CN110478356A - 氯硝柳胺在治疗弓形虫病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了氯硝柳胺在治疗弓形虫病中的应用；氯硝柳胺对人包皮成纤维细胞的半数抑制浓度为：8.3μg/mL。当培养基中氯硝柳胺的浓度高于100ng/mL时，可以完全抑制虫体的入侵并呈剂量依赖。当氯硝柳胺的浓度的升高，处理孔内的包囊数，速殖子数，和纳虫囊泡内的平均虫体数均降低呈剂量依赖。氯硝柳胺对弓形虫速殖子的半数抑制浓度EC₅₀值为45.3ng/mL；可采用口服和灌胃治疗氯硝柳胺弓形虫病。氯硝柳胺可以抑制弓形虫速殖子的入侵和胞内复制，保护弓形虫急性感染的小鼠，超微结构观察显示，氯硝柳胺对弓形虫的抑制作用可能与虫体内部的线粒体氧化磷酸化有关。本发明表明氯硝柳胺细胞毒性小，可以作为治疗弓形虫病的候选药物。

Description

氯硝柳胺在治疗弓形虫病中的应用

技术领域

本发明涉及氯硝柳胺在治疗弓形虫病中的应用。

背景技术

弓形虫是专性胞内寄生原虫，隶属于顶复门(Apicomplexa)孢子虫纲(Sporozoasida)球虫亚纲(Coccidiasina)真球虫目(Eucoccidiorida)艾美耳亚目(Eimeriina)弓形虫科(Toxoplasmatidae)弓形虫属(Toxoplasma)，弓形虫属下只有一个种，为刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)常称其为弓形虫。

免疫系统正常的个体来说，患弓形虫病临床表现一般为无症状，而在免疫缺陷患者中就可能会危及生命。在这些免疫缺陷患者中，弓形虫病几乎都是反复发作的。弓形虫病的典型的临床表现为：单纯性的颈部或枕部淋巴结肿大。而弓形虫感染引起的视网膜脉络膜炎经常呈现覆膜的白色病灶和强烈的玻璃体炎症反应。中枢神经系统是受感染最典型和最严重的部位。弓形虫感染引起中枢神经系统受损，造成脑炎，临床表现包括精神状态改变、癫痫发作、局部运动障碍、颅神经紊乱、感觉异常、小脑症候、运动障碍和神经精神病的症状。免疫功能低下的弓形虫病患者也会发生脉络膜视网膜炎、肺炎，常表现为急性呼吸衰竭和类似感染性休克的血液动力学异常。在骨髓移植患者和艾滋病患者中，弓形虫肺炎似乎更为常见。胎儿先天性弓形虫病临床表现为脑积水、小头畸形、颅内钙化、脉络膜视网膜炎、斜视、失明、癫痫、智力障碍、血小板减少引起的出血和贫血等。

临床治疗通常用乙胺嘧啶、磺胺嘧啶和叶酸的联合应用治疗弓形虫感染，但治疗常常伴有副作用，且治疗不彻底，易复发。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中治疗弓形虫感染，治疗常常伴有副作用，且治疗不彻底，易复发的缺陷，提供一种氯硝柳胺在治疗弓形虫病中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

氯硝柳胺对人包皮成纤维细胞的半数抑制浓度为：8.3μg/mL。

为考察氯硝柳胺对弓形虫速殖子入侵HFF细胞的影响。在培养基中加入氯硝柳胺后加入弓形虫速殖子孵育2h，弃去药物培养基继续培养24h，用Giemsa染色观察氯硝柳胺对弓形虫入侵宿主细胞的影响，试验结果显示甘草查尔酮的浓度高于100ng/mL时，可以完全抑制虫体的入侵并呈剂量依赖。

为确定氯硝柳胺的抗虫体增殖效果和准确测定对虫体增殖的EC₅₀，首先，建立了用荧光定量PCR仪，评价虫体荷载量的方法，并采用此方法对不同浓度的氯硝柳胺作用下的虫体荷载量进行测定，计算氯硝柳胺对弓形虫的EC₅₀。同时，用Giemsa染色法观察不同浓度的氯硝柳胺对弓形虫增殖的影响。结果显示，建立的评价虫体荷载量的荧光定量PCR的方法精密度和回收率的RSD值均小于5。Giemsa染色表明：随着氯硝柳胺浓度的升高，处理孔内的包囊数，速殖子数，和纳虫囊泡内的平均虫体数均降低呈剂量依赖。用荧光定量PCR测定在各个氯硝柳胺浓度下的虫体荷载量，结果与Giemsa染色结果一致，并且通过计算得出，氯硝柳胺对弓形虫速殖子的半数抑制浓度EC₅₀值为45.3ng/mL。

为探究氯硝柳胺抑制虫体增殖的机制，采用JC-1染色，观察药物孵育后虫体线粒体膜电位下降；采用ATP试剂盒测定ATP水平，药物孵育后，虫体的ATP水平下降，且呈剂量依赖性。表明氯硝柳胺可能是通过干扰虫体线粒体的氧化磷酸化过程而引起虫体死亡。

