CN110423687A - 一种体外仿生血管芯片及其灌注系统以及操作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种体外仿生血管芯片及其灌注系统以及操作方法，用以解决现有的血管芯片成本偏高、不可重复使用、对于整个人体血管不具有普适性的问题，包括依次通过灌流管相连通的培养液储存罐、蠕动泵以及血管芯片；所述血管芯片包括从上至下依次可拆卸封装的上部流道层、中部细胞支架层以及下部密封层，上部流道层上设置有灌流入管以及灌流出管。本发明为以血管芯片为核心的体外仿生血管灌注系统，采用的血管芯片为可拆卸封装结构，使得血管芯片能够重复使用，增加了芯片使用频率及普适性，因此大大地降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及器官芯片技术领域，尤其是涉及一种体外仿生血管芯片及其灌注系统以及操作方法。
背景技术
随着国民生活条件的改善和生活水平的提高，心血管疾病已经跃升为中国国民生命健康的头号杀手，心血管疾病的严重性与普遍性不容忽视。通常心血管病变会使患者血管中出现狭窄甚至堵塞的情况，如得不到及时治疗，这些病变将引发心肌梗塞、中风等严重并发症，最终会造成患者偏瘫甚至死亡。对心血管疾病致病机理的深入研究和治疗心血管疾病的新药、新设备的开发已经刻不容缓。
传统的体外细胞培养模式在研究血管生理学、病理学方面已经取得了许多成就，但是这些简单的模式难以体现人体血管复杂的生理功能，因此常使用动物实验代替体外培养模式。然而，动物实验存在周期长、成本高、与人体关联性差等缺点，且动物模型常常不能准确预测人体对于各种药物的响应。
血管芯片概念的提出，正是为了解决动物实验的诸多不足，血管芯片是一种利用微加工技术，在微芯片上制造出能够模拟人类器官的主要功能的仿生系统。除了具有微型化、集成化、低消耗的特点外，血管芯片技术能够精确地控制多个系统参数，如化学浓度梯度、流体剪切力、以及构建细胞图形化培养、组织-组织界面相互作用等，从而模拟人体血管的复杂结构、微环境和生理学功能。但是一般的血管芯片因为制造过程精密且繁琐，成本依旧偏高。且芯片的封装多采用键合式不可逆封装技术，造成大多数血管芯片成为一次性制品，不可重复使用，无疑加大了成本。并且目前大多数血管芯片及其灌注系统针对于特定的生理学或病理学模型设计，而对于整个人体血管不具有普适性。
发明内容
本发明提出一种体外仿生血管芯片及其灌注系统以及操作方法，以解决传统外细胞培养模式的使用动物实验代替而导致周期长、成本高、与人体关联性差等缺点，以及现有的血管芯片成本偏高、不可重复使用、对于整个人体血管不具有普适性的问题，以降低生产成本，以达到可反复拆装使用、更换方便、具有一定普适性的目的。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种体外仿生血管芯片及其灌注系统，所述灌注系统包括依次通过灌流管相连通的用于盛放培养液的培养液储存罐、用于为灌流提供动力的蠕动泵以及用于接收培养液储存罐灌流入的培养液来进行人体血管、微环境和生理学功能模拟的血管芯片；
所述血管芯片包括从上至下依次可拆卸封装的用于灌流培养液的上部流道层、嵌装在上部流道层内用于接种细胞的中部细胞支架层以及用于进行血管芯片底部封装的下部密封层，上部流道层上设置有与培养液储存罐相连通的灌流入管以及用于通过培养液在血管芯片内流动将细胞代谢废物排出的灌流出管。
进一步优化技术方案，所述上部流道层包括呈矩形块状的上部支架、开设在上部支架内部的仿生血管通道以及设置在仿生血管通道中部的中部细胞培养室，中部细胞培养室的底部开设有呈凹槽状的培养腔，培养腔与仿生血管通道相连通。
