、以及可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性的无菌悬浮液。

本领域技术人员将理解，除了上文描述的药物组合物之外，本发明可以被配制成包合物，诸如环糊精包合物或脂质体。

此外，在一个实施方案中，包含PTH或其衍生物的组合物还可以包含粘合剂(例如，阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(例如，玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、瓜尔胶、乙醇酸淀粉钠)、多种pH和离子强度的缓冲剂(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、防止吸收至表面的添加剂诸如白蛋白或明胶、去污剂(例如，吐温20、吐温80、Pluronic F68、胆酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如月桂基硫酸钠)、渗透增强剂、增溶剂(例如，cremophor、甘油、聚乙二醇、苯扎氯铵、苯甲酸苄酯、环糊精、脱水山梨糖醇酯、硬脂酸)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基羟基茴香醚)、稳定剂(例如，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、增粘剂(例如，卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)、甜味剂(例如，阿斯巴甜、柠檬酸)、防腐剂(例如，硫柳汞、苄醇、对羟基苯甲酸酯)、润滑剂(例如，硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、月桂基硫酸钠)、助流剂(例如，胶体二氧化硅)、增塑剂(例如，邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(例如，卡波姆、羟丙基纤维素、月桂基硫酸钠)、聚合物包衣(例如，泊洛沙姆(poloxamer)或泊洛沙胺(poloxamine))、包衣和膜形成剂(例如，乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、和/或佐剂。

载体的选择将部分地由包含特定肽的组合物以及用于施用该组合物的特定方法来确定。因此，存在本发明的药物组合物的多种合适的制剂。用于胃肠外、皮下、肌肉内和腹膜内施用的以下制剂是示例性的，并且绝不是限制性的。多于一种途径可以被用于施用本发明的组合物，并且在某些情况中，特定的途径可以比另一种途径提供更多即时且更有效的应答。

可注射的制剂符合本发明。对用于可注射的组合物的有效药物载体的要求是本领域普通技术人员熟知的(参见，例如，Pharmaceutics and Pharmacy Practice,J.B.Lippincott Company,Philadelphia,PA,Banker和Chalmers,编著,第238-250页(1982)、和ASHP Handbook on Injectable Drugs,Trissel,第15版编著,第622-630页(2009))。

如本文使用的术语“药学活性化合物”或“治疗活性化合物”意指可用于治疗或调节患有疾病或状况的受试者中的疾病或状况的化合物。药学活性化合物的实例可以包括本领域中已知的用于治疗疾病适应症的任何药物。

通常，当PTH多肽或其衍生物与另外的治疗剂一起被施用时，可以使用较低的剂量。PTH或其衍生物可以通过注射或通过随时间逐渐灌注肠胃外施用。PTH多肽或其衍生物可以单独地或与效应细胞组合经腹膜内、肌肉内、皮下、腔内或透皮施用。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。水性载体包括水、醇溶液/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。还可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

实施例

人类受试者。

在被约翰霍普金斯大学的机构审查委员会(Institutional Review Board ofJohns Hopkins University)批准后，从进行针对腰椎间盘退化的椎间盘切除术的具有不同年龄的5名患者收集腰椎间盘样本。处理样本以便蛋白印迹检查。

小鼠。

对于衰老诱导的IVD退化模型，2月龄和16月龄的C57BL/6J WT雄性小鼠购自Charles River。我们从Jackson Laboratory购买了(ROSA)26Sortm1Sor/J小鼠。从HenryKronenberg博士的实验室获得了flox化的PTH1R(PTH1Rflox/flox)的小鼠。我们从CheryleA.Seguin博士处获得了NotoCre小鼠品系。

