CN110462374B - 用于分析具有无标记细胞的生物样本中是否存在感染物的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
一种分析包括多个无标记细胞的生物样本以确定该样本是否包括被感染物感染的细胞的离体方法，包括：利用光束光学地捕获生物样本中的无标记细胞，以及以光谱方式研究所捕获的无标记细胞以实时地确定所捕获的无标记细胞是否被感染物感染。
Description
技术领域
本发明涉及用于分析具有无标记细胞的生物样本中是否有异物或者感染物存在于细胞中或附着至细胞的离体方法和系统。
背景技术
诊断工具诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和基于核酸的测试与不准确的结果相关联，分别需要标记和底物(substrate)并且不能实时产生结果。因此，这些诊断工具不太适合在资源有限的环境中进行定点照护(POC，point-of-care)诊断，并且需要开发迅速、准确并且克服了这些挑战中的至少一些挑战的新型诊断工具。
实现用于检测生物因子的无标记技术的需求促进了对不同方法的发现，以在研究生物样本潜在的物理和化学特性的同时减少复杂性和准备时间。光谱术尤其是透射光谱术被认为是用于对生物材料的无标记研究的潜在候选。该方法是已在制药行业以及生物和医学领域广泛应用的实时、无创的光学检测技术。透射光谱图被用于例如区分人类血红细胞与血白细胞以及区分癌细胞与非癌细胞种类。常规透射光谱术的缺点是：该方法对细胞进行总体平均测量并且总体测量产生关于平均特性的信息。结果，通过对测量进行平均而掩盖了单个细胞的信息和特性。另外，采用透射光谱术，样本厚度和样本的不均匀性可能导致透射信号的严重损失。透射测量常常使用底物或水性细胞悬液——其中样本不均匀分布并因此是不均匀的——在固定化细胞上进行，这可能会产生光谱假象。这些假象通常会改变峰强度并导致对结果的错误解释。因此，本发明旨在实时稳定地分离和研究单个细胞。
光学捕获是用于对悬浮在液体培养基中的病毒、细菌和细胞进行微操作的宝贵的工具。该技术本质上使用光粒子的动量经由来自通过高数值孔径物镜发射的紧密聚焦的激光束的辐射压力的力来任意保持、定向和输送单个粒子或单个细胞。这种细胞固定化使得能够对单独的细胞进行准确的研究。用于光学捕获的近红外激光器的使用使得能够以无标记的方式进行非粘附细胞的无创操作。
发明内容
本发明提供了一种分析包括多个无标记细胞的生物样本以确定该样本是否包括被感染物感染的细胞的离体方法，该方法包括：
利用光束光学地捕获生物样本中的无标记细胞；以及
以光谱方式研究所捕获的无标记细胞以实时地确定所捕获的无标记细胞是否被感染物感染。
“感染物”意指能够侵入或感染宿主细胞或者附着至宿主细胞并且在宿主体内产生疾病或病症的异物或者病原微生物，其中，该感染物可以是或者可以包括病毒、细菌或其他微生物。在本发明的至少一个实施方式中，该感染物是病毒。
“无标记”意指不包括诸如酶、放射性同位素、DNA探针、荧光报道子(reporter)、电化学发光标签或其他外来元素的标示物的细胞，该标示物通常用于检测感染物在细胞中的存在。
1970年由Arthur Ashkin首次报道的还被称为“光学钳法”的光学捕获，现在是保持微观粒子稳定的公知的非接触技术。光学捕获通常采用高度聚焦的激光束(通常被称为光学钳子)以提供通常是皮牛级的吸引力或排斥力，以在物理上保持和/或移动微观的介电目标。该技术在文献中被很好地描述，包括其捕获单独病毒和细菌并且对细胞和胶体分类的用途。
光谱术也是依赖于物质与辐射能例如电磁辐射之间的相互关系来表征该物质的公知的分析技术。
据发明者所知，光学捕获，特别是与光谱术结合的光学捕获还没有被用于确定生物样本是否包括被感染物诸如病毒感染的无标记细胞。
光束可以是激光束，例如波长为1064nm的Nd:YAG(掺钕钇铝石榴石)激光束。
当感染物是病毒时，该病毒可以是导致人体免疫缺陷病毒(HIV)感染并且随着时间推移导致获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的HIV。在本发明的至少一个实施方式中，病毒可以是HIV-1。
