CN110507642B

CN110507642B - 靶向菌毛黏附素YadC的宿主受体ANXA2用于改善急性下尿路感染

Info

Publication number: CN110507642B
Application number: CN201910957083.6A
Authority: CN
Inventors: 王荃; 李晓; 裴庚
Original assignee: Tianjin Medical University
Current assignee: Tianjin Medical University
Priority date: 2019-10-10
Filing date: 2019-10-10
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2039-10-10
Also published as: CN110507642A

Abstract

本发明涉及靶向尿路致病性大肠杆菌的菌毛黏附素（YadC）的宿主受体——膜联蛋白A2（annexin A2,ANXA2）的治疗药物在改善急性下尿路感染中的应用。通过细胞生物学实验和动物实验证明了靶向菌毛黏附素YadC的宿主受体ANXA2的细胞内钙离子螯合剂BAPTA‑AM可有效阻止尿路致病性大肠杆菌对膀胱上皮细胞的黏附与侵袭，并在小鼠体内显著降低尿道致病性大肠杆菌在膀胱中的定植，具有改善尿路致病性大肠杆菌造成的急性下尿路感染的效果。

Description

靶向菌毛黏附素YadC的宿主受体ANXA2用于改善急性下尿路感染

技术领域

本发明涉及基于尿路致病性大肠杆菌的菌毛黏附素YadC的宿主受体ANXA2的治疗药物在改善急性下尿路感染中的应用，其中包括菌毛抗原类型YadC的确定，YadC在膀胱上皮细胞表面的受体ANXA2的鉴定，以及靶向宿主受体ANXA2的细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM的选取。

背景技术

尿道感染（urinary tract infections，UTIs）是最常见的细菌性感染疾病之一，病原细菌引起的尿道感染会导致急性单纯性膀胱炎、急性单纯性肾盂肾炎、复杂性尿道感染、反复发作性尿道感染等临床常见泌尿系统感染性疾病。据报道，大约40%的女性和12%的男性在一生中至少会经历一次有症状的尿道感染，其中10%的女性会在感染后的6-12个月中再次复发感染。统计数据表明，全球每年有超过一千多万的泌尿系统感染病例。泌尿系统感染也是重要的医院感染之一，占美国医院感染及菌血症的首位。病原细菌引起的泌尿系统感染也带来了巨大的社会经济负担，仅以美国的统计数据为例，每年花费在其治疗方面的费用达到35亿之多。因此，预防和控制泌尿系统病原细菌的感染是全球亟待解决的问题。

造成泌尿系统感染的病原细菌主要为革兰氏阴性细菌，包括大肠杆菌，变形杆菌，普罗维登斯氏菌，铜绿假单胞菌等。能够引发尿路感染的大肠杆菌被命名为尿路致病性大肠杆菌（Uropathogenic Escherichia coli, UPEC）。UPEC所造成的泌尿系统感染占单纯性感染的80%以上。泌尿系统感染细菌在人体中的生存环境较为特殊，病原细菌建立对宿主细胞的感染首先需要抵抗尿道中尿液的冲刷力，尿液和尿道上皮细胞产生的抗菌物质等，此外引起肾盂肾炎的泌尿系统致病细菌需要沿尿道上行至肾，因此泌尿系统病原细菌通常具有丰富的表面抗原，而菌毛抗原是满足细菌有效粘附和系统性感染的关键作用因子。

尿路感染通常用抗生素治疗；然而在抗生素治疗后数周内，仍可在泌尿道中发现UPEC菌株，并且耐多药菌株也在逐年增加，突显了开发替代治疗策略的重要性。许多研究将注意力集中在针对负责UPEC定植的菌毛粘附素的抗粘附治疗上。目前已开发出一些抗粘附剂，例如用于1型菌毛的甘露糖苷和用于P菌毛的球形四糖，作为用于治疗UTI的非抗生素疗法。已证明甘露糖及其衍生物（甘露糖苷）是1型菌毛的黏附素FimH的受体类似物，可阻断UPEC在膀胱中的结合和定植，从而减弱UPEC的毒性。大多数UPEC菌株在感染过程中会表达多种类型的菌毛。因此，鉴定在UPEC致病性中重要的其他菌毛粘附素和针对该菌毛粘附素的抗粘附治疗（包括多种药物）将更为有效。