携带侧翼为loxP位点的PTH1R基因(PTH1R^flox/flox)的小鼠与Noto^Cre小鼠交配，以产生在其种系中携带Noto^Cre和flox化的PTH1R等位基因的小鼠。将这些小鼠与纯合的flox化的小鼠回交(Noto^Cre/+/PTH1R^flox/+::PTH1R^flox/flox)，以产生具有脊索来源的细胞中的两个等位基因的失活的小鼠(基因型为Noto^Cre/+::PTH1R^flox/flox)。Noto基因座的纯合破坏是围产期致死的；存活的后代具有Noto^Cre/+::PTH1R^flox/flox(在Noto谱系细胞中具有PTH1R条件缺失的小鼠在本文本中称为“PTH1R^-/-”)或Noto^+/+::PTH1R^flox/flox(野生型同窝小鼠，此后在本文本中称为“PTH1R^+/+”)的基因型。转基因小鼠的基因型通过对从小鼠尾分离的基因组DNA的PCR分析来确定。用引物lox1F(5-TGGACGCAGACGATGTCTTTACCA-3)(SEQ ID NO：1)和lox1R(5-ACATGGCCATGCCTGGGTCTGAGA-3)(SEQ ID NO：2)鉴定flox化的PTH1R等位基因。对Cre转基因的基因分型通过PCR用引物Cre F(5-CAAATAGCCCTGGCAGAT-3)(SEQ ID NO:3)和Cre R(5-TGATACAAGGGACATCTTCC-3)(SEQ ID NO:4)进行。通过将Noto^Cre小鼠与具有阻止下游lacZ基因表达的侧翼为loxP的DNA终止序列的纯合的小鼠杂交，我们产生了Noto^Cre/+::ROSA26-lacZ^flox/flox。已经如描述的产生了IFT88^flox/flox小鼠模型。通过将NotoCre小鼠与IFT88 ^{flox /flox}小鼠杂交，产生了NP组织特异性原纤毛敲除(KO)小鼠系，其中原纤毛从NP组织中缺失。用引物lox2F(5’-GACCACCTTTTTAGCCTCCTG-3’)(SEQ ID NO：5)和lox2R(5’-AGGGAAGGGACTTAGGAATGA-3’)(SEQ ID NO:6)鉴定loxP IFT88等位基因。

对于腰椎不稳定的小鼠模型(LSI)：2月龄的PTH1R^+/+和PTH1R^-/-雄性小鼠被用于本实验。在用氯胺酮和赛拉嗪麻醉后，通过切除第3腰椎-第4腰椎(L3-L4)棘突连同棘上韧带和棘间韧带来对小鼠手术，以诱导腰椎的不稳定。在手术后0周、2周、4周和8周将小鼠安乐死(n＝8只/组)。

对于剂量筛选实验，将17月龄的雄性C57BL/6J WT小鼠分配为用不同剂量的PTH或媒介物治疗的四个组：20μg/kg/d、40μg/kg/d和80μg/kg/d的人类PTH(1–34)(BachemCalifornia,Inc.King of Prussia,PA,USA.)组或媒介物组。我们选择PTH(1–34)的最佳剂量用于其余的实验。

将11月龄的PTH1R^+/+和PTH1R^-/-雄性小鼠随机分为四个组：PTH1R^+/++PTH(1-34)组、PTH1R^+/++媒介物组、PTH1R^-/-+PTH(1-34)组以及PTH1R^-/-+媒介物组(n＝8只/组)。将11月龄的IFT88^+/+和IFT88^-/-雄性小鼠随机分为四个组：IFT88^+/++PTH(1-34)组、IFT88^+/++媒介物组、IFT88^-/-+PTH(1-34)组以及IFT88^-/-+媒介物组(n＝8只/组)。每天用PTH(1-34)或媒介物(与PTH等体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1mM乙酸)皮下注射小鼠，每周5天，并且在用PTH(1-34)/媒介物治疗后4周处死所有小鼠。

将所有动物维持在约翰霍普金斯大学医学院的动物机构(Animal Facility ofthe Johns Hopkins University School of Medicine)中。用于这两个物种的实验方案被约翰霍普金斯大学(Johns Hopkins University),Baltimore,MD,USA的机构动物保护和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)审查并批准。

原代NP细胞的分离和培养。

将绿色荧光蛋白(GFP)标记的脊索来源的NP细胞从15日龄的如先前描述的Noto^Cre/+::ROSA26-lacZ^flox/flox雄性小鼠分离。NP细胞来自15日龄的PTH1R^+/+和PTH1R^-/-、IFT88^+/+和IFT88^-/-雄性小鼠。简言之，将细胞从在胸中部区域至下腰椎区域的脊柱中的IVD的NP区域分离，并且开始用TrypLE Express(Gibco)在振荡器上消化30分钟，随后在37℃用0.25mg/ml胶原酶-P(Roche)消化另外的30分钟。将消化的细胞用PBS洗涤两次，并且在37℃、5％CO₂和5％O₂在补充有10％胎牛血清(Atlanta Biologicals)和1％青霉素-链霉素(Mediatech)的α-MEM(Gibco)中培养至80％-90％汇合。

