CN110494152B - 短trail抗体及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供针对短TRAIL的抗体，更具体地，涉及能够中和短TRAIL的人源化短TRAIL抗体，所述TRAIL是指肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体。例如，本文提供使用一种或多种人源化短TRAIL抗体(例如通过TRAIL介导的细胞死亡、自然杀伤(NK)细胞毒性和/或CD8+T细胞杀伤)来诱导凋亡的材料和方法。

Description

短TRAIL抗体及使用方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2017年2月10日提交的美国专利申请系列号第62/457,614号以及2017年5月30日提交的美国专利申请系列号第62/512,627号的权益。在先申请的公开被认为是本申请公开的部分(且通过引用纳入本文)。
有关联邦资助的声明
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的AI120698下由政府资助完成。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
1.技术领域
本文涉及针对短TRAIL(即TRAILshort)的抗体，更具体地，涉及能够中和短TRAIL的人源化短TRAIL抗体，所述TRAIL是指肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体。例如，本文提供使用一种或多种人源化短TRAIL抗体来诱导凋亡的材料和方法。
2.背景技术信息
TRAIL是一种免疫调节蛋白，由免疫细胞及其它细胞表达，能通过与靶细胞上的TRAIL受体1(TRAIL-R1)或TRAIL-R2结合来杀灭被病毒感染的细胞或恶性细胞。短TRAIL是一种TRAIL剪接变体，其能阻断TRAIL介导的细胞死亡。TRAIL能结合五种同源受体——TRAIL-R1、R2、R3、R4或骨保护素中的一种，而只有与TRAIL-R1或R2的结合通过携带该受体的细胞的凋亡来诱导死亡(Wang和El-Deiry,2003Oncogene 22:8628-8633)。
发明内容
短TRAIL是一种新型的TRAIL剪接变体，能与TRAIL-R1(“R1”)和/或TRAIL-R2(“R2”)结合。当与R1和/或R2结合时，短TRAIL防止全长TRAIL诱导细胞死亡(Schnepple等,2011J Biol Chem 286,35742-35754)。
本文提供一种针对短TRAIL的抗体(例如抗短TRAIL抗体)，更具体而言是能够中和短TRAIL但又不结合全长TRAIL的人源化短TRAIL抗体。本文也提供制备和使用针对短TRAIL的抗体的材料和方法。例如，可使用一种或多种人源化短TRAIL抗体(例如通过TRAIL介导的细胞死亡、自然杀伤(NK)细胞毒性、CD8+T细胞杀伤、嵌合抗原受体(CAR)T细胞杀伤和/或溶瘤病毒疗法)来调节(例如增加或减少)凋亡。在一些情况下，可使用一种或多种人源化短TRAIL抗体来治疗癌症(例如膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、食道癌、头颈癌、肾癌、肝细胞癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、子宫癌、以及血液学癌症如B细胞恶性肿瘤)和/或慢性病毒感染(例如人类免疫缺陷病毒(HIV)感染)。
如本文所证明，短TRAIL的抗TRAIL效果可以用短TRAIL特异性抗体有效地中和。短TRAIL的中和通过TRAIL介导的细胞死亡、NK细胞毒性、CD8+T细胞杀伤、CAR T细胞杀伤和/或溶瘤病毒疗法有效地诱导凋亡。
一般地，本文的一个方面提供了结合短TRAIL的抗体。该短TRAIL抗体可包括包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述的互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)结构域；以及包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所述的CDR的轻链可变区(VL)结构域。VH结构域可包括与SEQ ID NO:6具有至少75％序列相同性的序列。抗体可以是包括SEQ ID NO:6所述的VH结构域序列的人源化抗体。重链可包括包含SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的序列。VL结构域可包括与SEQ IDNO:20具有至少75％序列相同性的序列。抗体可以是包括SEQ ID NO:20所述的VL结构域序列的人源化抗体。VL结构域可包括选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25和SEQ ID NO:26的序列。抗体可以是嵌合抗体(例如人源化抗体)。抗体可以是抗体的抗原结合片段。抗体可以是单克隆抗体。抗体可结合短TRAIL。抗体可中和短TRAIL。在一些情况下，抗体可以是双特异性的，例如可包括结合短TRAIL的抗原结合片段和结合另一抗原(如细胞表面抗原，也称为细胞表面标记物)的抗原结合片段。
在另一方面，本文提供了中和哺乳动物中的短TRAIL的方法。该方法包括以下步骤或基本上由以下步骤组成：给予哺乳动物本文所述的结合短TRAIL的抗体(例如如下抗体，其包括：包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述的CDR的VH结构域；以及包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所述的CDR的VL结构域)。所述哺乳动物可以是人。抗体可以是人源化抗体。
在另一方面，本文提供了在哺乳动物细胞中诱导凋亡的方法。该方法包括以下步骤或基本上由以下步骤组成：在抗体能有效地在哺乳动物细胞中诱导凋亡的条件下，给予哺乳动物本文所述的结合短TRAIL的抗体(例如如下抗体，其包括：包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和SEQ ID NO:3所述的CDR的VH结构域；以及包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所述的CDR的VL结构域)。所述哺乳动物可以是人。抗体可以是人源化抗体。凋亡可包括TRAIL诱导的凋亡。
在另一方面，本文提供了在哺乳动物细胞中增强NK细胞的细胞毒性、CD8+T细胞杀伤、CAR T细胞杀伤和/或溶瘤病毒疗法的方法。该方法包括以下步骤或基本上由以下步骤组成：在抗体能有效地在哺乳动物细胞中增强NK细胞的细胞毒性、CD8+T细胞杀伤、CAR T细胞杀伤和/或溶瘤病毒疗法的条件下，给予哺乳动物本文所述的结合短TRAIL的抗体(例如如下抗体，其包括：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述的CDR的VH结构域；以及包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所述的CDR的VL结构域)。所述哺乳动物可以是人。抗体可以是人源化抗体。
在另一个方面，本文提供了一种治疗感染的方法。该方法包括以下步骤或基本上由以下步骤组成：在抗体增强NK细胞的细胞毒性、CD8+T细胞杀伤、CAR T细胞杀伤和/或溶瘤病毒疗法的条件下，给予患有感染的哺乳动物结合短TRAIL的抗体(例如如下抗体，其包括：包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述的CDR的VH结构域；以及包含SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所述的CDR的VL结构域)。感染可以是慢性感染(例如HIV感染)。所述哺乳动物可以是人。抗体可以是人源化抗体。该方法也可以包括给予哺乳动物TRAIL激动剂(例如重组TRAIL、抗TRAIL-R1抗体、抗TRAIL-R2抗体或TRAIL寡聚体)。该方法也可以包括给予哺乳动物抗逆转录病毒疗法(例如阿巴卡韦、地达诺新、恩曲他滨、恩替卡韦、拉米夫定、司他夫定、富马酸替诺福韦二吡呋酯、扎西他滨、齐多夫定、地拉韦啶、依非韦仑、依曲韦林、奈韦拉平、利匹韦林、阿德福韦、替诺福韦、恩夫韦肽、马拉韦罗、度鲁特韦、埃替格韦、雷特格韦、贝韦立马、安普那韦、福沙那韦、茚地那韦、洛匹那韦、奈非那韦、利托那韦、沙奎那韦、阿扎那韦、达芦那韦、替拉那韦、TRIM5α、tat拮抗剂或天花粉蛋白)。
在另一个方面，本文提供了一种治疗癌症的方法。该方法包括以下步骤或基本上由以下步骤组成：在抗体在来自癌症的癌细胞中诱导凋亡的条件下，给予患有癌症哺乳动物结合短TRAIL的抗体(例如如下抗体，其包括：包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所述的CDR的VH结构域；以及包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所述的CDR的VL结构域)。癌症可以是例如宫颈癌、头颈癌、淋巴瘤、白血病、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌或B细胞恶性肿瘤。所述哺乳动物可以是人。抗体可以是人源化抗体。该方法也可以包括给予哺乳动物TRAIL激动剂(例如重组TRAIL、抗TRAIL-R1抗体、抗TRAIL-R2抗体或TRAIL寡聚体)。该方法也可以包括给予哺乳动物癌症治疗(例如化疗剂、放疗、近程治疗或手术)。癌症治疗是化疗剂时，化疗剂可以选自六甲蜜胺、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、洛莫司汀、美法仑、奥沙利铂、替莫唑胺、噻替哌、5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤和培美曲塞、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、放线菌素D、博来霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷、米托蒽醌、多西他赛、雌莫司汀、伊沙匹隆、紫杉醇、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、泼尼松、乙基泼尼松龙、地塞米松、L-天冬酰胺酶、硼替佐米、类视黄醇、维甲酸、贝沙罗汀、三氧化二砷、CHOP、R-CHOP、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、达妥昔单抗(dinutuximab)、司妥昔单抗(siltuximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、奥拉单抗(olaratumab)、地诺单抗(denosumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、利妥昔单抗(rituximab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、达雷木单抗(daratumumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、贝伦妥单抗维多汀(brentuximab vedotin)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、美坦新(emtansine)、阿帕替尼(apatinib)、卡博替尼(cabozantinib)、艾乐替尼(alectinib)、克唑替尼(crizotinib)、达沙替尼(dasatinib)、伊马替尼(imatinib)、尼罗替尼(nilotinib)、埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、托法替尼(tofacitinib)、考比替尼(cobimetinib)、曲美替尼(trametinib)、硼替佐米(bortezomib)、双硫仑、乳胞素、他莫昔芬(tamoxifen)、奥巴克拉(obatoclax)、纳维托克斯(navitoclax)、棉酚、依尼帕尼(iniparib)、奥拉帕尼(olaparib)、哌立福新(perifosine)、达拉非尼(dabrafenib)、维罗非尼(vemurafenib)、曲美替尼(trametinib)、阿贝西尼(abemaciclib)、帕博西尼(palbociclib)、瑞博西尼(ribociclib)、曲拉西尼(trilaciclib)、氟维司群(fulvestrant)、坦西莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、维罗非尼(vemurafenib)、曲美替尼(trametinib)、达拉非尼(dabrafenib)或维他拉肽(vintafolide)。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料来实施本发明，但是下面描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性，并不旨在构成限制。
在附图和以下描述中详细说明了本发明的一种或多种实施方式。通过说明书和附图以及权利要求书，不难了解本发明的其它特征、目的和优点。
附图说明
图1显示在未被感染的细胞和被HIV感染的细胞中均产生短TRAIL。通过Fluidigm技术评估来自HIV阳性患者(HIV+；N＝6)和HIV阴性对照(HIV-；N＝3)的原代CD4 T细胞中的单细胞基因表达。A)来自单个HIV阳性患者的单细胞中的TRAIL、短TRAIL的mRNA转录物的表达、mRNA水平和细胞表面标记物的代表性热图。B)HIV+和HIV-患者(Pts)的细胞中的HIVmRNA基因表达。C)HIV+和HIV-Pts的细胞中的HLA-DR基因表达。D)HIV+和HIV-Pts的细胞中的短TRAIL信使表达。E)HIV+和HIV-细胞中的短TRAIL表达，通过HIV基因的细胞表达测定。F)表达TRAIL或不表达TRAIL的单细胞中的短TRAIL表达。G)休眠(CD25-、CD38-和HLA-DR-)或激活(CD25、CD38和/或HLA-DR中任一种表达)情况下的短TRAIL表达。H)T细胞亚组中的短TRAIL表达——RTE：新近胸腺迁出细胞(recent thymic emigrants)；TCM：中央记忆T细胞；TEM：效应记忆T细胞；TTM：移行记忆T细胞。
图2显示I型干扰素促进短TRAIL的产生。就A、B和C而言，原代未被感染的休眠(CD25-、CD69-、HLA-DR-)CD4 T细胞未经刺激、或者用干扰素(A)、白细胞介素(B)或其它生物活性蛋白质(C)刺激，并且通过qRT-PCR检测短TRAIL mRNA。D)在样品间比较附随的TRAIL和短TRAIL mRNA表达。E)如所述刺激休眠CD4 T细胞，并通过Western印迹评估短TRAIL蛋白表达。F)用载剂对照、TLR 7、8或9激动剂或者TL9无活性对照处理PBMC24小时，并检测短TRAIL mRNA表达。G)与(F)中的类似地处理休眠的分离CD4 T细胞，并检测短TRAIL mRNA。H)如(F)中所述处理PBMC，并在24小时后分离CD4 T细胞，检测CD4亚组中的短TRAIL mRNA。数据所示为每种处理的5次独立实验的平均值(SEM)。认为P<0.05是统计学显著的。
图3显示短TRAIL的C末端在细胞外，与TRAIL“死亡”受体相互作用，但不与TRAIL“诱骗(decoy)”受体相互作用。A)TRAILFL和短TRAIL的外显子、细胞溶质、跨膜、胞外和3’非翻译区(UTR)的示意性比对。B)用抗c-myc抗体或同种型对照对瞬时表达在EC结构域内克隆有c-myc的短TRAIL的293T细胞进行染色。注解：涂灰(eGFP+短TRAIL myc，用同种型对照)；虚线(eGFP，抗myc)；实线(eGFP+短TRAIL，抗myc)。C)将来自瞬时表达C末端有FLAG标签的TRAIL R1或R2的293T细胞的裂解物与来自表达N末端有HA标签的TRAILFL或N末端有HA标签的短TRAIL的细胞的裂解物合并(如图上部所示)，然后用抗HA抗体免疫沉淀。将复合的蛋白质拆分，针对FLAG或HA进行免疫印迹。总输入裂解物示于下方的两张图中。D)将来自表达TRAIL诱骗受体R3和R4的293T细胞的裂解物与来自表达N末端有HA标签的TRAILFL或N末端有HA标签的短TRAIL的细胞的裂解物合并(如图上部所示)，然后用抗HA抗体免疫沉淀。将复合的蛋白质拆分，针对FLAG或HA进行免疫印迹。总输入裂解物示于下方的两张图中。E)通过ELISA测定短TRAIL与TRAIL受体R1、R2、R3和R4的结合。F)通过共聚焦显微镜观察短TRAIL与TRAIL受体R1、R2、R3和R4的结合。所示数据为4次独立实验的代表。
