CN110441102B - 一种用于解吸电喷雾电离质谱的干血斑载体材料及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于解吸电喷雾电离质谱的干血斑载体材料及其在磷脂组学中的应用；所述干血斑载体材料由玻璃片和固定在玻璃片上的PARAFILM组成，PARAFILM上设有点样槽。由于PARAFILM为非纤维素基材料，对化合物的吸附作用较纤维素基材料弱，使得化合物可以更有效地解吸出来；另外，PARAFILM其组成成分本身在电喷雾作用下很难电离，在质谱分析中的也不易带来载体材料本身的杂质信号；所述点样槽一方面可以使得血液样本不再扩散，提高化合物强度，另一方面起到固定血液斑点的作用。本发明解决了用于DBSS的非纤维素基材料在DESI‑MS分析中的技术缺陷，使得扩大DBSS DESI‑MS的研究领域成为可能。

Description

一种用于解吸电喷雾电离质谱的干血斑载体材料及其应用

技术领域

本发明涉及血液检测和代谢组学分析技术领域，更具体地，涉及一种用于解吸电喷雾电离质谱的干血斑载体材料及其在磷脂组学中的应用。

背景技术

磷脂是所有细胞膜的主要组成成分，它在细胞功能的调控方面扮演着重要的角色，对磷脂的分析将有助于我们深入了解磷脂在有机生物体的生理功能以及其与疾病发生的联系。因此有必要建立一套专注于分析磷脂化合物的高效、高通量的分析检测方法。

随着质谱技术的发展，2004年普渡大学的Cooks团队开发出了一种直接、高通量的分析样品的技术，解吸电喷雾电离(DESI)，即不论是固态还是液态样品，均能以最少的前处理甚至在“零处理”条件下，在大气压环境进行分析。当分析液体样品时，为了满足DESI直接分析表面样品的需要，液体样本通常被点样在通用的基底上，待溶剂蒸发形成干斑后进行分析，这种制样方法又称作干基质制样(DMSS)；当基质为血液时，即为干血斑制样(DBSS)。然而，DBSS与DESI-MS相结合的最大技术难点是用于血液样本的载体材料。在现有的报道中，血液样本主要点样于纤维素基材料，如滤纸和采血卡，但这类材料对化合物有一定的吸附能力，影响化合物在DESI-MS分析中解吸效果，并且会带来载体材料本身的杂质信号。而使用非纤维素基材料虽然一定程度上可以规避纤维素基材料的弊端，如采用玻璃片为载体材料，但遗憾的是，血液斑点在此类材料的附着能力差，容易在DESI-MS分析中脱落导致采集失败。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种解吸电喷雾电离质谱的干血斑载体材料。

本发明的第二个目的在于提供上述干血斑载体材料在磷脂组学中的应用。

本发明的第三个目的在于提供基于上述干血斑制样联合解吸电喷雾电离质谱的磷脂组学方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

PARAFILM由美国BEMIS公司生产的一种半透明，有柔性的热塑性塑料；是一种高性能防水材料，本身无色，无嗅，无味。PARAFILM可以快速有效地密封实验器皿；具有防水防湿的性能，有效阻止样品发挥和污染，有效保护无水物质。而本发明研究发现，PARAFILM可用于干血斑制样，作为干血斑载体材料。由于PARAFILM为非纤维素基材料，对化合物的吸附作用较纤维素基材料弱，使得化合物可以更有效地解吸出来；另外，PARAFILM为一种石油蜡与聚烯烃的混合物，不仅具有可塑性和易获得的特，其组成成分本身在电喷雾作用下很难电离，在质谱分析中的也不易带来载体材料本身的杂质信号。

因此，本发明首先保护PARAFILM在制备或用于干血斑载体材料中的应用。

一种用于解吸电喷雾电离质谱的干血斑载体材料，由玻璃片和固定在玻璃片上的PARAFILM组成；所述PARAFILM上设有点样槽。

优选地，所述点样槽的容积为5μL。

优选地，所述点样槽为圆形的立体凹槽。

优选地，所述点样槽直径为4～6mm(优选为4mm)。

优选地，所述点样槽的深度为1～2mm(优选1mm)。

优选地，所述点样槽为若干个，相邻两个点样槽之间间隔2～4mm(优选3mm)。

优选地，所述玻璃片为DESI分析用的玻璃片。

本发明还请求保护上述干血斑载体材料的制备方法，为先在PARAFILM上压印点样槽，然后将PARAFILM固定在玻璃片上。

本发明还请求保护所述干血斑载体材料在磷脂组学中的应用。

一种基于干血斑制样联合解吸电喷雾电离质谱对干血斑进行磷脂组学分析的方法，包括以下步骤：

S1.干血斑制备：取血清样本点样于上述任一项所述干血斑载体材料上，于室温下干燥后上机测试；

S2.使用解吸电喷雾电离质谱检测上述干血斑样本，通过数据处理与数据分析，建立磷脂组学分析。

优选地，所述解吸电喷雾电离质谱的质谱参数为：毛细管电压±5kV，雾化气8.0bar，锥孔电压45V，离子源温度150℃。

优选地，解吸电喷雾电离质谱的几何参数为：MS inlet到TaperTipTM喷针的水平距离为4mm；TaperTipTM喷针到样品表面的垂直距离为2mm；MS inlet的底部与样品表面的垂直距离为0-1mm，喷雾器的入射角为55°。