进一步优化技术方案，所述下部密封层包括与中部细胞支架层尺寸相一致用于起到密封作用的PDMS密封垫以及设置在PDMS密封垫底部用于承托中部细胞支架层及PDMS密封垫的底部固定架，PDMS密封垫嵌装在中部细胞培养室的培养腔内，底部固定架与上部支架之间通过连接结构连接；
所述连接结构包括至少四根分别与底部固定架和上部支架螺纹连接的不锈钢螺栓以及与不锈钢螺栓数量相对应并与不锈钢螺栓相配合的螺母。
进一步优化技术方案，所述底部固定架上至少开设有四个用于增加血管芯片透气性的透气长条孔。
进一步优化技术方案，所述血管芯片上的灌流出管通过灌流管连通设置有用于收集从血管芯片排出细胞代谢废物的废液收集罐。
进一步优化技术方案，所述培养液储存罐和废液收集罐的顶部均配有用于防止细菌进入装置内部的过滤器。
进一步优化技术方案，所述血管芯片上的灌流出管通过循环灌流管与培养液储存罐相连通并形成循环回路。
进一步优化技术方案，所述灌注系统还包括用于为装置整体提供细胞生长适宜的温度、湿度和CO2浓度的细胞培养箱。
一种体外仿生血管芯片及其灌注系统的操作方法，包括以下步骤：
S1、安装血管芯片；将中部细胞支架层覆盖于PDMS密封垫上表面，再将PDMS密封垫及中部细胞支架层置于上部流道层底部设置的培养腔内，再将底部固定架置于PDMS密封垫的下方，最后采用不锈钢螺栓及螺母将上部流道层、中部细胞支架层、下部装密封层进行固定，组装得到血管芯片；
S2、采用酒精、紫外照射对血管芯片进行灭菌；
S3、安装灌注系统；利用灌流管将培养液储存罐、蠕动泵、血管芯片、废液收集罐依次连通；
或利用灌流管将培养液储存罐、蠕动泵和血管芯片依次连通，再利用循环灌流管将血管芯片的灌流出管与培养液储存罐相连通；
S4、对灌注系统采用高压蒸汽进行灭菌；
S5、将安装好的血管芯片及其灌注系统放入细胞培养箱内；
S6、通过蠕动泵提供灌流动力，将培养液从培养液储存罐泵送至血管芯片内，为血管芯片内的细胞生长提供所需营养，并将细胞代谢废物通过培养液流动从灌流出管排出；
在步骤S4中，对培养液储存罐、灌流管和废液收集罐采用高压蒸汽进行灭菌，或对培养液储存罐、灌流管和循环灌流管采用高压蒸汽进行灭菌；
在步骤S5中，细胞培养箱的温度为37℃，CO2的浓度为5％；
在步骤S6中，血管芯片内部培养液流体的流速、压强及对中部细胞支架层的剪切应力均在人体血流参数范围内。
进一步优化技术方案，在培养之前，利用有限元方法，计算得出适合细胞生长的灌流入口速度；
通过蠕动泵转速调节血管芯片的灌流入口速度，从而使芯片内流体符合人体血流主要参数，并且可根据不同细胞培养要求，来控制蠕动泵启停时间以及转速。
采用了上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明为利用血管芯片制成的体外仿生血管灌注系统，因此克服了实验动物的饲养和动物模型构建费用高、与人体关联性差、准备周期长、准备程序繁复以及不能准确预测人体对于各种药物的响应等问题；采用的血管芯片为可拆卸封装结构，使得血管芯片能够重复使用，增加了芯片使用频率及普适性，因此大大地降低了生产成本。
本发明使用三维建模软件设计血管芯片，之后使用有限元模拟软件对血管芯片内部培养液流体的流速、压强、流线、对壁面剪切应力等参数进行数值计算并以此来优化血管芯片1，使其内部流体主要参数符合人体血流主要参数，从而达到体外仿生的目标，加大实验的检测精度，确保实验结果的可比性。
本发明细胞培养箱的设置能够为装置整体提供细胞生长适宜的温度、湿度和CO2浓度。
