CN110433335B - 梯度密度型软骨修复用水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及梯度密度型软骨修复用水凝胶及其制备方法。该水凝胶由溶液A和溶液B制得,溶液A含有的组分A为作为主链分子的醛基化多糖,溶液B含有的组分B为作为交联剂的胺化双糖。该制备方法制得的水凝胶具有沿重力方向上密下疏的梯度分布的交联网络,能模拟天然软骨的上密下疏的梯度密度结构。本发明的水凝胶可通过微创注射的方式在关节缺损处原位成胶,且形成的凝胶可模拟天然软骨的上密下疏的梯度密度结构;其与微骨折术相配合,可引导自体干细胞分化成与软骨类似的多层取向结构,以达到关节缺损处的真正完整修复。
Description
技术领域
本发明涉及一种梯度密度型软骨修复用水凝胶及其制备方法,属于医用材料技术领域。
背景技术
据申请人了解,生物医用材料常用于修补或者替换人体结构的部分或全部自然功能。很多生物医用材料作为医疗器械或器械的部件使用,例如,内部组织胶、手术止血材料、防粘连材料,组织修复以及皮肤替代物,或者能够释放药物的药物洗脱支架等材料。透明质酸、壳聚糖、胶原、海藻酸钠等都是临床上用途十分广泛的生物医用材料。
组织工程修复在临床工作中非常常见,这其中,关节软骨修复一直是临床难题。和骨骼不同,关节软骨缺乏血管、神经和淋巴系统,一旦有较大的受损,难以靠组织自愈进行修复。临床上经典的治疗方法是骨髓刺激法,通过引入骨髓血,刺激缺损处软骨再生,例如微骨折和钻孔术。另外还有软骨自体/异体移植、自体软骨细胞移植和基质诱导的自体软骨细胞移植等。但是骨髓刺激法再生的软骨是纤维软骨,性能不如原生的透明软骨,且会随着时间退变;自体软骨移植则会存在基质整合不良、二次手术、供体损伤、细胞寿命短等缺点;异体软骨移植存在基质整合不良以及潜在疾病转移风险等问题;自体软骨细胞移植和基质诱导的自体软骨细胞移植则存在治疗周期长,费用高昂,修复再生的软骨以纤维软骨为主等缺点。
近些年来,微创手术的理念在各个临床领域深入人心,其具有创面小、恢复快、患者接受度高等优点。在关节软骨修复领域,以关节镜为代表的微创方式已有了广泛和成熟的应用。要成功修复软骨,充分利用关节镜的优势,所需材料除了良好的生物相容性,还需要具备来源广泛、湿粘附性、操作简便、适用缺损类型广、创伤性小、副作用小、成软骨性能优异等特点;配合临床关节镜,通过一次性微创注射,在任意缺损部位快速成胶进行填补,并且能够紧密粘附在缺损部位,尽可能减少病人负担,并达到促进软骨修复的效果。另一方面,由于天然的软骨结构是各向异性的,具有梯度结构,现有专利和文献中的软骨修复材料要么是各向同性的,要么虽然具备梯度结构,但其梯度结构在植入前已经定型,即支架材料无法通过注射的方式植入,需要较大的开放式切口。这就是关节修复领域在临床和研究上仍存在的微创和梯度软骨支架不可兼得的技术难题。
申请人曾于2018年7月18日申请了中国发明专利申请(申请号CN201810806833.5、申请公布号CN109161037A),其中提供了一种水凝胶复合物,能配合临床关节镜,通过一次性微创注射,在任意缺损部位快速成胶进行填补,并且能够紧密粘附在缺损部位,达到促进软骨修复的效果。目前申请人在进一步的研发过程中获得了新的技术成果,并以此来申请专利。
发明内容
本发明的主要目的是:克服现有技术存在的问题,提供一种梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物,采用该原料组合物可以制备梯度密度型软骨修复用水凝胶;同时,还提供相应的梯度密度型软骨修复用水凝胶制剂,以及原料组合物、水凝胶制剂的制备方法。
本发明解决其技术问题的技术方案如下:
一种梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物,由组分A和组分B构成,其特征是,所述组分A为作为主链分子的醛基化多糖,所述组分B为作为交联剂的胺化双糖。
该原料组合物可以制备出梯度密度型软骨修复用水凝胶,用以修复关节软骨。