发明内容

本发明的目的在于建立一种改善急性下尿路感染的方法，即靶向菌毛黏附素YadC的宿主受体ANXA2的细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM。本发明公开的实施方式满足了这一目的。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

基于尿路致病性大肠杆菌的菌毛黏附素YadC的宿主受体ANXA2的治疗药物在制备改善急性下尿路感染药物中的应用；所述的治疗药物指的是靶向菌毛黏附素YadC的宿主受体ANXA2的细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM。所述的BAPTA-AM指的是：1,2-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸）。所述的急性下尿路感染指的是：尿道致病性大肠杆菌造成的急性下尿路感染。

本发明进一步公开了基于尿路致病性大肠杆菌的菌毛黏附素YadC的宿主受体ANXA2的治疗药物的组合物，其特征在于添加药学上可接受的药用辅料制备成硬胶囊、软胶囊、片剂、颗粒剂、散剂、混悬剂或糖浆，其中所述片剂包括：分散片、含片、咀嚼片或泡腾片。

组合物可配制成片剂、分散片、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、溶液剂或胶囊。为制备口服药物组合物可采用乳糖或淀粉做载体，明胶，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等是合适的粘合剂。作为崩解剂可选用淀粉或微晶纤维素，常以滑石粉，胶体硅胶，硬脂酸甘油酯，硬脂酸钙或镁，聚乙二醇-4000，聚乙二醇-6000，焦亚硫酸钠等；作为合适的抗粘合剂和润滑剂。例如，可通过压制湿颗粒来制备片剂。活性成分与载体以及选择性的与一份崩解添加剂组成混合物，该混合物与粘合剂的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合适的设备中进行颗粒化，干燥颗粒随后加入其它的崩解剂，润滑剂和抗粘剂将此混合物压片。

本发明公开了UPEC的菌毛黏附素YadC在膀胱上皮细胞表面的宿主受体——膜联蛋白A2（annexin A2, ANXA2）。膜联蛋白A2广泛分布于各种细胞，包括内皮细胞，单核细胞和上皮细胞，并参与许多生化过程，例如细胞增殖，内吞，自噬和膜运输。ANXA2以钙依赖的方式可逆地结合到带负电荷的膜磷脂上，并主要以稳定的异四聚体形式存在于细胞膜上，该异源四聚体由ANXA2和p11（S100A10）两个分子组成，形成ANXA2 / p11复合物（A2t）。S100A10是EF手型Ca^{2 +}结合蛋白S100家族的成员，细胞内S100A10参与包括ANXA2在内的几种蛋白向质膜的运输。二者的结合发生在ANXA2的螺旋状N末端，在该复合物中，ANXA2可以保护S100A10免于被快速泛素化和降解，而S100A10则可以增加ANXA2的Ca^{2 +}敏感性及其结合膜和F-肌动蛋白的能力。ANXA2被鉴定为铜绿假单胞菌和病毒的潜在受体，据报道ANXA2和A2t与细菌和病毒感染上皮细胞有关。但是，尚未报道ANXA2在UPEC感染中的作用。质谱和co-IP实验均证实了体外纯化的YadC蛋白可以和细胞内源性ANXA2蛋白及体外纯化的ANXA2蛋白有直接的相互作用。

本发明公开了靶向ANXA2的细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM（有市售）指的是：（1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethylester)，1,2-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸）在改善急性下尿路感染中的作用。

