CN110426335A - 一种基于原子力显微镜的纳米颗粒浓度测量方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于原子力显微镜的纳米颗粒浓度检测方法，包括：快速制备待测纳米颗粒样本；将所述样本置于原子力显微镜的真空吸盘上，沿样本的直径方向选择多个待测点，分别对所述待测点进行扫面及图像采集；分别统计各待测点图像中纳米颗粒个数，并绘制曲线图；将对称位置被测点的颗粒数目总数取平均值，重新绘制曲线图。根据新的曲线图的分布规律计算圆内的纳米颗粒浓度。本发明使用原子力显微镜(AFM)测量纳米颗粒，特别是未知浓度的纳米颗粒具有制样简单快速、原位测试、灵敏度高、不破坏样本等优点，能够最大限度同时测出未知样本的真实浓度、颗粒的粒径和表征、形态等参数。

Description

一种基于原子力显微镜的纳米颗粒浓度测量方法

技术领域

本发明涉及一种生物、纳米材料检测领域，具体涉及一种基于原子力显微镜的纳米颗粒浓度测量方法。

背景技术

颗粒样品最重要的物理特性就是颗粒浓度，测量颗粒浓度在很多领域有着广泛的应用，很多情况下，只了解颗粒的大小是不够的，还需要了解样本的浓度和颗粒的表征、形态等参数。例如：外泌体(exosome)是指包含了复杂RNA和蛋白质的细胞分泌的小膜泡，特指直径在40-100nm的盘状囊泡，主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中，参与细胞间通讯等功能。外泌体的研究目前处于起步阶段，但临床应用已显示出良好的前景。现有的纳米颗粒的制备大多是已知纳米颗粒总质量，将其与一些有机溶液混合制备纳米颗粒溶液，从而计算出溶液浓度。对于某些新发现的纳米颗粒，特别是没有良好物理特性的纳米颗粒并没有有效测量其浓度的方法。

常见的纳米颗粒测试方法如：扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)、透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)颗粒样品需要经过固定、染色及包被等过程，操作繁琐、耗时较长，由于一次所能观察到的颗粒数量有限，因此所获得的粒径分布数据往往不具代表性。同时，电子显微镜的本，往往需要通过干燥、固定以及冷冻等不同方式进行前处理，对样本的表征、形态等可能会造成一定的影响，可能已经破坏了样本的真实浓度。纳米颗粒跟踪分析技术(Nanosight Tracking Analysis，NTA)通过光学显微镜得到每个纳米颗粒的散射光图形，并对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。X射线衍射法、X射线小角散射法、动态光散射法等只能检测颗粒的大小和浓度，对于颗粒的表征和形态等无法检测。现有技术缺点：颗粒样品需要经过固定、染色及包被等过程，操作繁琐、耗时较长。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种不破坏纳米颗粒，成本低，操作简单的纳米颗粒浓度检测方法。