本发明原料组合物进一步完善的技术方案如下:
优选地,对于组分A,所述醛基化多糖为醛基化透明质酸、醛基化羟甲基几丁质、或醛基化葡聚糖;对于组分B,所述胺化双糖为胺化蔗糖、胺化麦芽糖、胺化海藻糖和胺化乳糖。
采用该优选方案的原料组合物,可以制备出更好的梯度密度型软骨修复用水凝胶。
优选地,所述组分A由以下方法制得:
S1.先将预设质量的多糖溶于纯化水以形成多糖水溶液,再向多糖水溶液中加入高碘酸钠,然后避光反应;
S2.向S1的反应物中加入乙二醇终止反应,然后避光透析或超滤;将所得产物冻干即得组分A;
所述组分B由以下方法制得:
T1.先将双糖溶于N,N-二甲基甲酰胺以形成双糖溶液,再向双糖溶液中加入N-溴代丁二酰亚胺并搅拌均匀,然后于低温在氮气气氛下加入三苯基膦进行反应,所述低温的温度范围为0℃-8℃;反应结束后,向反应物中加入丙酮以析出呈固形物的产物,以丙酮洗涤产物,然后将产物冷冻干燥;
T2.将产物溶于N,N-二甲基甲酰胺以形成溶液,向溶液中加入叠氮化钠进行反应;反应结束后,向反应物中加入冰水以析出呈固形物的产物,以冰水洗涤产物,然后将产物冷冻干燥;所述冰水的温度为0℃-4℃;
T3.将产物溶于丙酮以形成溶液,向溶液中加入三苯基膦进行反应,反应预设时间后再加入水继续反应,所述预设时间为至少1小时;反应结束后,蒸干溶剂以得到产物,以乙醚洗涤产物,然后将产物冷冻干燥即得组分B。
更优选地,S1中,所述多糖水溶液中多糖的浓度为10~1000mg/mL,所述高碘酸钠与多糖重复单元的摩尔比为1:10~2:1,避光反应时间为1~24小时;多糖重复单元的摩尔量=多糖的预设质量÷多糖重复单元的分子量;
S2中,所述乙二醇与高碘酸钠的摩尔比为1:1;
T1中,所述双糖溶液中双糖的浓度为10~200mg/mL,所述N-溴代丁二酰亚胺与双糖的摩尔比为1:10~10:1;所述三苯基膦与N-溴代丁二酰亚胺的摩尔比为1:5~5:1;反应时间为12~48小时;丙酮洗涤次数大于1次;
T2中,所述溶液中产物的浓度为50~200mg/mL,所述叠氮化钠占整个体系质量的质量分数为1~10%,所述整个体系质量为产物、N,N-二甲基甲酰胺、叠氮化钠的总质量;反应时间为至少4小时;冰水洗涤次数大于1次;
T3中,所述溶液中产物的浓度为50~100mg/mL,所述三苯基膦占整个体系质量的质量分数为2~10%,所述整个体系质量为产物、丙酮、三苯基膦的总质量,所述预设时间为1~6小时,加水后继续反应时间为至少4小时;加入的水的体积为加水前反应液体积的0.5~2倍;乙醚洗涤次数大于1次。
采用以上优选方案的原料组合物,可以制备出更好的梯度密度型软骨修复用水凝胶。
一种梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物的制备方法,所述原料组合物由组分A和组分B构成,其特征是,所述组分A为作为主链分子的醛基化多糖,所述组分B为作为交联剂的胺化双糖;
所述制备方法由组分A的制备方法和组分B的制备方法构成;
所述组分A的制备方法包括以下步骤:
S1.先将预设质量的多糖溶于纯化水以形成多糖水溶液,再向多糖水溶液中加入高碘酸钠,然后避光反应;
S2.向S1的反应物中加入乙二醇终止反应,然后避光透析或超滤;将所得产物冻干即得组分A;
所述组分B的制备方法包括以下步骤:
T1.先将双糖溶于N,N-二甲基甲酰胺以形成双糖溶液,再向双糖溶液中加入N-溴代丁二酰亚胺并搅拌均匀,然后于低温在氮气气氛下加入三苯基膦进行反应,所述低温的温度范围为0℃-8℃;反应结束后,向反应物中加入丙酮以析出呈固形物的产物,以丙酮洗涤产物,然后将产物冷冻干燥;
T2.将产物溶于N,N-二甲基甲酰胺以形成溶液,向溶液中加入叠氮化钠进行反应;反应结束后,向反应物中加入冰水以析出呈固形物的产物,以冰水洗涤产物,然后将产物冷冻干燥;所述冰水的温度为0℃-4℃;
T3.将产物溶于丙酮以形成溶液,向溶液中加入三苯基膦进行反应,反应预设时间后再加入水继续反应,所述预设时间为至少1小时;反应结束后,蒸干溶剂以得到产物,以乙醚洗涤产物,然后将产物冷冻干燥即得组分B。
