CN110482643A - 一种修复干细胞的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞修复技术领域，具体涉及一种修复干细胞的方法及应用。本发明在原有发明技术的基础上进行改进，通过具有占宽相等，间隔不等脉冲序列的脉冲波处理水获得了具有修复干细胞作用的脉冲波处理水。以脉冲波处理水制备的培养体系在不影响细胞增殖的基础上，不仅能够降低人脐带间充质干细胞(H‑MSC)的自然凋亡作用，还可以对损伤诱导的H‑MSC细胞凋亡起到抑制作用，具有细胞修复作用。

Description

一种修复干细胞的方法及应用
技术领域
本发明属于细胞修复技术领域，具体涉及一种修复干细胞的方法及应用。
背景技术
水是生命之源，原始状态下的水源是清澈见底，口感甘洌，随着时间与物质的富饶，环境变得越发恶劣，原始水源失去了它原有的样子，遭到破坏的水源频率发生了巨大的变化。由于现代化城市高楼林立，磁波交错干扰了这种频率，同时人的生物频率遭到干扰破坏，导致生命体出现病理性改变，迫使疾病产生。
目前，已有编码脉冲技术多数应用于电子行业。申请人于1999年7月12日申请了专利名称为《一种改进的脉冲处理仪》的中国发明专利(授权公告号为：CN1119289C)，该专利公开了通过对脉冲仪的脉冲序列和间隔的进行设置，并形成特定的脉冲周期，以该脉冲周期控制形成的远红外辐射波处理食物后，能够降低食物中自由基的浓度，达到保健作用，但是该处理技术使用范围有限。
针对现有技术及申请人早期公开的专利技术中的不足，申请人对现有的脉冲处理技术的具体参数及处理方式进行了改进，并以改进后的方式处理饮用水获得了一种脉冲波处理水，以该脉冲波处理水配置的培养基对干细胞进行培养，在不影响干细胞正常增殖的情况下，能够抑制干细胞的自然凋亡和诱导损伤凋亡，具有修复干细胞的作用。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种脉冲波处理水的方法，所述方法为：采用功率为28W，频率为1.5M的脉冲波辐射处理饮用水，所述脉冲波由若干个重复脉冲序列组成，所述重复脉冲序列由第一脉冲序列和第二脉冲序列间隔组成，第一脉冲序列和第二脉冲序列均由四个脉冲和四个间隔组成，所述第一脉冲序列的四个脉冲的占宽相等，脉冲占宽范围为1.3-3.5μs，四个脉冲间的间隔相同，脉冲间隔范围为0.7-3.1μs；所述第二脉冲序列的四个脉冲的占宽相等，脉冲占宽范围为1.1-3.9μs，第一、三个脉冲间隔相同，脉冲间隔范围为1.8-4.6μs，第二、四个脉冲间隔相同，脉冲间隔范围为0.9-2.3μs。
优选地，所述脉冲波辐射处理饮用水的次数为两次，每次30min。
本发明的目的在于提供另一种脉冲波处理水的方法，所述方法为：采用功率为35W，频率为1.9M的脉冲波辐射处理饮用水，所述脉冲波由若干个重复脉冲序列组成，所述重复脉冲序列由第一脉冲序列和第二脉冲序列间隔组成，第一脉冲序列和第二脉冲序列均由四个脉冲和四个间隔组成，所述第一脉冲序列的四个脉冲的占宽相等，脉冲占宽范围为1.3-3.5μs，四个脉冲间的间隔相同，脉冲间隔范围为0.7-3.1μs；所述第二脉冲序列的四个脉冲的占宽相等，脉冲占宽范围为1.1-3.9μs，第一、三个脉冲间隔相同，脉冲间隔范围为1.8-4.6μs，第二、四个脉冲间隔相同，脉冲间隔范围为0.9-2.3μs。
优选地，所述脉冲波辐射处理饮用水的次数为一次，共30min。