BAPTA-AM的化学结构如下：

BAPTA-AM是一种细胞可渗透的细胞质钙螯合剂，对细胞没有损害，被广泛应用于研究与Ca^{2 +}相关色细胞的生理功能。研究发现BAPTA-AM：

1）具有细胞保护作用，主要体现在保护神经细胞的作用，抗氧化作用和抑制细胞凋亡；

2）护肝作用，BAPTA-AM对以大量细胞死亡为特征的疾病的救治研究已经获得国家专利（专利号ZL200310106055.2，宋必卫等）；

3）对心血管和呼吸系统也有重要影响，主要体现在舒张血管作用，治疗药源性心室纤颤，促进肺泡Ⅱ型细胞分泌表面活性物质。

BAPTA-AM及其衍生物有望成为中风、肝功能衰竭、呼吸窘迫综合征等严重疾患的重要抢救药物。但BAPTA-AM在UPEC引起的急性下尿路感染中的应用还未有报道。由于ANXA2以Ca^{2 +}依赖性的方式结合膜磷脂，并且有研究证明BAPTA-AM抑制可以ANXA2和S100A10蛋白的相互作用，减少A2t蛋白复合物的形成，因此我们将其用作阻碍ANXA2功能的抑制剂。体外结果显示使用靶向ANXA2的BAPTA-AM能显著降低UPEC对膀胱上皮细胞的黏附与侵袭；体内结果也证实了在UPEC感染C57BL/6J小鼠前给予BAPTA-AM膀胱局部处理后能显著降低细菌在膀胱的定植，改善急性下尿路感染。

本发明所述实施方式涉及用靶向ANXA2的细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM来改善急性下尿路感染的方法。

实施方式如下：

1） 5 μm BAPTA-AM预处理人膀胱上皮5637（ATCC HTB-9）细胞1 h后，以CFT073（ATCC 700928）和yadC缺失菌株（本实验构建，下述构建方法）感染5637细胞，通过涂板计数统计各组的黏附与侵袭菌量；

2）在UPEC经尿道感染小鼠前1 h给予小鼠2 mg/kg BAPTA-AM膀胱局部处理，24 h后处死小鼠取膀胱进行组织匀浆，通过涂板计数统计各组的定植菌量。

实施方式有效地改善急性下尿路感染，并避免了传统的基于抗生素的治疗方案的缺点。因而，当前的实施方式不会促成多重耐药性菌株的产生，不会对胃肠道中的微菌群有不利地影响。

附图说明

图1. YadC在体内外促进CFT073的致病性；

a：野生菌株（CFT073）、缺失菌株（ΔyadC）、回补菌株（ΔyadC p-yadC）感染5637细胞，通过涂板计数统计各组的黏附菌量；

b：野生菌株（CFT073）、缺失菌株（ΔyadC）、回补菌株（ΔyadC p-yadC）感染5637细胞，通过涂板计数统计各组的侵袭菌量；

c：野生菌株（CFT073）、缺失菌株（ΔyadC）、回补菌株（ΔyadC p-yadC）感染C57BL/6J小鼠12小时后，通过涂板计数统计各组的膀胱定植菌量；

d：野生菌株（CFT073）、缺失菌株（ΔyadC）、回补菌株（ΔyadC p-yadC）感染C57BL/6J小鼠24小时后，通过涂板计数统计各组的膀胱定植菌量；

图2. ANXA2蛋白与YadC蛋白具有直接相互作用；

a：Far-western blotting和LC-MS/MS质谱技术鉴定YadC在5637细胞表面的相互作用蛋白为ANXA2，箭头所指为质谱鉴定的条带；

b：免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, co-IP）技术检测纯化的FLAG-YadC蛋白与内源性ANXA2蛋白的相互作用；