该制备方法能制备出梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物。
一种梯度密度型软骨修复用水凝胶,其特征是,由前文所述的梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物经以下步骤配制获得:
U1.将组分A溶于缓冲液中以形成溶液A,将组分B溶于缓冲液中以形成溶液B;
U2.将溶液A与溶液B共混;
U3.溶液A与溶液B的混合溶液随时间推移逐渐成胶;当混合溶液形成溶胶且尚未形成凝胶时,在溶胶顶端补加溶液B;
U4.当整体形成凝胶时,所得凝胶即为梯度密度型软骨修复用水凝胶成品。
该水凝胶可在U2后即微创注射于关节缺损部位以原位成胶,然后溶液A与溶液B的混合溶液即在席夫碱反应下逐渐成胶;成胶过程较为缓慢,在U3中补加溶液B后,溶液B中的组分B即通过重力作用在溶胶网络中慢慢扩散,并最终在整体形成凝胶时,使凝胶中形成沿重力方向上密下疏的梯度分布的交联网络,能模拟天然软骨的上密下疏的梯度密度结构。此外,该水凝胶还可与微骨折术相配合,引导自体干细胞分化成与软骨类似的多层取向结构,以达到关节缺损处的真正完整修复。
本发明水凝胶进一步完善的技术方案如下:
优选地,U1中,所述溶液A中组分A的浓度为5~20mg/mL;所述溶液B中组分B的浓度为5~20mg/mL。
更优选地,U1中,所述缓冲液为PBS缓冲液;所述溶液A中组分A的浓度与溶液B中组分B的浓度相同;
U2中,溶液A与溶液B的体积比为2:1;
U3中,补加溶液B的体积与U2中溶液B的体积相同。
采用以上优选方案,可使水凝胶更易制得。
一种梯度密度型软骨修复用水凝胶的制备方法,其特征是,采用前文所述的梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物,所述制备方法包括以下步骤:
U1.将组分A溶于缓冲液中以形成溶液A,将组分B溶于缓冲液中以形成溶液B;
U2.将溶液A与溶液B共混;
U3.溶液A与溶液B的混合溶液随时间推移逐渐成胶;当混合溶液形成溶胶且尚未形成凝胶时,在溶胶顶端补加溶液B;
U4.当整体形成凝胶时,所得凝胶即为梯度密度型软骨修复用水凝胶成品。
该制备方法能制备出梯度密度型软骨修复用水凝胶。
前文所述梯度密度型软骨修复用水凝胶的用途,其特征是,所述用途为用作药剂或用于制备药剂,所述药剂包括关节软骨修复剂、自体干细胞分化引导剂。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
本发明的水凝胶可通过微创注射的方式在关节缺损处原位成胶,且形成的凝胶可模拟天然软骨的上密下疏的梯度密度结构;其与微骨折术相配合,可引导自体干细胞分化成与软骨类似的多层取向结构,以达到关节缺损处的真正完整修复。
附图说明
图1为本发明实施例3中正常关节(右膝)的HE、番红O染色图。
图2为本发明实施例3中损伤关节(左膝)修复后的HE、番红O染色图。
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例1、梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物
本实施例的梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物,由组分A和组分B构成,组分A为作为主链分子的醛基化多糖,组分B为作为交联剂的胺化双糖。对于组分A,醛基化多糖为醛基化透明质酸、醛基化羟甲基几丁质、或醛基化葡聚糖;对于组分B,胺化双糖为胺化蔗糖、胺化麦芽糖、胺化海藻糖和胺化乳糖。
本实施例包含若干实例,各实例的组分A、组分B具体组成如下表所示:
实例序号 | 组分A | 组分B |
1 | 醛基化透明质酸 | 胺化蔗糖 |
2 | 醛基化羟甲基几丁质 | 胺化麦芽糖 |
3 | 醛基化葡聚糖 | 胺化乳糖 |
4 | 醛基化透明质酸 | 胺化海藻糖 |
5 | 醛基化羟甲基几丁质 | 胺化麦芽糖 |