无标记细胞可以悬浮在流体例如液体或溶液中。
光学地捕获生物样本中的无标记细胞可以包括：捕获无标记细胞，并且如果需要，将无标记细胞转移在二维平面或在三维空间中。通常，光学地捕获生物样本中的无标记细胞包括：捕获无标记细胞，并且如果需要，将无标记细胞转移在三维空间中。
在本说明书中，“实时”旨在指示在开始被捕获的细胞的光谱研究起几分钟——例如，不到4分钟、不到3分钟、不到2分钟或者不到1分钟——之内可获得针对被捕获的无标记细胞的结果。
以光谱方式研究所捕获的无标记细胞可以附加地指示生物样本中的病毒感染程度，例如，病毒载量。
该方法可以迭代地或重复地实施，从而研究多个被捕获的无标记细胞。研究多个被捕获的无标记细胞可以增加研究的准确性或者提供附加的信息或诊断。
光学地捕获无标记细胞和以光谱方式研究所捕获的无标记细胞各自可以借助于激光束完成。光学地捕获无标记细胞和以光谱方式研究所捕获的无标记细胞可以借助于相同的激光束或不同的激光束来完成。光学地捕获无标记细胞和以光谱方式研究所捕获的无标记细胞可以同时或顺序地完成。
以光谱方式研究所捕获的无标记细胞可以包括确定透射值或吸收值。该透射值或吸收值可以指示无标记细胞是否被感染物感染。因此，以光谱方式研究所捕获的无标记细胞以实时地确定所捕获的无标记细胞是否被感染物感染可以采用吸收光谱术或透射光谱术来检测细胞中是否存在感染物，诸如病毒，例如HIV。在本发明的一个实施方式中，采用近红外(通常在750nm至1400nm光的范围内)透射光谱术。
本方法可以包括生成表示被捕获的无标记细胞的至少一个光谱特性的光谱图。该光谱图可以示出来自在单个被捕获的无标记细胞上进行的多次测量的平均信号光谱。该光谱图可以采用常规的光谱技术进行分析。
本方法可以包括将光谱图与条件阈值作比较。例如，如果该光谱图的光谱特性(比如，光学透射)在该条件阈值的一侧(比如，下方)，这指示感染物(比如，HIV)存在；如果该光谱图的光谱特性(比如，光学透射)在条件阈值的另一侧(比如，上方)，这可以指示感染物(比如，HIV)不存在。
条件阈值可以是预定义阈值。可以基于先前生物样本——其中感染物存在与否是预先知道的——的先验分析(比如，统计分析)来预定义该条件阈值。
本发明扩展至一种用于分析包括多个无标记细胞的生物样本以确定该样本是否包括被感染物感染的细胞的系统，该系统包括激光装置和光学检测器，其中：
激光装置被配置成发射光学捕获激光束，该光学捕获激光束被配置成从生物样本中光学地捕获并分离单个无标记细胞；
激光装置被配置成朝向所捕获的无标记细胞发射诊断激光束；以及
光学检测器被配置成检测与所捕获的无标记细胞相互作用之后的诊断激光束，其中，所检测的激光束的至少一个光谱特性能够实时获得并且指示所捕获的无标记细胞是否被感染物感染。
激光装置可以被配置成：以被选择成使得诊断激光束部分地透射穿过所捕获的无标记细胞的波长来发射诊断激光束。
在一个实施方式中，激光装置可以包括单个激光束发射器，该单个激光束发射器被配置成发射光学捕获激光束和诊断激光束。光学捕获激光束和诊断激光束可以被同时发射。光学捕获激光束和诊断激光束可以是相同的激光束。光学捕获激光束和诊断激光束可以被顺序地发射。
在另一实施方式中，激光装置可以包括多个激光束发射器，其中一个激光束发射器被配置成发射光学捕获激光束，另一个激光束发射器被配置成发射诊断激光束。光学捕获激光束和诊断激光束可以被同时发射。光学捕获激光束和诊断激光束可以被顺序地发射。
激光装置可以包括至少一个激光二极管以发射光学捕获激光束和/或诊断激光束。该激光二极管可以是红外激光二极管。该激光二极管可以被配置成发射连续波。该激光二极管可以具有1064nm±10％的发射波长。该激光二极管可以具有0.1W至10W，更具体地0.5W至3.0W，比如1.5W的输出功率。
优选地，光学捕获激光束被操作成或配置成使得不会对正被研究的所捕获的无标记细胞造成光毒性损害和/或热损害。
光学捕获激光束可以是单射束梯度力陷阱。
光学捕获激光束可以具有少于或小于无标记细胞的相应测量的横截面积或直径。
附图说明
现在将参考附图通过示例的方式来进一步描述本发明。