为解决以上技术问题，本发明的技术方案为采用一种基于原子力显微镜的纳米颗粒浓度检测方去，包括：

制备纳米颗粒测量样本；

将所述样本置于原子力显微镜的真空吸盘上，沿样本的直径方向选择多个待测点，分别对所述待测点进行扫描及图像采集；

分别统计各待测点图像中纳米颗粒个数，并绘制颗粒个数与位置关系的曲线图；

将对称位置被测点的颗粒数目总数取平均值，重新绘制曲线图，根据新的曲线图的分布规律计算圆内的纳米颗粒浓度。

优选的，还包括将计算出的浓度与标准纳米颗粒浓度进行误差分析。

优选的，所述误差分析具体为：设每微升纳米颗粒的质量(M_nominal)为已经给定的参数，因此每微升标准纳米颗粒的数量可以通过如下公式计算：

式中

N_estimate——每微升标准纳米颗粒悬浮液中纳米颗粒的数量；

m_sphere——每个标准纳米颗粒的质量，单位为kg；

m_sphere计算公式为：

m_sphere＝ρv

式中ρ——纳米颗粒的密度，单位为kg/m³；

v——单个纳米颗粒的体积，单位为m³；

纳米粒子浓度的准确度通过测量值与理论值的比率来评估：

式中

C_accuracy——测量值与理论值估算值的比率；

C_accuracy值越高表示浓度的计算越准确。

优选的，所述制备纳米颗粒样本具体为：

用稀释剂稀释纳米颗粒；

稀释好的溶液记录稀释倍数，将其放入离心管中进行水浴超声；

从超声好的溶液中使用移液枪取出；液滴垂直滴在清洗好的硅片上，液滴迅速铺展成一个近似圆，进行防尘处理，自然蒸发后，得到纳米颗粒样本。

优选的，所述超声的时间为1～10分钟。

优选的，所述取出的液体体积为0.5～3μL。

优选的，所述多个待测点的数量为10～50个。

优选的，所述多个待测点的数量为15～30个。

优选的，所述纳米颗粒浓度由以下公式计算得出：

式中

ρ(x)——纳米颗粒相对于x的分布密度；

N_measure——1μl纳米颗粒悬浮液中纳米颗粒数量；

其中ρ(x)的计算公式为：

式中

f(x)——沿着样本图案半径相对于x的被测量点的纳米颗粒个数；

A——采集图像的视框面积大小3μm×3μm或5μm×5μm。

本发明使用原子力显微镜(AFM)测量纳米颗粒，特别是未知浓度的纳米颗粒(例如：外泌体)具有制样简单、原位测试、灵敏度高、不破坏样本等优点，能够最大限度测出未知样本的真实浓度、颗粒的粒径和表征、形态等参数，结合本发明的算法，可以简单快速的在复杂的生物背景下(如血浆，尿液)测量外泌体浓度，大小和表征等数据。

附图说明

图1为本发明实施例提供的基于AFM的测量方法原理图；

图2为本发明实施例提供的采样测量路径原理图；

图3为本发明实施例提供沿着样本图案直径采样测量点的AFM图像；

图4为本发明实施例提供的直径为100nm的标准纳米维球其中一种测量路径的纳米微球数量分布图；

图5为本发明实施例提供的直径为100nm的标准纳米微球其中一种测量路径的纳米微球数量分布图；

图6为本发明实施例使用AFM沿着样本半径测量的外泌体实物图

图7为本发明实施例使用AFM沿着样本半径测量的外泌体布曲线。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

原子力显微镜：原子力显微镜(Atomic Force Microscope，AFM)，一种可用来研究包括绝缘体在内的固体材料表面结构的分析仪器。它通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质，将一对微弱力极端敏感的微悬臂一端固定，另一端的微小针尖接近样品，这时它将与其相互作用，作用力将使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。扫描样品时，利用传感器检测这些变化，就可获得作用力分布信息，从而以纳米级分辩率获得表面形貌结构信息及表面粗糙度信息。

纳米颗粒：纳米颗粒又称纳米微粒或纳米粒子(纳米粒子又称超细微粒)，或者纳米尘埃，纳米尘末，指纳米量级的微观颗粒。它被定义为至少在一个维度上小于100纳米的颗粒，小于10纳米的半导体纳米颗粒，由于其电子能级量子化，又被称为量子点。

本发明提供了一种基于AFM的纳米颗粒浓度测量方法，包括：直径为100nm的标准纳米微球(上海辉质生物科技有限公司)，其固含量为1wt％。用无水乙醇将纳米微球悬浮液稀释不同的倍数，然后将稀释液水浴超声5分钟，分别取出1μL滴在干净的规格为15mm*15mm的硅片上，在通风条件较好的通风橱里面自然蒸发，作为待测样本。