6 | 醛基化葡聚糖 | 胺化海藻糖 |
本实施例的组分A由以下方法制得:
S1.先将预设质量的多糖溶于纯化水以形成多糖水溶液,再向多糖水溶液中加入高碘酸钠(NaIO4),然后避光反应。
S2.向S1的反应物中加入乙二醇终止反应,然后避光透析或超滤。将所得产物冻干即得组分A。
具体而言,S1中,多糖水溶液中多糖的浓度为10~1000mg/mL,高碘酸钠与多糖重复单元的摩尔比为1:10~2:1,避光反应时间为1~24小时。多糖重复单元的摩尔量=多糖的预设质量÷多糖重复单元的分子量。
S2中,乙二醇与高碘酸钠的摩尔比为1:1。
各实例中组分A的具体制备参数如下表所示:
注:关于多糖重复单元的摩尔量,以实例4为例,透明质酸重复单元的分子量为401g/mol,因此透明质酸重复单元的摩尔量为透明质酸的质量除以401g/mol,即0.02494mol;高碘酸钠的用量为0.006234mol。
另外,关于S2中的透析或超滤,具体举例如下:
若采用透析,则选用截留分子量为3000的透析袋,透析外液为纯化水,外液体积为1L,每天换2次液,一共透析4天。
若采用超滤,用2%NaOH溶液洗膜30分钟,随后用纯化水洗膜至滤出液pH7.0左右。将S2中的反应液进行超滤,纯化水为洗滤液,控制进口端与出口端压力平均值小于0.2MPa,待滤出液体积达到反应液初始体积的20倍时,停止超滤,浓缩,收集。
本实施例的组分B由以下方法制得:
T1.先将双糖溶于N,N-二甲基甲酰胺以形成双糖溶液,再向双糖溶液中加入N-溴代丁二酰亚胺并搅拌均匀,然后于低温在氮气气氛下加入三苯基膦进行反应,所述低温的温度范围为0℃-8℃。反应结束后,向反应物中加入丙酮以析出呈固形物的产物,以丙酮洗涤产物,然后将产物冷冻干燥。
T2.将产物溶于N,N-二甲基甲酰胺以形成溶液,向溶液中加入叠氮化钠进行反应。反应结束后,向反应物中加入冰水以析出呈固形物的产物,以冰水洗涤产物,然后将产物冷冻干燥。所述冰水的温度为0℃-4℃。
T3.将产物溶于丙酮以形成溶液,向溶液中加入三苯基膦进行反应,反应预设时间后再加入水继续反应,所述预设时间为至少1小时。反应结束后,蒸干溶剂以得到产物,以乙醚洗涤产物,然后将产物冷冻干燥即得组分B。
具体而言,T1中,所述双糖溶液中双糖的浓度为10~200mg/mL,所述N-溴代丁二酰亚胺与双糖的摩尔比为1:10~10:1。所述三苯基膦与N-溴代丁二酰亚胺的摩尔比为1:5~5:1。反应时间为12~48小时。丙酮洗涤次数大于1次。
T2中,溶液中产物的浓度为50~200mg/mL,叠氮化钠占整个体系质量的质量分数为1~10%,整个体系质量为产物、N,N-二甲基甲酰胺、叠氮化钠的总质量;反应时间为至少4小时;冰水洗涤次数大于1次;
T3中,溶液中产物的浓度为50~100mg/mL,三苯基膦占整个体系质量的质量分数为2~10%,整个体系质量为产物、丙酮、三苯基膦的总质量,预设时间为1~6小时,加水后继续反应时间为至少4小时;加入的水的体积为加水前反应液体积的0.5~2倍;乙醚洗涤次数大于1次。
各实例中组分B的具体制备参数如以下各表所示:
实施例2、梯度密度型软骨修复用水凝胶
本实施例的梯度密度型软骨修复用水凝胶,由实施例1的梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物经以下步骤配制获得:
U1.将组分A溶于缓冲液中以形成溶液A,将组分B溶于缓冲液中以形成溶液B;溶液A中组分A的浓度为5~20mg/mL;溶液B中组分B的浓度为5~20mg/mL;缓冲液为PBS缓冲液;溶液A中组分A的浓度与溶液B中组分B的浓度相同。
注:在实际使用时,在U1步后先将各溶液过0.22μm滤头除菌,然后在无菌环境下分别灌装于5mL预灌封玻璃注射器中备用。
U2.将溶液A与溶液B共混;溶液A与溶液B的体积比为2:1。
注:在实施关节修复时,在U2步后即将混合溶液注射至目标部位。
U3.溶液A与溶液B的混合溶液随时间推移逐渐成胶;当混合溶液形成溶胶且尚未形成凝胶时,在溶胶顶端补加溶液B;补加溶液B的体积与U2中溶液B的体积相同。