在附图中：
图1示出了作为示例的用于测量TZM-bl感染和未感染的单细胞的透射率和吸收光谱的光学捕获光谱实验系统；
图2示出了作为示例的用于记录背景信号、参考信号和透射信号的过程；
图3示出了作为示例的在1060nm到1068nm之间记录的细胞生长培养基、具有HIV-1病毒的细胞生长培养基以及1064nm处的激光的透射光谱；
图4示出了作为示例的在载物台移动之前(A)和之后(B)和(C)相继光学捕获的二氧化硅小球的图像序列，其中捕获功率60mW，箭头指示周围未被捕获的小球的移动；
图5示出了作为示例的样本室中的处于悬浮的TZM-bl细胞，其中被捕获的细胞在聚焦平面中并且未被捕获的细胞在第二平面上看起来离焦且模糊；
图6示出了作为示例的在载物台移动之前(A)和之后(B)分别光学地捕获的未感染的TZM-bl单细胞，以及在载物台移动之前(C)和之后(D)相继光学地捕获的HIV-1感染的单细胞，其中捕获波长为1064nm，功率60mW，箭头指示周围未被捕获的细胞的移动；
图7示出了作为示例的细胞生长培养基和具有HIV-1病毒的细胞生长培养基的在9425cm-1和9375cm-1处的透射光谱；
图8示出了作为示例的具有全范围光谱的细胞生长培养基中悬浮的被分别捕获的HIV-1感染的细胞和HIV-1未感染的细胞的透射光谱平均数据；以及
图9示出了作为示例的与十个未被感染的细胞相比的十个被感染的细胞的透射光谱峰值。
具体实施方式
本发明的以下描述被提供为本发明的实现教示。相关领域的技术人员将认识到：可以对所述实施方式进行多种改变，同时仍然获得本发明的有益结果。还明显的是，可以通过选择本发明的一些特征而不使用其他特征来获得本发明的一些期望的益处。因此，本领域的技术人员将认识到：对本发明的修改和调整是可行的，在某些情况下甚至可以是期望的，并且是本发明的一部分。因此，提供以下描述作为本发明的原理的说明，而不是对本发明的限制。
本发明包括光学捕获系统与激光透射光谱术的新颖组合，其使用单射束梯度陷阱来确定与单个被捕获的无标记HIV-1感染细胞相关联的相对于单个被捕获的无标记HIV-1未感染细胞的光谱透射强度的变化，并且在这样做时，实时识别被捕获的细胞是否被HIV-1感染。
材料和方法
细胞培养
在补充有10％胎牛血清(FBS)(Biochrom，S0615)和1％青霉素-链霉素(Sigma-Aldrich，P4333)抗生素的杜尔贝克改良的Eagle培养基(DMEM)(Sigma-Aldrich，D5796)中使用T-75通气顶培养瓶(The Scientific Group，430641U)培养TZM-bl细胞。在37℃、5％CO2和85％湿度(最佳条件)的孵化器中孵育所培养的细胞，直至达到70％至80％的汇合度，随后用胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)(Sigma-Aldrich，T4049)进行胰蛋白酶化至下一传代(passage)。
样本准备
在最优条件下，将细胞以2x104的浓度接种在具有23mm直径的1型玻璃盖玻片的直径为35mm的玻璃底部培养皿中48小时。细胞被分为两组即HIV感染的细胞和HIV未感染的细胞进行培养。在孵育时间之后，用1ml 1X Hanks平衡盐溶液(HBSS)(Gibco)冲洗平皿(plate)。将等体积的500μl胰蛋白酶加至平皿并孵育3分钟，另外1ml的10％生长培养基被添加以停止胰蛋白酶化。每个平皿的溶液被转移至2ml的微量离心管，在该微量离心管中经由微型离心机(Corning LSE高速微型离心机6767HS)以2200rpm将溶液离心5分钟。
在上清液丢弃之后，将细胞团块重悬在500μl的新鲜生长培养基中，将每组50μl体积转移至新管并加满至500μl，从而将重悬细胞以1:10的稀释度稀释至生长培养基混合物。在光学装置上观察之前，将每组500μl的总体积分别转移至具有1型玻璃盖玻片的35mm的玻璃底部培养皿中。为了进行透射实验，首先通过从激光强度信号中减去背景光并且具有激光强度参考来进行强度背景减去和标准化，之后，分析两组细胞，即HIV-1感染的细胞和HIV-1未感染的细胞。