图4显示短TRAIL包含在胞外囊泡中。A)通过共聚焦显微镜分析瞬时表达GFP-短TRAIL的Jurkat T细胞，并计数被DAPI染色的细胞。B)针对HSP70(细胞溶质选择蛋白)或短TRAIL，分析被HIV感染的和未被感染的(NI)Jurkat T细胞的膜或细胞溶质组分。C)由被HIV感染的和未被感染的(NI)Jurkat T细胞制备细胞溶质、膜和上清液组分，并通过Western印迹用抗短TRAIL抗体进行分析。D)将来自经PHA刺激的CD4+细胞的胞外囊泡固定，并用磷钨酸染色，然后通过电子显微镜进行分析。比例尺，2μm。E)针对短TRAIL，通过Western印迹分析来自经PHA刺激的和未经刺激的CD4+细胞的胞外囊泡。F)来自瞬时表达HA-TRAILFL和HA-短TRAIL的293T细胞的纯化胞外囊泡制备物的Western印迹分析。G)来自单独转染eGFP-短TRAIL、单独转染Ruby-TRAILFL的293T细胞的上清液的胞外囊泡制备物的流式细胞术分析。H)使用来自单独转染HA-TRAILFL、单独转染HA-短TRAIL或以1:1或1:2的比例共转染HA-TRAILFL/HA-短TRAIL的293T细胞的上清液的胞外囊泡来处理靶Jurkat T细胞。通过针对切割的半胱天冬酶3对Jurkat细胞进行染色来测定凋亡活性。I)来自(H)的293T细胞中的胞外囊泡中的HA-TRAILFL和HA-短TRAIL表达的Western印迹确认。J)如所示将来自对照、被HIV感染和被模拟物感染的原代培养CD4 T细胞的上清液分离为微泡或外泌体组分，并通过Western印迹用短TRAIL特异性单克隆抗体进行分析。
图5显示短TRAIL对TRAIL的保护作用可转移至相邻细胞。A)将仅表达TRAILFL、仅表达短TRAIL或同时表达两者的效应293T细胞与CTO标记的靶Jurkat T细胞混合。孵育后，通过流式细胞术分析细胞，门选细胞示踪橙(Cell Tracker Orange,CTO)阳性(Jurkat)群，并针对活/死细胞进行染色。B)用1、2、5、10或20μg的N末端有HA标签的TRAILFL单独转染293T细胞，并通过Western用抗HA抗体进行分析。C)用1、2、5或10μg的短TRAIL和恒定为10μg的TRAILFL共转染293T细胞，并通过Western印迹进行分析。D)将来自(B)的用递增量的TRAILFL转染的293T效应细胞与CTO+靶Jurkat细胞共培养，并测定CTO+Jurkat细胞杀伤百分数。E)将来自(D)的用递增量的短TRAIL和恒定量的TRAILFL共转染的293T效应细胞与靶细胞共培养，并如(C)中所述进行分析。F)编码N末端有Ruby标签的短TRAIL(Ruby-短TRAIL)的质粒、编码缺失跨膜结构域的构建物(Ruby-短TRAILΔTM)的质粒、以及编码单独的Ruby标签的质粒的示意图(下方图)。用抗短TRAIL抗体和抗肌动蛋白对照对来自用这些构建物转染的293T细胞的裂解物进行Western分析(上方图)。G)用(F)中的构建物转染293T细胞，并展示代表性的显微照片(上方图)。收获来自293T转染细胞的上清液，用其处理靶HeLa细胞，然后通过共聚焦显微镜进行分析。所示为将DAPI染色的HeLa细胞核和ruby-短TRAIL或Ruby-短TRAILΔTM滤光通道相叠加的代表性的显微照片(下方图)。用来自表达Ruby短TRAIL的293T细胞的上清液处理的HeLa细胞只在质膜上具有点状的表面定位Ruby短TRAIL。H)用超级杀手(sk)-TRAIL对经来自用Ruby、Ruby-短TRAIL或Ruby-短TRAILΔTM转染的293T细胞的上清液预处理的来自(G)的HeLa细胞进行处理。通过活性半胱天冬酶3染色经时地对细胞杀伤进行定量。在最右的时间点，四条迹线从上到下为sk-TRAIL+Ruby、sk-TRAIL+Ruby-短TRAILΔTM、sk-TRAIL+培养基、sk-TRAIL+Ruby-短TRAILΔTM。数据为4次独立实验的代表。认为P<0.05是通过线性回归而统计学显著的。
图6显示短TRAIL包含PEST结构域，并且被泛素化和被蛋白酶体降解。A)用N末端有HA标签的短TRAIL转染293T细胞，用环己酰亚胺(100μg/mL)处理，并在指定时间通过Western分析用抗HA抗体进行分析。B)短TRAIL中推定的PEST结构域用短TRAIL的肽序列下方的“+”表示。C)将脯氨酸76到丙氨酸(P76A)的突变工程改造到短TRAIL的PEST结构域中，并如(A)中所述转染细胞、在环己酰亚胺的存在下进行分析。D)将有HA标签的短TRAIL转染至293T细胞中，用抗HA抗体免疫沉淀，然后用多种去泛素化酶(DUB)处理免疫沉淀物，这些DUB区分Lys48和Lys63的泛素连接(OTUB1、AMSH、OOTUD3、TRABID、OTUD7B、YOD1、Otulin或USP2)。处理好的样品通过SDS-PAGE分离，然后针对泛素进行免疫印迹。E)将用短TRAIL转染的293T细胞在MG132的存在下孵育指定的时间，然后收获并通过Western用抗短TRAIL进行分析。F)在P76A突变体中，短TRAIL表达增加。将短TRAIL和P76A短TRAIL转染至293T细胞中，并通过流式细胞术针对短TRAIL(下方图)或用同种型对照抗体(上方图)进行分析。所有数据都是至少3次独立实验的代表。
图7显示短TRAIL对于引发TRAIL抵抗是必要且充分的。A)在存在或不存在递增量的抗短TRAIL抗体的情况下，通过添加sk-TRAIL来诱导组成型表达短TRAIL的Jurkat T细胞的死亡。细胞死亡通过活性半胱天冬酶3染色来检测。对照细胞仅用递增的抗短TRAIL抗体进行处理。在最右的时间点，上方的四条迹线从上到下为5μg/mL抗短TRAIL、2.5μg/mL抗短TRAIL、1μg/mL抗短TRAIL和0μg/mL抗短TRAIL。B)在不存在或存在递增量的由与Fc融合的短TRAIL胞外结构域构成的融合蛋白(Ts-ECD:Fc)的情况下，通过添加sk-TRAIL，或者用牛血清白蛋白(BSA)对照来刺激不表达短TRAIL的HeLa细胞的死亡，并如(A)中所述进行分析。其它对照细胞仅用递增的短TRAIL-ECD:Fc进行处理。在最右的时间点，上方的五条迹线从上到下为0μg/mL抗短TRAIL-ECD:Fc、10μg/mL BSA、5μg/mL抗短TRAIL-ECD:Fc、2.5μg/mL抗短TRAIL-ECD:Fc和10μg/mL抗短TRAIL-ECD:Fc。数据为6次独立实验的代表。
图8显示短TRAIL的过表达减弱NK细胞的细胞毒性。A)显示Jurkat细胞中短TRAIL-EGFP-C1的过表达的Western印迹。B)将NK细胞与带CTO标记的Jurkat细胞共培养，并且针对活化的半胱天冬酶3进行染色。C)在短TRAIL或对照质粒的存在下，以递增的E:Tt比例用Jurkat细胞实施细胞毒性试验。在各情况下，EGFP-C1位于左侧，短TRAIL-EGFP-C1位于右侧。
图9包括流式细胞术，显示HIV IIIB在NK细胞中诱导短TRAIL的表面表达。将NK细胞与含有HIV IIB病毒或Gp120重组蛋白的培养上清液一起孵育，并针对短TRAIL和TRAILFL的表面表达进行染色。
图10包括显示短TRAIL不影响NK活化的图。将NK细胞与过表达短TRAIL的Jurkat细胞共培养(灰色柱)，分离并针对CD16、穿孔蛋白、CD107和CD69进行染色。
图11包括显示A)短TRAIL如何占据靶细胞上的TRAIL受体1和/或2从而防止TRAIL介导的细胞死亡；以及B)短TRAIL抗体如何能够与短TRAIL结合并将其阻断从而允许TRAIL结合R1或R2并诱导凋亡的示意图。
图12包括代表性的抗短TRAIL抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列。A.氨基酸序列比对，包括鼠VH(VH0)序列(SEQ ID NO:4)与4种人源化VH变体：VH1(SEQID NO:5)、VH2(SEQ ID NO:6)、VH3(SEQ ID NO:7)和VH4(SEQ ID NO:8)的比对。CDR用下划线标出。B.氨基酸序列比对，包括鼠VL(VL0)序列(SEQ ID NO:17)与4种人源化VL变体：VL1(SEQ ID NO:18)、VL2(SEQ ID NO:19)、VL3(SEQ ID NO:20)和VL4(SEQ ID NO:21)的比对。CDR用下划线标出。
图13包括人源化抗短TRAIL抗体的氨基酸序列。A.人源化重链HC0(SEQ ID NO:9)、HC1(SEQ ID NO:10)、HC2(SEQ ID NO:11)、HC3(SEQ ID NO:12)和HC4(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列。B.人源化轻链LC0(SEQ ID NO:22)、LC1(SEQ ID NO:23)、LC2(SEQ ID NO:24)、LC3(SEQ ID NO:25)和LC4(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列。
图14显示抗短TRAIL抗体(2.2)的体内给药可减少小鼠中白血病细胞的数量，并延长存活。A)显示第52天在小鼠中的代表性的荧光素酶表达的照片，所述小鼠在第27天用抗短TRAIL抗体(左方图)或同种型对照(IC；右方图)处理，并在翌日(例如第28天)用抗TRAIL受体2(抗DR5)抗体处理。B)为了灰度表示而作了优化的、显示第45天在小鼠中的荧光素酶表达的照片，所述小鼠在第27天用抗短TRAIL抗体(左方图)或同种型对照(IC；右方图)处理，并在翌日(例如第28天)用抗TRAIL受体2(抗DR5)抗体处理。C)显示小鼠中的荧光素酶表达的图，所述小鼠在第27天用IC或抗短TRAIL抗体处理，如点虚线所示，并在第28天用抗TRAIL受体2(抗DR5)抗体处理，如短划线所示。D)显示小鼠的存活百分数的图，所述小鼠在第27天用IC或抗短TRAIL抗体处理，如点虚线所示，并在第28天用抗TRAIL受体2(抗DR5)抗体处理，如短划线所示。E)显示小鼠中的荧光素酶表达的图，所述小鼠在第20、27和34天用IC或抗短TRAIL抗体处理，如点虚线所示。F)显示小鼠的存活百分数的图，所述小鼠在第20、27和34天用IC或抗短TRAIL抗体处理，如点虚线所示。
图15包括显示在不同的癌细胞系中抗短TRAIL抗体对sk-TRAIL细胞毒性的作用的图。将癌细胞与抗短TRAIL抗体2.2(Ts 2.2)或IgG3对照一起预孵育，然后向细胞中添加sk-TRAIL。在A)Jeko和HBL1淋巴瘤白血病细胞，B)L 3.6、BxPc3和Miapaca胰腺癌细胞，C)MeLa15、sk-mel-28、C32TG和A375黑色素瘤细胞，以及D)TYKNU、Kuramochi、hOvtax2、CaOv3、COV362、PEO1、OVCAR5和Ovcar8卵巢癌细胞中，经时地检测细胞死亡(半胱天冬酶3/7+)。当示出时，p值指的是单独的sk-TRAIL相对于添加抗短TRAIL抗体2.2时的sk-TRAIL的p值。
图16包括显示不同癌细胞中的短TRAIL(TRAIL-s)mRNA的定量的图。采用qRTPCR，使用TRAIL-s标准物来计算TRAIL-s的拷贝数。
图17包括显示用短TRAIL 2.2抗体染色的组织的免疫组织化学图。所示为正常组织和相应的短TRAIL染色阳性的癌组织的例子(上方图)。也显示了放大40倍的恶性样品(下方图)。与非恶性组织相比，胰腺癌、胃癌和前列腺癌组织的短TRAIL表达显著提高。
图18显示在组织微阵列的免疫组织化学中观察到短TRAIL表达。该图是用1:400稀释的抗短TRAIL抗体2.2实施的8份组织微阵列(TMA)的汇总。内圈表示阵列的短TRAIL染色为阳性的情况的百分数。外圈表示如下所述计算的免疫反应性评分：阳性组织的百分数(0-25％＝1、26-50％＝2、51-75％＝3、76-100％＝4)乘以染色的强度(阴性＝0、弱＝1、中等＝2、强＝3)。
图19显示短TRAIL在许多人类肿瘤中可见。显示了各种人类肿瘤中的短TRAIL水平，以每千个碱基的每百万读取(reads per kilobase million,RPKM)定量。数据由癌症基因组图谱(TCGA)测定。
图20显示在一些人类肿瘤中，递增水平的短TRAIL与较差的存活相关联。存活是通过卡普兰-迈耶(Kaplan Meyer)分析，针对患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(A)、结肠直肠腺癌(B)、嫌色性肾细胞癌(C)、胰腺癌(D)和胸腺瘤(E)的患者进行评估。示出P值
图21证实抗短TRAIL抗体与短TRAIL抗原相互作用。用编码绿色荧光蛋白(GFP)(上方一行)、GFP-短TRAIL(中间一行)或GFP-TRAILFL(下方一行)的质粒转染HEK293T细胞。将细胞用抗短TRAIL抗体、山羊抗小鼠藻红蛋白(PE)二抗(中间左列)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(中间右栏)染色。针对PE标记(红色；最左列)、GFP(绿色；中间左列)和被DAPI染色的细胞核(蓝色；中间右列)，通过共聚焦显微镜对细胞进行分析。也显示了将所有三种颜色叠加的合成图(合并；最右列)。
图22显示抗短TRAIL抗体克隆HC2LC3显示出3.8pM的亲和力，并且在sk-TRAIL(1ng/ml)的存在下显示出显著的协同杀伤。
图23显示一些患者衍生细胞对于抗短TRAIL抗体+sk-TRAIL有响应。将来自接受针对疑似血液恶性肿瘤的脾脏切除术的患者脾脏的细胞新鲜分离，不作处理(对照)或者以指定浓度(并且单独地或以指定组合)用超级杀手TRAIL(sk-TRAIL，寡聚化TRAIL激动剂)、人源化抗短TRAIL抗体(克隆HC2LC3)或同种型对照抗体(IgG4)处理。使用Incucyte活细胞成像平台，通过经时地分析活性半胱天冬酶3/7的活性来经时地监测细胞死亡。A)来自患有血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤的患者的结果(下方图显示有着相同诊断并显示出显著的短TRAIL表达的不同病例中的短TRAIL的IHC)。B)来自患有霍奇金淋巴瘤的患者的结果(下方图显示有着相同诊断并显示出最小的短TRAIL表达的不同病例中的短TRAIL的IHC)。C)来自患有复发B细胞淋巴瘤的患者的结果(下方图显示针对相同细胞的短TRAIL、TRAIL、DR4和DR5的流式细胞术)。D)来自患有套细胞淋巴瘤的患者的结果(下方图显示针对相同细胞的短TRAIL、TRAIL、DR4和DR5的流式细胞术)。E)来自患有非霍奇金淋巴瘤B细胞谱系/细胞周期蛋白D阳性的患者的结果。
图24包括显示在不同的人类患者衍生的癌细胞系中抗短TRAIL抗体对sk-TRAIL细胞毒性的作用的图。将来自患者脾脏的细胞新鲜收取在RPMI中，并在存在或不存在递增剂量的抗短TRAIL克隆HC2LC3(1.25、2.5或5μg)的情况下，在1ng/mL剂量的sk-TRAIL的存在下测试对于细胞毒性的敏感性，对照用相同剂量的人IgG4处理。在72小时内，每2小时通过切割的半胱天冬酶3/7阳性细胞的数量来监测细胞死亡。图A～I中所示的癌症的种类已标出。
图25显示在多种人类患者衍生的癌细胞系中，对于抗短TRAIL+sk-TRAIL的响应性高于对单独的sk-TRAIL的响应性。所示为以1ng/mL的剂量用单独的sk-TRAIL进行处理或者用sk-TRAIL(相同剂量)+5μg/mL剂量的抗短TRAIL克隆HC2LC3进行处理后48小时的死细胞数量。响应性定义为在添加抗短TRAIL抗体后死细胞数量的统计学上的显著增加。所示为针对配对t检验的统计。
图26显示人类患者衍生的细胞系对单独的抗短TRAIL或抗短TRAIL与sk-TRAIL的联用的响应性的结果概述。响应性定义为相对于单独的sk-TRAIL处理、死细胞数量的统计学上的显著增加。
图27显示对于抗短TRAIL有响应的细胞系中的短TRAIL表达增加。A)在各种响应性和非响应性细胞系中，使用实时qPCR进行短TRAIL mRNA的拷贝数的定量。B)用与CF555偶联的抗短TRAIL 2.2或同种型对3种细胞系进行染色，通过流式细胞术来检测短TRAIL阳性的百分数。
图28显示293T细胞及来自患者的肿瘤组织中的短TRAIL表达。所示为用1:400稀释的抗短TRAIL抗体对短TRAIL进行染色的免疫组织化学片。A)左列显示用EGFP转染的293T细胞(放大20倍)，右列显示用短TRAIL EGFP转染(放大20倍)并用对短TRAIL有特异性的抗体染色(显示为棕色)的293T细胞。上方一行是合成图，中间一行是染成蓝色的图的成分，下方一行是染成棕色(针对短TRAIL染色)的图的成分。B)放大20倍(左)和40倍(右)的胰腺癌患者组织。上方一行是合成图，中间一行是染成蓝色的图的成分，下方一行是染成棕色(针对短TRAIL染色)的图的成分。C)放大20倍(左)和40倍(右)的鳞状细胞癌患者扁桃体组织。上方一行是合成图，中间一行是染成蓝色的图的成分，下方一行是染成棕色(针对短TRAIL染色)的图的成分。
图29显示用抗DR5+抗短TRAIL抗体的组合有效地治疗植入了人Jurkat T细胞淋巴瘤细胞的NSG小鼠。每2周处理所建立的肿瘤，每14天用10mg/kg的(i)短TRAIL的同种型对照和DR5抗体的同种型(称为同种型)，(ii)抗短TRAIL抗体克隆2.2+抗DR5的同种型对照(称为抗短TRAIL)，(iii)抗短TRAIL抗体的同种型对照+抗DR5抗体(称为同种型对照+抗DR5)或(iv)抗短TRAIL(2.2)+抗DR5进行处理，如所示。A)经时地通过全身成像针对荧光素酶表达对小鼠进行分析。B)通过卡普兰-迈耶分析来评估存活。
