CN110438222B - 一种用于侵袭性淋巴瘤的早期诊断检测试剂盒 - Google Patents

一种用于侵袭性淋巴瘤的早期诊断检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于恶性淋巴瘤的早期诊断领域，具体涉及一种用于侵袭性淋巴瘤的早期诊断检测试剂盒。本发明公开了能够用于淋巴瘤的早期诊断、预后评估的生物标志物和检测方法；公开了进行淋巴瘤早期诊断的检测具体方法和引物信息。本发明可用于淋巴瘤的早期诊断，对于判断和预测淋巴瘤的恶性程度和复发风险，具有重要意义。

Description

一种用于侵袭性淋巴瘤的早期诊断检测试剂盒
技术领域
本发明属于恶性淋巴瘤的早期诊断领域，具体涉及一种用于侵袭性淋巴瘤的早期诊断检测试剂盒。
背景技术
B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)是淋巴瘤的主要类型，其中弥散大B细胞淋巴瘤(DLBCL)在B-NHL中的发生比例最高。在临床上，尽管淋巴瘤的黄金化疗方案CHOP/R-CHOP可以基本治愈60％的DLBCL患者，但是仍然有40％的DLBCL患者对CHOP/R-CHOP治疗方案无应答，这些患者中大部分在治疗后期(4.7-9.0个月)，被进一步检测出淋巴瘤侵犯中枢神经系统CNS，如果发生CNS侵犯，这类病人的治疗效果非常不理想，随后的生存期仅为2-5个月。因此，开发相关淋巴瘤的早期诊断方法对于淋巴瘤的复发预防和治疗具有重要意义，是治疗恶性淋巴瘤的关键。
目前针对恶性淋巴瘤，尤其是侵袭性淋巴瘤，还没有比较合适的生物标记物对其进行预测，因此一部分淋巴瘤患者发生复发后，往往发生严重的中枢神经系统侵犯，失去了早期预防复发和治疗的最佳时机。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于侵袭性淋巴瘤的早期诊断检测试剂盒。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供UTX用于制备或筛选淋巴瘤检测试剂的用途。
在一种实施方式中，UTX作为生物标志物。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂用于淋巴瘤的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂用于淋巴瘤的早期诊断、淋巴瘤的恶性程度评价、淋巴瘤发生CNS侵犯的可能性预测。
需要说明的是，所述淋巴瘤检测试剂并不限定为必须为液体形式。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂为特异性识别UTX的试剂。
在一种实施方式中，所述特异性识别UTX的试剂选自特异性识别UTX基因的试剂或特异性识别UTX蛋白的试剂。
在一种实施方式中，基于所述的UTX的基因序列，制备或筛选特异性识别UTX基因的试剂，从而作为淋巴瘤检测试剂。
在一种实施方式中，所述特异性识别UTX基因的试剂选自以下任一种或多种：
(1)特异性扩增UTX基因或转录本的引物；
(2)特异识别UTX基因或转录本的探针。
在一种实施方式中，基于所述的UTX的蛋白序列，制备或筛选特异性识别UTX蛋白的试剂，从而作为淋巴瘤检测试剂。
在一种实施方式中，所述特异性识别UTX蛋白的试剂为UTX蛋白的抗体或配体。
在一种实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的第二方面，提供EFNB1用于制备或筛选淋巴瘤检测试剂的用途。
在一种实施方式中，EFNB1作为生物标志物。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂用于淋巴瘤的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂用于淋巴瘤的早期诊断、淋巴瘤的恶性程度评价、淋巴瘤发生CNS侵犯的可能性预测。
需要说明的是，所述淋巴瘤检测试剂并不限定为必须为液体形式。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂为特异性识别EFNB1的试剂。
在一种实施方式中，所述特异性识别EFNB1的试剂选自特异性识别EFNB1基因和特异性识别EFNB1蛋白的试剂。