原纤毛的可视化和共定位分析。

在血清饥饿(DMEM、0.5％FBS、1％P/S)48小时后，通过免疫细胞化学研究NP细胞内的PTH信号传导组分的定位。将细胞用PTH(重组人类PTH，100nmol，Bachem California,Inc.King of Prussia,PA,USA.)或剪切应力(1dyn/cm²)以多次暴露处理30分钟，固定并且对原纤毛的乙酰化的α-微管蛋白、PTH1R(Abcam,1:100)和pCREP(Abcam,1:500)染色。将盖玻片用Fluoroshield-DAPI封片。使用配备有63×物镜的Zeiss LSM710 META共聚焦激光扫描显微镜对所有细胞成像。使用ImageJ软件手动选择感兴趣的区域。通过追踪跨越原纤毛的长度的线并且使用ImageJ软件测量沿该线的强度来进行沿纤毛的强度谱分析。对每个条件至少30个纤毛细胞测量了纤毛区域中的平均强度。

蛋白印迹分析和共免疫沉淀。

对来自体外培养的NP细胞或NP组织的蛋白质裂解物进行蛋白印迹分析，所述NP细胞或NP组织来自在PTH(1-34)治疗后特定时间点的小鼠以及具有腰椎间盘退化的不同年龄的人。将蛋白质提取物离心，上清液的浓度通过DC蛋白质测定(Bio-Rad Laboratories)评估，并且然后通过SDS-PAGE分离，并且印迹于聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad Laboratories)上。在特异性抗体中孵育之后，我们使用增强型化学发光试剂盒(Amersham Biosciences)检测到蛋白质。我们使用识别以下的特异性抗体检查裂解物中的蛋白质浓度：兔CTGF(CCN2)(Abcam,1:1000)、聚集蛋白聚糖(ACAN)(Abcan,1:1000)、p-Smad2(Cell SignalingTechnology Inc.,1:1000)、Smad2(Cell Signaling Technology Inc.,1:1000)、GAPDH(Cell Signaling Technology Inc.,1:1000)、CREB(Abcam,1:2500)、pCREB(Abcam,1:2500)、PTH1R PRB-635P(Covance,1:100)、PTH1R PRB-640P(Covance,1:500)和山羊整联蛋白β6(Santa Cruz,1:500)。对使用NE-PER细胞核和细胞质提取试剂盒(Pierce ThermoScientific,78833)从用PTH(1-34)或媒介物处理的体外培养的NP细胞提取的细胞核和细胞质蛋白质进行共免疫沉淀分析。用抗pCREB抗体(Abcam,1:500)和抗PTH1R抗体(Abcam,1:500)揭示了PTH1R和pCREB表达。

染色质免疫沉淀(ChIP)测定。

ChIP测定使用Thermo Fisher ChIP试剂盒(目录号：26156)进行。来自NP细胞的粗匀浆在室温用1％甲醛交联10min。通过添加甘氨酸(0.25M)终止反应。在离心后，收集沉淀物并且将其在包含蛋白酶抑制剂混合物的SDS裂解缓冲液中裂解。对裂解物超声，直到DNA断裂成具有200bp-1,000bp的平均长度的片段。将这些样品首先用蛋白G琼脂糖预清洗，并且然后用2mg的兔抗pCREB抗体(CST,1:50)进行免疫沉淀过夜，或用2mg的正常兔血清在4℃过夜。用于免疫沉淀的样品的10％-20％被用作输入(阳性对照)。在纯化后，DNA片段用表1中列出的用于β6启动子的引物使用实时PCR来扩增。

表1

cAMP测定和ELISA分析。

对于cAMP测定，使汇合的细胞通过在37℃在无血清α-MEM中孵育而饥饿过夜的35-mm六孔板中生长。然后用100nM的人类PTH(1–34；Bachem California,Inc.)处理细胞1h。提取细胞cAMP并且用Biotrak酶免疫测定系统(GE Healthare,Inc.,Princeton,HJ)测量浓度。我们使用ELISA开发试剂盒(R&D Systems)根据制造商的说明确定了NP组织中总TGF-β和活性TGF-β的浓度。

定量性RT-PCR

在蛋白质提取后，使用TRIzol试剂(Invitogen)根据制造商的说明制备来自相同组的小鼠的用于RNA提取的样本。RNA的纯度通过测量260nm和280nm处的吸光度来测试。对于qRT-PCR，使用SuperScript第一链合成系统(Invitrogen)将两微克的RNA逆转录成cDNA，并且在热循环仪中用SYBR Green-Master混合物(Qiagen)分析，两组引物对每种靶基因是特异性的。通过方法计算每种基因的相对表达，GAPDH用于归一化。用于qRT-PCR的引物在表2中列出。