图30显示抗短TRAIL抗体+同种型对照或抗短TRAIL抗体+抗DR5抗体导致人类癌症的小鼠异种移植物模型中肿瘤生长的抑制。将人弥漫性大B细胞淋巴瘤(HBL-1)细胞系皮下植入NSG小鼠，并每天测量肿瘤尺寸。当肿瘤达到大于或等于100mm3的尺寸时，通过每周的IP注射让小鼠接受指定的处理，每14天用10mg/kg的(i)短TRAIL和DR5抗体的同种型对照(IC+IC)，(ii)抗短TRAIL抗体克隆2.2+抗DR5的同种型对照(2.2+IC)，(iii)抗短TRAIL抗体的同种型对照+抗DR5抗体(IC+DR5)或(iv)抗短TRAIL(2.2)+抗DR5抗体(2.2+DR5)进行处理，如所示。A)经时地针对肿瘤尺寸和根据基线算出的变化倍数对小鼠进行分析。B)通过卡普兰-迈耶分析来评估存活。
图31显示在组织中可通过原位杂交(ISH)检出短TRAIL。将被猴免疫缺陷病毒(SIV)感染的猕猴组织用TRAIL全长特异性探针或短TRAIL特异性探针染色，并以下述放大倍数观察。在A～D中，左列是放大10倍，中间列是放大20倍，右列是放大40倍。在A～D中，上方一行是合成图，中间一行是显红色的合成图的成分((A)和(C)中为TRAIL，(B)和(D)中为短TRAIL)，下方一行是显蓝色的合成图的成分。A)用TRAIL特异性探针染色的被SIV感染的猕猴腋窝淋巴结组织。B)用短TRAIL特异性探针染色的被SIV感染的猕猴腋窝淋巴结组织。C)用TRAIL特异性探针染色的被SIV感染的猕猴脾脏组织。D)用短TRAIL特异性探针染色的被SIV感染的猕猴脾脏组织。
具体实施方式
本文提供能够中和短TRAIL的短TRAIL抗体(例如人源化短TRAIL抗体)，以及制备和使用短TRAIL抗体的材料和方法。在一些情况下，可使用一种或多种短TRAIL抗体来治疗疾病(例如癌症和/或肝病)和/或感染(例如慢性感染)。例如，可以在使患病细胞(例如癌细胞)和/或感染细胞的数量减少的条件下，将一种或多种短TRAIL抗体给予患有疾病和/或感染的哺乳动物。在一些情况下，可使用一种或多种短TRAIL抗体(例如通过TRAIL介导的细胞死亡、NK细胞毒性、CD8+T细胞杀伤、CAR T细胞杀伤和/或溶瘤病毒疗法)来调节(例如增加或减少)凋亡。例如，可以在一种或多种患病细胞(例如癌细胞)和/或一种或多种感染细胞中诱导了凋亡的条件下，将一种或多种短TRAIL抗体给予具有疾病细胞(例如癌细胞)和/或感染细胞(例如被病毒感染的细胞)的哺乳动物。本文也提供编码本文所述的短TRAIL抗体的核酸，以及用于表达编码本文所述的短TRAIL抗体的核酸的构建物。
如本文所述治疗疾病时，该疾病可以是例如癌症(如癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤、母细胞瘤和转移)或肝病。可以如本文所述治疗的癌症的例子包括但不限于：卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、血液恶性肿瘤(例如T细胞恶性肿瘤和B细胞恶性肿瘤)、膀胱癌、肺癌(例如非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌和非鳞状非小细胞肺癌)、结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌(例如激素受体阳性乳腺癌、HER2阳性乳腺癌和三阴乳腺癌)、宫颈癌、食道癌、头颈癌、肾癌(例如肾乳头状细胞癌、肾透明细胞癌、肾移行细胞癌和嫌色性肾细胞癌)、肝细胞癌、骨髓瘤和子宫癌。
如本文所述治疗感染时，该感染可以是例如慢性感染和/或病毒感染。可以如本文所述治疗的感染的例子包括但不限于：HIV、SIV、内源性逆转录病毒、指环病毒、圆环病毒、人疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、多瘤病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、GB病毒C、乳头瘤病毒、人T细胞白血病病毒、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒、多瘤病毒、风疹病毒、细小病毒、麻疹病毒和柯萨奇病毒感染。在一些情况下，如本文所述治疗的感染可以是HIV感染。
如本文所述治疗不希望的凋亡时，该不希望的凋亡可以例如与任何合适的疾病和/或病症相关。可以如本文所述治疗的与不希望的凋亡相关的疾病和/或病症的例子包括但不限于：心肌梗塞、缺血再灌注损伤、神经退行性疾病(例如多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、帕金森病、阿尔茨海默病和亨延顿舞蹈病)、肝损伤(例如饮酒后、服药(例如对乙酰氨基酚)后和非酒精性脂肪性肝炎)。
患有疾病和/或感染或者具有发展疾病和/或感染的风险的任何种类的哺乳动物都可以如本文所述治疗。例如，患有疾病和/或感染的人和其它灵长类动物如猴可以用一种或多种短TRAIL抗体治疗。在一些情况下，狗、猫、马、牛、猪、绵羊、兔、小鼠和大鼠可以用本文所述的一种或多种短TRAIL抗体治疗。
可以采用任何合适的方法来鉴定患有疾病和/或感染或者具有发展疾病(例如癌症)和/或感染的风险的哺乳动物。例如，可以采用成像技术(有或没有对比；例如计算机断层扫描(CT)扫描或磁共振成像(MRI))、活检技术、骨髓穿刺、结肠镜、乙状结肠镜、数字直肠检查、血液检查、血小板检查、粪便检查、尿液检查、内窥镜技术、ELISA技术、基于PCR的技术、印迹技术(例如Western印迹)和组织学技术来鉴定患有癌症的哺乳动物(例如人)。例如，可以采用成像技术(有或没有对比；例如CT扫描或MRI)、活检技术(例如肝组织检查)和血液检验来鉴定患有肝病的哺乳动物(例如人)。例如，可以采用抗体技术、病毒抗原检测检验、培养技术、ELISA技术、基于PCR的技术(例如病毒载量检验)、印迹技术(例如Western印迹)、杂交技术(例如ISH)和组织学技术(例如免疫组织化学(IHC))来鉴定患有感染的哺乳动物(例如人)。
在一些情况下，可以采用一种或多种短TRAIL抗体来鉴定很可能对基于TRAIL的疗法有良好的响应的哺乳动物。例如，可给予患有疾病和/或感染的哺乳动物一种或多种短TRAIL抗体来鉴定很可能对基于短TRAIL的疗法有良好的响应的哺乳动物。在一些情况下，对于患有疾病和/或感染或者具有发展疾病和/或感染的风险的哺乳动物，可以评估短TRAIL和/或TRAIL存在与否。例如，获自患有疾病和/或感染的人的样品中短TRAIL和/或TRAIL的存在与否或水平可用来确定此人是否很可能对基于TRAIL的疗法有响应。对于任何合适的样品，都可以评估短TRAIL和/或TRAIL存在与否。例如，生物样品如组织样品和液体样品(例如血液、血清、血浆或尿液)可以从哺乳动物获得，并评估短TRAIL和/或TRAIL的存在与否或水平。可以采用任何合适的方法来检出短TRAIL和/或TRAIL的存在与否或水平。例如，可以采用抗体技术、病毒抗原检测检验、培养技术、ELISA技术、基于PCR的技术(例如病毒载量检验)、印迹技术(例如Western印迹)、杂交技术(例如ISH)和组织学技术(例如IHC)来测定获自哺乳动物的样品中短TRAIL和/或TRAIL的存在与否或水平。在一些情况下，本文所述的短TRAIL抗体(例如包括包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述的CDR的VH结构域；以及包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所述的CDR的VL结构域)可以被标记(例如用放射性核素做标记，从而能够进行PET或SPECT成像)，并用来测定获自哺乳动物的样品中短TRAIL和/或TRAIL的存在与否或水平。当获自哺乳动物的样品具有可检测水平的短TRAIL和/或TRAIL时，可以将该哺乳动物鉴定为很可能对基于TRAIL的疗法有响应。在一些情况下，鉴定为很可能对基于TRAIL的疗法有响应的哺乳动物可以如本文所述治疗。例如，对于被鉴定为患有三阴乳腺癌(例如TNBC)的人，可给予抑制IL-6、IL-8和EGF的一种或多种抗癌剂来治疗此人。
一旦被鉴定为患有疾病和/或感染、具有发展疾病和/或感染的风险、或者很可能对基于TRAIL的疗法有良好的响应，可给予该哺乳动物或指导该哺乳动物自行施用一种或多种短TRAIL抗体(例如含有中和短TRAIL的一种或多种短TRAIL抗体的组合物)。在一些情况下，哺乳动物(例如人)可以被鉴定为具有短TRAIL。例如，可以采用任何合适的方法来评价哺乳动物中短TRAIL的存在与否。例如，检测短TRAIL水平的技术包括ELISA技术、基于PCR的技术、印迹技术(例如Western印迹)、杂交技术(例如ISH)和/或组织学技术(例如IHC)。短TRAIL的存在与否可用来确定例如哺乳动物是否很可能对短TRAIL抗体疗法有响应。
可以采用任何合适的方法来给予哺乳动物一种或多种短TRAIL抗体。例如，可给予哺乳动物一种或多种短TRAIL抗体和/或可给予哺乳动物编码一种或多种短TRAIL抗体的核酸。在给予哺乳动物编码一种或多种短TRAIL抗体的核酸的情况下，该核酸可以包含在载体中(例如载体介导的抗体基因转移)。
本文提供的短TRAIL抗体特异性结合短TRAIL上的表位。本文所用的术语“抗体”是指完整抗体以及保留一些结合短TRAIL的能力的抗体片段(例如抗原结合片段)。在一些情况下，本文提供的短TRAIL抗体不结合全长TRAIL。短TRAIL抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。短TRAIL抗体可以是嵌合(例如部分人源化或完全人源化)抗体。短TRAIL抗体可以是非免疫原性抗体。在一些情况下，短TRAIL抗体可以是中和性抗体。如本文所用，短TRAIL“中和性”抗体是与短TRAIL结合来中和短TRAIL的生物学作用的抗体。在一些情况下，短TRAIL抗体能够诱导(例如增加)凋亡。例如，短TRAIL中和性抗体与短TRAIL结合，防止短TRAIL与R1和/或R2结合，从而令R1和R2能够结合TRAIL并诱导凋亡。例如，短TRAIL中和性抗体与短TRAIL结合，将结合的短TRAIL从R1和/或R2除去，从而令R1和R2能够结合TRAIL并诱导凋亡。在一些情况下，短TRAIL抗体能够重现短TRAIL功能。如本文所用，“短TRAIL功能”包括减少和/或消除TRAIL介导的细胞死亡的能力。在一些情况下，短TRAIL抗体能够抑制(例如减少)凋亡。例如，本文提供的短TRAIL抗体可包括与Fc结构域(例如IgG Fc结构域)融合的短TRAIL的胞外结构域。例如，与IgG Fc结构域融合的短TRAIL的胞外结构域可用来减少和/或消除凋亡(例如不希望的凋亡)。
本文提供的短TRAIL抗体可以用任何合适的方法制备(参见例如Green等,多克隆抗血清的制备(Production of Polyclonal Antisera),Immunochemical Protocols(Manson编著),第1～5页(Humana出版社，1992)；Coligan等,兔、大鼠、小鼠和仓鼠中的多克隆抗血清的制备(Production of Polyclonal Antisera in Rabbits,Rats,Mice andHamsters),免疫学实验指南(Current Protocols In Immunology),2.4.1小节(1992)；Coligan等,第9单元,免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology),WileyInterscience,1994；Kohler&Milstein,Nature 256:495(1975),Coligan等,2.5.1 2.6.7小节；和Harlow等,抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual),第726页(ColdSpring Harbor Pub.1988))。例如，含有短TRAIL的样品可以用作免疫原在动物中引起免疫应答，从而制备特异性抗体。
本文提供的短TRAIL抗体可以采用任何合适的方法人源化和/或去免疫化(例如使其无免疫原性)。例如，可通过将小鼠CDR从小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区转移到人可变结构域中、然后置换小鼠对应物的构架区中的人残基来产生人源化单克隆抗体。在治疗人时，使用由人源化单克隆抗体衍生的抗体成分可避免与鼠恒定区的免疫原性有关的潜在问题。克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的常规技术的描述见于，例如Orlandi等,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 86:3833(1989)。制备人源化单克隆抗体的技术的描述见于，例如Jones等,Nature 321:522(1986)；Riechmann等,Nature 332:323(1988)；Verhoeyen等,Science239:1534(1988)；Carter等,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA89:4285(1992)；以及Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437(1992)；Singer等,J.Immunol.150:2844(1993)。在一些情况下，可以采用别处(Hwang等,Methods,36:35-42(2005))描述的人源化、如超级人源化。在一些情况下，可以采用SDR移植(Kashmiri等,Methods,36:25-34(2005))、人类序列含量优化(human string content optimization)(Lazar等,Mol.Immunol.,44:1986-1998(2007))、框架改组(framework shuffling)(Dall’Acqua等,Methods,36:43-60(2005)；和Damschroder等,Mol.Immunol.,44:3049-3060(2007))以及噬菌体展示方法(Rosok等,J.Biol.Chem.,271:22611-22618(1996)；Radar等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,95:8910-8915(1998)；和Huse等,Science,246:1275-1281(1989))来获得短TRAIL抗体制备物。在一些情况下，可以如实施例3和4中所述将短TRAIL抗体人源化。短TRAIL抗体可以是抗体Ab866。
短TRAIL抗体重链可包括免疫球蛋白Fc结构域(例如人源化免疫球蛋白Fc结构域)。该Fc结构域可以来自任何同种型(例如IgG、IgA、IgD、IgE或IgM)。该Fc结构域可以来自任何同种型亚类。例如，Fc结构域是IgG同种型时，该Fc结构域可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。
短TRAIL抗体(例如抗体Ab866)VH结构域可包含如下所述的互补决定区(CDR)：
VH CDR1：GYIFTNNDMN(SEQ ID NO:1)；
VH CDR2：GIDPGDGRTKYNEKFKG(SEQ ID NO:2)；以及
VH CDR3：GRGGYEFGIDY(SEQ ID NO:3)。
包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的短TRAIL抗体VH结构域的例子包括但不限于如下所述的VH结构域：
VH0：
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYIFTNNDMNWVKQRPGQGLEWIGGIDPGDGRTKYNEKFKGKATLTADKFSNTVYMQLSSLTSENSAVYFCGRGGYEFGIDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:4)；
VH1：
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYIFTNNDMNWVQQAPGKGLEWMGGIDPGDGRTKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRGGYEFGIDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:5)；
VH2：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTNNDMNWVRQAPGQGLEWMGGIDPGDGRTKYNEKFKGRVTMTRDTSTNTVYMELSSLTSEDTAVYFCGRGGYEFGIDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:6)；
VH3：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGYIFTNNDMNWVRQAPGQGLDWMGGIDPGDGRTKYNEKFKGRVTISADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCGRGGYEFGIDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:7)；以及