在一种实施方式中，基于所述的EFNB1的基因序列，制备或筛选特异性识别EFNB1基因的试剂，作为淋巴瘤检测试剂。
在一种实施方式中，特异性识别EFNB1基因的试剂选自以下任一种或多种：
(1)特异性扩增EFNB1基因或转录本的引物；
(2)特异识别EFNB1基因或转录本的探针。
在一种实施方式中，基于所述的EFNB1的蛋白序列，制备或筛选特异性识别EFNB1蛋白的试剂，作为淋巴瘤检测试剂。
在一种实施方式中，所述特异性识别EFNB1蛋白的试剂为EFNB1蛋白的抗体或配体。
在一种实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的第三方面，提供UTX和EFNB1联合用于制备或筛选淋巴瘤检测试剂的用途。
在一种实施方式中，UTX和EFNB1联合作为生物标志物。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂用于淋巴瘤的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂用于淋巴瘤的早期诊断、淋巴瘤的恶性程度评价、淋巴瘤发生CNS侵犯的可能性预测。
需要说明的是，所述淋巴瘤检测试剂并不限定为必须为液体形式。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂包括特异性识别UTX的试剂和特异性识别EFNB1的试剂。
在一种实施方式中，所述特异性识别UTX的试剂选自特异性识别UTX基因的试剂或特异性识别UTX蛋白的试剂。所述特异性识别EFNB1的试剂选自特异性识别EFNB1基因的试剂或特异性识别EFNB1蛋白的试剂。
在一种实施方式中，基于所述的UTX的基因序列，制备或筛选特异性识别UTX基因的试剂；基于所述的EFNB1的基因序列，制备或筛选特异性识别EFNB1基因的试剂；将特异性识别UTX基因的试剂和特异性识别EFNB1基因的试剂联合作为淋巴瘤检测试剂。
在一种实施方式中，特异性识别UTX基因的试剂选自以下任一种或多种：
(1)特异性扩增UTX基因或转录本的引物；
(2)特异识别UTX基因或转录本的探针。
特异性识别EFNB1基因的试剂选自以下任一种或多种：
(1)特异性扩增EFNB1基因或转录本的引物；
(2)特异识别EFNB1基因或转录本的探针。
在一种实施方式中，基于所述的UTX的蛋白序列，制备或筛选特异性识别UTX蛋白的试剂；基于所述的EFNB1的蛋白序列，制备或筛选特异性识别EFNB1蛋白的试剂。将特异性识别UTX蛋白的试剂和特异性识别EFNB1蛋白的试剂联合作为淋巴瘤检测试剂。
在一种实施方式中，特异性识别UTX蛋白的试剂为UTX蛋白的抗体或配体。特异性识别EFNB1蛋白的试剂为EFNB1蛋白的抗体或配体。
在一种实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的第四方面，特异性识别UTX的试剂用于制备淋巴瘤检测试剂盒的用途。
在一种实施方式中，UTX作为生物标志物。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂盒用于淋巴瘤的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂盒用于淋巴瘤的早期诊断、淋巴瘤的恶性程度评价、淋巴瘤发生CNS侵犯的可能性预测。
需要说明的是，所述特异性识别UTX的试剂并不限定为必须为液体形式。
在一种实施方式中，所述特异性识别UTX的试剂选自特异性识别UTX基因的试剂或特异性识别UTX蛋白的试剂。
在一种实施方式中，所述特异性识别UTX基因的试剂选自以下任一种或多种：
(1)特异性扩增UTX基因或转录本的引物；
(2)特异识别UTX基因或转录本的探针。
在一种实施方式中，特异性识别UTX蛋白的试剂为UTX蛋白的抗体或配体。
在一种实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的第五方面，特异性识别EFNB1的试剂用于制备淋巴瘤检测试剂盒的用途。
