CN110398483B - 一种高效的茶树基因细胞学定位方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种高效的茶树基因细胞学定位方法，试验当天将新鲜茶树根、茎、叶样品置于PBS缓冲液中，琼脂糖（包埋）固定后，于震荡切片机中切成50‑100μm切片，获得的茶树鲜样切片与目的基因特异抗体以及商业抗体杂交，最后于激光共聚焦显微镜下拍照。本发明细胞学基因定位方法能够快速高效的进行基因的精细定位；基因的定位可达到细胞学水平；试验过程所需周期短；避免因在模式植物拟南芥上进行茶树的基因定位带来的异源困扰；安全、可操作性和重复性强。

Description

一种高效的茶树基因细胞学定位方法
技术领域
本发明涉及基因定位技术领域，具体涉及一种高效的茶树基因细胞学定位方法。
背景技术
基因的组织定位很大程度上决定了其所行使的功能。如茶树氮素代谢限制酶编码基因谷氨酰胺合成酶基因，有定位于细胞质中的胞质型谷氨酰胺合成酶GS1和在叶绿体或线粒体中的质体型谷氨酰胺合成酶GS2。前者主要在根部氮代谢中发挥作用，而后者则主要将叶绿体和光呼吸再合成的NH4 +转化成谷氨酰胺，同时也参与根部氮的合成。拟南芥5个GS1成员由于表达部位的不同而导致其对不同氮源的响应不同，如GLN1;1、GLN1;2、GLN1;3、GLN1;4根据他们是在根表皮细胞还是维管组织中表达而导致其对NH4 +响应存在极大的差异。因此，对茶树基因进行精细定位是非常必要的。
茶树属多年生乔灌木，次生代谢物含量丰富，特别是多酚类含量物质高，可占总干物质重的20%-35%。正式由于其丰富的酚类物质含量导致其在遗传转化上的瓶颈，迄今并没有形成一个成熟的茶树遗传转化体系，导致茶树基因功能研究往往只能依靠在遗传转化体系成熟的拟南芥、番茄、烟草等植物中进行，如基因的定位、功能回复试验。由于茶树次生代谢物积累的特殊性，其他植物中常用的基因细胞学定位方法不适用于茶树，主要表现在效率低，稳定性差。但是异源转化并不能很好的解释茶树基因的确切功能，茶树的基因在别的物种中所起的调控作用是否与在茶树树体内一样并无充分的证据说明。
综上，有必要形成茶树树体内的基因定位技术。知道基因在茶树根、茎、叶中的表达定位情况，而非在其他植物中的定位来说明其功能，有力于推进生物技术在茶树养分利用、遗传育种等的方面的研究。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供一种快速高效的植物基因定位技术，以解决现有技术存在的弊端，克服了现有技术中由于前处理时间长、操作要求高、且实验周期长的问题。
本发明提供一种高效的茶树基因细胞学定位方法，试验当天将新鲜茶树根、茎、叶样品置于PBS缓冲液中，琼脂糖包埋固定后，于震荡切片机中切成50-100 μm切片，获得的茶树鲜样切片与目的基因特异抗体以及商业抗体杂交，最后于激光共聚焦显微镜下拍照。
作为本发明进一步的改进，所述琼脂糖为5%的琼脂糖。
作为本发明进一步的改进，所述PBS缓冲液的浓度为0.1 mol/L。
作为本发明进一步的改进，具体包括以下步骤：
S1. 一年生茶树扦插苗，在完全营养液中进行水培，取新生长的根、嫩茎、叶片于磷酸缓冲液中；
S2. 配置琼脂糖凝胶，待凝胶温度到50-60℃时，将上述茶树组织置于凝胶中，随后室温冷却至凝胶凝固，完成新鲜茶树组织的固定；
S3. 将固定好的茶树组织，置于振荡切片机上进行横切，切片厚度50-100 μm，切好的根、茎、叶的横切片室温孵育于PBS缓冲液中；
S4. 用含5% BSA的PBS缓冲液封闭30 分钟后，用PBS缓冲液冲洗四次；
S5. 将切片置于含基因特异抗体的PBS缓冲液中杂交孵育，用 PBS缓冲液冲洗四次；之后用含商业抗体Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG的PBS缓冲液中杂交孵育；最后再用PBS缓冲液多次冲洗；
S6. 将切片平铺于载玻片上，压片后于激光共聚焦显微镜下进行荧光观察并拍照。
作为本发明进一步的改进，步骤S2中所述琼脂糖凝胶为5%的琼脂糖凝胶。
作为本发明进一步的改进，步骤S3中所述PBS缓冲液的pH为7.4。
作为本发明进一步的改进，步骤S4和步骤S5中所述PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L。
作为本发明进一步的改进，步骤S5中每次杂交孵育时间为1-2小时。
作为本发明进一步的改进，步骤S5中所述基因特异性抗体为胞质型谷氨酰胺合成酶基因CsGS1.2和质体型谷氨酰胺合成酶基因CsGS2。
作为本发明进一步的改进，步骤S6中所述激光共聚焦显微镜为蔡司710双光子激光共聚焦显微镜。
本发明具有如下有益效果：
本发明细胞学基因定位方法适用于非模式植物茶树，遗传转化体系不完善，无法在茶树上进行基因的组织定位，同时也适用于其他遗传转化体系不完善的植物；
本发明细胞学基因定位方法能够快速高效的进行基因的精细定位；基因的定位可达到细胞学水平；试验过程所需周期短；避免因在模式植物拟南芥上进行茶树的基因定位带来的异源困扰；安全、可操作性和重复性强。
本发明与传统方法和实施效果的比较见表1：
表1 本发明与现有技术的主要优点
比较项目 本发明的技术特征 其他基因定位方法（原位杂交） 其他基因定位方法（转基因）
样品要求 茶树新鲜活体样 茶树组织经甲醛、丙酮脱水后的石蜡固定样 模式植物拟南芥