表2

免疫细胞化学、免疫荧光和组织形态计量法(histomorphometry)。

对于免疫细胞化学染色，我们将共染色的GFP标记的NP细胞与抗兔PTH1R PRB-635P的一级抗体(Covance,1:100)孵育1h，并且随后在室温用与荧光缀合的二级抗体染色。在安乐死时，我们解剖腰椎并且将腰椎固定在10％缓冲的福尔马林中48h，在10％EDTA(pH7.4)中使其脱钙14天-21天，并且将其包埋在石蜡或最佳切割温度(OCT)化合物(SakuraFinetek)中。处理L1-L6脊柱的四微米厚的冠状方向的切片用于番红O和固绿染色(safranin O and fast green staining)。使用标准方案进行切片的免疫染色，并且将切片与针对以下的一级抗体在4℃孵育过夜：兔ACAN(Abcam,1:100)、CCN2(Abcam,1:100)、整联蛋白β8(Abcam,1:200)、pCREB(Abcam,1:100)和PTH1R PRB-635P(Covance,1:100)、小鼠pSmad2/3(Santa Cruz,1:100)、整联蛋白αvβ6(Millipore,1:100)、整联蛋白αvβ3(Bioss,1:100)、整联蛋白αvβ5(Bioss,1:100)。对于免疫组织化学染色，随后使用辣根过氧化物酶-链霉亲和素检测系统(Dako)检测免疫活性，随后用苏木精(Sigma-Aldrich)复染。对于免疫荧光测定，将载玻片与用荧光缀合的二级抗体在室温孵育1h，同时避光。我们使用相同的浓度和条件的同种型匹配的对照，诸如多克隆兔IgG(R&D Systems,AB-105-C)作为阴性对照。我们对切片微摄影以对脊柱的L3-L4的整个区域进行组织形态计量法测量(OlympusDP71)。

用Image-Pro Plus软件6.0版(Media Cybernetics Inc)以盲法进行定量组织形态计量法分析。如先前描述的67，获得IVD组织学评分。每组中每只小鼠的五个随机选择的L3-L4层(level)处的切片被选择用于定量组织形态计量法分析。通过对NP区域中阳性染色细胞的数目与总细胞的数目计数来获得pSmad2/3阳性细胞和pCREB阳性细胞的百分比。通过测量每组中L3-L4的阳性面积与整体面积来计算CCN2和ACAN阳性染色的面积百分比。

传播相衬微断层摄影术扫描。

基于同步辐射扫描的传播相衬微断层摄影术(PPCT)在中国的上海同步辐射装置(SSRF)中以BL13W1生物医学光束线进行(图7A)。为了获得高的X-射线衰减对比度图像，将单色X-射线能量调整至15keV，将扫描仪设置在15keV的电压，将暴露时间设置为2.5s，并且将样品到检测器的距离(SDD)调整至30cm，并且分辨率为每像素3.7μm。这些图像分别使用GPU-CT-Reconstructio软件(通过BL13W1实验站应用)和VG Studio Max3D软件(2.1版,Volume Graphics GmbH,Germany)重建并分析。感兴趣的区域被定义为覆盖整个L3-L4区(compartment)。对IVD的3D定量分析用商购可得的Image Pro Analyzer 3D软件(7.0版,Media Cybernetics,Inc.,USA)进行。分析了3D结构参数的IVD的平均高度和体积以及厚度分布。从骨髓对L4的小梁骨分段并且对小梁骨分析以确定小梁骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数目(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。

基于PPCT的3D有限元测试。

对于每个模型，首先对L3-L4的一个运动区段(segment)的PPCT图像进行噪声消除，并且使用通过判别分析获得的阈值来进行二值化。然后根据分段结果重建骨组织(包括软骨终板)和IVD的3D几何模型，诸如图9A、图9C中示出的。对于骨组织模型，由于大量的小梁微结构，使用几何实体模型可能导致一些拓扑学误差和不期望的几何特征，因此需要用一些几何修复和优化操作预处理。随后，有限元网格模型可以直接通过VG Studio Max 3D软件中的自适应网格工具通过来自几何实体模型的10节点二次四面体元离散化。根据先前的研究设置组织的材料性质。最后，在ABAQUS(Dassault Systèmes Americas Corp,Waltham,MA,USA)中进行有限元分析(FEA)。对于每个模型，将L3的上表面和L4的下表面用刚性杆固定，诸如图9B中示出的橙色部分，其可以精确地施加扭矩载荷以模拟四个不同方向上的运动：背屈、前屈、左侧屈和右侧屈测量。最后，计算每个运动区段的所得的运动范围(ROM)。