原子力显微镜(BRUKER Dimension Icon)，使用布鲁克(BRUKER)SCANASYST-AIR探针对所制作得样本沿着液滴形成的圆(近似)从外环至内环等距选取适量的测量点(优选地，20个左右)，这些测量点关于样本圆形图案对称分布。采集图片的视框大小为5μm*5μm，依次从一侧圆外环到另一侧圆外环统计所采集的图片中的颗粒个数，并绘制分布曲线图。对数据的分布曲线图进一步优化调整，从而根据纳米颗粒外环至内环颗粒数大致逐渐减小的规律分布，通过积分计算估算出所测得纳米颗粒的数量浓度。然后与标准的浓度进行比较，误差在30％以内。

本发明实施例提供一种基于AFM的纳米颗粒浓度测量方法，用于纳米颗粒浓度测量，该方法包括以下步骤：

样本制备步骤：

用无水乙醇(优选的)稀释纳米颗粒，稀释好的溶液记录稀释倍数，将其放入离心管中进行水浴超声5分钟(优选的)，以减少纳米颗粒团聚现象。从超声处理完毕的溶液中使用移液枪取出1μL(优选的)液滴垂直滴在清洗好的硅片上，液滴迅速铺展成一个近似圆，用容器盖住，防止灰尘等污染，等待其自然蒸发，作为待测样本。

原子力显微镜测量步骤：

将样本置于真空吸盘上固定，通过调节AFM上的CCD靠近样本表面，根据屏幕下方的坐标测量液滴形成圆的直径。沿着直径选择合适的等距待测点(20个左右(优选的))，然后下针扫描进行图像数据采集。

数据分析计算步骤：

统计待测点图像中的颗粒个数，绘制曲线图，可以大致看出沿着直径的测量点颗粒数量大体上呈现先减小后增大的趋势，且关于圆的对称位置的被测点的纳米颗粒个数相近。进一步优化，对称位置被测点的颗粒数目总数取平均值，重新绘制曲线图。根据新的曲线图的分布规律计算圆内的纳米颗粒浓度。计算出的浓度与标准纳米颗粒浓度进行误差分析。

本发明既可以用于测量标准品的纳米颗粒浓度，也可以用于测量其他未知的纳米颗粒浓度。与现有的纳米浓度测量方法相比，具有以下优点：不破坏样本，操作简单，减少成本、又样本本身的物理特性没有要求，通用性强，从而有效的解决纳米颗粒浓度测量问题。

如图1、图2所示，对所制作得样本沿着液滴形成的圆(近似)从外环至内环选取适量的测量点(20个左右(优选的))，这些测量点在圆上对称分布。采集图片的视框大小为5μm*5μm(优选的)，依次从一侧圆外环到另一侧圆外环统计所采集的图片中的颗粒个数，并绘制分布曲线图。对数据的分布曲线图进一步优化调整，从而根据纳米颗粒外环至内环颗粒数大致逐渐减小的规律分布，通过积分计算估算出所测得纳米颗粒的数量浓度。

具体的：

本发明首先首先根据采集的AFM图像计数每个测量点上的纳米颗粒的数量并进行统计，然后对这些离散点进行函数拟合，以获得沿圆形图案半径的纳米颗粒数量密度曲线。优选地，可使用五阶多项式对密度分布进行函数拟合，表示为ρ(x)：

ρ(x)＝R₁x⁵+R₂x⁴+R₃x³+R₄x²+R₅x+C

式中R1、R2、R3、R4、R5为变量x的系数，C为常数。ρ(x)表示纳米颗粒相对于x的分布密度变化，x是指扫描测量点距圆形样本图案中心的距离。

优选地，样本的纳米颗粒数量可以通过以下公式计算：

式中

ρ(x)——纳米颗粒相对于x的分布密度；

N_measure——1μl纳米颗粒悬浮液中纳米颗粒数量。

其中ρ(x)的计算公式为：

式中

f(x)——沿着样本图案半径相对于x的被测量点的纳米颗粒个数；

A——采集图像的视框面积大小(3μm×3μm或5μm×5μm)。

对所测量的纳米颗粒浓度进行误差分析，可通过与已知质量分数的标准纳米颗粒浓度进行对比。对于标准纳米颗粒，每微升纳米颗粒的质量(M_nominal)为已经给定的参数。因此每微升标准纳米颗粒的数量可以通过质量分数进行估算：