注:在实施关节修复时,补加溶液B的操作也在目标部位处完成。
U4.当整体形成凝胶时,所得凝胶即为梯度密度型软骨修复用水凝胶成品。
本实施例包含若干实例,且各实例为实施例1各实例的延续。
实施例3、动物关节修复实验
试验动物:6组SPF级新西兰大白兔,每组3只,雄性,6-8个月龄,2-2.5kg。
手术过程:每组兔子与实施例2的1个实例对应。3%的戊巴比妥钠按1㎎/㎏沿兔耳缘静脉麻醉,麻醉成功后,在无菌操作下,兔子仰卧位,左膝关节备皮,膝关节正中切开皮肤,髌骨内侧切开膝关节,暴露膝关节,屈曲膝关节后暴露股骨滑车。使用软骨移植器械在股骨滑车做一直径3.5mm,深度3.0mm的缺损。在缺损处按如下步骤注入混合凝胶:取实施例2各实例于U1步后灌装的溶液A和溶液B,按U2步将溶液A和溶液B共混后注射入缺损处,按U3步在混合溶液形成溶胶且尚未形成凝胶时在溶胶顶端补加溶液B,最后按U4形成最终凝胶成品。然后,逐层缝合,关闭膝关节。术后注射青霉素纳20万,1次/d,连续3d,以防感染。将兔子放回笼子里(单独笼养,温度16~25℃,光照12/12小时)。右膝不做任何处理做为对照。
观察:3个月后将兔子处死,取左右关节股骨于10%福尔马林溶液中固定,固定完成后,组织经脱钙、取材、修整,按照常规石蜡切片制作方法,经脱水、包埋、切片等步骤,再进行常规的HE、番红O染色,镜下观察。结果显示,与未做任何处理的正常关节(右膝)相比,各实例水凝胶对造软骨缺损的关节(左膝)修复效果良好。图1和图2为实例4对应实验组的典型结果图,其它实例对应实验组的结果与此基本一致。
除上述实施例外,本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案,均落在本发明要求的保护范围。
Claims (9)
1.一种梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物,由组分A和组分B构成,其特征是,所述组分A为作为主链分子的醛基化多糖,所述组分B为作为交联剂的胺化双糖;
所述组分A由以下方法制得:
S1.先将预设质量的多糖溶于纯化水以形成多糖水溶液,再向多糖水溶液中加入高碘酸钠,然后避光反应;
S2.向S1的反应物中加入乙二醇终止反应,然后避光透析或超滤;将所得产物冻干即得组分A;
所述组分B由以下方法制得:
T1.先将双糖溶于N,N-二甲基甲酰胺以形成双糖溶液,再向双糖溶液中加入N-溴代丁二酰亚胺并搅拌均匀,然后于低温在氮气气氛下加入三苯基膦进行反应,所述低温的温度范围为0℃-8℃;反应结束后,向反应物中加入丙酮以析出呈固形物的产物,以丙酮洗涤产物,然后将产物冷冻干燥;
T2.将产物溶于N,N-二甲基甲酰胺以形成溶液,向溶液中加入叠氮化钠进行反应;反应结束后,向反应物中加入冰水以析出呈固形物的产物,以冰水洗涤产物,然后将产物冷冻干燥;所述冰水的温度为0℃-4℃;
T3.将产物溶于丙酮以形成溶液,向溶液中加入三苯基膦进行反应,反应预设时间后再加入水继续反应,所述预设时间为至少1小时;反应结束后,蒸干溶剂以得到产物,以乙醚洗涤产物,然后将产物冷冻干燥即得组分B。
2.根据权利要求1所述的梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物,其特征是,对于组分A,所述醛基化多糖为醛基化透明质酸、醛基化羟甲基几丁质、或醛基化葡聚糖;对于组分B,所述胺化双糖为胺化蔗糖、胺化麦芽糖、胺化海藻糖和胺化乳糖。
3.根据权利要求1所述的梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物,其特征是,S1中,所述多糖水溶液中多糖的浓度为10~1000mg/mL,所述高碘酸钠与多糖重复单元的摩尔比为1:10~2:1,避光反应时间为1~24小时;多糖重复单元的摩尔量=多糖的预设质量÷多糖重复单元的分子量;
S2中,所述乙二醇与高碘酸钠的摩尔比为1:1;