体内微MRI。

用配备有与B0磁场正交定位的定制的、单匝卷线圈(single-turn volume coil)的水平30-cm-孔径9.4T Bruker Biospec临床前扫描仪进行体内脊柱IVD成像。小鼠的麻醉用4％异氟醚开始，并且用2％异氟醚和氧气混合物维持。将小鼠仰卧地放置在托盘上，并且用胶带粘住以最小化运动伪影。我们使用弛豫增强(RARE)序列以以下参数获得T2加权图像：回波时间/重复时间(TE/TR)为15.17ms/3,000ms、35个0.35mm的厚度的切片、视场(FOV)为1.75cm×1.75cm并且矩阵大小为256×128。将所有T2加权图像处理成最终矩阵大小为256×256，而各向同性分解为0.068mm像素-1。为了将信号强度定量为椎间盘组织水合的指示物，选择每组中在L3-L4层处的感兴趣的区域并且使用Image-Pro Plus软件6版测量。

统计学。

将数据表示为平均值±s.d。我们使用非配对双尾学生t-检验用于两组之间的比较，并且使用单向方差分析(ANOVA)与Bonferroni事后检验用于多重比较。所有数据证明了组之间的正态分布和相似的变化。将显著性水平设置在P<0.05。使用SPSS 22.0分析软件(SPSS Inc.)进行所有数据分析。

实施例1

TGF-β活性在IVD在衰老期间退化时降低。

我们系统地检查了IVD在衰老期间的变化。使用基于同步辐射的传播相衬微断层摄影术(PPCT)使IVD的三维(3D)变化可视化，示出了2月龄的小鼠和18月龄的小鼠中具有相邻椎的IVD(上方)和完整IVD(下方)的3D图像(图1A和图7)。18月龄的小鼠中IVD的高度和体积相对于2月龄的小鼠显著减少(图1B)。类似地，3D图像中五个不同的IVD区域(特别是后部区域)内的厚度分布随衰老而减少(图1C、图1D和图7)。如通过对18月龄的小鼠的IVD切片的番红-O染色可视化的，NP细胞的数目也显著减少，而作为退化的指示物的IVD评分增加(图1E、图1F)。免疫组织化学染色证明，18月龄的小鼠中IVD的聚集蛋白聚糖(ACAN)、结缔组织生长因子(CTGF/CCN2)⁺、和pSmad2/3⁺细胞的水平相对于2月龄的小鼠显著降低(图1G、图1H)。蛋白印迹分析验证了18月龄的小鼠中pSmad2/3的减少(图1I)。我们的结果示出在衰老的IVD退化期间，活性TGF-β的减少与其下游合成代谢CCN2-ECM级联有关。

实施例2

PTH在NP细胞中直接诱导cAMP产生和CREB的磷酸化。

我们检查了PTH在NP细胞中是否直接活化其下游信号传导，因为在两栖动物中进化的PTH腺表明其用于脊椎动物对陆地的适应的功能。L3-L4盘切片的免疫染色示出PTH1R在NP细胞(棕色区域)中表达(图2A)。蛋白印迹分析进一步证明了NP和AF中PTH1R的表达(图2B)。为了验证在NP细胞中的PTH1R表达是脊索来源的，我们将ROSA26-GFP^flox/flox小鼠与Noto^Cre小鼠杂交，以产生在脊索细胞谱系中具有GFP荧光的小鼠(NotoCre::ROSA26-GFP)。从Noto^Cre::ROSA26-GFP小鼠分离的GFP⁺IVD细胞与PTH1R共定位(图2C，上图)，并且IVD切片的免疫荧光染色也证明PTH1R与NP区域中的GFP⁺细胞共定位(图2C，下图)，这证实PTH1R在脊索来源的NP细胞中表达。