优选地，所述脉冲波由脉冲处理仪产生，所述脉冲处理仪包括脉冲序列发生器1、驱动电路2、辐射器7、处理平台11和空间储物区，所述处理平台11上装有饮用水或超纯水，所述脉冲序列发生器1由高频振荡器a、脉冲存储分频电路b和混频电路c组成，所述高频振荡器a、脉冲存储分频电路b和混频电路c串联连接；所述脉冲序列发生器1通过驱动电路2与辐射器7连接，所述空间储物区位于辐射器7的下方，所述处理平台11位于空间储物区上；所述高频振荡器a产生的高频振荡波通过脉冲存储分频电路b和混频电路c进行调制编码形成脉冲序列，形成的脉冲序列通过驱动电路2增大功率后加到辐射器7上；辐射器7辐射出的脉冲波辐射到处理平台11放置的饮用水或超纯水中。
优选地，所述空间储物区能够自由调节位置，保证入射的脉冲波与水形成不同的辐射高度和辐射角度，所述辐射角度范围为0-90°。
优选地，所述辐射角度为45°，辐射高度为55cm。
本发明的另一目的在于提供一种经脉冲波处理获得的脉冲波处理水，所述脉冲波处理水为脉冲波处理饮用水或脉冲波处理超纯水。
本发明的另一目的在于提供一种体外修复干细胞的方法，包括以下步骤：
(1)干细胞细胞复苏和传代扩增；
(2)取经脉冲波处理超纯水溶解Gibco DMEM干粉培养基，定容至1L，制备获得诱导培养基；
(3)培养干细胞24h后，更换诱导培养基进行诱导培养。
优选地，所述干细胞包括胚胎干细胞、脐带干细胞、胎盘干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞或脐血干细胞。
优选地，所述干细胞为人脐带间充质干细胞。
本发明的另一目的在于提供一种脉冲波处理超纯水在在制备促进干细胞体外修复的培养体系中的应用。
优选地，所述干细胞包括正常干细胞、自然凋亡干细胞、DMSO诱导损伤干细胞、阳性药物A+B诱导损伤干细胞、划痕干细胞。
本发明的另一目的在于提供一种脉冲波处理饮用水在制备中药制品、保健品、食品、饮品或化妆品中的应用。
本发明的有益效果是：①本发明通过对脉冲波的波形、频率和功率进行了限定，并通过该脉冲波辐射饮用水处理获得了脉冲波处理水，以该脉冲波处理水的方式，具有不接触水就能改变水分子结构中氢氧键夹角，增加水中的溶解氧含量，提高水中锶、钾、钙、铁等有利元素的含量，降低砷、钡、隔、锰等重金属元素以及有机物；②本发明获得的脉冲波处理水能够抑制干细胞凋亡，具有干细胞修复作用，特别是对于人脐带间充质干细胞的修复；③并且本发明获得的脉冲波处理水对干细胞增殖基本无影响，对干细胞生长发育是安全可靠的。
附图说明
图1为脉冲处理仪的电路图，其中，1-脉冲序列发生器，2-驱动电路，3-报警电路，4-主CPU控制单元，5-电源变换器，6-档位切换开关，7-辐射器，8-空间储物区1，9-空间储物区2，10-水，11-处理平台，a-高频振荡器，b-脉冲存储分频电路，c-混频电路；
图2 H-MSC细胞的生长增值图；图2a为H-MSC细胞的生长增值曲线，图2b为H-MSC细胞的传代培养后的增值情况；
图3实时动态成像系统对H-MSC细胞自然死亡数目变化情况的监控图
图4 H-MSC细胞的自然凋亡图；图4a为H-MSC细胞自然死亡变化曲线，图4b为H-MSC细胞接种24h后自然死亡数；
图5实时动态成像系统对DMSO诱导H-MSC细胞损伤死亡数目变化情况的监控图
图6 DMSO诱导H-MSC细胞损伤死亡图；其中图6a为H-MSC细胞诱导损伤变化曲线，图6b为H-MSC细胞接种24h后诱导死亡数
图7实时动态成像系统对阳性试剂诱导H-MSC细胞损伤死亡数目变化情况的监控图
图8阳性试剂诱导H-MSC细胞损伤死亡图；其中图8a为H-MSC细胞诱导损伤变化曲线，图8b为H-MSC细胞接种24h后诱导死亡数
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。
实施例中相关术语及仪器材料的说明