式中

N_estimate——每微升标准纳米颗粒悬浮液中纳米颗粒的数量；

m_sphere——每个标准纳米颗粒的质量(kg)。

m_sphere计算公式为：

m_sphere＝ρv

式中ρ——纳米颗粒的密度(kg/m³)；

v——单个纳米颗粒的体积(m³)。

纳米粒子浓度的准确度通过测量值与理论值的比率来评估：

式中

C_accuracy——测量值与理论值估算值的比率。

C_accuracy值越高表示浓度的计算越准确。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：标准纳米微球稀释100倍测量

具体操作方法如下：

(1)样本制备步骤：

从直径为100nm(优选的)的标准纳米微球溶液中(上海辉质生物科技有限公司)使用移液枪取出1μL滴入离心管中，然后用移液枪注入99μL的无水乙醇，配成重量百分比为0.01wt％的稀释液。将离心管中液体水浴超声5分钟(优选的)，从超声好的溶液中使用移液枪取出1μL液(优选的)滴垂直滴在清洗好的硅片上，液滴迅速铺展成一个近似圆，用容器盖住，防止灰尘等污染，等待其自然蒸发，作为待测样本。如图1所示的原理图，即为蒸发后的待测样本。

(2)原子力显微镜测量步骤：

将样本置于真空吸盘上固定，通过调节AFM上的CCD靠近样本表面，根据屏幕下方的坐标测量液滴形成圆的直径(D＝10000μm)。沿着直径选择合适的等距待测点20个，然后下针扫描进行图像数据采集。图2即为待测点路径示意图。

(3)数据分析计算步骤：

统计待测点图像中的颗粒个数，绘制曲线图，如图4所示，可以看出距离圆心越远，颗粒数量越多，且关于圆的对称位置的被测点的纳米颗粒个数相近。进一步优化，对称位置被测点的颗粒数目总数取平均值，重新绘制曲线图。根据新的曲线图的分布规律计算圆内的纳米颗粒浓度。计算出的浓度与已知质量分数换算出的浓度比值为92％。

实施例2：标准纳米微球稀释200倍测量

具体操作方法下：

(1)样本制备步骤：

从直径为100nm(优选的)的标准纳米微球溶液中(上海辉质生物科技有限公司)使用移液枪取出1μL(优选的)滴入离心管中，然后用移液枪注入199μL的无水乙醇，配成重量百分比为0.005wt％的稀释液。将离心管中液体水浴超声5分钟(优选的)，从超声好的溶液中使用移液枪取出1μL液(优选的)滴垂直滴在清洗好的硅片上，液滴迅速铺展成一个近似圆，用容器盖住，防止灰尘等污染，等待其自然蒸发，作为待测样本。其原理图亦如图1所示。

(2)原子力显微镜测量步骤：

将样本置于真空吸盘上固定，通过调节AFM上的CCD靠近样本表面，根据屏幕下方的坐标测量液滴形成圆的直径(D＝9100μm)。沿着直径选择合适的等距待测点20个，然后下针扫描进行图像数据采集，如图2所示。

(3)数据分析计算步骤：

统计待测点图像中的颗粒个数，绘制曲线图，如图5所示，可以大致看出沿着直径的测量点颗粒数量大体上呈现先减小后增大的趋势，且关于圆的对称位置的被测点的纳米颗粒个数相近。进一步优化，对称位置被测点的颗粒数目总数取平均值，重新绘制曲线图。根据新的曲线图的分布规律计算圆内的纳米颗粒浓度。计算出的浓度为与已知理论值的比值为91％。