VH4：
QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKVSGYIFTNNDMNWVRQAPGEGLEWMGGIDPGDGRTKYNEKFKGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRGGYEFGIDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:8)。
在一些情况下，短TRAIL抗体VH结构域可具有与SEQ ID NO:4至8中任一项所述的序列有至少75％(例如至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)相同性的氨基酸序列。例如，短TRAIL抗体重链VH结构域可具有与SEQ ID NO:4有至少75％相同性的氨基酸序列。例如，短TRAIL抗体重链VH结构域可具有与SEQ ID NO:6有至少75％相同性的氨基酸序列。
短TRAIL抗体重链的例子如下所述：
HC0：
MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYIFTNNDMNWVKQRPGQGLEWIGGIDPGDGRTKYNEKFKGKATLTADKFSNTVYMQLSSLTSENSAVYFCGRGGYEFGIDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:9)；
HC1：
MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYIFTNNDMNWVQQAPGKGLEWMGGIDPGDGRTKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRGGYEFGIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:10)；
HC2：
MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTNNDMNWVRQAPGQGLEWMGGIDPGDGRTKYNEKFKGRVTMTRDTSTNTVYMELSSLTSEDTAVYFCGRGGYEFGIDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:11)；
HC3：
MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGYIFTNNDMNWVRQAPGQGLDWMGGIDPGDGRTKYNEKFKGRVTISADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCGRGGYEFGIDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:12)；以及
HC4：
MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKVSGYIFTNNDMNWVRQAPGEGLEWMGGIDPGDGRTKYNEKFKGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRGGYEFGIDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:13)。
短TRAIL抗体(例如抗体Ab866)VL结构域可包括如下所述的CDR：
VL CDR1：KSSQSLLNSGNQKNSLA(SEQ ID NO:14)；
VL CDR2：GASTRES(SEQ ID NO:15)；以及
VL CDR3：QNDHSFPLT(SEQ ID NO:16)。
包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的短TRAIL抗体VL结构域的例子包括但不限于如下所述的VL结构域：
VL0：
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNSLAWYQQKP GRPPTLLISGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQND HSFPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:17)；
VL1：
DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDHSFPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:18)；
VL2：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDHSFPLTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:19)；
VL3：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNSLAWYQQRPGHPPKLLLYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDHSFPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:20)；以及
VL4：
EIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNSLAWYQHKPGRPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGEDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDHSFPLTFGPGTKVDLK(SEQ ID NO:21)。
在一些情况下，短TRAIL抗体VL结构域可具有与SEQ ID NO:17至21中任一项所述的序列有至少75％(例如至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)相同性的氨基酸序列。例如，短TRAIL抗体VL结构域可具有与SEQ ID NO:17有至少75％相同性的氨基酸序列。例如，短TRAIL抗体VL结构域可具有与SEQ ID NO:20有至少75％相同性的氨基酸序列。
短TRAIL抗体轻链的例子如下所述：
LC0：
MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNSLAWYQQKPGRPPTLLISGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:22)；
LC1：
MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDHSFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:23)；
LC2：
MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDHSFPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:24)；
LC3：
MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNSLAWYQQRPGHPPKLLLYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDHSFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:25)；以及
LC4：
MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCEIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNSLAWYQHKPGRPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGEDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDHSFPLTFGPGTKVDLKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:26)。
本文所述的短TRAIL抗体可包括本文所述的重链和本文所述的轻链的任意组合。在一些情况下，短TRAIL抗体可包括HC2和LC3。
在一些情况下，本文所述的短TRAIL抗体可包括(例如融合有或耦合有)一种或多种标记物(例如可检测的标记物)。标记物可以是但不限于：荧光标记物(例如荧光团)、放射性标记物或酶。可检测的标记物的例子包括但不限于：R-藻红蛋白(PE)、CTO、GFP、荧光团激活蛋白(FAP)、Gaussia荧光素酶(GLuc)、Cypridina荧光素酶(Cluc)和放射性核素、生物素。
在一些情况下，可给予哺乳动物一种或多种短TRAIL抗体(例如1种、2种、3种、4种、5种或更多种短TRAIL抗体)来治疗疾病和/或感染。例如，可给予哺乳动物(例如人)2种或多种短TRAIL抗体来治疗疾病和/或感染。
在一些情况下，可给予患有疾病和/或感染的哺乳动物包含一种或多种短TRAIL抗体的组合物作为唯一的活性成分。
在一些情况下，可给予患有疾病和/或感染的哺乳动物包含一种或多种短TRAIL抗体的组合物作为与用于治疗该疾病和/或该感染的一种或多种其它药剂/疗法的联合疗法。例如，用于治疗患有疾病和/或感染的哺乳动物的联合疗法可包括联合给予该哺乳动物(例如人)一种或多种短TRAIL抗体以及一种或多种基于细胞的疗法和/或一种或多种基于TRAIL的疗法。基于TRAIL的疗法可包括例如TRAIL调节剂，包括但不限于：重组TRAIL(例如杜拉乐明(dulanermin))、抗TRAIL-R1抗体(例如马帕木单抗(mapatumumab))、抗TRAIL-R2抗体(例如可那木单抗(conatumumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、多兹图单抗(drozitumab)、LBY-135)、TRAIL寡聚体(例如ABBV-621)和/或短TRAIL胞外结构域:Fc融合物。在一些情况下，TRAIL调节剂可以是TRAIL激动剂。在一些情况下，TRAIL调节剂可包括(例如融合有或耦合有)一种或多种其它结构域(例如提高稳定性和/或功能的结构域，如多聚组氨酸、FLAG表位、异亮氨酸拉链基序(LZ)、人免疫球蛋白的Fc部分、白蛋白和/或纳米颗粒)。给予哺乳动物2种或多种(例如2种、3种、4种或更多种)TRAIL调节剂的情况下，该TRAIL调节剂可以单独给予或以任意组合给予。基于细胞的疗法可包括例如过继性细胞转移疗法(例如过继性T细胞疗法)，包括但不限于：过继性转移c肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，包括自体TIL、用α-βT细胞受体基因工程改造的TIL、用嵌合抗原受体基因工程改造的TIL(CAR T细胞疗法)和/或基因工程改造的NK或NK/T细胞。
用于治疗患有癌症的哺乳动物的联合疗法可包括给予哺乳动物(例如人)包含一种或多种短TRAIL抗体的组合物和一种或多种癌症治疗，所述癌症治疗例如为：化疗剂，包括但不限于烷基化剂(例如六甲蜜胺、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、洛莫司汀、美法仑、奥沙利铂、替莫唑胺和噻替哌)、抗代谢剂(例如5-FU、6-巯基嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤和培美曲塞)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星和伊达比星)、非蒽环类抗生素(例如放线菌素D、博来霉素、丝裂霉素C和米托蒽醌)、拓扑异构酶I抑制剂(例如托泊替康和伊立替康(例如CPT-11))、拓扑异构酶II抑制剂(例如依托泊苷(例如VP-16)、替尼泊苷和米托蒽醌)、有丝分裂抑制剂(例如多西他赛、雌莫司汀、伊沙匹隆、紫杉醇、长春碱、长春新碱和长春瑞滨)、皮质类固醇(例如泼尼松、乙基泼尼松龙和地塞米松)、酶(例如L-天冬酰胺酶)和/或蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)；分化剂，包括但不限于类视黄醇、维甲酸、贝沙罗汀和三氧化二砷；鸡尾酒疗法(例如环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松的组合(CHOP)，或者利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松的组合(R-CHOP))；单克隆抗体，包括但不限于抗HER2抗体(例如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)、抗CTLA-4抗体(例如伊匹单抗)、抗GD2抗体(例如达妥昔单抗)、抗IL-6抗体(例如司妥昔单抗)、抗EGFR抗体(例如西妥昔单抗、帕尼单抗和耐昔妥珠单抗)、抗VEGF抗体(例如雷莫芦单抗和贝伐单抗)、抗PD-1抗体(例如帕博利珠单抗和纳武单抗)、抗PD-L1抗体(例如阿特珠单抗)、抗PDGF抗体(例如奥拉单抗)、抗RANK抗体(例如地诺单抗)、抗CD3抗体(例如博纳吐单抗)、抗CD19抗体(例如博纳吐单抗)、抗CD20抗体(利妥昔单抗、奥法木单抗和奥比妥珠单抗)、抗CD38抗体(例如达雷木单抗)、抗CD52抗体(例如阿仑单抗)以及抗SLAMF7抗体(例如埃罗妥珠单抗)；抗体-药物偶联物，包括但不限于吉妥珠单抗奥佐米星、贝伦妥单抗维多汀、曲妥珠单抗和美坦新；靶向性小分子，包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂(例如VEGF抑制剂(如阿帕替尼)、c-Met抑制剂(如卡博替尼)、ALK抑制剂(如艾乐替尼和克唑替尼)、Brc-Abl抑制剂(如达沙替尼、伊马替尼和尼罗替尼)、EGFR抑制剂(如埃罗替尼和吉非替尼)、HER2抑制剂(如拉帕替尼)、多靶向性酪氨酸激酶抑制剂(如索拉非尼和舒尼替尼)、JAK1抑制剂(如托法替尼)、MEK抑制剂(如考比替尼和曲美替尼)、蛋白酶体抑制剂(如伊沙佐米(ixazomib)、卡非佐米(carfilzomib)、硼替佐米、双硫仑、和乳胞素)、雌激素受体调节剂(如他莫昔芬)、Bcl-2抑制剂(如奥巴克拉、纳维托克斯和棉酚)、PARP抑制剂(如依尼帕尼和奥拉帕尼)、PI3K抑制剂(如哌立福新)、BRAF抑制剂(如达拉非尼和维罗非尼)、MEK抑制剂(如曲美替尼)、CDK抑制剂(如阿贝西尼、帕博西尼、瑞博西尼和曲拉西尼)、选择性雌激素受体降解剂(如氟维司群)、BET抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂(如坦西莫司、依维莫司、维罗非尼、曲美替尼和达拉非尼)；小分子药物偶联物，包括但不限于维他拉肽；放疗(例如外束疗法、强度调制放疗、图像引导放疗、质子束疗法)；近程治疗；和/或手术(例如肿瘤、肿瘤的一部分或转移灶的手术切除)。
用于治疗患有肝病的哺乳动物的联合疗法可包括给予哺乳动物(例如人)包含一种或多种短TRAIL抗体的组合物和一种或多种肝脏疾病治疗，所述肝脏疾病治疗包括但不限于：减肥、针对肝脏疾病(例如甲肝、乙肝和丙肝)的疫苗接种、维生素E和/或咖啡。
用于治疗患有感染(例如病毒感染)的哺乳动物的联合疗法可包括给予哺乳动物(例如人)包含一种或多种短TRAIL抗体的组合物和一种或多种感染治疗，所述感染治疗例如为抗逆转录病毒疗法，包括但不限于：核苷逆转录酶抑制剂(例如阿巴卡韦、地达诺新、恩曲他滨、恩替卡韦、拉米夫定、司他夫定、富马酸替诺福韦二吡呋酯、扎西他滨和齐多夫定)；非核苷逆转录酶抑制剂(例如地拉韦啶、依非韦仑、依曲韦林、奈韦拉平和利匹韦林)；核苷酸逆转录酶抑制剂(例如阿德福韦和替诺福韦)；融合抑制剂(例如恩夫韦肽)；进入抑制剂(例如马拉韦罗)；整合酶抑制剂(例如度鲁特韦、埃替格韦(和或不和利托那韦(ritonovair)和/或可比司他(cobisistat)一起)和雷特格韦)；成熟抑制剂(例如贝韦立马)；蛋白酶抑制剂(例如安普那韦、福沙那韦、茚地那韦、洛匹那韦、奈非那韦、利托那韦、沙奎那韦、阿扎那韦、达芦那韦和替拉那韦)；脱衣壳抑制剂(例如TRIM5α)；转录抑制剂(例如tat拮抗剂)；和/或翻译抑制剂(例如天花粉蛋白)；PEG化α干扰素(PEG-IFN-a)；达卡他韦(daclatasvir)；依巴司韦(elbasvir)；格拉瑞韦(grazoprevir)；格卡瑞韦(glecaprevir)；哌仑他韦(pibrentasvir)；雷迪帕韦(ledipasvir)；索非布韦(sofosbuvir)；奥比他韦(ombitasvir)；帕立瑞韦(paritaprevir)；利托那韦(ritonavir)；达沙布韦(dasabuvir)；西美瑞韦(simeprevir)；维帕他韦(velpatasvir)；以及伏西瑞韦(voxilaprevir)。