本发明中的脉冲波处理水在实施例中均为超纯水经脉冲波处理获得的生命之水。
本发明中的生命之水是通过辐射角度小于90°的脉冲波辐射处理饮用水获得的脉冲波处理水，其中辐射角度为45°时辐射角处理获得的脉冲波处理水的水质最佳。
主要仪器：实时动态活细胞成像系统(RT-LCI)；CO2培养箱；编码脉冲处理仪(由专利号为ZL 99109583.9专利文献所述的脉冲处理仪改进后获得)；
主要材料：人脐带间充质干细胞P4代(H-MSC)(赛莱拉SC-08-003，NA)；细胞培养6孔板(Coming 3516，1966040728)；Essen#4379 ImageLock Plates培养板(Essen 4379，17050401)；死亡染料Cell killing-488(Themro YOYO-1，NA)；DMSO(sigma RNBG989，202008)；细胞凋亡阳性诱导试剂(细胞凋亡诱导试剂A+细胞凋亡诱导试剂B)(碧云天C0005，NA)；生命之水-1为采用功率为28W，频率为1.5M的脉冲波处理超纯水两次，每次30min获得脉冲波处理水；生命之水-2为采用功率为35W，频率为1.9M的脉冲波处理超纯水1次共30min获得脉冲波处理水。
实施例1脉冲仪处理仪及工作原理
一种脉冲处理仪，包括脉冲序列发生器1、驱动电路2、报警电路3、主CPU控制单元4、电源变换器5、档位切换开关6、辐射器7、处理平台11和空间储物区，所述空间储物区包括空间储物区1和空间储物区2，空间储物区1和空间储物区2平行排列，保证脉冲波入射角度小于90°，所述处理平台11上装有超纯水，所述脉冲序列发生器1由高频振荡器a、脉冲存储分频电路b和混频电路c组成，所述高频振荡器a、脉冲存储分频电路b和混频电路c串联连接；所述脉冲序列发生器1通过驱动电路2与辐射器7连接，所述空间储物区于辐射器7的下方，所述处理平台11位于空间储物区上；所述主CPU控制单元4分别与报警电路3、电源变换器5和档位切换开关6连接，所述档位切换开关6又分别与电源变换器5和辐射器7连接，所述档位开关6包括Ⅰ档S1和Ⅱ档S2，所述Ⅰ档功率为28W，频率1.5M，所述Ⅱ档功率为35W，频率为1.9M；
脉冲处理仪的工作原理：首先，主CPU控制器单元4负责面板各种上按键，指示灯，报警器，定时器的控制，并将指令发送至报警电路3、电源变换器5、档位切换开关6，电源变换器5将由降压器降压后的市电(220v)处理后，输出处理后的电压到不同单元，为整个系统提供各种电源；其次，脉冲序列发生器1中的高频振荡器a产生的高频振荡波通过脉冲存储分频电路b和混频电路c进行调制编码形成脉冲波序列，编码形成的脉冲波序列通过驱动电路2增大功率后加到辐射器7上，辐射器7辐射出的脉冲波辐射到处理平台11放置的超纯水中；最后，切换档位切换开关6，调整脉冲处理仪的功率和频率，控制脉冲波的脉冲强度和时间。
实施例2脉冲处理仪处理获得生命之水
2.1生命之水的制备
生命之水-1的制备：采用改进的脉冲处理仪产生的脉冲波辐射处理超纯水两次，每次30min，所述脉冲波由若干个重复脉冲序列组成，所述重复脉冲序列由第一脉冲序列和第二脉冲序列间隔组成，第一脉冲序列和第二脉冲序列均由四个脉冲和四个间隔组成，所述第一脉冲序列的四个脉冲的占宽相等，脉冲占宽范围为1.3-3.5μs，四个脉冲间的间隔相同，脉冲间隔范围为0.7-3.1μs；所述第二脉冲序列的四个脉冲的占宽相等，脉冲占宽范围为1.1-3.9μs，第一、三个脉冲间隔相同，脉冲间隔范围为1.8-4.6μs，第二、四个脉冲间隔相同，脉冲间隔范围为0.9-2.3μs，脉冲波的功率为28W，脉冲波频率为1.5M，辐射高度为55cm，辐射角度为45°；