为了阐明PTH是否刺激下游细胞内信号传导，我们测量了NP细胞中PTH诱导的环腺苷一磷酸(cAMP)产生的水平。NP细胞中的cAMP水平在用PTH(1-34)(100nmol)处理30分钟时达到峰值(图2D)。NP区域中pCREB+细胞的数目在处理30分钟时增加，并且在处理后1小时达到峰值(图2E、图2F)。蛋白印迹分析也证明，在30min时PTH在NP细胞中诱导的CREB的磷酸化(图2G)。重要的是，在患者腰IVD样本的蛋白印迹分析中，人类NP细胞和AF细胞中的PTH1R蛋白水平在年轻人和成人中是相对低的，但在衰老期间显著增加(图2H)。类似地，NP组织中PTH1R mRNA表达的水平在年轻成人中是相对低的，并且随衰老增加。(图2I)。总之，这些结果揭示具有维持IVD的潜在功能的NP细胞在衰老期间的PTH直接信号传导。

实施例3

iPTH通过诱导整联蛋白αvβ6的表达以活化TGF-α来减轻椎间盘退化。

为了检查间歇性PTH(iPTH)对IVD退化的潜在作用，我们以不同的剂量每天用PTH(人类PTH(1-34)的C-末端截短的合成类似物)注射成年小鼠，持续8周。iPTH 40μg/kg和80μg/kg显著改善了IVD形态，并且选择40μg/kg的剂量用于其余的研究(图8A、图8B)。具体地，18月龄的小鼠中IVD高度和体积在有iPTH的情况下相对于媒介物小鼠增加(图3A、图3B)，并且骨体积(BV/TV)和连接性(Tb.Con)增加(图8C、图8D)。此外，在3D图像中在具有iPTH的五个不同的区域，特别是IVD的中央区中，IVD厚度显著增加(图3C、图3D)。腰IVD的MRI信号强度在有iPTH注射的情况下显著增加(图3E、图3F)。NP细胞的数目在IVD评分降低的情况下显著增加(图3G、图3H)，并且聚集蛋白聚糖和CCN2⁺的水平在有iPTH的情况下增加(图3I、图3J)。此外，pSmad2/3⁺NP细胞的数目在有iPTH治疗的情况下增加(图3I、图3J)，指示PTH在IVD中诱导TGF-β的活化。事实上，活性TGF-β的水平在有iPTH治疗的IVD中增加，而总TGF-β水平在ELISA中没有变化(图3H、图3L)。蛋白印迹分析证实pSmad2在有iPTH的情况下增加(图3M)。

为了确定PTH在IVD中诱导TGF-β活化的机制，我们检查了PTH是否增加介导潜伏TGF-β活化的αvβ整联蛋白的表达。分别用抗αvβ3、αvβ5、αvβ6和β8的单独抗体对从iPTH或媒介物治疗的18月龄的小鼠制备的IVD切片免疫染色，并且将整联蛋白水平与2月龄的小鼠的整联蛋白水平比较。结果示出，18月龄的小鼠中αvβ5和αvβ6整联蛋白的表达相对于2月龄的小鼠显著减少，而αvβ3和β8的表达水平保持相对不变。重要的是，PTH在18月龄的小鼠中仅显著增加αvβ6水平(图3N、图3O)。为了验证通过iPTH对αvβ6整联蛋白的调控，我们进行了qRTPCR以定量PTH治疗对单独的整联蛋白mRNA表达的作用。一致地，PTH在成年小鼠的NP细胞中特异性地诱导β6整联蛋白的mRNA表达(图3P)。PTH还以时间依赖性的方式显著刺激β6整联蛋白的蛋白质水平(图3Q)。因此，PTH通过增加NP组织中αvβ6表达来活化潜伏TGF-β，提供了针对腰椎间盘疾病的潜在的治疗靶。

为了确定PTH诱导的β6整联蛋白基因转录的机制，我们用β6整联蛋白启动子中的4个不同的潜在pCREB结合位点(引物1、2、3和4)进行了染色质免疫沉淀测定。免疫沉淀结果揭示了，pCREB特异性地结合至β6整联蛋白启动子中最远端的CREB位点(引物1)(图3R、图3S)。总之，这些结果证明PTH通过诱导pCREB与NP细胞中的β6整联蛋白启动子的直接结合来活化β6整联蛋白的表达。