将一种或多种短TRAIL抗体与用于治疗疾病和/或感染的一种或多种其它药剂联合使用的情况下，该一种或多种其它药剂可同时或独立给药。例如，可以首先给予包含一种或多种短TRAIL抗体的组合物，接着给予一种或多种其它药剂，反之亦可。将一种或多种短TRAIL抗体与用于治疗疾病和/或感染的一种或多种其它疗法联合使用的实施方式中，该一种或多种其它疗法可与一种或多种短TRAIL抗体的给药同时或独立实施。例如，可以在给予包含一种或多种短TRAIL抗体的组合物之前、之时或之后实施一种或多种其它疗法。
在一些情况下，一种或多种短TRAIL抗体可以配制成药学上可接受的组合物，以用于对患有疾病和/或感染的哺乳动物的给药。例如可以将治疗有效量的短TRAIL抗体和一种或多种药学上可接受的载剂(添加剂)和/或稀释剂配制在一起。药物组合物可以配制成固体或液体形式以用于给药，包括但不限于：无菌溶液、混悬剂、缓释剂型、片剂、胶囊、丸剂、粉末和颗粒。可以用在本文所述的药物组合物中的药学上可接受的载剂、填料和运载体包括但不限于：离子交换物质、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂，血清蛋白质如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
包含一种或多种短TRAIL抗体的药物组合物可以设计成用于口服、胃肠道外(包括皮下、肌肉内、静脉内、腹膜内、鞘内和皮内)或吸入给药。口服给药时，包含一种或多种短TRAIL抗体的药物组合物可以呈丸剂、片剂或胶囊的形式。适合于胃肠道外给药的组合物包括水性和非水性无菌注射溶液以及水性和非水性无菌混悬剂，所述水性和非水性无菌注射溶液可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、以及使所述制剂与目标受体的血液等渗的溶质；所述水性和非水性无菌混悬剂可包含悬浮剂和增稠剂。用于吸入的组合物可以用例如吸入器、喷雾器和/或干粉吸入器进行递送。可以用单位剂量或多剂量容器、例如密封的安瓿和药瓶提供该制剂，也可以在冷冻干燥(冻干)条件下保存该制剂，临用前只需要加入无菌液体载剂如注射用水即可使用。临配的注射溶液和混悬剂可由无菌粉末、颗粒和片剂制备。
在一些情况下，包含一种或多种短TRAIL抗体的药学上可接受的组合物可以局部或全身给药。例如，包含短TRAIL抗体的组合物可通过对哺乳动物(例如人)口服给药或令其吸入的方式全身给药。
有效剂量可根据疾病和/或感染的严重程度、给药的途径、对象的年龄和总体健康状况、赋形剂的使用、与其它治疗性措施(如其它药剂的使用)共同使用的可能性、以及治疗医生的判断而变化。
在一些情况下，包含一种或多种短TRAIL抗体的组合物的有效量可以是在不对哺乳动物产生显著的毒性的情况下、减少欲治疗的疾病和/或感染的症状的严重程度或发生的任何量。在一些情况下，包含一种或多种短TRAIL抗体的组合物的有效量可以是在不对哺乳动物产生显著的毒性的情况下、减少疾病细胞(例如癌细胞)和/或感染细胞的数量的任何量。有效量可以保持恒定，或者可以作为一项浮动刻度或可变剂量进行调整，这取决于哺乳动物对治疗的响应。各种因素可影响用于特定应用的实际有效量。例如，给药的频率、治疗的持续时间、多种治疗剂的使用、给药的途径、以及疾病和/或感染的严重程度可能需要增加或减少给药的实际有效量。
在一些情况下，给药的频率可以是在不对哺乳动物产生显著的毒性的情况下、减少欲治疗的疾病和/或感染的症状的严重程度或发生的任何频率。在一些情况下，给药的频率可以是在不对哺乳动物产生显著的毒性的情况下、减少疾病细胞(例如癌细胞)和/或感染细胞的数量的任何频率。例如，给药的频率可以是约每月一次至每两周一次、约每周一次至约每天三次、约每月两次至约每天六次、约每周两次至约每天一次。在一些情况下，给药的频率可以是每周给药。在一些情况下，给药的频率可以是每两周给药。给药的频率可以保持恒定，或者可以在治疗的持续过程中变化。采用包含一种或多种短TRAIL抗体的组合物的治疗过程可包括间歇期。例如，包含一种或多种短TRAIL抗体的组合物可以在两周的时间内每天给药，然后是两周的间歇期，这样的方案可以重复多次。如同有效量，各种因素可影响用于特定应用的实际给药频率。例如，有效量、治疗的持续时间、多种治疗剂的使用、给药的途径、以及疾病和/或感染的严重程度可能需要增加或减少给药频率。
在一些情况下，包含一种或多种短TRAIL抗体的组合物的给药的有效持续时间可以是在不对哺乳动物产生显著的毒性的情况下、减少欲治疗的疾病和/或感染的症状的严重程度或发生的任何持续时间。在一些情况下，包含一种或多种短TRAIL抗体的组合物的给药的有效持续时间可以是在不对哺乳动物产生显著的毒性的情况下、减少疾病细胞(例如癌细胞)和/或感染细胞的数量的任何持续时间。例如，有效持续时间可在数天至数周、数月或数年的范围内变化。在一些情况下，用于治疗疾病和/或感染的有效持续时间在约一个月至约10年的持续时间范围内。多种因素可影响用于特定治疗的实际有效持续时间。例如，有效持续时间可随着给药的频率、有效量、多种治疗剂的使用、给药的途径和欲治疗的病症的严重程度而变化。
在某些情况下，可以监测治疗过程和欲治疗的疾病和/或感染的严重程度。可以采用任何合适的方法来确定疾病和/或感染的严重程度是否减少。例如，可以在不同的时间点用成像技术(有或没有对比)、活检技术、骨髓穿刺、结肠镜、乙状结肠镜、数字直肠检查、血液检查、血小板检查、粪便检查、尿液检查、内窥镜技术、ELISA技术、基于PCR的技术、印迹技术(例如Western印迹)、流式细胞术、遗传分析(例如针对基因重排)和/或组织学技术来评估疾病(例如癌症)的严重程度。例如可以在不同的时间点用抗体技术、病毒抗原检测检验、培养技术、ELISA技术、基于PCR的技术(例如病毒载量检验)、印迹技术(例如Western印迹)和/或组织学技术来评估感染的严重程度。可以采用任何合适的方法来监测对短TRAIL抗体疗法或包含短TRAIL抗体的联合疗法的响应。例如，检测TRAIL和/或短TRAIL水平的技术包括ELISA技术、基于PCR的技术、印迹技术(例如Western印迹)、杂交技术(例如ISH)和/或组织学技术(例如IHC)。
在一些情况下，监测对短TRAIL抗体疗法或包含短TRAIL抗体的联合疗法的响应可包括治疗诊断。例如，可以给予患有疾病和/或感染的哺乳动物一种或多种短TRAIL抗体，并且可以同时监测该疾病和/或感染。例如，本文所述的一种或多种短TRAIL抗体(例如如下抗体，其包括：包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述的CDR的VH结构域；以及包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所述的CDR的VL结构域)可以用放射性核素标记，从而能够通过PET或SPECT成像进行监测。
以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求书所述的本发明范围。
实施例
实施例1：对TRAIL的抵抗是由微泡相关短TRAIL导致的，并通过抗体中和而逆转
概述
TRAIL与TRAIL-R1或TRAIL-R2结合，并能够在肿瘤细胞和/或被病毒感染的细胞中诱导凋亡，但在正常细胞中却很少诱导凋亡。不幸的是，TRAIL受体靶向性疗法的临床成功还很有限。下述数据表明，I型干扰素信号转导诱导短TRAIL的表达，并且短TRAIL流入微泡，进入细胞微环境，在其中其可被旁邻细胞(bystander cell)摄取。短TRAIL与TRAIL-R1和R2结合，但不与TRAIL诱骗受体R3和R4结合，并防止全长TRAIL诱导细胞死亡。短TRAIL介导的针对TRAIL杀伤的保护为反式，因为在结合短TRAIL后，不产生短TRAIL的细胞针对TRAIL受到保护。重组短TRAIL足以保护细胞免受TRAIL诱导的杀伤，而用特异性抗体消除短TRAIL可恢复TRAIL敏感性。这些结果建立了一个用于理解和克服TRAIL抵抗的范例。
结果
未被感染的细胞和被HIV感染的细胞均产生短TRAIL
采用单细胞mRNA分析来评估被HIV感染的细胞相较于未被感染的细胞中的短TRAIL产生。在这些实验中，通过集成流体通路从被HIV感染的供体或未被感染的供体分离单个CD4 T细胞，并采用PCR针对HIV特异性靶标、短TRAIL和TRAIL受体/配体以及细胞谱系和活化状态的标记物进行单个细胞分析(图1A)。
如下所述确认试验的特异性：观察到未被HIV感染的供体没有含有HIV转录物的细胞，而只有极少数的来自被HIV感染的供体的CD4 T细胞含有HIV转录物(图1B)。也观察到了在患有HIV感染的患者中可见的不适当和过度的免疫活化，即，与来自未被HIV感染的供体的细胞相比，有更多来自被HIV感染的供体的细胞表达活化标记物HLA-DR(图1C)。来自被HIV感染的供体和未被HIV感染的供体的细胞均含有短TRAIL的转录物(图1D)，并且来自被HIV感染的供体的被HIV感染的(HIV mRNA+)细胞和未被HIV感染的(HIV mRNA-)细胞均表达短TRAIL(图1E)，这表明短TRAIL的产生并不需要HIV感染。大多数单个细胞只表达TRAILFL和短TRAIL中的一者，或者TRAILFL和短TRAIL都不表达，这与短TRAIL是TRAILFL的剪接变体相一致(图1F)。为了进一步深入了解何种刺激会诱导短TRAIL表达，评估了这样的表达是否与细胞活化相关，并且发现，通过CD25、CD38或HLA-DR转录物的存在，确定短TRAIL信使与免疫活化无关(图1G)。在本分析所述的CD4 T细胞亚组中，与新近胸腺迁出细胞(RTE)、效应记忆CD4 T细胞(TEM)或移行记忆CD4 T细胞(TTM)相比，有更多的中央记忆CD4 T细胞(TCM)含有短TRAIL转录物(图1H)。所以所述数据表明，短TRAIL可以在未被HIV感染的单个细胞中表达。
I型干扰素驱动短TRAIL的产生
因为未被HIV感染的细胞能够制造短TRAIL，所以其有助于理解哪些刺激负责驱动短TRAIL的产生；HIV蛋白、HIV诱导的细胞因子和/或IFN可能负责诱导短TRAIL表达。HIV感染产生许多生物活性HIV编码蛋白，其对宿主细胞具有多效性。单个细胞的HIV感染可通过包括TLR和RIG在内的许多种模式识别受体(PRR)来识别，所述模式识别受体在I型IFN的产生和随后的IFN刺激基因(ISG)的诱导中达到峰值(Zitvogel等,2015Nat Rev Immunol15:405-414)。为了确定这些刺激中的何种刺激驱动短TRAIL的产生，筛选出感染患者的血浆中存在的一组细胞因子、IFN和HIV蛋白，来评估是否这些刺激中的某种刺激能够诱导休眠(CD25-、CD69-、HLA-DR-)CD4 T细胞产生短TRAIL。IFNα14和IFNβ以约50倍的倍数显著诱导短TRAIL信使(图2A&E)，而一组细胞因子(包括炎症细胞因子)仅以数倍的倍数略微但不显著地增加短TRAIL信使的表达(图2B)。类似地，TNFα、LPS和gp120极小地影响短TRAIL表达(图2C)。在分析被处理样品中的短TRAIL蛋白水平时，发现与其它刺激相比，I型干扰素也具有类似的效果(图2E)。在相同样品中检测TRAILFL信使，并发现TRAILFL表达与短TRAIL表达之间有密切的线性相关性(图2D)，这与图1F相一致。这些数据共同支持如下结论：短TRAIL实际上是一种干扰素刺激基因，因此很可能在以I型干扰素信号转导为特征的各种条件下表达。
短TRAIL的羧基末端在质膜上外化，并与TRAIL受体R1&R2相互作用，但不与TRAIL受体R3&R4相互作用
TRAILFL表达为单次II型跨膜蛋白，具有胞外C末端结构域。含有约95～281个氨基酸的TRAILFL的C末端区域负责促凋亡功能，并围绕着中心锌离子配位而形成同源三聚体(Cha等,1999Immunity 11:253-261)。短TRAIL是剪接事件的结果，在该剪接事件中，外显子3和4被删除，并在外显子5中引入移码，导致产生提前终止密码子和新的11个氨基酸的C末端(图3A)。
评价短TRAIL是否迁移至质膜并存在于细胞的外表面上。为此，在短TRAIL的新的C末端中插入myc标签，并采用流式细胞术在非透化或透化的转染细胞中分析表位可接近性。透化的对照转染细胞含有可检测的myc(可能反映了内源性myc)，而短TRAIL-myc转染细胞显示出额外的myc染色，这与转染蛋白质的表达相一致(图3B，左方图)。相同细胞的非透化样品未显示出对照转染细胞的表面myc染色，却在短TRAIL-myc表达后可检测到明显的表面myc阳性细胞群(图3B，右方图)，这支持了短TRAIL的羧基末端在胞外环境中可接近这一解释。
TRAILFL通过与TRAIL受体家族成员结合来发挥其促凋亡效果，该家族中有四种不同的成员蛋白质。TRAIL-R1和R2包含死亡结构域，其在配体结合后招募含死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)并导致半胱天冬酶8活化。TRAIL-R3和R4不含功能性死亡结构域，不导致半胱天冬酶8活化，通常被认为是“诱骗”受体。TRAIL受体家族成员也通过它们在结合TRAILFL的能力上的不同来彼此区分。一项等温滴定量热法研究显示，TRAILFL对TRAIL-R2的结合亲和力比对TRAIL-R1的结合亲和力高至少35倍，比对TRAIL-R3的结合亲和力高100倍(TRAIL-R4未评估)(Truneh等,2000,J Biol Chem275:23319-23325)，而另一项研究显示TRAIL R4>R2>R3>R1，其解离常数的范围为0.869至4.08nM(Lang等,2016,J Biol Chem 291:5022-5037)。这些研究将TRAIL-R2凸显为对TRAILFL有最高亲和力的凋亡诱导受体。
为了明确短TRAIL是否也与任何其它TRAIL受体家族成员相互作用，将来自表达C末端有FLAG标签的TRAIL-R1、R2、R3或R4的293T细胞的细胞裂解物与来自表达N末端有HA标签的TRAILFL或N末端有HA标签的短TRAIL的细胞的裂解物合并。将该混合物用抗HA免疫沉淀，并针对含FLAG的蛋白质进行分析。FLAG-TRAIL-R1和R2均通过HA-TRAILFL免疫沉淀(图3C)。FLAG-TRAIL-R1和R2也以类似的程度将HA-短TRAIL免疫共沉淀(图3C)。然而，TRAILFL与TRAIL-R3和R4相关联，但短TRAIL却明显不相关联(图3D)。因此，短TRAIL优先结合诱导死亡的TRAIL-R1和R2，但却很少结合诱骗受体R3和R4，这就提示选择性受体结合性可能是短TRAIL的生物学效应的关键。
短TRAIL包含在胞外囊泡中
仍然不知道短TRAIL如何释放至该区室中。为了探索该过程，通过共聚焦显微镜分析用GFP或GFP-短TRAIL转染的Jurkat T细胞。观察到短TRAIL定位于质膜(图4A)，这是通过被HIV感染的细胞或对照细胞的重膜组分的免疫印迹确认的(图4B)；组分的纯度通过细胞溶质特异性HSP70确认。短TRAIL在感染培养物的上清液组分中存在。另外，上清液相关短TRAIL的迁移类似于细胞相关短TRAIL，这就提示上清液相关短TRAIL不太可能通过切割事件产生(图4C)。
为了考察短TRAIL是否会被纳入胞外囊泡中，通过超速离心收获来自经PHA刺激的和未经刺激的CD4+细胞的胞外囊泡，固定，并通过电子显微镜分析尺寸，显示了范围为50nm至约400nm、中位直径为136nm的尺寸(图4D)。这些结果提示微泡(>100nm)和外泌体(<100nm)的同时存在。用抗短TRAIL抗体实施相同的胞外囊泡的Western印迹分析。这项分析显示出约15kDa处的条带(图4E)，这与含有短TRAIL的胞外囊泡相一致。通过Western印迹，来自用HA-TRAILFL和HA-短TRAIL转染的293T细胞的全细胞裂解物和纯化的胞外囊泡制备物产生相似的图案(图4F)。通过用eGFP-TRAILFL和/或Ruby-短TRAIL转染293T细胞并通过流式细胞术分析上清液，进一步证实了与短TRAIL相关的胞外囊泡的存在。未转染细胞的上清液几乎不含GFP或Ruby信号，而单独转染eGFP-TRAILFL或Ruby-短TRAIL的细胞对于各蛋白质分别显示出可检测的表达。用eGFP-TRAILFL和Ruby-短TRAIL共转染细胞时，单独用eGFP-TRAILFL、单独用Ruby-短TRAIL、以及同时用eGFP-TRAILFL和Ruby-短TRAIL均可检出囊泡。(图4G)。
定位于微泡的TRAILFL显示出生物活性(Huber等,2005Gastroenterology 128:1796-1804)，因此考察胞外囊泡中的短TRAIL是否也有生物活性。用单独的HA-TRAILFL、单独的HA-短TRAIL、1:1比例或1:2比例的HA-TRAILFL:HA-短TRAIL转染293T细胞，并收集含有短TRAIL微泡的浓缩上清液。将Jurkat细胞在新鲜培养基、来自未转染的293T细胞的条件培养基、或来自四种不同的转染293T细胞之一的条件培养基中孵育，通过流式细胞术分析切割的半胱天冬酶3作为由凋亡引起的细胞死亡的标记物。在新鲜培养基或来自未转染的293T细胞的培养基中孵育的Jurkat细胞具有低水平的基础凋亡(约5％)。相反地，在来自用TRAILFL转染的293T细胞的培养基中孵育的Jurkat细胞具有>20％的凋亡，这与TRAILFL在微泡部分中有活性相一致。明显地，用TRAILFL和短TRAIL共转染293T细胞时，由微泡制备物引起的Jurkat T细胞杀伤的程度有所下降，并且在存在更大量的短TRAIL时是最低的(约3％～13％；图4H&I)。