生命之水-2的制备：采用改进的脉冲处理仪产生的脉冲波辐射处理超纯水1次共30min，所述脉冲波由若干个重复脉冲序列组成，所述重复脉冲序列由第一脉冲序列和第二脉冲序列间隔组成，第一脉冲序列和第二脉冲序列均由四个脉冲和四个间隔组成，所述第一脉冲序列的四个脉冲的占宽相等，脉冲占宽范围为1.3-3.5μs，四个脉冲间的间隔相同，脉冲间隔范围为0.7-3.1μs；所述第二脉冲序列的四个脉冲的占宽相等，脉冲占宽范围为1.1-3.9μs，第一、三个脉冲间隔相同，脉冲间隔范围为1.8-4.6μs，第二、四个脉冲间隔相同，脉冲间隔范围为0.9-2.3μs，脉冲波功率为35W，脉冲波频率为1.9M，辐射高度为55cm，辐射角度为45°。
2.2水质检测结果
经脉冲波处理获得的生命之水，经兰州大学用激光拉曼光谱检测，水分子的结构氢氧键夹角由104.5℃扩大到180℃，为非极性；并且水中氢、氧原子的电子云角度重合，水中溶解氧含量增加12％以上，PH值成弱碱性；经国家食品药品监督局指定部门检测，水中的锶、钾、钙、铁等有利元素升高，砷、钡、隔、锰等重金属元素下降，有机物降低；以该生命之水烧水沸腾后壶中水垢能够自行脱落。
实施例3 H-MSC细胞生长增殖实验
3.1分组与培养
H-MSC细胞复苏、传代扩增，显微镜下观察确保细胞状态良好，待细胞融合度达80％，分为4组(正常组、对照组、生命之水-1组和生命之水-2组)，分别接种于6孔板，每孔细胞接种量为1.2×105个，培养体系为2mL/孔。
3.2培养
待细胞接种24h后，更换培养基进行诱导培养，培养条件为：H-DMEM培养基+10％FBS(BI胎牛血清)+1％双抗+5％CO2+37℃；其中正常组H-DMEM培养基为商品化H-DMEM培养基(Coming 03318002，201908)；对照组培养基是由超纯水溶解Gibco DMEM干粉培养基配制而成的；生命之水-1组培养基是由生命之水-1溶解Gibco DMEM干粉培养基配制而成的；生命之水-2组培养基是由脉冲波处理水-2溶解Gibco DMEM干粉培养基配制而成的。
3.3 H-MSC细胞生长增值测定
利用实时动态成像系统对细胞进行监控，细胞诱导培养2代，观察并测定生命之水诱导传代72h内H-MSC细胞的生长增殖情况。
3.4测定结果
结果如图2所示，以生命之水配置的培养基培养H-MSC细胞的生长曲线与正常组和以纯水配置的培养基培养H-MSC细胞的生长曲线基本一致，且培养72h后，生命之水-1组和生命之水-2组H-MSC细胞的增值数与对照组和正常组比较无显著性差异(其中P＞0.05，n＝8)，结果表明生命之水不会影响H-MSC细胞的正常增值，对细胞生长发育是安全可靠性。
实施例4 H-MSC细胞自然凋亡实验
4.1分组与培养
将H-MSC细胞分为3组(对照组、生命之水-1组和生命之水-2组)，分别诱导培养2代后(诱导培养方式同实施例2下述2.2)，待细胞融合度达60％，接种于Essen#4379ImageLock Plates培养板，每孔细胞接种量为8000个，培养体系为150μL/孔。
4.2 H-MSC细胞自然死亡数目测定
每组设3孔作为平行对照，细胞接种24h后，加入最终浓度为1μM死亡染料Ki488，利用实时动态成像系统对细胞进行监控，观察并测定细胞自然死亡数目变化情况。
4.3测定结果
实时动态成像系统对细胞进行监控结果如图3所示，对照组H-MSC细胞死亡明显，与对照组相比，生命之水-1组和生命之水-2组H-MSC细胞死亡明显降低。图4结果显示，生命之水-1组和生命之水-2组H-MSC细胞自然死亡曲线缓慢，且低于对照组；在培养24h后的细胞死亡数显著低于对照组(P＜0.001，n＝8)，说明，用不同脉冲强度处理的生命之水培养体系，对H-MSC细胞自然凋亡，表现出细胞的活性，抑制细胞自然凋亡，且死亡数目与对照组比较，差异显著，证明了生命之水能够促进新陈代谢，改变细胞环境，保证细胞正常分化。