本发明通过不锈钢螺栓和螺母能够实现上部流道层、中部细胞支架层和下部装密封层之间的紧密配合，进而保证血管芯片的密封性。同时，连接结构的设置能够使得血管芯片能够进行反复组装拆卸，便于取样。且当中部细胞支架层或PDMS密封垫需要进行更换时，可直接将其拆出，更换上新的中部细胞支架层或PDMS密封垫，可根据不同的生理血管模型选用对应型号的PDMS密封垫及中部细胞支架层与不变的上部流道层、下部固定架组装成为新的体外仿生血管芯片，使得血管芯片能够重复使用，增加了芯片使用频率及普适性，因此大大地降低了生产成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的结构示意图；
图2为本发明所述血管芯片的爆炸图；
图3为本发明所述血管芯片的俯视图；
图4为本发明所述血管芯片的仰视图；
图5为本发明所述血管芯片的左视图。
其中：1、血管芯片；2、上部流道层，21、上部支架，22、仿生血管通道，221、仿生第一主管，222、仿生第二主管，223、仿生支管，23、中部细胞培养室；3、中部细胞支架层；4、下部密封层；5、灌流入管；6、灌流出管；7、培养液储存罐；8、灌流管；9、废液收集罐；10、蠕动泵；11、过滤器；12、PDMS密封垫；13、底部固定架，131、透气长条孔；14、不锈钢螺栓；15、螺母。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种体外仿生血管芯片及其灌注系统，结合图1至图5所示，包括灌注系统和血管芯片1。
灌注系统包括依次通过灌流管8相连通的培养液储存罐7、蠕动泵10以及血管芯片1。培养液储存罐7用于盛放培养液；蠕动泵10用于为灌流提供动力；血管芯片1用于接收培养液储存罐7灌流入的培养液来进行人体血管、微环境和生理学功能模拟。
血管芯片1包括从上至下依次可拆卸封装的上部流道层2、中部细胞支架层3以及下部密封层4。上部流道层2用于灌流培养液；中部细胞支架层3嵌装在上部流道层2内，用于接种细胞；下部密封层4用于进行血管芯片1底部封装。上部流道层2上设置有灌流入管5以及灌流出管6，灌流入管5与培养液储存罐7相连通，灌流出管6用于通过培养液在血管芯片1内流动将细胞代谢废物排出，灌流入管5和灌流出管6均设置为倒锥形，便于插入到灌流管8内。
上部流道层2包括呈矩形块状的上部支架21、开设在上部支架21内部的仿生血管通道22以及设置在仿生血管通道22中部的中部细胞培养室23，中部细胞培养室23的底部开设有呈凹槽状的培养腔，培养腔与仿生血管通道22相连通。
仿生血管通道22包括仿生第一主管221、仿生第二主管222和仿生支管223，第一主管221与灌流入管5相连通，横向设置。仿生第二主管222与灌流出管6相连通，横向设置。仿生支管223设置有多个，仿生支管223分设为与仿生第一主管221相连通的仿生支管a以及与生第二主管222相连通的仿生支管b，仿生支管a和仿生支管b均插入到培养腔内部。
下部密封层4包括与中部细胞支架层3尺寸相一致的PDMS密封垫12以及设置在PDMS密封垫12底部的底部固定架13。PDMS密封垫12用于起到密封作用，PDMS密封垫12嵌装在中部细胞培养室23的培养腔内。底部固定架13用于承托中部细胞支架层3及PDMS密封垫12。
在满足以上条件的基础上，可根据不同生理血管模型要求将PDMS垫圈12设计成不同形状，同时可采用相符的材料制备中部细胞支架3。