在一种实施方式中，EFNB1作为生物标志物。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂盒用于淋巴瘤的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂盒用于淋巴瘤的早期诊断、淋巴瘤的恶性程度评价、淋巴瘤发生CNS侵犯的可能性预测。
需要说明的是，所述特异性识别EFNB1的试剂并不限定为必须为液体形式。
在一种实施方式中，特异性识别EFNB1的试剂选自特异性识别EFNB1基因的试剂或特异性识别EFNB1蛋白的试剂。
在一种实施方式中，特异性识别EFNB1基因的试剂选自以下任一种或多种：
(1)特异性扩增EFNB1基因或转录本的引物；
(2)特异识别EFNB1基因或转录本的探针。
在一种实施方式中，所述特异性识别EFNB1蛋白的试剂为EFNB1蛋白的抗体或配体。
在一种实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的第六方面，提供特异性识别UTX的试剂和特异性识别EFNB1的试剂联合用于制备淋巴瘤检测试剂盒的用途。
在一种实施方式中，UTX和EFNB1联合作为生物标志物。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂盒用于淋巴瘤的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂盒用于淋巴瘤的早期诊断、淋巴瘤的恶性程度评价、淋巴瘤发生CNS侵犯的可能性预测。
在一种实施方式中，特异性识别UTX的试剂选自特异性识别UTX基因的试剂或特异性识别UTX蛋白的试剂。特异性识别EFNB1的试剂选自特异性识别EFNB1基因的试剂或特异性识别EFNB1蛋白的试剂。
在一种实施方式中，特异性识别UTX基因的试剂选自以下任一种或多种：
(1)特异性扩增UTX基因或转录本的引物；
(2)特异识别UTX基因或转录本的探针。
特异性识别EFNB1基因的试剂选自以下任一种或多种：
(1)特异性扩增EFNB1基因或转录本的引物；
(2)特异识别EFNB1基因或转录本的探针。
在一种实施方式中，所述特异性识别UTX蛋白的试剂为UTX蛋白的抗体或配体。所述特异性识别EFNB1蛋白的试剂为EFNB1蛋白的抗体或配体。
在一种实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的第七方面，提供一种淋巴瘤检测试剂盒，所述试剂盒中至少包括特异性识别UTX的试剂。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂盒用于淋巴瘤的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂盒用于淋巴瘤的早期诊断、淋巴瘤的恶性程度评价、淋巴瘤发生CNS侵犯的可能性预测。
在一种实施方式中，所述特异性识别UTX的试剂选自特异性识别UTX基因的试剂或特异性识别UTX蛋白的试剂。
在一种实施方式中，所述特异性识别UTX基因的试剂选自以下任一种或多种：
(1)特异性扩增UTX基因或转录本的引物；
(2)特异识别UTX基因或转录本的探针。
在一种实施方式中，特异性识别UTX蛋白的试剂为UTX蛋白的抗体或配体。
在一种实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的第八方面，提供一种淋巴瘤检测试剂盒，所述试剂盒中至少包括特异性识别EFNB1基因的试剂。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂盒用于淋巴瘤的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂盒用于淋巴瘤的早期诊断、淋巴瘤的恶性程度评价、淋巴瘤发生CNS侵犯的可能性预测。
在一种实施方式中，特异性识别EFNB1的试剂选自特异性识别EFNB1基因的试剂或特异性识别EFNB1蛋白的试剂。
在一种实施方式中，特异性识别EFNB1基因的试剂选自以下任一种或多种：
(1)特异性扩增EFNB1基因或转录本的引物；
(2)特异识别EFNB1基因或转录本的探针。
在一种实施方式中，特异性识别EFNB1蛋白的试剂为EFNB1蛋白的抗体或配体。