测试短TRAIL是否也类似地与微泡有关而与外泌体无关，因为短TRAIL是具有跨膜结构域的膜相关蛋白。将来自被HIV感染的原代CD4 T细胞培养物的上清液分离为微泡(通过超速离心)或外泌体(通过基于树脂的萃取)(如别处所述，参见例如Taylor等,2011Methods Mol Biol 728:235-246)。通过免疫印迹用我们的短TRAIL特异性抗体分析微泡制备物和外泌体，并且只在微泡制备物中鉴定到短TRAIL(图4J)。
短TRAIL对TRAIL的保护作用可转移至相邻细胞
为了评估短TRAIL表达的生物学影响，使用293T细胞作为效应细胞，在其中表达TRAILFL、短TRAIL或两者。将表达TRAIL-R2的靶Jurkat T细胞用细胞示踪橙(CTO)标记，将效应293T细胞与靶CTO+Jurkat细胞混合，并通过流式细胞术门选CTO阳性群来进行分析(图5A)。靶Jurkat细胞与递增量的转染HA-TRAILFL质粒(7.1％至32.8％的范围内，通过转染1μg至20μg HA-TRAILFL)正相关(图5B&C)。用10μg的HA-TRAILFL和递增量的HA-短TRAIL转染效应293T细胞，与CTO标记的Jurkat T细胞共培养，并以类似方式分析。递增量的短TRAIL质粒导致短TRAIL的表达增加(图5D)。这进而导致Jurkat靶细胞杀伤量的减少(图5E)。因此，与TRAILFL共表达的短TRAIL以剂量依赖性方式拮抗TRAILFL的凋亡诱导活性。
为了考察由短TRAIL介导的对TRAIL杀伤的抵抗是否可以从产生短TRAIL的细胞转移至存在于微环境中的不产生短TRAIL的旁邻细胞，生成有ruby标签的短TRAIL(ruby-短TRAIL)和有ruby标签的缺失跨膜结构域的短TRAIL(ruby-短TRAILΔTM)的表达构建物，并证实了各构建物的强表达(图5F)。用ruby-短TRAIL转染的293T细胞证明了ruby的膜周表达，而表达ruby-短TRAILΔTM的细胞显示出弥散的胞质表达(图5G，上方图)。收获来自转染细胞的上清液，并用来处理HeLa细胞。经处理的HeLa细胞显示出ruby-短TRAIL的摄取，但未显示出ruby-短TRAILΔTM的摄取(图5G，下方图)，这与跨膜结构域对于短TRAIL的膜定位是必须的这一理解相一致，并且也表明含有短TRAIL的微泡被不产生短TRAIL的相邻细胞摄取。测试这些经微泡处理的HeLa细胞是否获得了对TRAIL介导的杀伤的抵抗。未处理的HeLa细胞在用sk-TRAIL处理后以时间依赖性方式死亡。添加来自用ruby转染或用ruby-短TRAILΔTM转染的293T细胞的上清液并未明显地改变sk-TRAIL杀伤，而添加来自用ruby-短TRAIL转染的细胞的上清液使得sk-TRAIL诱导的杀伤减少了约20％(图5H)。因此，一个细胞的短TRAIL表达可通过短TRAIL的微泡转移来介导赋予另一个细胞TRAIL抵抗。
短TRAIL包含PEST结构域，并且被泛素化和被蛋白酶体降解
在考察短TRAIL的亚细胞定位的研究(图1A)中，注意到短TRAIL有貌似较短的半衰期。为了验证该发现，用HA-短TRAIL转染293T细胞，并在不存在或存在蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺的情况下评价蛋白质半衰期(图6A)。在最初的约60分钟里损失了约50％的蛋白质，这表明蛋白质周转迅速。在第59个氨基酸和第81个氨基酸之间鉴定到短TRAIL中的推定PEST结构域(图6B)。将脯氨酸76置换为丙氨酸显著地延长的短TRAIL的半衰期(图6C)，这就确认了功能性PEST结构域，并提示后续的泛素化和蛋白酶体介导的降解。
为了鉴定短TRAIL被泛素化，在293T细胞中表达有HA标签的短TRAIL，并实施抗HA的拉下和泛素的免疫印迹。这些分析显示，在与聚泛素化HA-短TRAIL相对应的尺寸下，有丰富的泛素化蛋白质迁移(图4D)。在蛋白质的Lys48连接处用泛素进行蛋白质修饰可驱动蛋白酶体降解，而Lys63连接处的泛素化导致蛋白质-蛋白质间相互作用的改变和信号转导通路的改变(Deng等,2000Cell 103:351-361)。为了评估泛素化短TRAIL是否通过Lys48靶向降解，使用特异性去泛素化酶(DUB)，其区分Lys48和Lys63的泛素连接(参见例如Komander等,2009Nat Rev Mol Cell Biol 10:550-563)。HA-短TRAIL的泛素化在Lys48特异性DUBUSP2的作用下逆转(图6D)，这表明短TRAIL的泛素化方式与其靶向降解用蛋白酶体的方式一致。这是通过检测用蛋白酶体抑制剂MG132处理或未处理的细胞中的短TRAIL水平确认的，这表明蛋白酶体的抑制大幅提高短TRAIL的表达水平(图6E)。与这些发现相一致，并且基于泛素-蛋白酶体通路控制着短TRAIL的表达水平这一假说，PEST突变体P76A短TRAIL的表达导致单个细胞上的短TRAIL的水平提高；含有短TRAIL的细胞的总数并不明显增加(图6F)。
短TRAIL对于引起TRAIL抵抗是充分且必要的
这些数据表明，对于产生短TRAIL的细胞以及摄取来自微泡介导的转移的短TRAIL的旁邻细胞，短TRAIL都根本性地影响细胞死亡/存活。为了评估单独的短TRAIL是否负责这些效果，通过克隆与免疫球蛋白G的Fc结构域融合的短TRAIL的胞外结构域，生成短TRAIL的重组构建物。纯化后，将重组短TRAIL胞外结构域:Fc融合物(短TRAIL ECD:Fc)添加至单独的Jurkat T细胞或用sk-TRAIL预处理的Jurkat T细胞。短TRAIL ECD:Fc没有毒性，无法以剂量依赖性方式防止sk-TRAIL介导的Jurkat T细胞杀伤(图7A)。
评估短TRAIL的消除是否足以减轻TRAIL抵抗。对短TRAIL特有的11个C末端氨基酸有特异性的短TRAIL抗体的产生如别处所述(参见例如Schnepple等,2011J Biol Chem286:35742-35754)。用IFNα14刺激组成型表达短TRAIL的Jurkat T细胞，以诱导最大的短TRAIL表达，然后通过sk-TRAIL诱导死亡。与我们先前的观察相一致，sk-TRAIL处理导致Jurkat T细胞的强杀伤(图7B)。与短TRAIL是TRAIL的拮抗剂相一致，递增剂量的短TRAIL抗体存在下的sk-TRAIL处理诱导Jurkat杀伤的剂量依赖性增加，该Jurkat杀伤在受试抗体的最高剂量5μg/ml下有效地使死细胞的数量倍增，而单独的短TRAIL抗体却没有固有的细胞毒性。综上所述，在本模型系统中，短TRAIL的存在对于TRAIL抵抗是必要且充分的，并且我们的数据表明，短TRAIL的抗TRAIL效果可被短TRAIL特异性抗体有效地抑制。
实施例2：短TRAIL减小NK细胞的细胞毒性能力
NK细胞在对HIV感染的抗病毒响应中起着关键作用。虽然NK细胞可产生TRAIL作为效应分子来杀伤肿瘤细胞，其在抗病毒防御中的作用只是新发现的。由被HIV感染的细胞产生的短TRAIL可能是这些细胞对病毒发生显著的先天性免疫应答的能力减小的主要因素。为了测定短TRAIL对NK功能的影响，评价短TRAIL在减小HIV感染过程中NK细胞的细胞毒性功能方面的作用。
方法
用对照或短TRAIL表达质粒转染Jurkat细胞，并以各种效靶比(1:1至20:1)和来自未被感染的供体的原代NK细胞一起孵育(N＝10)。采用基于流式细胞术的试验来测定NK细胞对靶Jurkat细胞的细胞毒性作用。通过针对CD69、穿孔蛋白、CD16和CD107a进行染色来测定短TRAIL过表达对NK细胞活性和功能的作用。此外，通过表面染色来检测gp120或含有HIV-1IIIB毒株的上清液对TRAIL和短TRAIL的NK表达的作用。
结果
与对照细胞相比，靶细胞中短TRAIL的过表达在整个E:T比例范围内显著减小NK对这些细胞的细胞毒性功能(图8；在20:1的E:T比例下p＝0.006)。这些结果证明，短TRAIL表达显著减小NK介导的细胞毒性。
用含有HIV IIIB病毒的培养上清液对NK细胞进行的预处理导致短TRAIL的表面表达大幅增加，却对TRAIL表达没有影响，而单独的gp120未产生这样的效果(图9)。这些结果证明，单独的含有HIV上清液增加NK细胞上短TRAIL的表面表达。
短TRAIL不改变NK细胞中的CD69、CD16、穿孔蛋白或CD107a的表达(图10)。这些结果证明，短TRAIL影响NK功能，并且能够在对HIV感染的先天性免疫应答中起到重要作用。
实施例3：抗短TRAIL抗体的人源化
将鼠单克隆抗体TRAILs 2.2人源化以产生抗体Ab866。
重链
鼠TRAILs 2.2的VH结构域的序列如下所述，其中CDR以粗体表示：
/>
将鼠VH的CDR移植到人受者的构架中以产生人源化变体VH1～VH4：
VH1：
VH2：
VH3：
VH4：
VH0鼠序列和人源化变体VH1～4的比对示于图12A。人源化变体VH1～4相对于VH0鼠序列的同源性示于下表1。
表1.人源化变体相对于鼠VH的同源性。
相同氨基酸 共有氨基酸
VH1 79.7％ 86.4％
VH2 83.9％ 91.5％
VH3 81.4％ 91.5％
VH4 78.0％ 86.4％
轻链
鼠TRAILs 2.2的VL结构域的序列如下所述，其中CDR以粗体表示：
将鼠VL的CDR移植到人受者的构架中以产生人源化变体VL1～VL4：
VL1：
VL2：
VL3：
VL4：
VL0鼠序列和人源化变体VL1～4的比对示于图12B。人源化变体VL1～4相对于VL0鼠序列的同源性示于下表2。
表2.人源化变体相对于鼠VL的同源性。
相同氨基酸 共有氨基酸
VL1 85.8％ 92.9％
VL2 86.7％ 93.8％
VL3 84.1％ 93.8％
VL4 83.2％ 92.0％
所有的人源化变体都以世界卫生组织(WHO)的人源化抗体的定义为根据。
实施例4：抗短TRAIL抗体
各VH结构域用人IgG1同种型恒定结构域序列进行框内合成。可对整个重链序列进行密码子优化(DNA2.0，USA)，并鉴定DNA序列。IgG1恒定结构域(同种异型G1m17,1)的氨基酸序列为：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:29)。
各VL结构域用人IgK同种型恒定结构域序列进行框内合成。可对整个轻链序列进行密码子优化(DNA2.0，USA)，并鉴定DNA序列。IgK恒定结构域(同种异型Km3)的氨基酸序列为：
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC(SEQ ID NO:30)。
各变体链通过DNA序列分析进行鉴定。这16种人源化抗体可包括表3中所示的人源化可变结构域的任意组合。
表3.人源化抗短TRAIL抗体中的人源化可变结构域的组合。
各重链和轻链的全部氨基酸序列示于图13。
实施例5：用于治疗癌症的抗短TRAIL抗体
为了考察抗短TRAIL抗体在体内的效果，用组成型表达荧光素酶的Jurkat T细胞白血病细胞注射NSG小鼠，并每周两次测定荧光素酶表达。对于图14A～C所示的实验，在第27天用10mg/kg的IC抗体或抗短TRAIL抗体克隆2.2(例如实施例4中所述的鼠TRAILs 2.2)注射小鼠。24小时后(例如在第28天)，用抗TRAIL受体2(抗DR5)抗体(10mg/kg)注射小鼠。相对于用同种型对照处理的小鼠，在用抗短TRAIL抗体处理的小鼠中，代表性荧光素酶表达减少(图14A和14B)。在用抗短TRAIL抗体和抗DR5处理的小鼠中，荧光素酶表达显著减少(图14C)。用抗短TRAIL抗体和抗DR5处理的小鼠全部存活，而对照小鼠未全部存活，但是该差异不是统计学显著的(图14D)。这些结果显示，与同种型对照+抗DR5相比，TRAIL激动剂(抗DR5)存在下的短TRAIL抑制导致肿瘤控制的改善和存活的改善。对于图14D～E所示的实验，在第20、27和34天用10mg/kg的IC抗体或抗短TRAIL抗体克隆2.2注射小鼠。与用同种型对照抗体处理的小鼠相比，在用抗短TRAIL抗体处理的小鼠中，荧光素酶表达显著减少(图14E)，并且在用抗短TRAIL抗体处理的小鼠中，存活显著增加(图14F)。这些结果证明，单独或在抗DR5的存在下，抗短TRAIL抗体的体内给药可减少小鼠中白血病细胞的数量并延长小鼠的存活。
在不同的癌细胞系中考察抗短TRAIL抗体对sk-TRAIL细胞毒性的影响。将细胞以1×104个细胞每孔的密度接种于96孔板。然后，如所示将细胞与不同浓度(1～20μg/mL)的中和性抗短TRAIL抗体克隆2.2或IgG3对照一起在37℃下预孵育1小时。然后，如所示向细胞中添加1～10ng/mL的剂量的Sk-TRAIL。为了检测细胞死亡，向细胞中添加1:1000稀释的半胱天冬酶3/7凋亡试验试剂。对于细胞死亡的存活时间分析，每2小时使用系统来捕获细胞的实时图像。考察了淋巴瘤白血病细胞(图15A)、胰腺癌细胞(图15B)、黑色素瘤细胞(图15C)和卵巢癌细胞(图15D)。各处理重复实施三次。这些结果证明，在一些细胞系中，抗短TRAIL抗体和重组TRAIL一起起作用在癌细胞中诱导凋亡。
表4.抗短TRAIL抗体在不同的人癌细胞系中的作用。
*对单独的或与sk-TRAIL联用的抗短TRAIL抗体有响应的细胞系
为了考察不同癌细胞中的TRAIL表达，通过qRTPCR在不同的癌细胞中进行TRAILmRNA的定量。使用凯杰公司(Qiagen)RNeasy小试剂盒分离RNA。使用高容量cDNA反转录试剂盒将1μg的RNA反转录为cDNA。将cDNA稀释，并使用短TRAIL和TRAILFL的标准物来计算淋巴瘤白血病细胞、胰腺癌细胞、黑色素瘤细胞和卵巢癌细胞中的各基因的拷贝数(图16)。
为了进一步考察不同癌细胞中的TRAIL表达，以1:400的浓度使用短TRAIL 2.2抗体，通过免疫组织化学对来自组织微阵列的组织进行染色。如图17所示，来自胰腺、胃和前列腺的正常组织和相应的癌组织对于短TRAIL呈染色阳性。这些结果证明，与非恶性组织相比，癌组织的短TRAIL表达显著提高。
实施例6：用于治疗癌症的抗短TRAIL抗体
采用组织微阵列的免疫组织化学来观察多种癌症种类中的短TRAIL表达。用1:400稀释的抗短TRAIL抗体2.2实施的8份组织微阵列(TMA)汇总于图18和下表5。
表5.在组织微阵列的免疫组织化学中观察到的短TRAIL表达。
/>
/>
短TRAIL在许多人类肿瘤中存在(图19)。短TRAIL水平以每千个碱基的每百万读取(RPKM)定量。数据由癌症基因组图谱(TCGA)测定。
在一些人类肿瘤中，提高水平的短TRAIL与较差的存活相关联(图20)。存活是通过卡普兰-迈耶分析，针对患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(图20A)、结肠直肠腺癌(图20B)、嫌色性肾细胞癌(图20C)、胰腺癌(图20D)和胸腺瘤(图20E)的患者进行评估，并通过以每千个碱基的每百万转录物(TPM)计的短TRAIL表达水平进行分层。存活曲线由癌症基因组图谱(TCGA)测定。
抗短TRAIL抗体与短TRAIL抗原相互作用。用编码绿色荧光蛋白(GFP)、GFP-短TRAIL或GFP-TRAILFL的质粒转染HEK293T细胞，并通过共聚焦显微镜进行分析(图21)。
密码子优化得到了16种抗短TRAIL抗体变体。这些抗短TRAIL抗体的变体在与超级杀手(sk)-TRAIL联用的情况下对TRAIL诱导的针对Jurkat细胞的细胞毒性具有不同的影响，并且具有不同的亲和力(表6)。用表面等离振子共振分析亲和力。克隆HC2LC3显示出3.8pM的亲和力，并且在sk-TRAIL(1ng/ml)的存在下显示出显著的协同杀伤(图22)。
表6.密码子优化的抗短TRAIL抗体对TRAIL诱导的细胞毒性和亲和力的影响。
一些患者衍生的细胞对抗短TRAIL抗体+sk-TRAIL有响应，而其余的没有。将来自接受针对疑似血液恶性肿瘤的脾脏切除术的患者脾脏的细胞新鲜分离，不作处理(对照)或者用超级杀手TRAIL(sk-TRAIL，寡聚化TRAIL激动剂)、人源化抗短TRAIL抗体(克隆HC2LC3)或同种型对照抗体(IgG4)处理。使用Incucyte活细胞成像平台，通过经时地分析活性半胱天冬酶3/7的活性来经时地监测细胞死亡(图23)。
在不同的人类患者衍生的癌细胞系中评价抗短TRAIL抗体对sk-TRAIL细胞毒性的影响。将来自患者脾脏的细胞新鲜收取在RPMI中，并在存在或不存在递增剂量的抗短TRAIL克隆HC2LC3(1.25、2.5或5μg)的情况下，在1ng/mL剂量的sk-TRAIL的存在下测试对于细胞毒性的敏感性。对照用相同剂量的人IgG4处理。使用Incucyte，在72小时内，每2小时通过切割的半胱天冬酶3/7阳性细胞的数量来监测细胞死亡(图24)。
在多种人类患者衍生的癌细胞系中，对抗短TRAIL+sk-TRAIL的响应性高于对单独的sk-TRAIL的响应性。以1ng/mL的剂量用单独的sk-TRAIL进行处理或者用sk-TRAIL(相同剂量)+5μg/mL剂量的抗短TRAIL克隆HC2LC3进行处理后48小时的死细胞数量示于图25。响应性定义为在添加抗短TRAIL抗体后死细胞数量的统计学上的显著增加。所示为针对配对t检验的统计。
人类患者衍生的细胞系对单独的抗短TRAIL或抗短TRAIL与sk-TRAIL的联用的响应性示于图26和表7。响应性定义为相对于单独的sk-TRAIL处理、死细胞数量的统计学上的显著增加。