T1中,所述双糖溶液中双糖的浓度为10~200mg/mL,所述N-溴代丁二酰亚胺与双糖的摩尔比为1:10~10:1;所述三苯基膦与N-溴代丁二酰亚胺的摩尔比为1:5~5:1;反应时间为12~48小时;丙酮洗涤次数大于1次;
T2中,所述溶液中产物的浓度为50~200mg/mL,所述叠氮化钠占整个体系质量的质量分数为1~10%,所述整个体系质量为产物、N,N-二甲基甲酰胺、叠氮化钠的总质量;反应时间为至少4小时;冰水洗涤次数大于1次;
T3中,所述溶液中产物的浓度为50~100mg/mL,所述三苯基膦占整个体系质量的质量分数为2~10%,所述整个体系质量为产物、丙酮、三苯基膦的总质量,所述预设时间为1~6小时,加水后继续反应时间为至少4小时;加入的水的体积为加水前反应液体积的0.5~2倍;乙醚洗涤次数大于1次。
4.一种梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物的制备方法,所述原料组合物由组分A和组分B构成,其特征是,所述组分A为作为主链分子的醛基化多糖,所述组分B为作为交联剂的胺化双糖;
所述制备方法由组分A的制备方法和组分B的制备方法构成;
所述组分A的制备方法包括以下步骤:
S1.先将预设质量的多糖溶于纯化水以形成多糖水溶液,再向多糖水溶液中加入高碘酸钠,然后避光反应;
S2.向S1的反应物中加入乙二醇终止反应,然后避光透析或超滤;将所得产物冻干即得组分A;
所述组分B的制备方法包括以下步骤:
T1.先将双糖溶于N,N-二甲基甲酰胺以形成双糖溶液,再向双糖溶液中加入N-溴代丁二酰亚胺并搅拌均匀,然后于低温在氮气气氛下加入三苯基膦进行反应,所述低温的温度范围为0℃-8℃;反应结束后,向反应物中加入丙酮以析出呈固形物的产物,以丙酮洗涤产物,然后将产物冷冻干燥;
T2.将产物溶于N,N-二甲基甲酰胺以形成溶液,向溶液中加入叠氮化钠进行反应;反应结束后,向反应物中加入冰水以析出呈固形物的产物,以冰水洗涤产物,然后将产物冷冻干燥;所述冰水的温度为0℃-4℃;
T3.将产物溶于丙酮以形成溶液,向溶液中加入三苯基膦进行反应,反应预设时间后再加入水继续反应,所述预设时间为至少1小时;反应结束后,蒸干溶剂以得到产物,以乙醚洗涤产物,然后将产物冷冻干燥即得组分B。
5.一种梯度密度型软骨修复用水凝胶,其特征是,由权利要求1-3任一项所述的梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物经以下步骤配制获得:
U1.将组分A溶于缓冲液中以形成溶液A,将组分B溶于缓冲液中以形成溶液B;
U2.将溶液A与溶液B共混;
U3.溶液A与溶液B的混合溶液随时间推移逐渐成胶;当混合溶液形成溶胶且尚未形成凝胶时,在溶胶顶端补加溶液B;
U4.当整体形成凝胶时,所得凝胶即为梯度密度型软骨修复用水凝胶成品。
6.根据权利要求5所述的梯度密度型软骨修复用水凝胶,其特征是,U1中,所述溶液A中组分A的浓度为5~20mg/mL;所述溶液B中组分B的浓度为5~20mg/mL。
7.根据权利要求5所述的梯度密度型软骨修复用水凝胶,其特征是,U1中,所述缓冲液为PBS缓冲液;所述溶液A中组分A的浓度与溶液B中组分B的浓度相同;
U2中,溶液A与溶液B的体积比为2:1;
U3中,补加溶液B的体积与U2中溶液B的体积相同。
8.一种梯度密度型软骨修复用水凝胶的制备方法,其特征是,采用权利要求1-3任一项所述的梯度密度型软骨修复用水凝胶原料组合物,所述制备方法包括以下步骤:
U1.将组分A溶于缓冲液中以形成溶液A,将组分B溶于缓冲液中以形成溶液B;
U2.将溶液A与溶液B共混;
U3.溶液A与溶液B的混合溶液随时间推移逐渐成胶;当混合溶液形成溶胶且尚未形成凝胶时,在溶胶顶端补加溶液B;
U4.当整体形成凝胶时,所得凝胶即为梯度密度型软骨修复用水凝胶成品。
9.权利要求5-7任一项所述梯度密度型软骨修复用水凝胶的用途,其特征是,所述用途为用于制备药剂,所述药剂包括关节软骨修复剂、自体干细胞分化引导剂。
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