底部固定架13与上部支架21之间通过连接结构连接。连接结构包括至少四根分别与底部固定架13和上部支架21螺纹连接的不锈钢螺栓14以及与不锈钢螺栓14数量相对应并与不锈钢螺栓14相配合的螺母15。通过不锈钢螺栓14和螺母15能够实现上部流道层2、中部细胞支架层3和下部装密封层4之间的紧密配合，进而保证血管芯片1的密封性。同时，连接结构的设置能够使得血管芯片1能够进行反复组装拆卸，便于取样。且当中部细胞支架层3或PDMS密封垫12需要进行更换时，可直接将其拆出，更换上新的中部细胞支架层3或PDMS密封垫12，可根据不同的生理血管模型选用对应型号的PDMS密封垫12及中部细胞支架层3与不变的上部流道层2、下部固定架13组装成为新的体外仿生血管芯片1，使得血管芯片1能够重复使用，增加了芯片使用频率及普适性，因此大大地降低了生产成本。
底部固定架13上至少开设有四个透气长条孔131，透气长条孔131为呈矩形状的镂空区域，透气长条孔131用于增加血管芯片透气性。
血管芯片1上的灌流出管6通过灌流管8连通设置有用于收集从血管芯片1排出细胞代谢废物的废液收集罐9。培养液储存罐7和废液收集罐9的顶部均配有用于防止细菌进入装置内部的过滤器11。过滤器11为防菌级0.22μm过滤器。
灌注系统还包括用于为装置整体提供细胞生长适宜的温度、湿度和CO2浓度的细胞培养箱。
血管芯片1的设计、制造的步骤如下。
使用三维建模软件设计血管芯片1，三维建模软件采用UG NX，还可用其他三维建模软件。之后使用有限元模拟软件对血管芯片1内部培养液流体的流速、压强、流线、对壁面剪切应力等参数进行数值计算并以此来优化血管芯片1，使其内部流体主要参数符合人体血流主要参数，从而达到体外仿生的目标，限元模拟软件采用COMSOL，还可用其他限元模拟软件。
使用数控CNC在塑料板雕刻优化后的血管芯片的上部流道层2，塑料板可采用PMMA，也可采用其他塑料。之后用压敏单面胶封装上部流道层2上端。并在上部流道层2上雕刻四个螺纹孔。
选用生物相容性良好的材料制备中部细胞支架层3，生物相容性良好的材料可选用PCL，也可选用其他的材料。
制备下部密封层。选取规格一定的PDMS密封垫，将PDMS密封垫剪切成与中部细胞支架层3相同的形状。在底部固定架13上雕刻多个透气长条孔131以及四个螺纹孔。
一种体外仿生血管芯片及其灌注系统的操作方法，包括以下步骤：
S1、安装血管芯片1。根据所需生理血管模型，选用合适的已接种细胞的中部细胞支架层3对应的PDMS密封垫12。
将中部细胞支架层3覆盖于PDMS密封垫12上表面，再将PDMS密封垫12及中部细胞支架层3置于上部流道层2底部设置的培养腔内，再将底部固定架置于PDMS密封垫12的下方，最后采用不锈钢螺栓14及螺母15将上部流道层2、中部细胞支架层3、下部装密封层4进行固定，组装得到血管芯片1。
S2、血管芯片1具有耐受酒精、紫外线照射的特性，采用酒精、紫外照射对血管芯片1进行灭菌。
S3、安装灌注系统。利用灌流管8将培养液储存罐7、蠕动泵10、血管芯片1、废液收集罐9依次连通。
S4、对灌注系统采用高压蒸汽进行灭菌。对培养液储存罐7、灌流管8和废液收集罐9采用高压蒸汽进行灭菌。。
S5、将安装好的血管芯片及其灌注系统放入细胞培养箱内。细胞培养箱的温度为37℃，CO2的浓度为5％。
S6、在培养之前，利用有限元方法，计算得出适合细胞生长的灌流入口速度。血管芯片1内部培养液流体的流速、压强及对中部细胞支架层3的剪切应力均在人体血流参数范围内。
S7、通过蠕动泵10提供灌流动力，将培养液从培养液储存罐7泵送至血管芯片1内，为血管芯片1内的细胞生长提供所需营养，并将细胞代谢废物通过培养液流动从灌流出管6排出。
通过蠕动泵10转速调节血管芯片1的灌流入口速度，从而使芯片1内流体符合人体血流主要参数，并且可根据不同细胞培养要求，通过控制程序(控制程序可为PLC控制器)来控制蠕动泵10启停时间以及转速，从而满足细胞培养要求。
实施例2
基于实施例1的基础上，本实施例与实施例1的区别在于，在进行短时间培养时，将废液收集罐9拆除。血管芯片1上的灌流出管6通过循环灌流管与培养液储存罐7相连通，并形成循环回路。由血管芯片1流出培养液将再次流入培养液储存罐7，实现培养液的循环利用。