实施例3：未知浓度外泌体浓度测量

具体操作方法如下：

(1)样本制备步骤：

外泌体是从细胞中脱落的米级囊泡，它们可以将蛋白质和核酸从一个细胞转移到另一个细胞，因此在细胞间材料的传递和转运中起主要作用。外泌体具有重要的生物医学应用价值，对其浓度进行准确标定具有重要意义。首先将外泌体溶液使用无水乙醇稀释100倍，然后使用移液枪取出1μl稀释溶液滴定在15mm*15mm的洁净硅片上，液滴快速挥发，在硅片上形成圆形的待测图案。其原理图亦如图1所示。

(2)原子力显微镜测量步骤：

将样本置于真空吸盘上固定，通过调节AFM上的CCD靠近样本表面，根据屏幕下方的坐标测量液滴形成圆的直径(D＝8800μm)。沿着直径选择合适的等距待测点20个，然后下针扫描进行图像数据采集。图6为使用AFM沿着样本半径测量的外泌体的实物图，能够清楚的看出外泌体在特定范围内的分布情况。图7所示为使用AFM沿着样本半径测量的外泌体分布图。图6和图7分别可以初步推算出纳米颗粒的浓度范围。

(3)数据分析计算步骤：

统计待测点图像中的颗粒个数，绘制曲线图，如图7所示为纳米颗粒数量密度相对于样本图案半径的变化图，以及拟合函数ρ(x)的曲线图。最后对20个采样点中的纳米颗粒个数进行统计，可以得到本外泌体溶液样本浓度为2.93×10¹¹/ml。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于原子力显微镜的纳米颗粒浓度检测方法，其特征在于，包括：

制备纳米颗粒测量样本；

将所述样本置于原子力显微镜的真空吸盘上，沿样本的直径方向选择多个待测点，分别对所述待测点进行扫描及图像采集；

分别统计各待测点图像中纳米颗粒个数，并绘制颗粒个数与位置关系的曲线图；

将对称位置被测点的颗粒数目总数取平均值，重新绘制曲线图，根据新的曲线图的分布规律计算圆内的纳米颗粒浓度。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，还包括将计算出的浓度与标准纳米颗粒浓度进行误差分析。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述误差分析具体为：设每微升纳米颗粒的质量(M_nominal)为已经给定的参数，因此每微升标准纳米颗粒的数量可以通过如下公式计算：

式中

N_estimate——每微升标准纳米颗粒悬浮液中纳米颗粒的数量；

m_sphere——每个标准纳米颗粒的质量，单位为kg；

m_sphere计算公式为：

m_sphere＝ρv

式中ρ——纳米颗粒的密度，单位为kg/m³；

v——单个纳米颗粒的体积，单位为m³；

纳米粒子浓度的准确度通过测量值与理论值的比率来评估：

式中

C_accuracy——测量值与理论值估算值的比率；

C_accuracy值越高表示浓度的计算越准确。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述制备纳米颗粒样本具体为：

用稀释剂稀释纳颗粒；

稀释好的溶液记录稀释倍数，将其放入离心管中进行水浴超声；

从超声好的溶液中使用移液枪取出；液滴垂直滴在清洗好的硅片上，液滴迅速铺展成一个近似圆，进行防尘处理，自然蒸发后，得到纳米颗粒样本。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述超声的时间为1～10分钟。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述取出的液体体积为0.5～3μL。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述多个待测点的数量为10～50个。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述多个待测点的数量为15～30个。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述纳米颗粒浓度由以下公式计算得出：

式中

ρ(x)——纳米颗粒相对于x的分布密度；

N_measure1μl纳米颗粒悬浮液中纳米颗粒数量；

其中ρ(x)的计算公式为：

式中

f(x)——沿着样本图案半径相对于x的被测量点的纳米颗粒个数；

A——-采集图像的视框面积大小3μm×3μm或5μm×5μm。