c：co-IP技术检测纯化的FLAG-YadC蛋白与纯化的ANXA2蛋白的相互作用；

图3. 靶向受体ANXA2的BAPTA-AM在UPEC感染过程中的作用；

a：将图柱从左至右依次定义为1-4；1,3分别为野生菌株（CFT073）、缺失菌株（ΔyadC）、

在DMSO存在下感染5637细胞后计数的黏附菌量；2,4分别为野生菌株（CFT073）、缺失菌株（ΔyadC）在5 μmBAPTA-AM存在下感染5637细胞后计数的黏附菌量；

b：将图柱从左至右依次定义为1-4；1,3分别为野生菌株（CFT073）、缺失菌株（ΔyadC）、在DMSO存在下感染5637细胞后计数的侵袭菌量；2,4分别为野生菌株（CFT073）、缺失菌株（ΔyadC）在5μm BAPTA-AM存在下感染5637细胞后计数的侵袭菌量；

c：C57BL/6J雌鼠经尿道向膀胱注入2 mg/kg BAPTA-AM或DMSO处理，24小时后取膀胱组织进行H&E染色；

d：C57BL/6J雌鼠经尿道向膀胱注入2 mg/kg BAPTA-AM或DMSO处理，1小时后经尿道接种1×10⁸ CFU CFT073，24小时后处死小鼠取膀胱组织进行匀浆，计数的膀胱定植菌量；将图柱从左至右依次定义为1-4；1,3分别为野生菌株（CFT073）、缺失菌株（ΔyadC）、在DMSO存在下的膀胱定植菌量；2,4分别为野生菌株（CFT073）、缺失菌株（ΔyadC）在2 mg/kgBAPTA-AM存在下的膀胱定植菌量。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

实施例1

yadC缺失菌株的构建

所用方法为Red同源重组系统技术（具体方法参见利用 Red 重组系统敲除大肠杆菌O157∶ H7 的 waaL 基因，中国生物工程杂志 China Biotechnology， 2011， 31( 10) :83-87），所用到的质粒有pKD46、pKD3（有市售）；

1)设计用于同源重组的引物如下：

wq0573：TGGTAAAATATTAATCTTCACAGAGGAGTTAAAAATATTATGGGAATTAGCCATGGTCC

wq0574：GGAGTAGCTATAACAATGGCCAATAAATAATTTCCCGAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

2)PCR扩增含有yadC基因同源臂的氯霉素抗性片段；

3)pKD46 的转化， Red 重组系统的诱导表达及制备感受态细胞；

4)电转化；

5)筛选与鉴定

鉴定引物如下：

wq0575：AGCGCTGAATGTCACCTCTG

wq0576：AGCGTATCCTGATAAATGATGTTG

wq0636：GGAGTGAATACCACGACGAT

wq0637：ATTGGCTGAGACGAAAAACA

实施例2

YadC在体内外均促进CFT073的致病性

1)从菌种保存管中取少许菌液，划线接种于LB固体平板，37°C，过夜培养。

2)挑取平板上的单克隆菌落，接种于LB液体培养基，37℃，过夜培养。

3)取一定的菌液，5000 × g离心5分钟收集菌体，弃去上清，PBS洗，用细胞培养基或PBS重悬菌体。

4)以一定细菌MOI值去侵染5637膀胱上皮细胞1小时。弃去培养上清液，PBS洗3次，胰酶消化10分钟后加含血清培基终止，收集裂解液，进行梯度稀释，涂布于对应抗性LB固体平板，37℃过夜培养。12-16小时后，对平板进行菌落计数，即为粘附的菌落数；弃去培养上清液，PBS洗3次后加入含100 mg/ml庆大霉素的细胞培养基继续培养1小时，弃去培养上清液，PBS洗3次，0.2% Triton X-100裂解10分钟，裂解液以原液或10倍稀释液涂布于对应抗性LB固体平板，37°C过夜培养。12小时后，对平板进行菌落计数，即为侵袭的菌落数。