所以在体外仿生血管芯片及其灌注系统的操作方法中，步骤S3更变为利用灌流管8将培养液储存罐7、蠕动泵10和血管芯片1依次连通，再利用循环灌流管将血管芯片1的灌流出管6与培养液储存罐7相连通。
步骤S4更变为对培养液储存罐7、灌流管8和循环灌流管采用高压蒸汽进行灭菌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种体外仿生血管芯片及其灌注系统，其特征在于：所述灌注系统包括依次通过灌流管(8)相连通的用于盛放培养液的培养液储存罐(7)、用于为灌流提供动力的蠕动泵(10)以及用于接收培养液储存罐(7)灌流入的培养液来进行人体血管、微环境和生理学功能模拟的血管芯片(1)；
所述血管芯片(1)包括从上至下依次可拆卸封装的用于灌流培养液的上部流道层(2)、嵌装在上部流道层(2)内用于接种细胞的中部细胞支架层(3)以及用于进行血管芯片(1)底部封装的下部密封层(4)，上部流道层(2)上设置有与培养液储存罐(7)相连通的灌流入管(5)以及用于通过培养液在血管芯片(1)内流动将细胞代谢废物排出的灌流出管(6)。
2.根据权利要求1所述的一种体外仿生血管芯片及其灌注系统，其特征在于：所述上部流道层(2)包括呈矩形块状的上部支架(21)、开设在上部支架(21)内部的仿生血管通道(22)以及设置在仿生血管通道(22)中部的中部细胞培养室(23)，中部细胞培养室(23)的底部开设有呈凹槽状的培养腔，培养腔与仿生血管通道(22)相连通。
3.根据权利要求2所述的一种体外仿生血管芯片及其灌注系统，其特征在于：所述下部密封层(4)包括与中部细胞支架层(3)尺寸相一致用于起到密封作用的PDMS密封垫(12)以及设置在PDMS密封垫(12)底部用于承托中部细胞支架层(3)及PDMS密封垫(12)的底部固定架(13)，PDMS密封垫(12)嵌装在中部细胞培养室(23)的培养腔内，底部固定架(13)与上部支架(21)之间通过连接结构连接；
所述连接结构包括至少四根分别与底部固定架(13)和上部支架(21)螺纹连接的不锈钢螺栓(14)以及与不锈钢螺栓(14)数量相对应并与不锈钢螺栓(14)相配合的螺母(15)。
4.根据权利要求3所述的一种体外仿生血管芯片及其灌注系统，其特征在于：所述底部固定架(13)上至少开设有四个用于增加血管芯片透气性的透气长条孔(131)。
5.根据权利要求1所述的一种体外仿生血管芯片及其灌注系统，其特征在于：所述血管芯片(1)上的灌流出管(6)通过灌流管(8)连通设置有用于收集从血管芯片(1)排出细胞代谢废物的废液收集罐(9)。
6.根据权利要求5所述的一种体外仿生血管芯片及其灌注系统，其特征在于：所述培养液储存罐(7)和废液收集罐(9)的顶部均配有用于防止细菌进入装置内部的过滤器(11)。
7.根据权利要求1所述的一种体外仿生血管芯片及其灌注系统，其特征在于：所述血管芯片(1)上的灌流出管(6)通过循环灌流管与培养液储存罐(7)相连通并形成循环回路。
8.根据权利要求1所述的一种体外仿生血管芯片及其灌注系统，其特征在于：所述灌注系统还包括用于为装置整体提供细胞生长适宜的温度、湿度和CO2浓度的细胞培养箱。
9.一种体外仿生血管芯片及其灌注系统的操作方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、安装血管芯片(1)；将中部细胞支架层(3)覆盖于PDMS密封垫(12)上表面，再将PDMS密封垫(12)及中部细胞支架层(3)置于上部流道层(2)底部设置的培养腔内，再将底部固定架置于PDMS密封垫(12)的下方，最后采用不锈钢螺栓(14)及螺母(15)将上部流道层(2)、中部细胞支架层(3)、下部装密封层(4)进行固定，组装得到血管芯片(1)；