在一种实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的第九方面，提供一种淋巴瘤检测试剂盒，所述试剂盒中至少包括特异性识别UTX的试剂和特异性识别EFNB1的试剂。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂盒用于淋巴瘤的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。
在一种实施方式中，所述淋巴瘤检测试剂盒用于淋巴瘤的早期诊断、淋巴瘤的恶性程度评价、淋巴瘤发生CNS侵犯的可能性预测。
在一种实施方式中，特异性识别UTX的试剂选自特异性识别UTX基因的试剂或特异性识别UTX蛋白的试剂。特异性识别EFNB1的试剂选自特异性识别EFNB1基因的试剂或特异性识别EFNB1蛋白的试剂。
在一种实施方式中，特异性识别UTX基因的试剂选自以下任一种或多种：
(1)特异性扩增UTX基因或转录本的引物；
(2)特异识别UTX基因或转录本的探针。
特异性识别EFNB1基因的试剂选自以下任一种或多种：
(1)特异性扩增EFNB1基因或转录本的引物；
(2)特异识别EFNB1基因或转录本的探针。
在一种实施方式中，特异性识别UTX蛋白的试剂为UTX蛋白的抗体或配体。特异性识别EFNB1蛋白的试剂为EFNB1蛋白的抗体或配体。
在一种实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明公开了能够用于淋巴瘤的早期诊断、预后评估的生物标志物和检测方法；公开了进行淋巴瘤早期诊断的检测具体方法和引物信息。本发明可用于淋巴瘤的早期诊断，对于判断和预测淋巴瘤的恶性程度和复发风险，具有重要意义。
附图说明
图1：UTX基因的表达水平与人类淋巴瘤患者整体生存时间的相关性。
图2：EFNB1基因的表达水平与人类淋巴瘤患者整体生存时间的相关性。
图3：UTX基因和EFNB1基因的表达水平与人类淋巴瘤患者整体生存时间的相关性。
图4A：将自发B细胞淋巴瘤小鼠体内UTX基因进行敲除的的方法。
图4B：另一种将自发B细胞淋巴瘤小鼠体内UTX基因进行敲除的方法。
图4C：获得UTX基因经过基因打靶修饰的Eμ-Myc转基因小鼠作为实验对照。
图5：自发B细胞淋巴瘤小鼠体内UTX基因进行敲除后，肿瘤发生的性别特点和生存时间。
图6：在小鼠内敲除UTX基因促进淋巴瘤发生发展成为高度恶性的侵袭性淋巴瘤。
图7：在淋巴瘤细胞中过表达EFNB1基因使淋巴瘤细胞在体内获得增强的侵袭和血管生成能力。
图8：EFNB1基因在UTX基因敲除的淋巴瘤的表达水平升高。
具体实施方式
本发明经过研究，首次发现，基因UTX和基因EFNB1的表达水平与人类淋巴瘤的预后和生存时间具有相关性，基因UTX低表达和或基因EFNB1高表达的淋巴瘤患者的预后更差。
基于本发明人的上述新发现，可将UTX基因和/或基因EFNB1基因作为淋巴瘤的生物标志物。通过开发检测基因UTX和或基因EFNB1的核酸或蛋白检测试剂盒，可以用于检测淋巴瘤中的基因UTX和基因EFNB1的表达水平，这些结果可以用于评价人类淋巴瘤的恶性程度、预测淋巴瘤发生CNS侵犯的可能性，实现恶性淋巴瘤的分子分型和早期诊断。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
一、材料和方法：
人类淋巴瘤的基因表达与预后分析方法
通过SurvExpress程序(http://bioinformatica.mty.itesm.mx/SurvExpress)对基因表达数据库(Lenz Staudt淋巴瘤GSE10846)进行分析，分析UTX基因(Genebank登录号为7403)的表达水平与病人生存时间的相关性，得到图1的分析结果。
如图1显示，基因UTX的表达水平与人类淋巴瘤的预后具有相关性，基因UTX低表达的淋巴瘤患者的预后更差。
通过SurvExpress程序(http://bioinformatica.mty.itesm.mx/SurvExpress)对人类淋巴瘤基因表达数据库(Lenz Staudt GSE10846)进行分析，分析EFNB1基因(Genebank登录号为1947)的表达水平与病人生存时间的相关性，得到图2的分析结果。
如图2显示，基因EFNB1的表达水平与人类淋巴瘤的预后具有相关性，基因EFNB1高表达的淋巴瘤患者的预后更差。
