CN110358856A - 侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物及其在鉴定侧耳属物种中的应用 - Google Patents

侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物及其在鉴定侧耳属物种中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物及其在鉴定侧耳属物种中的应用，涉及遗传进化领域。该引物包括上游引物和下游引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明解决了现有技术中没有线粒体nad4L基因条形码对侧耳属进行分类鉴定的问题，该侧耳属线粒体nad4L基因特异性引物，可以一次性高通量对多个侧耳属物种进行扩增，为侧耳属物种鉴定及系统发育分析提供极大的便利；该引物的扩增产物大小为230bp左右，覆盖了nad4L基因大部分序列，既有足够的遗传位点用于物种区分鉴定，又可保证一个测序反应就能测完全部序列，具有操作简单，节约成本的优点。

Description

侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物及其在鉴定侧耳属物种 中的应用
技术领域
本发明涉及遗传进化领域，具体而言涉及侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物及其在鉴定侧耳属物种中的应用。
背景技术
线粒体是大多数真核细胞的能量制造机构，进行有氧呼吸的主要场所，被称为能量工厂。线粒体是一种半自主性细胞器，拥有自身的遗传物质和遗传体系。线粒体基因组是一种位于核外的胞质遗传系统，几乎仅遵从母系遗传，一般不发生重组，父本线粒体在受精过程中被迅速降解或此后不久在复制时被丢失了。线粒体基因组有相对恒定的进化速率，因此在种内水平及种间水平的分子生态学特别是分子系统地理学的研究中，是广泛应用的主流分子标记。
侧耳属物种是食药用菌的重要组成部分。侧耳属分类上属于担子菌门，伞菌纲，含有几十个已被描述的物种。侧耳属中的许多物种被作为珍贵的食药用菌，如杏鲍菇、平菇、金顶侧耳等，受到消费者的广泛欢迎。同时侧耳属子实体还含有多种生物活性物质，如萜类、甾醇、多糖等，被发现具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、调节免疫力等作用。由于侧耳属物种具有较少的可供区分的形态特征，同时部分形态特征变异较大，导致对侧耳属物种进行准确分类及鉴定变得非常困难，这限制了对侧耳属物种的进一步开发利用。
发明内容
本发明的第一发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物，该引物可以一次性高通量的对多种侧耳属物种进行扩增，为侧耳属物种鉴定及系统发育分析提供极大的便利。
本发明的第二发明目的在于，提供上述引物在鉴定侧耳属物种中的应用。
本发明采用的技术方案如下：
侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物，其包括上游引物和下游引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述的侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物在鉴定侧耳属物种中的应用。
本发明的侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物在鉴定侧耳属物种中的应用，其包括如下步骤：
根据侧耳属物种的线粒体nad4L基因序列中的保守序列设计上游引物和下游引物；
用所述上游引物和下游引物PCR扩增侧耳属线粒体nad4L基因，若PCR产物中无非特异性扩增，则引物特异性良好；
用所述上游引物和下游引物PCR扩增待测物种线粒体nad4L基因，若PCR产物中无非特异性扩增，则该真菌为侧耳属物种。
侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物在鉴定侧耳属物种中的应用，上游引物和下游引物之间的扩增片段在200-300bp；引物序列中GC含量为40％-60％。
本发明的侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物在鉴定侧耳属物种中的应用，PCR反应时，30μL体系包括：
本发明的侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物在鉴定侧耳属物种中的应用，PCR程序为：95℃5min；94℃45s，56℃35s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
本发明的侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物在鉴定侧耳属物种中的应用，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若PCR产物泳道上有且只有一条带，则无非特异扩增产生。
本发明的侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物在鉴定侧耳属物种中的应用，电泳检测后，若无非特异性扩增，回收PCR产物，纯化后测序，测序结果与已知的物种nad4L数据库中的侧耳属物种DNA序列进行比对，构建系统发育树，检验PCR产物序列与已知的侧耳属物种nad4L数据库中序列聚类在一起的物种，若待测物种与数据库中的物种构成单支系，则待测物种鉴定为该物种。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明提供了侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物及其在鉴定侧耳属物种中的应用，解决了现有技术中没有线粒体nad4L基因条形码对侧耳属进行分类鉴定的问题，提供的侧耳属线粒体nad4L基因特异性引物，可以一次性高通量的对多个侧耳属物种进行扩增，为侧耳属物种鉴定及系统发育分析提供极大的便利；该引物的扩增产物大小为230bp左右，覆盖了nad4L基因大部分序列，既有足够的遗传位点用于物种区分鉴定，又可保证一个测序反应就能测完全部序列，具有操作简单，节约成本的优点。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1是本发明实施例2中引物特异性检测的电泳结果图；
图2是本发明实施例3中15个侧耳属物种DNA的PCR扩增产物的电泳检测结果图；
图3是本发明实施例3中构建的系统发育树。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1
侧耳属nad4L基因序列片段数据库的建立以及引物设计。下载所有已发表的侧耳属物种线粒体nad4L基因序列，建立侧耳属nad4L基因序列片段数据库。然后利用MEGA 6.06软件对侧耳属nad4L序列进行比对，获取侧耳属nad4L基因的保守区段。根据保守区段设计侧耳属nad4L基因的通用引物，引物应当满足：
(1)上下游引物之间的扩增片段长度在200-300之间；
(2)引物序列GC含量在40％-60％之间。
本实施例中，一共构建了30对引物用于进一步筛选。避免引物内部可能出现二级结构；同时进行比对分析保证引物序列与核酸序列数据库其他程序无明显同源性，从而最终筛选获得了1对最佳的引物序列，正向引物为SEQ ID NO.1：5’-ttggtatcttagggtttat-3’，反向引物为SEQ ID NO.2：5’-cttaaagaaa tagttcctc-3’。
实施例2
引物特异性以及扩增方法有效性确认。本实施例通过多个单因素优化实验，最终确定了侧耳属nad4L基因的PCR扩增条件和反应体系。
其中，最佳PCR扩增条件为：95℃5min；94℃45s，56℃35s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
30μL体系包括：2×PCR Mix 15μL，DNA模板1μL，上、下游引物各1μL，ddH2O补齐至30μL。
用本实施例提供的最佳PCR扩增条件及体系进行PCR扩增，以验证引物的特异性和方法的有效性。具体方法如下：
取3个侧耳属物种和3个非侧耳属物种分别进行DNA的提取。其中，3个侧耳属物种分别为：糙皮侧耳、剌芹侧耳、美味侧耳。3个非侧耳属物种分别为：羊肚菌、香菇、裂褶菌。首先，利用液氮先对各物种的子实体进行充分研磨，然后利用OMEGA真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.TM Fungal DNA Kit，美国)提取总DNA，提取方法如该试剂盒说明书所示，本文中不再赘述。
直接以总DNA为模板(1μL)，利用上述的PCR反应条件和反应体系进行扩增，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(110v，30min)。
结果如图1所示，图1中，1-3泳道的检测样品分别为3个侧耳属物种DNA的PCR扩增产物，4-6泳道分别为3个非侧耳属物种DNA的PCR扩增产物。由图3可知，3个侧耳属物种获得了单一的条带，大小在200-300bp之间。而非侧耳属物种没有得到扩增条带(图未示)。由此表明，实施例1提供的引物具有良好的物种特异性。
实施例3
本实施例利用实施例1提供的引物和实施例2提供的PCR扩增条件及体系鉴定物种，为本发明提供的引物及其应用提供进一步的依据。需要说明的是，为了验证本发明提供的引物的有效性，本实施例中所选用的带鉴定物种均为已知的侧耳属物种。
本实施例中选取了15个侧耳属物种进行nad4L基因扩增及系统发育分析，包括糙皮侧耳、美味侧耳、剌芹侧耳、黄白侧耳、白阿魏蘑、肺形侧耳、具核侧耳、金顶侧耳、红平菇、桃红侧耳、鲍鱼菇、栎生侧耳、长柄侧耳、佛罗里达侧耳和扇形侧耳。具体操作方法如下：
将各侧耳子实体首先用液氮充分研磨，然后利用OMEGA真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.TM Fungal DNA Kit，美国)提取总DNA。提取的总DNA利用DNA纯化试剂盒进行纯化(D1300，北京索莱宝科技有限公司)，试剂盒的使用均按照其说明书进行。
然后以总DNA为模板(1μL)，利用实施例2提供的PCR反应条件和反应体系进行扩增，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(110v，30min)。
结果如图2所示，图2中，1-15泳道的检测样品分别为上述15个侧耳属物种DNA的PCR扩增产物。由图2可知，15个侧耳属物种都获得了单一的条带，进一步证明了扩增引物的特异性。
随后将PCR扩增产物利用PCR纯化试剂盒(D0033，碧云天)进行纯化，纯化产物进行测序，利用MEGA软件对获得的序列构建系统发育树，所构建的发育树如图3所示。由图3可知，系统发育树共分为4个大的分支：红平菇、桃红侧耳、扇形侧耳为第一个分支；金顶侧耳为第二个分支；具核侧耳、鲍鱼菇、栎生侧耳为第三个分支；美味侧耳、灰白侧耳、糙皮侧耳、黄白侧耳、佛罗里达侧耳、刺芹侧耳、白阿魏蘑、肺形侧耳为第四个分支。系统发育关系近的物种具有较近的亲缘关系，本研究的结果与侧耳属形态学和分子分类的结果基本一致，表明nad4L基因可以作为分析侧耳属物种系统发育关系的有效分子标记。
综上所述，本发明提供的侧耳属线粒体nad4L基因特异性引物，可以一次性高通量的对多个侧耳属物种进行扩增，为侧耳属物种鉴定及系统发育分析提供极大的便利；该引物的扩增产物大小为230bp左右，覆盖了nad4L基因大部分序列，既有足够的遗传位点用于物种区分鉴定，又可保证一个测序反应就能测完全部序列，具有操作简单，节约成本的优点。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川省农业科学院生物技术核技术研究所
<120> 侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物及其在鉴定侧耳属物种中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttggtatctt agggtttat 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cttaaagaaa tagttcctc 19