光学捕获的光谱装置
图1示出了与透射光谱系统结合的光学捕获。在该系统中，L1至L7是透镜，M1至M2是红外镜，M3是银镜，DM是分色镜并且BS是分束器。该系统使用可调谐的单连续波(CW)二极管激光束，其输出波长为1064nm，产生1.5W的最大输出功率，其中M2<1.2，并且功率稳定性为0.108％(MIL-S-1064-A，中国长春新产业(Changcun New Industries))。1.8mrad发散度的1mm直径高斯激光束穿过九倍扩束器(有效地实现了包括焦距分别为50mm和450mm的两个透镜的望远镜)，以稍微地填满100x 1.25NA的油浸式显微镜物镜的后孔径。
射束操纵透镜中继器(具有相同焦距的双透镜系统)被插入在射束路径上以在射束不会远离其在显微镜物镜的后孔径的位置移动的情况下操纵单射束陷阱穿过样本。包含银镜以将激光束重定向至显微镜物镜的后孔径。100x物镜将激光束通过培养皿聚焦至尺寸为1.08μm的衍射极限斑，在放置有细胞溶液的培养皿的玻璃底部上方约10μm。培养皿被放置在自动移动的载物台上。
激光束既被用于光学捕获，也被用于激光透射光谱术。使用长工作距离物镜(焦距为200mm)采集从样本透射的激光并将
照明系统耦合至样本平面。所采集的透射激光束通过40mm焦距的透镜聚焦至单模光纤中，以将光引导至Andor(Andor Technology Ltd(安道尔科技有限公司)，7Millenium Way，Springvale Business Park，Belfast BT 127AL(贝尔法斯特BT 12 7AL斯普林维尔商业园千禧路7号)英国)光谱仪(Shamrock 303i)的入口狭缝上，并且通过Andor iStar 734系列CCD摄像机检测透射光谱。iStar摄像机被空气冷却至-20℃以减小暗电流的影响。被捕获的细胞的图像通过用
照明系统照射的摄影机(Watec，W96N15832 CCD摄像机)查看。
数据处理
使用Andor的Solis软件记录透射光谱数据。依据光子计数来表示透射强度，光子计数是对透射穿过被捕获的细胞的光的测量。在光学捕获透射光谱实验之前，记录强度背景校正和激光透射强度以从信号中减去背景光并且具有激光强度参考。
图2示出了为了记录背景信号、参考信号和透射信号要遵循的过程的示意图。强度背景是通过记录暗信号而获得的，其中，激光器关闭并且在培养皿中没有样本。以相同的方式记录参考强度，其中，激光打开并且在培养皿中没有样本。类似地，测量信号，其中激光器打开并且培养皿中充满培养基和TZM-bl细胞，从而光学地捕获一个细胞。
在数据处理中，透射光谱以由下式给出的透射百分比来表示：
其中，IT是透射百分比强度，IS是信号强度，IB是背景强度，并且I0是参考强度。
对于每个被捕获的细胞，根据Andor Solis软件记录50个光谱并且计算和自动绘制平均光谱。获得的光谱被导出到OriginPro 8中以用于数据分析。这些过程是在上述两组的十个不同的被捕获的细胞上进行的。使用Ocean Optics(海洋光学)软件获得的吸收光谱被导出到OriginPro 8中以用于数据分析。
结果
本发明涉及捕捉和捕获具有无标记细胞的样本内的单独TZM-bl细胞(HIV-1感染的和HIV-1未感染的)，并且对单个细胞或多个单细胞执行透射光谱分析。据认为，可以通过分析HIV-1感染的细胞与HIV-1未感染的细胞之间的透射光谱强度的变化来实现实时区分HIV-1感染的细胞与HIV-1未感染的细胞的能力。首先，研究细胞生长培养基对透射强度的影响，其中，样本厚度约1mm的两个培养皿中分别装有500μl的有病毒的细胞生长培养基和无病毒的细胞生长培养基。
图3示出了有病毒的细胞培养基和无病毒的细胞培养基相对于激光强度的透射强度下降。注意到激光强度的透射的大约80％的下降。然而，在有HIV-1病毒的细胞生长培养基与无HIV-1病毒的细胞生长培养基之间观察到的透射光谱看起来相对相似。其透射百分比保持相似，在20％处。这是细胞生长培养基中的病毒不影响透射光谱技术的指示。