通过SurvExpress程序(http://bioinformatica.mty.itesm.mx/SurvExpress)对人类淋巴瘤基因表达数据库(Lenz Staudt GSE10846)进行分析，同时分析UTX基因和EFNB1基因的表达水平与病人生存时间的相关性，得到图3的分析结果。
如图3显示，基因UTX和基因EFNB1的表达水平与人类淋巴瘤的预后具有相关性，基因UTX低表达且基因EFNB1高表达的淋巴瘤患者的预后更差。
实施例2
本实施例的目的在于考察淋巴瘤小鼠内的基因UTX敲除后，会产生什么结果。
因此，首先，将自发B细胞淋巴瘤小鼠【亦即Eμ-Myc转基因小鼠，购买于美国杰克逊实验室(The Jackson laboratory)】体内的UTX基因敲除。
如图4A所示，敲除方法包括步骤：(1)雌性UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠与雄性Eμ-Myc转基因小鼠交配，获得UTX基因经过基因打靶修饰的Eμ-Myc转基因小鼠；(2)雌性UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠与雄性Cre转基因工具小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠；(3)取步骤(1)中获得的雄性UTX基因经过基因打靶修饰的Eμ-Myc转基因小鼠与步骤(2)中获得的雌性UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除的Eμ-Myc转基因小鼠。
其中，UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠，构建和来源于陈德贵实验室(生物化学与细胞生物学研究所)。构建UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠时，可通过DNA同源重组方法，打靶载体中含有LoxP序列的一段DNA序列，与小鼠ES细胞(胚胎干细胞)基因组中同源序列进行替换，从而在小鼠基因组中UTX基因的第10号和第14号内含子中插入LoxP序列，进而繁育成经过基因打靶修饰的野生型小鼠。UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠的构建属于现有技术，可参照Liting Zheng,Longyong Xu.Qing Xu,Lu Yu,DanfengZhao,Pu Chen,Wei Wang,Yiqin Wang,Gang Han,Charlie Degui Chen.Utx loss causesmyeloid transformation.Leukemia.2018 Feb 20。
如图4B所示，另一种敲除方法包括步骤：(1)雌性UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠与雄性Cre转基因工具小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠；(2)雄性Eμ-Myc转基因小鼠与步骤(1)中获得的雌性UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除的Eμ-Myc转基因小鼠。
如图4C所示，雌性UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠与雄性Eμ-Myc转基因小鼠交配，获得UTX基因经过基因打靶修饰的Eμ-Myc转基因小鼠，作为实验对照。
对上述图4A所示繁殖方案、图4B所示繁殖方案、图4C所示繁殖方案中所得结果分别进行统计，结果如表1-1、表1-2和表1-3所示：
表1-1繁殖方案-图4A的小鼠出生比例
表1-2繁殖方案-图4B的小鼠出生比例
表1-3繁殖方案-图4C的小鼠出生比例
由此，可知，上述图4A所示繁殖方案、图4B所示繁殖方案、图4C所示繁殖方案，所得小鼠进行基因型鉴定和统计，获得了各基因型小鼠的出生数量，这些小鼠的出生比例符合孟德尔遗传定律，说明这些基因修饰和敲除对于小鼠早期发育影响很小。