5)C57BL/6J小鼠以1.5%戊巴比妥钠麻醉后，以10⁸ CFU的细菌量经尿道接种至小鼠膀胱中，构建小鼠急性尿路感染模型。12、24小时后颈椎脱臼处死小鼠后无菌取出小鼠膀胱组织进行匀浆，梯度稀释，涂布于对应抗性LB固体平板，37℃过夜培养，菌落计数。

结果显示，yadC敲除后菌株侵染膀胱上皮细胞5637（图1. a-b）的能力和在小鼠膀胱上皮处的定植能力（图1. c-d）均显著减弱，而yadC回补菌株的能力恢复至野生菌株CFT073的水平。表明YadC在体内外均促进CFT073的致病性。

实施例3

ANXA2蛋白与YadC蛋白具有直接相互作用

1)利用Far-western blotting和LC-MS/MS技术鉴定YadC在5637细胞表面的相互作用受体。简要步骤为根据试剂盒步骤提取5637细胞的膜蛋白，经SDS-PAGE电泳将蛋白转印至PVDF膜上；体外纯化重组HA标签的YadC蛋白和空载体蛋白与膜共孵育，差异条带送质谱鉴定；

2)利用co-IP技术确定YadC和ANXA2的相互作用；

结果显示，利用Far-western blotting和LC-MS/MS技术鉴定YadC与5637细胞表面的ANXA2蛋白有相互作用（图2. a）；利用co-IP技术确定YadC和ANXA2之间有直接相互作用（图2. b-c）。

实施例4

靶向受体ANXA2的BAPTA-AM在UPEC感染过程中的作用；

1)收集过夜培养的细菌菌体，弃去上清，PBS洗，用相应的细胞培养基或PBS重悬菌体。

2)以DMSO和5μm BAPTA-AM预处理5637细胞1小时，再以不同菌株感染5637细胞1小时。与上述相同计数粘附和侵袭的菌落数。

3) 经尿道给予C57BL/6J雌鼠2 mg/kg BAPTA-AM膀胱局部预处理，1小时后经尿道接种10⁸ CFU UPEC菌株，24小时后处死小鼠取膀胱组织进行匀浆，梯度稀释，涂布于对应抗性LB固体平板，37℃过夜培养，菌落计数。

结果显示，与DMSO组相比，BAPTA-AM能显著降低野生菌株CFT073对膀胱上皮细胞5637的黏附与侵袭能力，而对yadC缺失菌株无影响（图3. a-b）；给予C57BL/6J雌鼠2 mg/kgBAPTA-AM 膀胱局部预处理不会引起膀胱的病理改变（图3. c），并且，与DMSO组相比，BAPTA-AM能显著降低野生菌株CFT073在膀胱的定植能力，而对yadC缺失菌株无影响（图3.d），说明靶向受体ANXA2的抑制剂BAPTA-AM可以用于改善UPEC造成的急性下尿路感染。

实施例5

取BAPTA-AM 8g，1,2-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸），药用淀粉50.0g，50%乙醇适量，制粒，整粒，烘干，装2#胶囊。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津医科大学

<120> 靶向菌毛黏附素YadC的宿主受体ANXA2用于改善急性下尿路感染

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggtaaaata ttaatcttca cagaggagtt aaaaatatta tgggaattag ccatggtcc 59

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggagtagcta taacaatggc caataaataa tttcccgaag tgtaggctgg agctgcttc 59

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcgctgaat gtcacctctg 20

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agcgtatcct gataaatgat gttg 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggagtgaata ccacgacgat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

attggctgag acgaaaaaca 20

Claims

1.基于尿路致病性大肠杆菌的菌毛黏附素YadC的宿主受体ANXA2的治疗药物在制备改善急性下尿路感染药物中的应用；所述的治疗药物指的是靶向菌毛黏附素YadC的宿主受体ANXA2的细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM，化学名称为：1,2-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸）。

2.权利要求1所述的应用，其中所述的急性下尿路感染指的是：尿道致病性大肠杆菌造成的急性下尿路感染。