S2、采用酒精、紫外照射对血管芯片(1)进行灭菌；
S3、安装灌注系统；利用灌流管(8)将培养液储存罐(7)、蠕动泵(10)、血管芯片(1)、废液收集罐(9)依次连通；
或利用灌流管(8)将培养液储存罐(7)、蠕动泵(10)和血管芯片(1)依次连通，再利用循环灌流管将血管芯片(1)的灌流出管(6)与培养液储存罐(7)相连通；
S4、对灌注系统采用高压蒸汽进行灭菌；
S5、将安装好的血管芯片及其灌注系统放入细胞培养箱内；
S6、通过蠕动泵(10)提供灌流动力，将培养液从培养液储存罐(7)泵送至血管芯片(1)内，为血管芯片(1)内的细胞生长提供所需营养，并将细胞代谢废物通过培养液流动从灌流出管(6)排出；
在步骤S4中，对培养液储存罐(7)、灌流管(8)和废液收集罐(9)采用高压蒸汽进行灭菌，或对培养液储存罐(7)、灌流管(8)和循环灌流管采用高压蒸汽进行灭菌；
在步骤S5中，细胞培养箱的温度为37℃，CO2的浓度为5％；
在步骤S6中，血管芯片(1)内部培养液流体的流速、压强及对中部细胞支架层(3)的剪切应力均在人体血流参数范围内。
10.根据权利要求9所述的一种体外仿生血管芯片及其灌注系统的操作方法，其特征在于：在培养之前，利用有限元方法，计算得出适合细胞生长的灌流入口速度；
通过蠕动泵(10)转速调节血管芯片(1)的灌流入口速度，从而使芯片(1)内流体符合人体血流主要参数，并且可根据不同细胞培养要求，来控制蠕动泵(10)启停时间以及转速。
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| CN (1) | CN110423687A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113005036A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-06-22 | 厦门大学 | 一种产生扰流的可拆卸式细胞培养流动腔室 |
| CN114260032A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-04-01 | 中国科学院大学深圳医院(光明) | 用于建立体外血管生理学模型的微流控芯片平台 |
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| CN205258447U (zh) * | 2015-12-15 | 2016-05-25 | 东南大学 | 一种基于内含物和贯通孔道的细胞芯片 |
| CN109825437A (zh) * | 2018-02-09 | 2019-05-31 | 百澳瑞派（天津）生物科技有限公司 | 一种用于细胞培养的微流控芯片及培养方法 |
| CN109894171A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-06-18 | 大连理工大学 | 一种可逆键合微流控芯片的方法 |
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2019
- 2019-07-10 CN CN201910621729.3A patent/CN110423687A/zh active Pending
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