此外，我们对图4A、图4B和图4C中繁殖方案获得的目的基因型小鼠和对照基因型小鼠进行正常饲养，观察小鼠发病情况，每周对小鼠腋下淋巴结进行触摸检测，并记录出生和死亡日期，根据每个基因型小鼠的生存时间绘制生存曲线图，得到了图2的结果。目的基因型小鼠如图2中蓝线和绿线所示，蓝线分别代表一个UTX基因拷贝敲除的Eμ-Myc雄鼠和两个UTX基因拷贝敲除的Eμ-Myc雌鼠，绿线代表一个UTX基因拷贝敲除的Eμ-Myc雌鼠，对照基因型小鼠如图2中红线和黑线所示，红线代表UTX基因修饰的Eμ-Myc雄鼠和雌鼠，黑线代表UTX基因修饰的雄鼠和雌鼠。
目的基因型小鼠，即UTX基因在B细胞中被敲除的Eμ-Myc小鼠，简写成Eμ-Myc；UTXKO，共有3种基因型类别，这三种基因型小鼠均具有自发发生恶性侵袭性淋巴瘤的疾病发生潜力。这3种基因型详细信息如下：
基因型表示为Eμ-Myc；UTXf/y；CD19-Cre-/+，简写成Eμ-Myc；UTX-/y,即一个UTX基因拷贝被敲除的Eμ-Myc雄鼠，见表1-1和表1-2，对应于图5雄鼠生存曲线中的蓝线。
基因型表示为Eμ-Myc；UTXf/f；CD19-Cre-/+，简写成Eμ-Myc；UTX-/-,即两个UTX基因拷贝均被敲除的Eμ-Myc雌鼠，见表1-1，对应于图5雌鼠生存曲线中的蓝线。
基因型表示为Eμ-Myc；UTXf/+；CD19-Cre-/+，简写成Eμ-Myc；UTX-/+,即一个UTX基因拷贝被敲除的Eμ-Myc雌鼠，见表1-2，对应于图5雌鼠生存曲线中的绿线。
对照基因型小鼠，即UTX基因发生修饰的Eμ-Myc小鼠和UTX基因在B细胞中被敲除的小鼠，分别简写成Eμ-Myc；UTXf/y和UTX-/y(雄鼠)，Eμ-Myc；UTXf/f和UTX-/-(雌鼠)，对应4种基因型类别，详细信息如下：
基因型表示为Eμ-Myc；UTXf/y，即一个UTX基因拷贝发生修饰的Eμ-Myc雄鼠，见表1-3，对应于图5雄鼠生存曲线中的红线。
基因型表示为Eμ-Myc；UTXf/f，即两个UTX基因拷贝均发生修饰的Eμ-Myc雌鼠，见表1-3，对应于图5雌鼠生存曲线中的红线。
基因型表示为UTXf/y；CD19-Cre-/+，简写成UTX-/y,即一个UTX基因拷贝在B细胞中被敲除的雄鼠，见表1-1和表1-2，对应于图5雄鼠生存曲线中的黑线。
基因型表示为UTXf/f；CD19-Cre-/+，简写成UTX-/-,即两个UTX基因拷贝在B细胞中均被敲除的雌鼠，见表1-1，对应于图5雌鼠生存曲线中的黑线。
补充说明，UTX基因发生修饰的Eμ-Myc小鼠与传统的Eμ-Myc小鼠类似，会发生自发淋巴瘤，但这些小鼠发生的自发淋巴瘤的恶性程度很低，淋巴瘤很少侵犯到淋巴节外器官，并且淋巴瘤周围未见明显血管生成，而UTX基因在B细胞中被敲除的小鼠存活和繁殖良好，未见淋巴瘤方面的疾病特征。
如图5所示，侵袭性淋巴瘤小鼠模型与图4C繁殖方案所得对照小鼠相比，在淋巴瘤发生比例和淋巴瘤发生时间上都有非常大的提高，在雌鼠中，显示出淋巴瘤的发生是UTX剂量依赖性特征。图5中分别显示了雄性和雌性小鼠各基因型的肿瘤发生的特点和生存时间。
当触摸到小鼠的腋下淋巴瘤发生明显肿大和小鼠出现病态时，对小鼠实施安乐死，并对小鼠尸体进行解剖和拍照，并对小鼠的脾脏的大小进行测量和拍照记录，分别得到了图6中A、B、C的结果。进一步，对小鼠的脾脏进行固定和包埋，制作石蜡切片和HE染色，对脾脏内的生发中心结构进行组织学分析，得到了图6中D的结果。详细过程如下，HE染色组化分析的方法包括如下步骤：颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠脾脏和淋巴瘤，浸泡在卡诺氏固定液中4℃固定过夜，使用正丁醇脱水，每次12小时，共4次，浸蜡每次24小时，共3次，石蜡包埋后，制成5um超薄石蜡切片，采用苏木素伊红(HE)染色试剂盒(C0105#碧云天)进行染色，染色步骤按照说明书进行，经二甲苯梯度脱蜡，梯度乙醇复水，苏木精室温染色十分钟，10mMNaOH溶液浸泡几秒钟至组织切片变蓝，浸泡95％乙醇后，伊红染色1-2分钟，95％乙醇清晰伊红染液，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。染色结果使用OLYMPUS BX51正置荧光显微镜进行观察并拍照。
对发生淋巴瘤侵犯头部的小鼠，去除了头部表皮，对头骨侧面进行拍照，得到了图6中E、F的结果。对淋巴瘤侵犯胸腔的小鼠，将胸腔内的淋巴瘤组织和肺组织取出，进行拍照，得到了图6中G、H的结果。对发生淋巴瘤侵犯头部和胸腔的小鼠的数量进行统计和分析，得到了图6中I的结果。对小鼠的淋巴瘤周围发生了大量血管生成的进行拍照记录，得到了图6中J、K的结果。