实施例5 H-MSC细胞诱导杀伤实验
5.1 2％DMSO诱导H-MSC细胞损伤实验
5.1.1分组与培养
分组与培养同实施例3下述3.1。
5.1.2 H-MSC细胞自然死亡数目测定
每组设3孔作为平行对照，细胞接种24h后，各组细胞更换成含有2％DMSO的培养基，加入最终浓度为1μM死亡染料Ki488，利用实时动态成像系统对细胞进行监控，观察2％DMSO诱导H-MSC细胞损伤死亡数目变化情况。
5.1.3测定结果
实时动态成像系统对细胞进行监控结果如图5所示，对照组H-MSC细胞经2％DMSO诱导后死亡明显，与对照组相比，生命之水-1组和生命之水-2组H-MSC细胞死亡明显降低。图6结果显示，生命之水-1组和生命之水-2组H-MSC细胞经2％DMSO诱导后的死亡曲线缓慢，且低于对照组；在培养24h后的细胞死亡数显著低于对照组(P＜0.001，n＝8)，说明，不同脉冲强度处理的生命之水培养体系对H-MSC细胞受到2％DMSO诱导损伤时，表现出对生存环境较强的适应能力，能够显著抑制细胞损伤凋亡，具有一定的修复作用。
5.2阳性诱导试剂诱导H-MSC细胞损伤实验
5.2.1分组与培养
分组与培养同实施例3下述3.1。
5.2.2 H-MSC细胞自然死亡数目测定
每组设3孔作为平行对照，细胞接种24h后，组细胞更换成含有1/1250原液的阳性诱导试剂的培养基，加入最终浓度为1μM死亡染料Ki488，利用实时动态成像系统对细胞进行监控，观察阳性诱导试剂诱导H-MSC细胞损伤死亡数目变化情况。
5.2.3测定结果
实时动态成像系统对细胞进行监控结果如图7所示，对照组H-MSC细胞经含有1/1250原液的阳性诱导诱导后细胞死亡明显，与对照组相比，生命之水-1组和生命之水-2组H-MSC细胞死亡明显降低。图8结果显示，生命之水-1组和生命之水-2组H-MSC细胞经含有1/1250原液的阳性诱导试剂诱导后的死亡曲线缓慢，且低于对照组；在培养24h后的细胞死亡数显著低于对照组(P＜0.001，n＝8)，说明，不同脉冲强度处理的生命之水培养体系对H-MSC细胞受到阳性诱导试剂诱导凋亡时，表现出细胞的抗感染能力与排毒功能远超对照组，减缓细胞死亡，细胞的生存能力强于对照组，差异显著，能够显著抑制细胞损伤凋亡，具有一定的修复作用。
综上所述，用脉冲仪处理超纯水配置的培养基培养H-MSC细胞时，不仅不会影响H-MSC细胞的正常增值，而且能够显著抑制H-MSC细胞的自然凋亡损伤和诱导损伤凋亡，具有干细胞修复作用。

Claims (14)

1.一种脉冲波处理水的方法，其特征在于，采用功率为28W，频率为1.5M的脉冲波辐射处理饮用水，所述脉冲波由若干个重复脉冲序列组成，所述重复脉冲序列由第一脉冲序列和第二脉冲序列交替组成，第一脉冲序列和第二脉冲序列均由四个脉冲和四个间隔组成，所述第一脉冲序列的四个脉冲的占宽相等，脉冲占宽的范围为1.3-3.5μs，四个脉冲间的间隔相同，脉冲间隔的范围为0.7-3.1μs；所述第二脉冲序列的四个脉冲的占宽相等，脉冲占宽的范围为1.1-3.9μs，第一、三个脉冲间隔相同，脉冲间隔的范围为1.8-4.6μs，第二、四个脉冲间隔相同，脉冲间隔的范围为0.9-2.3μs。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脉冲波辐射处理饮用水的次数为两次，每次30min。