优选地，所述血清样本点样量为5μL。

优选地，所述解吸电喷雾电离质谱的喷雾溶剂为乙腈，喷雾流速为10μL/min。

作为一种优选地可实施方式，当进行日本血吸虫感染动物体后的磷脂组学分析时，所述分析方法包括如下步骤：

(1)将健康小鼠分为2组，正常对照组与日本血吸虫感染42天组；正常对照组不做处理，感染组小组感染日本血吸虫；

(2)样本的收集：实验小鼠麻醉后，进行眼底静脉丛采集全血，室温静置至血液凝固后，室温条件下10000g离心10min，收集上清液为血清样本，-80℃分装冻存。

(3)干血斑制备：取血清样本点样于上述任一项所述干血斑载体材料上，并在室温下(24℃)置于干燥器中干燥后上机测试；

(4)使用优选参数后的解吸电喷雾电离质谱检测上述干血斑样本，通过数据处理与数据分析，建立磷脂组学分析。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了一种用于解吸电喷雾电离质谱的干血斑载体材料，所述干血斑载体材料，对化合物的吸附作用较纤维素基材料弱，使得化合物可以更有效地解吸出来，同时所述干血斑载体材料在电喷雾作用下很难电离，在质谱分析中的也不易带来载体材料本身的杂质信号；所述点样槽一方面可以使得血液样本不再扩散，提高化合物强度，另一方面起到固定血液斑点的作用。本发明的干血斑载体材料解决了用于DBSS的非纤维素基材料在DESI-MS分析中的技术缺陷，使得扩大DBSS DESI-MS的研究领域成为可能。

(2)本发明提供一种基于干血斑制样联合解吸电喷雾电离质谱的磷脂组学方法，对采用DESI-MS采集的所有干血斑样本中的数据进行模型构建及判别分析来进行高通量、简便、无预处理的磷脂组学分析。

附图说明

图1为采用PARAFILM制备得到的干血斑载体材料的结构示意图。

图2为不同干血斑载体材料在DESI-MS分析中对磷脂信号强度的影响。

图3为化合物的质谱成像图。

图4为实验组PCA得分图。

图5为实验组OPLS-DA得分图。

图6为OPLS-DA模型验证图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

一种用于解吸电喷雾电离质谱的干血斑载体材料，制备材料包括空白载玻片(76mm×26mm)和PARAFILM；制备过程如下：

采用定制平底圆柱体在PAFAFILM压印每一个点样槽为圆形立体凹槽，每个点样槽直径4～6mm，本实施中使用4mm直径的平底圆柱体压印每一个点样槽直径为4mm，既能保证5μL的血液样本能够固定在载体中，也能使得同一张载体材料上能设置更多的点样槽。每个点样槽深度为1～2mm，本实施中使用的为单层PARAFILM，压印深度约为1mm，既能保证5μL的血液样本能够固定在载体中，也能避免深度过深或过浅导致的斑点凹凸。每相邻的两个点样槽之间间隔长度为2～4mm，本实施中每相邻的两个点样槽之间间隔长度为3mm，防止制样过程和采集过程的交叉污染；再将压印有点样槽的PARAFILM使用双面胶带固定于载玻片上(76mm×26mm)，制备得到干血斑载体材料；所述干血斑载体材料的具体结构如图1所示：由DESI分析用的玻璃片及固定在玻璃片上的PARAFILM组成，且PARAFILM上设有若干个点样槽。

实施例2

一种基于干血斑制样联合解吸电喷雾电离质谱仪对所制备干血斑进行磷脂组学分析，包括如下步骤：

1、日本血吸虫感染小鼠模型建立

无特定病原体(Specific Pathogens Free，SPF)BALB/c雌性小鼠，6–8周龄，平均体重18±2g，分为正常对照组(0dpi)和日本血吸虫感染42天组(42dpi)，每组5只小鼠。正常对照组不做处理，感染组小鼠按常规方法进行感染：取日本血吸虫阳性钉螺置于去氯水中，在无风、无震荡、25℃～28℃光照条件下逸放尾蚴2h，用接种环蘸取水面尾蚴收集至盖玻片上。小鼠麻醉后腹部朝上固定于鼠板，腹部剃毛后使用去氯水湿润，经腹部贴片法感染20min(30±2条尾蚴/小鼠)。