Claims (8)

1.侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物，其特征在于，其包括上游引物和下游引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的侧耳属线粒体nad4L基因的扩增引物在鉴定侧耳属物种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，其包括如下步骤：
根据侧耳属物种的线粒体nad4L基因序列中的保守序列设计上游引物和下游引物；
用所述上游引物和下游引物PCR扩增侧耳属线粒体nad4L基因，若PCR产物中无非特异性扩增，则引物特异性良好；
用所述上游引物和下游引物PCR扩增待测物种线粒体nad4L基因，若PCR产物中无非特异性扩增，则该真菌为侧耳属物种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，上游引物和下游引物之间的扩增片段在200-300bp；引物序列中GC含量为40％-60％。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，PCR反应时，30μL体系包括：
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，PCR程序为：95℃ 5min；94℃ 45s，56℃35s，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸10min。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若PCR产物泳道上有且只有一条带，则无非特异扩增产生。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，电泳检测后，若无非特异性扩增，回收PCR产物，纯化后测序，测序结果与已知的侧耳属物种nad4L数据库中的物种DNA序列进行比对，构建系统发育树，检验PCR产物序列与已知的侧耳属物种nad4L数据库中序列聚类在一起的物种，若待测物种与数据库中的物种构成单支系，则待测物种鉴定为该物种。
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