在体内，建立体内弓形虫急性感染模型，采用口服灌胃的方式对不同浓度氯硝柳胺的体内抗虫效果进行评价。氯硝柳胺的口服灌胃时剂量分别为160、200、240mg/kg.bw时，存活率分别为20、40、50％。治疗7天后，测定小鼠组织内虫体数显著下降。

本发明所达到的有益效果是：氯硝柳胺可以抑制弓形虫速殖子的入侵和胞内复制，保护弓形虫急性感染的小鼠，超微结构观察显示，氯硝柳胺对弓形虫的抑制作用可能与虫体内部的线粒体氧化磷酸化有关。本发明表明氯硝柳胺细胞毒性小，可以作为治疗弓形虫病的候选药物。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是氯硝柳胺抗弓形虫胞内增殖情况；

图2是氯硝柳胺影响弓形虫线粒体功能。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1不同浓度氯硝柳胺处理后速殖子的增殖情况

感染前一天将HFF接种于6孔板种，接种量为1×10⁵个/孔，第二天细胞基本长满80％时，接种速殖子，接种量为2×10⁶个/孔，放入培养箱培养6h，弃去培养基，用PBS清洗2遍去除未感染的虫体，加入不同浓度的氯硝柳胺培养基(30-100ng/mL)，阳性药物选用阿奇霉素(8.6μg/mL)和磺胺嘧啶(0.4μg/mL)，阴性对照组只加感染培养基，孵育24h，孵育期间每隔12h观察一次虫体的生长状况和细胞的状态，24h后取出用4％的中性多聚甲醛固定10min，PBS清洗两遍，Giemsa染色，镜下拍照观察。

实施例2：荧光定量PCR测定不同浓度氯硝柳胺处理后虫体荷载量。

为评价不同药物、不同浓度下的虫体荷载量，进行此次试验。感染前一天将HFF接种于6孔板种，接种量为1×10⁵个/孔，次日细胞基本长满80％时，接种弓形虫速殖子，接种量为1×10⁵个/孔，放入CO₂培养箱培养6h，弃去培养基，用PBS清洗2遍去除未感染的虫体，加入不同浓度的氯硝柳胺培养基(30-100ng/mL)，阳性药物选用阿奇霉素(8.6μg/mL)和磺胺嘧啶(0.4μg/mL)，阴性对照组只加感染培养基，每个做三个重复，孵育24h，弃去培养基，PBS清洗两遍，进行总DNA的提取和相对表达量的测定，并换算各个样本(T样)和阴性对照(T阴)的虫体荷载量。计算各个浓度下的增殖率并做图，用抑制率做Probit回归分析，找到抑制率为50％时所对应的浓度。增殖率＝T样/T阴×100％，抑制率＝1-(T样/T阴)。

实施例3：氯硝柳胺影响弓形虫线粒体氧化磷酸化

(1)线粒体膜电位下降

胞外速殖子1×10⁶个/孔用氯硝柳胺孵育后，JC-1染色后，缓冲液洗涤两次后，共聚焦观察荧光变化，用荧光酶标仪检测荧光强度。

(2)透射电子显微镜样品制备

胞外速殖子1×10⁶个/孔用氯硝柳胺孵育后，裂解液裂解后，采用荧光酶标液测定ATP染色后，用荧光酶标仪检测上清液的荧光强度。

图1为本发明氯硝柳胺抗弓形虫胞内增殖情况；用qPCR测定氯硝柳胺对HFF细胞弓形虫感染的抗增殖作用。未经治疗(对照)或使用氯硝柳胺(30、40、50、60、70、80、90或100ng/ml)和对照化合物(阿奇霉素或磺胺嘧啶)治疗的HFF细胞感染了弓形虫。感染后24小时，通过靶向T.gondii基因组529bp重复序列测定各组T.gondii DNA的含量。比较各组与阳性对照组对速殖酸盐增殖的抑制率。数据以三个独立实验的平均值±s.d.表示。*与对照组相比P≤0.01。

图2是本发明氯硝柳胺影响弓形虫线粒体功能；50ng/ml氯硝柳胺(c)或不含药物作为阳性对照和阴性对照的DMEM中分别培养8h，然后用CCCP培养阴性对照，以耗尽ΔΨm。所有样品均用JC-1染色。用激光共聚焦显微镜观察荧光强度(A，B，C)，用荧光酶标仪测定各组JC-1的红/绿荧光强度的比值。结果显示至少三个独立实验的平均值±s.d.。*与阳性对照组比较P≤0.01。比例尺：20μm。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.氯硝柳胺在治疗弓形虫病中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，氯硝柳胺对人包皮成纤维细胞的半数抑制浓度为：8.3μg/mL。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，当培养基中加入氯硝柳胺后加入弓形虫速殖子孵育2h，弃去药物培养基继续培养24h，氯硝柳胺的浓度高于100ng/mL时，可以完全抑制虫体的入侵并呈剂量依赖。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，当氯硝柳胺的浓度的升高，处理孔内的包囊数，速殖子数，和纳虫囊泡内的平均虫体数均降低呈剂量依赖。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，氯硝柳胺对弓形虫速殖子的半数抑制浓度EC₅₀值为45.3ng/mL。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，可采用口服灌胃治疗氯硝柳胺弓形虫病。