2、样本的收集与处理

健康小鼠麻醉后，进行眼底静脉丛采集全血，室温静置至血液凝固后，室温条件下10 000r/min离心10min，收集上清液为血清样本，-80℃分装冻存。

3、载体材料预处理

(1)纤维素基材料：903采血卡，双环定量滤纸；将修剪过的采血卡与滤纸使用双面胶带固定于载玻片上(76mm×26mm)以进行干血斑制样。

(2)非纤维素材料：空白载玻片(76mm×26mm)、实施例1制备得到的干血斑载体材料；将上述干血斑载体材料进行干血斑制样。

4、干血斑的制备

移取5μL血液样本，点样于载体材料上，并在室温下(24℃)置于干燥器中干燥后上机测试。

5、载体材料优选

本实施例考察了上述载体材料在DBSS DESI-MS分析中对磷脂信号强度的影响：分别移取血液样本，点样于不同的载体材料上，采用所选磷脂化合物进行效果评估(见表1所选磷脂的鉴定信息)。

表1所选磷脂的鉴定信息

*使用一级精确质量数鉴定

从图2可以看出，在所选载体材料中，PARAFILM制成载体材料表现出最强的总信号强度，整体信号比其它材料高出1～2个数量级。这是由于PARAFILM这种非纤维素基材料对化合物的吸附作用较纤维素基材料弱，使得化合物可以更有效地解吸出来；PARAFILM材料又是一种石油蜡与聚烯烃的混合物，其组成成分本身在电喷雾作用下很难电离，从而降低了背景信号的干扰。

因此，选择PARAFILM作为DBSS DESI-MS分析中的载体材料。

6、基于上述样本与载体材料进行磷脂组学分析，具体分析条件如下：

(1)仪器设备：SYNAPT G2-Si HDMS(Waters,Milford,MA,USA)，配备2D-DESI离子源(Prosolia,Zionsville,IN,USA)

(2)DESI-MS实验条件

DESI-MS质谱参数：毛细管电压±5kV，喷雾溶剂流速10μL/min，雾化气8.0bar，锥孔电压45V，离子源温度150℃。

DESI-MS几何参数：MS inlet到TaperTipTM喷针的水平距离为4mm；TaperTipTM喷针到样品表面的垂直距离为2mm；MS inlet的底部与样品表面的垂直距离为0-1mm，喷雾器的入射角为55°。

(3)数据采集与处理

采用High Definition Imagine(HDI)软件进行数据采集、处理与成像重构。数据采集过程中同时采集空白样本数据，设为空白组(blank)，以排除系统噪音、载体材料杂质以及仪器系统背景的干扰。

采集参数：数据采集模式为DESI MS模式；采集模式为Resolution mode；扫描范围为m/z 100–1200，水平方向与垂直方向的扫描速率设置为200μm/s，扫描时间1.0秒，像素分辨率为200μm。

成像重构参数：提取离子设置为1000个，提取范围为m/z 400–1000；在默认设置下，质量窗口和分辨率分别选择为0.02Da和20000；本实验采用400pg/μL亮氨酸-脑啡肽作为内标化合物对质谱图像进行了归一化处理。

从质谱成像图(图3)可以看出，与0dpi相比，可直观地观察到代谢物在42dpi中含量明显提高，表明两组间代谢物表达具有差异性。

(4)数据分析

通过HDI软件导出原始数据，并导入Progenesis QI软件中进行滤噪、峰提取之后提取出包含样本信息与归一化离子强度的峰值表；将所得峰值表通过MetaboAnalyst进行分析，为了考察感染组与对照组磷脂代谢的变化，采用无监督的主成分分析(图4)和有监督的正交偏最小二乘法判别分析(图5，图6)方法来表征差异性，R²值为模型的解释率，Q²值为模型的预测率。

从0dpi与42dpi的主成分分析和正交偏最小二乘法判别分析的得分图可以发现，两组之间存在一定的分离趋势；由模型验证图可以看出，正交偏最小二乘法判别分析的拟合度和预测能力良好，说明所选载体材料可有效地进行代谢组学研究。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种干血斑载体材料在解吸电喷雾电离质谱中的应用，其特征在于，所述干血斑载体材料由玻璃片和固定在玻璃片上的PARAFILM组成，PARAFILM上设有点样槽；先在PARAFILM上压印点样槽，然后将PARAFILM固定在玻璃片上。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述点样槽直径为4～6 mm。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述点样槽的深度为1～2 mm。

4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述点样槽为若干个，相邻两个点样槽之间间隔2～4 mm。

5.一种基于干血斑制样联合解吸电喷雾电离质谱对干血斑进行磷脂组学分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.干血斑制备：取血清样本点样于干血斑载体材料上，于室温下干燥后上机测试；所述干血斑载体材料由玻璃片和固定在玻璃片上的PARAFILM组成，PARAFILM上设有点样槽；先在PARAFILM上压印点样槽，然后将PARAFILM固定在玻璃片上；

S2.使用解吸电喷雾电离质谱检测上述干血斑样本，通过数据处理与数据分析，建立磷脂组学分析。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，解吸电喷雾电离质谱的质谱参数为：毛细管电压±5 kV，雾化气8.0 bar，锥孔电压45 V，离子源温度150℃。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，解吸电喷雾电离质谱的几何参数为：MSinlet到TaperTipTM 喷针的水平距离为4 mm；TaperTipTM喷针到样品表面的垂直距离为2mm；MS inlet的底部与样品表面的垂直距离为0～1 mm，喷雾器的入射角为55°。

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