为了创建光学陷阱，将通过100x物镜传递的60mW的1064nm激光用于捕获TZM-bl细胞。高斯射束具有M2<1.2和0.108％的良好的功率稳定性。光学捕获系统的特征在于：使用用于捕获球形二氧化硅小球的完善协议(Lee WM，Reece PJ，Marchington RF，Metzger NK和Dholakia K(2007)Construction and calibration of an optical trap on afluorescence optical microscope.Nature Protocols 2(12):3226-3238)并且如文献所指出地通过评估捕获效率来确定捕获的质量，即q值。
图4示出了二氧化硅小球被采集时的图像序列(从图4的A至图4的C)。这些图像显示了处于中心的被捕获的小球(图4的A)，并且周围是未被捕获的小球。在载物台移动后(图4的B和图4的C)，中心的小球保持被捕获，而周围的小球则如箭头所指示地移动。这些图像是用60μm/s的载物台速度记录的。此处获得的结果是成功捕获的指示。针对不同的载物台速度和激光功率来重复本方法以确定q值。测量的q值为大约0.045。这与在文献中发现的范围从0.03至0.1(Lee等.2007)的值很好地吻合。
图5示出了在聚焦平面中捕获的典型的单个细胞，而未被捕获的细胞处于第二图像平面上并且离焦。
图6描绘了光学捕获系统使未感染的TZM-bl单个细胞和HIV-1感染的TZM-bl单个细胞固定的能力。箭头指示未被捕获的细胞的移动。对于TZM-bl被HIV-1感染的细胞，形态和生物分子组成与未被感染的细胞不同。如在图6的C和图6的D中所观察到的，与图6的A和图6的B中未被感染的细胞相比，被感染的细胞呈现颗粒状。假定：该差异导致未被感染的TZM-bl细胞和HIV-1感染的TZM-bl细胞产生不同的透射光谱。
图7示出了有病毒的细胞生长培养基和无病毒的细胞生长培养基的透射强度。对于两个样本，注意到激光强度的大约20％透射。在有HIV-1病毒的细胞生长培养基与没有HIV-1病毒的细胞生长培养基之间观察到的透射光谱看起来相对相似。其透射百分比保持相似，在20％处。通常，透射光谱强列地依赖于样本的生化组成、均匀性和样本厚度(Mourant JR，Gibson RR，Johnson TM，Carpenter S，Short KW，Yamada YR和Freyer JP(2003)Methods for measuring the infrared spectra of biological cells.Phys MedBiol 48:243-257)。25μl总量的病毒被添加至细胞生长培养基，并且示出光谱无差异。这表明细胞生长培养基中的病毒不影响透射光谱技术。
分离的被感染的单个TZM-bl细胞和未被感染的单个TZM-bl细胞的透射光谱如图8所示。每个光谱都是通过对十个被捕获的细胞进行平均而获得的。所有的透射光谱表现出相似的特征并且其峰在1064nm处。然而，不同TZM-bl细胞的光谱显示了其峰幅度的变化。这些结果与Ma等(Ma H，Zhang Y和Ye A(2013)Single-cell discrimination based onoptical tweezers Raman spectroscopy.Chinese Science Bulletin，Nano-BiomedicalOptoelectronics Materials and Devices 58(21):2594-2600)的发现相关。被感染的TZM-bl细胞和未被感染的TZM-bl细胞分别呈现出大约16.77％和18.80％的透射百分比。通常，透射光谱依赖于如下参数，诸如样本厚度、入射射束的角度和偏振、细胞几何形状的不均匀性(Deng JL，Wei Q，Zhang MH，Wang YZ和Li YQ(2005)Study of the effect ofalcohol on single human red blood cells using near-infrared laser tweezersRaman spectroscopy.J Raman Spectrosc 36:257-261)以及所研究的样本的吸收系数。