实施例4

NP细胞中PTH1R的条件性敲除加速衰老期间的椎间盘退化。

为了研究衰老期间PTH信号传导在NP细胞中的作用，我们将Noto^Cre小鼠与PTH1R^flox/flox小鼠杂交，以使脊索来源的NP细胞中的PTH1R基因特异性地缺失(Noto^Cre::PTH1R^flox/flox，此后称为“PTH1R KO小鼠”)。PTH1R表达不能在PTH1R KO小鼠的椎间盘切片的NP细胞中检测到(图4A)。用PPCT评估了不同年龄的PTH1R KO小鼠及其野生型同窝小鼠的IVD变化。我们发现，IVD体积从6个月龄开始相对于其年龄匹配的野生型同窝小鼠(在下文被称为“PTH1R^+/+小鼠”)减少，而PTH1R KO小鼠的IVD体积在出生后和成年时保持正常(图4B、图4C)，表明PTH在维持衰老期间的IVD的功能的关键作用。在人类中，也仅在衰老人群的IVD中观察到较高水平的PTH1R表达(图2I)。为了评估IVD功能，基于PPCT图像采集的3D有限元分析模型被用于IVD柔韧性测试，包括背屈、前屈、左侧屈和右侧屈(图4D、图4E)。IVD在所有方向上的柔韧性示出在PTH1R KO小鼠中从6个月开始显著地进行性减少(图4F)。此外，我们通过切除与腰椎相邻的椎间韧带产生了脊柱不稳定的小鼠模型，以评估PTH是否在不稳定的机械载荷环境下调控椎间盘的功能(图4G)。在手术后4周，2月龄的PTH1R^-/-小鼠的IVD体积减少，这比稳定模型中的IVD体积减少要早得多，在稳定模型中显著减少开始于6月龄并且在12个月时非常明显(图4H、图4I)。

然后我们检查了NP细胞中PTH1R的缺失是否能够影响iPTH对IVD的合成代谢作用。在12月龄的PTH1R^+/+小鼠中通过iPTH增加的IVD体积在PTH1R KO小鼠中消除(图4J、图4K)。此外，蛋白印迹分析示出，在PTH1R KO小鼠的NP组织中观察到的PTH诱导的pSmad2、ACAN和CCN2水平的增加减少(图4L)。通过qRT-PCR，PTH显著地增加了野生型小鼠的NP细胞中ACAN和CCN2的mRNA表达，而在PTH1R KO小鼠中是迟钝的(图4M)。

因此，NP细胞中的PTH信号传导对于椎间盘内稳态是至关重要的，特别是在衰老期间。

实施例5

PTH刺激PTH1R向NP细胞的纤毛的转运。

为了了解机械应力是否调控NP细胞中的PTH信号传导，我们研究了NP细胞中的原纤毛是否调控PTH信号传导，因为PTH1R是一种GPCR并且存在于原纤毛中。对乙酰化的微管蛋白的免疫染色证明，原纤毛存在于野生型小鼠的NP细胞中，并且PTH1R KO小鼠中的原纤毛的长度显著减少(图5A、图5B)。重要的是，从10分钟开始，PTH显著地刺激PTH1R向纤毛的移位(图5C、图5D)。pCREB与乙酰化的微管蛋白的共免疫染色也揭示了纤毛中的pCREB增加(图5E、图5F)，表明纤毛调控PTH信号传导。为了检查PTH1R和pCREB是否形成复合物，用抗pCREB抗体共免疫沉淀并且用PTH1R印迹证明了PTH1R和pCREB之间的相互作用仅在包含纤毛的细胞质乙酰化的微管蛋白提取物中(图5G)。类似地，用抗PTH1R抗体的共免疫沉淀示出该相互作用仅存在于细胞质乙酰化的微管蛋白提取物中(图5H)。

然后我们检查了机械应力是否通过纤毛调控PTH信号传导。对NP细胞施加剪切应力，并且PTH1R向纤毛的移位被剪切应力显著增强(图5I、图5J)。苍白蛋白介导蛋白质向纤毛的转运。因此我们用siRNA敲除苍白蛋白以验证PTH增强的PTH1R向纤毛的移位。苍白蛋白的敲除阻断了PTH增强的PTH1R向纤毛的转运和CREB的磷酸化(图5K-图5M)。总之，PTH刺激PTH1R向原纤毛的转运并且剪切应力增强该转运。