表7.人类患者衍生的细胞系对抗短TRAIL的响应性。
在各种响应性和非响应性细胞系中，使用实时qPCR进行短TRAIL mRNA的拷贝数的定量(图27A)，并且用与CF555偶联的抗短TRAIL 2.2或同种型对3种细胞系进行染色，通过流式细胞术来检测短TRAIL阳性的百分数(图27B)，藉此观察对抗短TRAIL有响应的细胞系中的短TRAIL表达增加。
考察了293T细胞和来自患者的肿瘤组织中的短TRAIL表达。用1:400稀释的抗短TRAIL抗体对短TRAIL进行染色的免疫组织化学片示于图28。
用抗DR5+抗短TRAIL抗体的组合有效地治疗植入了人Jurkat T细胞淋巴瘤细胞的NSG小鼠。通过IV注射将表达荧光素酶的Jurkat T细胞植入NSG小鼠。建立肿瘤并每2周进行处理，每14天用10mg/kg的(i)短TRAIL的同种型对照和DR5抗体的同种型(称为同种型)，(ii)抗短TRAIL抗体克隆2.2+抗DR5的同种型对照(称为抗短TRAIL)，(iii)抗短TRAIL抗体的同种型对照+抗DR5抗体(称为同种型对照+抗DR5)或(iv)抗短TRAIL(2.2)+抗DR5进行处理，如所示。经时地通过全身成像针对荧光素酶表达对小鼠进行分析(图29A)。通过卡普兰-迈耶分析来评估存活(图29B)。
抗短TRAIL抗体+同种型对照或抗短TRAIL抗体+抗DR5抗体导致人类癌症的小鼠异种移植物模型中肿瘤生长的抑制(图30)。将人弥漫性大B细胞淋巴瘤(HBL-1)细胞系皮下植入NSG小鼠，并每天测量肿瘤尺寸。当肿瘤达到大于或等于100mm3的尺寸时，通过每周的IP注射让小鼠接受指定的处理，每14天用10mg/kg的(i)短TRAIL和DR5抗体的同种型对照(IC+IC)，(ii)抗短TRAIL抗体克隆2.2+抗DR5的同种型对照(2.2+IC)，(iii)抗短TRAIL抗体的同种型对照+抗DR5抗体(IC+DR5)或(iv)抗短TRAIL(2.2)+抗DR5抗体(2.2+DR5)进行处理，如所示。经时地针对肿瘤尺寸和根据基线算出的变化倍数对小鼠进行分析(图30A)。通过卡普兰-迈耶分析来评估存活(图30B)。
考察了抗短TRAIL抗体克隆2.2的毒性和任何毒性作用的可逆性。使用十只C57BL/6小鼠(5雄5雌)。在第1天，以10mg/kg的剂量和5ml/kg的体积通过静脉内推注让动物接受抗短TRAIL抗体克隆2.2。研究过程中评价的参数包括皮肤、毛皮、眼睛和黏膜的变化，呼吸系统、循环系统、自主中枢神经系统、躯体运动活性、运动活性和行为模式、体重变化、以及对死亡率的影响。在生存部分的终点，将所有动物称重，人道处死，收集血液用于临床化学和血液学分析，并实施全面尸检。任何动物的身体状况、活性或行为均无异常或变化。每天对所有研究动物进行临床观察。在7天内每天观察所有研究动物两次。所有动物都在研究的持续时间内存活。所有动物都在研究过程中体重减轻，但最终体重是在处死前、禁食后收集的，所以不知道重量的减轻是由于禁食过程的缘故、抗短TRAIL抗体克隆2.2的缘故、还是它们的组合的缘故。在第8天，对所有存活的健壮动物进行血液学和临床化学的临床病理学研究。从腔静脈或心脏穿刺收集最终血液样品。在对雄性或雌性动物第1天IV注射抗短TRAIL抗体后的7天观察期内，在10只健康C57 BL/6小鼠的组中未观察到不良毒性。
在组织中可通过原位杂交(ISH)检出短TRAIL(图31)。将被SIV感染的猕猴组织用获自ACD公司(Advanced Cell Diagnostics)的全长TRAIL特异性探针或短TRAIL特异性探针(序列为383bp 5’-tcgttaga aagactccaa gaatgaaaag gctctgggcc gca-3’423bp(SEQID NO:31))染色，并放大10倍、20倍和40倍进行观察(图31)。将被SIV感染的猕猴腋窝淋巴结组织用TRAIL特异性探针和短TRAIL特异性探针染色。类似地，将被SIV感染的猕猴脾脏组织用TRAIL特异性探针和短TRAIL特异性探针染色。
其他实施方式
应理解，虽然结合具体说明描述了本发明，但上述说明旨在阐释而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书所限定。其他方面、优点和改进也在下述权利要求书的范围内。
序列表
<110> 梅约医学教育与研究基金会(Mayo Foundation for Medical Educationand Research)
<120> 短TRAIL抗体及使用方法
<130> 07039-1647WO1
<150> US 62/512,627
<151> 2017-05-30
<150> US 62/457,614
<151> 2017-02-10
<160> 31
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体VH CDR1结构域
<400> 1
Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Asn Asp Met Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体VH CDR2结构域
<400> 2
Gly Ile Asp Pro Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体VH CDR3结构域
<400> 3
Gly Arg Gly Gly Tyr Glu Phe Gly Ile Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体VH结构域
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Asn
20 25 30
Asp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asp Pro Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Phe Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asn Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Gly Tyr Glu Phe Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体VH结构域
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Asn
20 25 30
Asp Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asp Pro Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Gly Tyr Glu Phe Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体VH结构域
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Asn
20 25 30
Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asp Pro Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Gly Tyr Glu Phe Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体VH结构域
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Asn
20 25 30
Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asp Pro Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Ile Phe Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Gly Tyr Glu Phe Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体VH结构域
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Asn
20 25 30
Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asp Pro Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Arg Gly Gly Tyr Glu Phe Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体重链
<400> 9
Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe
35 40 45
Thr Asn Asn Asp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asp Pro Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Phe Ser Asn
85 90 95
Thr Val Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asn Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Gly Arg Gly Gly Tyr Glu Phe Gly Ile Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
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180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
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305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 10
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体重链
<400> 10
Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ile Phe
35 40 45
Thr Asn Asn Asp Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Gly Ile Asp Pro Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gly Arg Gly Gly Tyr Glu Phe Gly Ile Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
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210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 11
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体重链
<400> 11
Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn
85 90 95
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Gly Arg Gly Gly Tyr Glu Phe Gly Ile Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
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210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Pro Gly Lys
465
<210> 12
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体重链
<400> 12
Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys
465
<210> 13
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体重链
<400> 13
Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ile Phe
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Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp
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Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
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Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体VL CDR1结构域
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Ala
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 17
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Gly Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg
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100 105 110
Lys
<210> 18
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体VL结构域
<400> 18
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
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50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
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85 90 95
Asp His Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体VL结构域
<400> 19
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Lys
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<211> 113
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<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体VL结构域
<400> 20
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Lys
<210> 21
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体VL结构域
<400> 21
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
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Lys
<210> 22
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体轻链
<400> 22
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Gly Thr Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
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Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 23
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体轻链
<400> 23
Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
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Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
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115 120 125
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130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
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Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
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Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
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Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
<210> 24
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体轻链
<400> 24
Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
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Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
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100 105 110
Tyr Cys Gln Asn Asp His Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
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Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
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225 230 235 240
<210> 25
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体轻链
<400> 25
Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
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<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短TRAIL抗体轻链
<400> 26
Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln His
50 55 60
Lys Pro Gly Arg Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Glu Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Asn Asp His Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Lys Val Asp Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
<210> 27
<211> 149
<212> PRT
<213> 鼠科（Murine）
<400> 27
Met Gly Trp Ser Trp Ile Ile Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe
35 40 45
Thr Asn Asn Asp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asp Pro Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Phe Ser Asn
85 90 95
Thr Val Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asn Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Gly Arg Gly Gly Tyr Glu Phe Gly Ile Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser
130 135 140
Val Tyr Pro Leu Ala
145
<210> 28
<211> 163
<212> PRT
<213> 鼠科（Murine）
<400> 28
Met Val Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser Gly Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu
20 25 30
Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly
35 40 45
Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Pro
50 55 60
Pro Thr Leu Leu Ile Ser Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp
100 105 110
His Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
130 135 140
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Lys
<210> 29
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 30
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 30
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 31
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸探针
<400> 31
tcgttagaaa gactccaaga atgaaaaggc tctgggccgc a 41

Claims (15)

1.一种抗体，其结合短TRAIL，所述TRAIL是指肿瘤坏死因子TNF相关凋亡诱导配体，所述抗体包括：
包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述的互补决定区CDR的重链可变区VH结构域，其中，VH CDR1为SEQ ID NO:1，VH CDR2为SEQ ID NO:2，VH CDR3为SEQ ID NO:3；以及
包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所述的CDR的轻链可变区VL结构域，其中，VL CDR1为SEQ ID NO:14，VL CDR2为SEQ ID NO:15，VL CDR3为SEQ ID NO:16。
2.如权利要求1所述的抗体，其中，所述VH结构域包括与SEQ ID NO:6具有至少75％序列相同性的序列。
3.如权利要求2所述的抗体，其中，所述抗体是包括SEQ ID NO:6所述的VH结构域序列的人源化抗体。
4.如权利要求1所述的抗体，其中，所述重链包括选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的序列。
5.如权利要求1所述的抗体，其中，所述VL结构域包括与SEQ ID NO:20具有至少75％序列相同性的序列。
6.如权利要求5所述的抗体，其中，所述抗体是包括SEQ ID NO:20所述的VL结构域序列的人源化抗体。
7.如权利要求1所述的抗体，其中，所述轻链包括选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的序列。
8.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体是嵌合抗体。
9.如权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述嵌合抗体是人源化抗体。
10.如权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体是抗体的抗原结合片段。
11.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
12.结合短TRAIL的抗体在制备用于治疗人类免疫缺陷病毒感染的药物中的应用，所述TRAIL是指肿瘤坏死因子TNF相关凋亡诱导配体，所述抗体包括：包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所述的互补决定区CDR的重链可变区VH结构域，其中，VH CDR1为SEQ IDNO:1，VH CDR2为SEQ ID NO:2，VH CDR3为SEQ ID NO:3；以及包含SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16所述的CDR的轻链可变区VL结构域，其中，VL CDR1为SEQ ID NO:14，VL CDR2为SEQ ID NO:15，VL CDR3为SEQ ID NO:16；
其中所述抗体增强自然杀伤NK细胞毒性。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述抗体是人源化抗体。
14.结合短TRAIL的抗体在制备用于治疗(a)非霍奇金淋巴瘤B细胞谱系细胞周期蛋白D阳性或(b)脾弥漫性小B细胞淋巴瘤的药物中的应用，所述TRAIL是指肿瘤坏死因子TNF相关凋亡诱导配体，所述抗体包括：包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述的互补决定区CDR的重链可变区VH结构域，其中，VH CDR1为SEQ ID NO:1，VH CDR2为SEQ ID NO:2，VH CDR3为SEQ ID NO:3；以及包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所述的CDR的轻链可变区VL结构域，其中，VL CDR1为SEQ IDNO:14，VL CDR2为SEQ ID NO:15，VL CDR3为SEQ ID NO:16；
其中所述抗体在来自所述(a)非霍奇金淋巴瘤B细胞谱系细胞周期蛋白D阳性或(b)脾弥漫性小B细胞淋巴瘤的癌细胞中诱导凋亡。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述抗体是人源化抗体。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017218624A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
US11254733B2 (en) 2017-04-07 2022-02-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza B virus neuraminidase antibodies and uses thereof
CA3137160A1 (en) * 2019-04-24 2020-10-29 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof
WO2023235453A1 (en) * 2022-06-03 2023-12-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for modulating t cell activation using trailshort polypeptides
WO2023250127A1 (en) * 2022-06-24 2023-12-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating cancer with chimeric antigen receptors that bind to trailshort polypeptides

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5693323A (en) * 1994-12-23 1997-12-02 Smithkline Beecham Corporation Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
US6284236B1 (en) * 1995-06-29 2001-09-04 Immunex Corporation Cytokine that induces apoptosis
US6342369B1 (en) * 1997-05-15 2002-01-29 Genentech, Inc. Apo-2-receptor
IL136156A0 (en) 2000-05-16 2001-05-20 Compugen Ltd Sequences of trail variants
US20020155109A1 (en) 2001-04-20 2002-10-24 Lynch David H. Bispecific antibodies that bind TRAIL-R1 and TRAIL-R2
US7122185B2 (en) * 2002-02-22 2006-10-17 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR5 antibody
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
WO2008088582A2 (en) 2006-08-04 2008-07-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials related to trail isoforms
KR100804126B1 (ko) * 2007-02-09 2008-02-19 아주대학교산학협력단 종양 괴사 인자―관련 세포사멸―유도 리간드의 수용체에특이적으로 결합하는 1가의 인간 단일클론 항체 및 그의항원결합 단편
CL2010000019A1 (es) * 2010-01-11 2010-06-11 Univ Chile Anticuerpo monoclonal contra el tnf humano y sus fragmentos, secuencias nucleotidicas que lo codifican, vector de expresion y celulas que las contienen, composiciones y kit que comprenden el anticuerpo, uso de los mismos y metodo para su obtencion.
TWI728373B (zh) * 2013-12-23 2021-05-21 美商建南德克公司 抗體及使用方法
JOP20200096A1 (ar) * 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A D Badley等.Altering cell death pathways as an approach to cure HIV infection.《Cell Death & Disease》.2013,e718. *
DJ Schnepple等.Isolation of a TRAIL antagonist from the serum of HIV-infected patients.《JBC》.2011,第35742-35754页. *
Lucie Barblu等.Reduction of death receptor 5 expression and apoptosis of CD4 + T cells from HIV controllers.《Clinical Immunology》.2014,第17-26页. *

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