所有的细胞都是以相同方式培养的，并且在细胞周期的相同阶段准备被感染的TZM-bl细胞样本和未被感染的TZM-bl细胞样本。假设细胞是均匀的。另外，保持样本厚度(路径长度)恒定。该透射百分比的差异可以被假设性地归因于(被感染的和未被感染的)两个细胞的折射率的差异，并且因此归因于其散射系数的差异，因为在透射光谱术中起主要作用的其他参数是恒定的。若干证据证实：HIV-1感染可以在宿主细胞(包括TZM-bl细胞)中引发大范围的反应。这些反应涉及将病毒蛋白加工成改变TZM-bl细胞的生化组成的肽分子。结果，将由于折射率的变化而修改散射系数。此外，图9证明：未被感染的TZM-bl捕获细胞的透射百分比保持大于HIV-1感染的捕获细胞的透射百分比。
已经开发了使用近红外激光的新颖光学捕获透射光谱技术以用于对样本中的病毒感染(比如，HIV感染)的细胞和未被感染的细胞进行实时光谱分析和识别。光学捕获系统与红外透射光谱术的组合能够在没有任何光毒性损害和/或热损害的情况下提供被感染的TZM-bl细胞和未被感染的TZM-bl细胞的无标记捕获和透射光谱。结果表明：HIV-1感染的细胞与未被HIV-1感染的细胞的透射光谱之间存在惊人且显著的差异。因此，透射数据意外地示出：可以在不需要标记或标示物的情况下实时光学地区分被感染的细胞和未被感染的细胞。使用二氧化硅小球以及与文献中报道的范围一致的捕获质量因数对系统的光学捕获部件进行测试和校准。
尽管本公开内容重点在于具有无标记细胞的离体样本中的HIV-1的光学和光谱实时识别，但是本发明在包括细菌和其他病毒的其他感染物的无标记识别中也具有潜在应用。
Claims (6)
1.一种用于分析包括多个无标记细胞的生物样本以确定所述样本是否包括被人体免疫缺陷病毒HIV病毒感染的细胞的系统，所述系统包括激光装置、光学检测器以及数据处理装置，其中：
所述激光装置被配置成发射光学捕获激光束，所述光学捕获激光束被配置成从所述生物样本中光学地捕获并分离单个无标记细胞；
所述激光装置被配置成朝向所捕获的无标记细胞发射诊断激光束；
所述激光装置被配置成发射一定波长的所述诊断激光束，以使得所述诊断激光束部分地透射穿过所捕获的无标记细胞；
所述光学检测器被配置成检测所述诊断激光束在穿过所捕获的无标记细胞之后的信号强度，并将检测到的信号强度实时地提供给所述数据处理装置；以及
所述数据处理装置被配置成实时地计算所捕获的无标记细胞的透射值或吸收值，并且在计算出的所捕获的无标记细胞的透射值低于针对所捕获的不含所述HIV病毒的无标记细胞计算出的透射值时，或者在计算出的所捕获的无标记细胞的吸收值高于针对所捕获的不含所述HIV病毒的无标记细胞计算出的吸收值时，指示所捕获的无标记细胞被所述HIV病毒感染。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述激光装置包括单个激光束发射器，其中，所述单个激光束发射器被配置成发射所述光学捕获激光束和所述诊断激光束二者。
3.根据权利要求2所述的系统，其中，所述光学捕获激光束和所述诊断激光束是相同的激光束。
4.根据权利要求1所述的系统，其中，所述激光装置包括多个激光束发射器，其中一个激光束发射器被配置成发射所述光学捕获激光束，另一个激光束发射器被配置成发射所述诊断激光束，并且其中，所述光学捕获激光束和所述诊断激光束被同时发射或顺序发射。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的系统，其中，所述激光束发射器或每个激光束发射器均是被配置成发射连续波的红外激光二极管。
6.根据权利要求1所述的系统，其中，所述数据处理装置被配置成评估透射光谱，其中，所述透射光谱用由如下等式给出的透射百分比表示：
其中，IT是透射百分比强度，IS是所测量的诊断激光束的信号强度，IB是在没有所述诊断激光束和所述生物样本的情况下获得的背景强度，并且I0是在有所述诊断激光束而没有所述生物样本的情况下获得的参考强度。
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