3.一种脉冲波处理水的方法，其特征在于，采用功率为35W，频率为1.9M的脉冲波辐射处理饮用水，所述脉冲波由若干个重复脉冲序列组成，所述重复脉冲序列由第一脉冲序列和第二脉冲序列交替组成，第一脉冲序列和第二脉冲序列均由四个脉冲和四个间隔组成，所述第一脉冲序列的四个脉冲的占宽相等，脉冲占宽的范围为1.3-3.5μs，四个脉冲间的间隔相同，脉冲间隔的范围为0.7-3.1μs；所述第二脉冲序列的四个脉冲的占宽相等，脉冲占宽的范围为1.1-3.9μs，第一、三个脉冲间隔相同，脉冲间隔的范围为1.8-4.6μs，第二、四个脉冲间隔相同，脉冲间隔的范围为0.9-2.3μs。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述脉冲波辐射处理饮用水的次数为一次，共30min。
5.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述脉冲波由脉冲处理仪产生，所述脉冲处理仪包括脉冲序列发生器(1)、驱动电路(2)、辐射器(7)、处理平台(11)和空间储物区，所述处理平台(11)上装有饮用水或超纯水，所述脉冲序列发生器(1)由高频振荡器(a)、脉冲存储分频电路(b)和混频电路(c)组成，所述高频振荡器(a)、脉冲存储分频电路(b)和混频电路(c)串联连接；所述脉冲序列发生器(1)通过驱动电路(2)与辐射器(7)连接，所述空间储物区位于辐射器(7)的下方，所述处理平台(11)设置于空间储物区上；所述高频振荡器(a)产生的高频振荡波通过脉冲存储分频电路(b)和混频电路(c)进行调制编码形成脉冲序列，形成的脉冲序列由驱动电路(2)增大功率后加到辐射器(7)上，辐射器(7)辐射出脉冲波辐射到处理平台(11)放置的饮用水或超纯水中，处理获得脉冲波处理水。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述空间储物区能够自由调节位置，保证入射的脉冲波与水形成不同的辐射高度和辐射角度，所述辐射角度范围为0-90°。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述辐射角度为45°，辐射高度为55cm。
8.根据权利要求1-4任一所述方法处理获得的脉冲波处理水，所述脉冲波处理水为脉冲波处理饮用水或脉冲波处理超纯水。
9.一种体外修复干细胞的方法，包括以下步骤：
(1)干细胞细胞复苏和传代扩增；
(2)取经权利8所述的脉冲波处理超纯水溶解Gibco DMEM干粉培养基，定容至1L，制备获得诱导培养基；
(3)培养干细胞24h后，更换诱导培养基进行诱导培养。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述干细胞包括胚胎干细胞、脐带干细胞、胎盘干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、脐血干细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述干细胞为人脐带间充质干细胞。
12.如权利要求8所述的脉冲波处理超纯水在制备促进干细胞体外修复的培养体系中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述干细胞包括正常干细胞、自然凋亡干细胞、DMSO诱导损伤干细胞、阳性药物A+B诱导损伤干细胞、划痕干细胞。
14.如权利要求8所述的脉冲波处理饮用水在制备中药制品、保健品、食品、饮品或化妆品中的应用。
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