同源性 同源基因 同源基因 异源基因
技术要求 人为影响因素较小 操作人员熟练程度对实验处理效果影响较大 人为影响因素大
实验周期时间 效率高，一个白天可以完成实验 实验周期长，从样品固定到探针杂交至少需一个星期 实验周期最长2-3个月以上，即时采用模式植物也需要保证植株纯合才能进行后续的研究
操作安全性 本发明中所使用的试剂磷酸缓冲液对人体无毒害，且对环境安全 组织样品固定采用采用甲醛、二甲苯等毒性大 转基因存在生物安全问题
附图说明
图1为实施例1和实施例2中水培“龙井43”扦插苗。
图2为实施例1和实施例2中茶树组织琼脂糖包埋固定。
图3为实施例1中 CsGS1.2在叶片中的细胞学定位显微图。
图4为实施例2中 CsGS2在叶片中的细胞学定位显微图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
实施例1
用于茶树胞质型谷氨酰胺合成酶基因CsGS1.2定位
以‘龙井43’茶树一年生扦插苗为材料，取溶液培养四周后茶苗茶树吸收根、嫩茎、完全展开叶（见图1），5% 琼脂糖凝胶包埋固定后（见图2），在振荡切片机（VT 1000 S，Leica，Bensheim，Germany）上进行横切，切片厚度50-100 μm，切好的根、茎、叶的横切片室温孵育于pH为7.4的PBS缓冲液中，CsGS1.2抗体由杭州华安生物技术有限公司制备，兔二抗IgG购自Sigma公司。经一抗和二抗杂交孵育后平铺于载玻片上，压片后于710双光子激光共聚焦显微镜下进行荧光观察并拍照（图3），其中，箭头可明确看到该基因定位于细胞质中。
具体包括以下步骤：
S1. 一年生龙井43(Camelliasinensis cv.‘Longjing43’)扦插苗（图1），在完全营养液中进行水培，取新生长的根、嫩茎、叶片于磷酸缓冲液中；
S2. 配置5%的琼脂糖凝胶，待凝胶温度到50-60℃时，将上述茶树组织置于凝胶中，随后室温冷却至凝胶凝固，完成新鲜茶树组织的固定（图2）；
S3. 将固定好的茶树组织，置于振荡切片机上进行横切，切片厚度50-100 μm，切好的根、茎、叶的横切片室温孵育于pH为7.4的PBS缓冲液中；
S4. 用含5% BSA的PBS缓冲液封闭30 分钟后，用0.1mol/LPBS缓冲液冲洗四次；
S5. 将切片置于含胞质型谷氨酰胺合成酶基因CsGS1.2的0.1mol/LPBS缓冲液中杂交孵育，时间为1-2小时，用0.1mol/LPBS缓冲液冲洗四次；之后用含商业抗体AlexaFluor 555 goat anti-rabbit IgG的0.1mol/LPBS缓冲液中杂交孵育，时间为1-2小时；最后再用0.1mol/LPBS缓冲液多次冲洗；
S6. 将切片平铺于载玻片上，压片后于蔡司710双光子激光共聚焦显微镜下进行荧光观察并拍照（图3）。
实施例2
用于茶树质体型谷氨酰胺合成酶基因CsGS2定位
以‘龙井43’茶树一年生扦插苗为材料，取溶液培养四周后茶苗茶树吸收根、嫩茎、完全展开叶（见图1），5% 琼脂糖凝胶包埋固定后（见图2），在振荡切片机（VT 1000 S，Leica，Bensheim，Germany）上进行横切，切片厚度50-100 μm，切好的根、茎、叶的横切片室温孵育于1×PBS（pH 7.4）缓冲液中，CsGS2抗体由杭州华安生物技术有限公司制备，兔二抗IgG购自Sigma公司。经一抗和二抗杂交孵育后平铺于载玻片上，压片后于710双光子激光共聚焦显微镜下进行荧光观察并拍照（图4），其中，箭头可明确看到该基因定位于质体中。
具体包括以下步骤：
S1. 一年生龙井43(Camelliasinensis cv.‘Longjing43’)扦插苗（图1），在完全营养液中进行水培，取新生长的根、嫩茎、叶片于磷酸缓冲液中；
S2. 配置5%的琼脂糖凝胶，待凝胶温度到50-60℃时，将上述茶树组织置于凝胶中，随后室温冷却至凝胶凝固，完成新鲜茶树组织的固定（图2）；
S3. 将固定好的茶树组织，置于振荡切片机上进行横切，切片厚度50-100 μm，切好的根、茎、叶的横切片室温孵育于pH为7.4的PBS缓冲液中；
S4. 用含5% BSA的PBS缓冲液封闭30 分钟后，用0.1mol/LPBS缓冲液冲洗四次；
S5. 将切片置于含质体型谷氨酰胺合成酶基因CsGS2特异抗体的0.1mol/LPBS缓冲液中杂交孵育，时间为1-2小时，用0.1mol/LPBS缓冲液冲洗四次；之后用含商业抗体Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG的0.1mol/LPBS缓冲液中杂交孵育，时间为1-2小时；最后再用0.1mol/LPBS缓冲液多次冲洗；
S6. 将切片平铺于载玻片上，压片后于蔡司710双光子激光共聚焦显微镜下进行荧光观察并拍照（图4）。
与现有技术相比，本发明细胞学基因定位方法适用于非模式植物茶树，遗传转化体系不完善，无法在茶树上进行基因的组织定位，同时也适用于其他遗传转化体系不完善的植物；
本发明细胞学基因定位方法能够快速高效的进行基因的精细定位；基因的定位可达到细胞学水平；试验过程所需周期短；避免因在模式植物拟南芥上进行茶树的基因定位带来的异源困扰；安全、可操作性和重复性强。
本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。