实施例6

纤毛的破坏减少NP细胞中的IVD体积、PTH信号传导和TGF-β活性。

为了检查纤毛维持IVD功能的作用，我们将IFT88^flox/flox小鼠与Noto^Cre/+小鼠杂交以产生在NP细胞中的纤毛被特异性破坏的IFT88::Noto-Cre小鼠(IFT88^-/-)。相对于其野生型小鼠，IFT88^-/-小鼠的IVD体积在NP细胞中的纤毛被特异性破坏的情况下显著减少(图6A、图6B)，并且因此IVD评分增加(图6A、图6C)。此外，IFT88^-/-小鼠中iPTH增加的IVD体积相对于其野生型小鼠是迟钝的(图6A、图6B)，并且iPTH对IVD评分的提高也受损(图6A、图6C)。为了验证机械应力通过PTH1R向纤毛的转运来调控PTH信号传导，我们检查了PTH是否刺激原纤毛被破坏的NP细胞中的CREB磷酸化。蛋白印迹分析示出，在野生型小鼠中，PTH显著刺激CREB的磷酸化并且剪切应力增强磷酸化(图6D)，然而，原纤毛的破坏显著地降低了由PTH或剪切应力引起的IFT88^-/-NP细胞中的CREB磷酸化水平。重要的是，免疫组织化学染色证明，在野生型小鼠中相对于媒介物，PTH显著地刺激pSmad2/3⁺NP细胞的数目和CCN2和聚集蛋白聚糖的水平，并且该作用通过IFT88^-/-小鼠的NP细胞中纤毛的特异性破坏而钝化(图6E-图6H)。这些数据证明机械应力经由原纤毛增强NP细胞中的PTH信号传导，以维持IVD功能。

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序列表

<110> 约翰霍普金斯大学

<120> 甲状旁腺激素和退行性椎间盘疾病的再生

<130> P13213-03

<150> 62/453,044

<151> 2017-02-01

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列

<400> 1

tggacgcaga cgatgtcttt acca 24

<210> 2

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<212> DNA

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<223> 合成序列

<400> 2

acatggccat gcctgggtct gaga 24

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<212> DNA

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<223> 合成序列

<400> 3

caaatagccc tggcagat 18

<210> 4

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<212> DNA

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<223> 合成序列

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tgatacaagg gacatcttcc 20

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<212> DNA

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<223> 合成序列

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gaccaccttt ttagcctcct g 21

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<212> DNA

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<223> 合成序列

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agggaaggga cttaggaatg a 21

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<212> DNA

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cagatggcac cctccgatac 20

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gacacacctc ggaagcagaa 20

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<212> DNA

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ccgccaaccg caagatc 17

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accgacccac cgaagaca 18

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actgtgaagg cgcagaatca 20

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tgcctctatc cagtcgacca 20

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ctcccttctt ccctcccctc 20

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atctcgatta cgggacacgc 20

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gccaagttcc aaagtgagcg 20

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ctaccaggtc ccttagggct 20

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ctcacgggta cagtaacgca 20

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ccacaaaaga gccaaagccc 20

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ttatgcagca gagccccatc 20

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caagacggaa gtcacgggaa 20

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aatgtgtccg tcgtggatct ga 22

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agtgtagccc aagatgccct tc 22

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tgtgctgttc caacctct 18

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ttcctgaaga acaccctg 18

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ttgaaacgaa ccctgaaa 18

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agtgtagccc aagatgccct tc 22

Claims (9)

1.一种组合物，用于治疗受试者中的IVD退化和/或LDD，所述组合物包含有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

2.一种组合物，用于使受试者中老化的椎间盘(IVD)再生，所述组合物包含有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

3.一种组合物，用于增加受试者的IVD中的髓核(NP)和/或纤维环(AF)和/或软骨终板(EP)的总组织体积，所述组合物包含有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

4.一种组合物，用于减少受试者的IVD中的NP细胞凋亡，所述组合物包含有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

5.一种组合物，用于增加受试者的IVD的NP细胞中的活性TGF-β的水平，所述组合物包含有效量的甲状旁腺激素(PTH)或其功能片段或类似物。

6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述PTH或其功能片段或类似物与药学上可接受的载体一起被施用。

7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述PTH或其功能片段或类似物选自由以下组成的组：PTH(1-28)、PTH(1-31)、PTH(1-34)、PTH(1-37)、PTH(1-38)、PTH(1-41)和重组rPTH(1-34)。

8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述PTH或其功能片段或类似物以10mg/kg/天至500mg/kg/天之间的剂量被施用。

9.如权利要求8所述的组合物，其中所述PTH或其功能片段或类似物经肌肉内、皮内或腹膜内施用。