人类恶性淋巴瘤的表现非常复杂，包括容易复发并发生中枢神经系统侵犯和胸腺侵犯等等，基因UTX敲除的淋巴瘤小鼠显示出的一系列特征与人类恶性淋巴瘤的特征非常类似。图6中A显示了各基因型小鼠的淋巴瘤原位发生特征，可以发现，基因UTX敲除的小鼠的淋巴瘤的血管更明显，B和C显示了各基因型小鼠的脾脏大小，D显示了各基因型小鼠的脾脏组织的HE染色结果，基因UTX敲除的小鼠的脾脏的生发中心破坏更严重，E和F显示基因UTX敲除的小鼠的淋巴瘤发生了脑侵犯，G和H显示了基因UTX敲除的小鼠的淋巴瘤发生了胸腺侵犯，I显示了发生脑和胸腺侵犯在各基因型中的发生比例，J和K显示了基因UTX敲除的小鼠的淋巴瘤发生了明显的血管生成现象。以上结果，充分说明基因UTX敲除的淋巴瘤小鼠表现出明显的侵袭性淋巴瘤的特征。此结果解释了基因UTX的表达水平与人类淋巴瘤的预后具有相关性，基因UTX低表达的淋巴瘤患者的预后更差的原因。
实施例3
为了研究EFNB1的高表达是否足以促进淋巴瘤细胞获得恶性程度更高的表型，进行了EFNB1过表达细胞构建与淋巴瘤移植实验。具体地，我们首先构建了过表达EFNB1基因的载体，并感染小鼠淋巴瘤细胞获得了EFNB1过表达的小鼠淋巴瘤细胞，接下来，通过尾静脉注射的方法，将淋巴瘤细胞导入小鼠内，获得了淋巴瘤移植小鼠模型，移植20天后，我们对受体小鼠进行安乐死和解剖分析，我们发现小鼠腹腔内产生大量血液生成，如图7中A，同时我们采用脱毛膏对小鼠脱毛，发现小鼠皮下腹股沟淋巴结的淋巴瘤周围发生明显的血管生成现象，如图7中B，进一步我们发现，小鼠脑内部也有明显血管生成，如图7中C，此外，我们还发现小鼠肾脏也受到淋巴瘤侵，如图7中D，统计结果见图7中E。
基因EFNB1对于淋巴瘤的脑侵犯和血管生成的作用研究，如图7显示，在小鼠模型中通过对基因EFNB1的过表达分析，发现基因EFNB1可以促进血管生成，同时促进脑部的血管生成，以及淋巴瘤在肾脏的侵犯，这些结果表面基因EFNB1对于淋巴瘤的恶性转化具有重要作用。这些结果可能解释了基因EFNB1的表达水平与人类淋巴瘤的预后具有相关性，基因EFNB1高表达的淋巴瘤患者的预后更差的原因。
我们对UTX基因敲除的淋巴瘤进行了RNA-seq测序分析，实时荧光mRNA定量分析具体方法如下：
总细胞mRNA使用Trizol试剂提取，总细胞mRNA，根据说明书操作方法，采用GoScript Reverse Transcription System试剂盒进行反转录，采用GoTaq QPCR MasterMix试剂盒进行荧光定量PCR扩增反应。人和小鼠的PCR引物序列如下：
/>
发现EFNB1在UTX敲除的淋巴瘤中高表达，我们进一步通过实时荧光定量PCR实验，对UTX未敲除和UTX敲除的淋巴瘤细胞进行分析，发现EFNB1基因的表达水平在UTX敲除的淋巴瘤中显著提高，如图8中的结果。如图8显示，与UTX基因没有敲除的淋巴瘤细胞相比，在UTX基因敲除的淋巴瘤细胞中，EFNB1基因的表达水平显著上升，这些结果说明，UTX基因和EFNB1基因在表达水平上是一对相互关联的基因对，UTX基因低表达水平和EFNB1基因高表达水平是恶性淋巴瘤的分子特征，是可以用于淋巴瘤早期诊断的分子检测指标。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 一种用于侵袭性淋巴瘤的早期诊断检测试剂盒
<130> 182363
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgaag gtcggagtca ac 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagagttaaa agcagccctg gt 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ataccccagc tcagcagaag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agatggtggt cttggaggtg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgtgttggtc acctgcaata g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggcttcca ttggatgttg a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggggtcgttg atggcaaca 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctcataacc gcacaaacct 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggacctgcca aatgtgaact 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgtggctatg gtcgtgctg 19
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcttcgggta gatcaccaag c 21

Claims (15)

1.特异性识别UTX的试剂用于制备B细胞淋巴瘤预后评估试剂盒的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，UTX作为生物标志物。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述B细胞淋巴瘤预后评估试剂盒用于B细胞淋巴瘤的恶性程度评价。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述特异性识别UTX的试剂选自特异性识别UTX基因的试剂或特异性识别UTX蛋白的试剂。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述特异性识别UTX基因的试剂选自以下任一种或多种：(1)特异性扩增UTX基因或转录本的引物；(2)特异识别UTX基因或转录本的探针；特异性识别UTX蛋白的试剂为UTX蛋白的抗体或配体。
6.特异性识别EFNB1的试剂用于制备B细胞淋巴瘤预后评估试剂盒的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，EFNB1作为生物标志物。
8.根据权利要求6所述的用途，所述B细胞淋巴瘤预后评估试剂盒用于B细胞淋巴瘤的恶性程度评价。
9.根据权利要求6所述的用途，特异性识别EFNB1的试剂选自特异性识别EFNB1基因的试剂或特异性识别EFNB1蛋白的试剂。
10.根据权利要求6所述的用途，特异性识别EFNB1基因的试剂选自以下任一种或多种：
(1)特异性扩增EFNB1基因或转录本的引物；(2)特异识别EFNB1基因或转录本的探针；所述特异性识别EFNB1蛋白的试剂为EFNB1蛋白的抗体或配体。
11.特异性识别UTX的试剂和特异性识别EFNB1的试剂联合用于制备B细胞淋巴瘤预后评估试剂盒的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，UTX和EFNB1联合作为生物标志物。
13.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述B细胞淋巴瘤预后评估试剂盒用于B细胞淋巴瘤的恶性程度评价。
14.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述特异性识别UTX的试剂选自特异性识别UTX基因的试剂或特异性识别UTX蛋白的试剂；所述特异性识别EFNB1的试剂选自特异性识别EFNB1基因的试剂或特异性识别EFNB1蛋白的试剂。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述特异性识别UTX基因和EFNB1基因的试剂选自以下任一种或多种：(1)特异性扩增UTX和EFNB1基因或转录本的引物；(2)特异识别UTX和EFNB1基因或转录本的探针；(3)所述特异性识别UTX蛋白的试剂为UTX蛋白的抗体或配体，所述特异性识别EFNB1蛋白的试剂为EFNB1蛋白的抗体或配体。
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