Claims (1)

1.一种高效的茶树基因细胞学定位方法，其特征在于，试验当天将新鲜茶树根、茎、叶样品置于PBS缓冲液中，琼脂糖固定后，于振荡切片机中切成50-100μm切片，获得的茶树鲜样切片与目的基因特异抗体以及商业抗体杂交，最后于激光共聚焦显微镜下拍照；
所述琼脂糖为5％的琼脂糖；
所述PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L；
具体包括以下步骤：
S1.一年生茶树扦插苗，在完全营养液中进行水培，取新生长的根、嫩茎、叶片于磷酸缓冲液中；
S2.配置琼脂糖凝胶，待凝胶温度到50-60℃时，将上述茶树组织置于凝胶中，随后室温冷却至凝胶凝固，完成新鲜茶树组织的固定，所述琼脂糖凝胶为5％的琼脂糖凝胶；
S3.将固定好的茶树组织，置于振荡切片机上进行横切，切片厚度50-100μm，切好的根、茎、叶的横切片室温孵育于PBS缓冲液中，所述PBS缓冲液的pH为7.4；
S4.用含5％BSA的PBS缓冲液封闭30分钟后，用PBS缓冲液冲洗四次；所述PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L；
S5.将切片置于含基因特异抗体的PBS缓冲液中杂交孵育，用PBS缓冲液冲洗四次；之后用含商业抗体Alexa Fluor 555goat anti-rabbit IgG的PBS缓冲液中杂交孵育；所述PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L；最后再用PBS缓冲液多次冲洗；每次杂交孵育时间为1-2小时；所述基因特异性抗体为胞质型谷氨酰胺合成酶基因CsGS1.2和质体型谷氨酰胺合成酶基因CsGS2；
S6.将切片平铺于载玻片上，压片后于激光共聚焦显微镜下进行荧光观察并拍照；所述激光共聚焦显微镜为蔡司710双光子激光共聚焦显微镜。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6614525B1 (en) * 1999-11-22 2003-09-02 Leica Microsystems Heidelberg Gmbh Laser scanning microscope with single wavelength excitation
CN101782582A (zh) * 2010-01-11 2010-07-21 天津师范大学 检测重金属胁迫下核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法
WO2012173636A1 (en) * 2011-06-16 2012-12-20 University Of Rochester Hiv incidence assays with high sensitivity and specificity
CN106676184A (zh) * 2017-02-14 2017-05-17 福建省亚热带植物研究所 一种检测并定位甘蔗宿根矮化病致病菌lxx的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6614525B1 (en) * 1999-11-22 2003-09-02 Leica Microsystems Heidelberg Gmbh Laser scanning microscope with single wavelength excitation
CN101782582A (zh) * 2010-01-11 2010-07-21 天津师范大学 检测重金属胁迫下核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法
WO2012173636A1 (en) * 2011-06-16 2012-12-20 University Of Rochester Hiv incidence assays with high sensitivity and specificity
CN106676184A (zh) * 2017-02-14 2017-05-17 福建省亚热带植物研究所 一种检测并定位甘蔗宿根矮化病致病菌lxx的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《茄子SmNAC转录因子表达特性及功能鉴定分析》;陈娜;《中国优秀硕士论文全文数据库》;20170315(第03期);正文第13页 *

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