CN110346476A

CN110346476A - 一种十二烷醇的应用

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Publication number: CN110346476A
Application number: CN201910681665.6A
Authority: CN
Inventors: 杨发忠; 周世萍; 唐敏; 李云仙; 朱国磊; 杨斌
Original assignee: Southwest Forestry University
Current assignee: Southwest Forestry University
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2019-10-18

Abstract

本发明公开了一种十二烷醇的应用，所述的十二烷醇的应用为所述的十二烷醇在制备植株感病标记检测物中的应用。本发明确定十二烷醇可用于对中国月季植株是否感染了白粉菌进行早期诊断。经过对健康和感病中国月季植株挥发性成分、以及白粉菌自身的挥发性成分进行鉴定，筛选出该化合物。在正常情况下健康植株不会合成所述的十二烷醇，只有在白粉菌的诱导作用下该标记化合物才会被植株合成出来，该化合物不是来自白粉菌，因此可作为感病标记化合物。

Description

一种十二烷醇的应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种十二烷醇的应用。

背景技术

截止目前，化学农药是控制植物病害的主要手段之一，然而化学农药，尤其是化学灭菌剂在消灭植物病害的同时，会对环境带来污染，以及出现众所周知的农药3R效应（residue残留、resistance抗性、resurgence再猖獗），如何解决和避免这些问题，多年来一直是植物保护领域科学家们研究的热点。其中，尽量减少农药的使用量是重要的解决办法之一。然而，按照常规农业生产模式，如果减少了农药的使用量，则因达不到理想的防效而导致经济损失。

要想减少农药使用量还能达到理想的防效，一个可行的办法就是，在作物感病初期、越早越好、甚至在感病症状还远未显现之前，就采取措施杀灭植物病原菌，这样就能有效减少农药使用量并达到理想的防效，以实现早发现、早防、早治的目的。然而，截止目前还没有一种合适的方法，在作物感病初期、未表现出感病症状之前，对植物是否感病进行准确诊断。为此，开发一种能解决上述问题的产品和方法是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种十二烷醇的应用。

本发明的目的是这样实现的，所述的十二烷醇在制备植株感病标记检测物中的应用。

中国月季Rosa chinensis Jacq.俗称玫瑰，在我国和全世界广为栽培，属世界四大鲜切花之一。据调查，中国月季种植过程中最主要病害是月季白粉菌Sphaerotheca pannosa (Wallr.: Ex Fr.) Lév.，在大棚生产条件下终年发生，导致严重经济损失。月季白粉菌属子囊菌亚门真菌，是专性寄生真菌，仅侵染蔷薇属植物。本发明的研究结果表明，中国月季感染了白粉菌后，植物挥发性成分种类和含量均会发生明显变化。有的挥发性化合物，正常情况下在健康中国月季植物体内是不会产生的，但是感染了白粉菌后，在白粉菌的诱导作用下，这些挥发性成分就会被植株合成出来。因此，如果中国月季感染了白粉菌，则能检测到这些挥发性化合物；反之，如果检测到这些挥发性化合物的存在，则表明植株已被白粉菌侵染。把这种能够标记植株是否感病的化合物称为感病标记化合物(biomarkerof infection)。本发明的研究结果表明，十二烷醇(1-dodecanol)是中国月季植株感染白粉菌的一种重要的感病标记化合物。

另外，在自然界中，白粉菌的菌丝或孢子落到植株上，需要在适宜的条件下才能萌发、生长，可能并不一定会成活。但是在检测时，白粉菌自身的挥发性成分会被检测到而被误认为是感病标记化合物，这将导致误诊。为了避免这一问题，所选感病标记化合物不能同时来自白粉菌，为此，白粉菌的挥发性成分也需要提前鉴定出来，如果发现来自白粉菌的化学成分则可加以避免。

通过原位检测、无损检测的方法对十二烷醇进行检测，并实现了早期检测，从而提供了一种方法，用于对中国月季植株是否感染了白粉菌进行早期诊断。如果检测到该化合物，则表明植株已感病。早在感病后的第4天、感病症状还远未显现之前，检测成功率就可达到100%。在这样的感病早期阶段开始用药杀灭白粉菌，能够极大减少农药的使用量，减少对植株的伤害，减少抗药性发生，减少农药残留量，减少对环境的污染等。可见，开发并使用早期诊断方法是十分必要的，也具有广阔的应用前景。

本发明所述的十二烷醇是发明人按以下步骤筛选出来的，具体为：

(1) 健康中国月季植株挥发性成分鉴定；

(2) 感染了白粉菌的中国月季植株的挥发性成分鉴定；

(3) 白粉菌自身的挥发性成分的鉴定；

(4) 筛选出感病标记化合物，需同时符合以下4个要求，一是在感染了白粉菌的中国月季植株中鉴定出了该种化合物；二是在健康中国月季植株中没有鉴定出来；三是白粉菌中也没有鉴定出来；四是鉴定出的该种化合物的含量较大。

(5) 测定所选感病标记化合物的含量是否会随着感病病级的增加而增加；并且测定是否会随感病时间的延长而增加。

结果表明，十二烷醇符合所述要求，是重要的感病标记化合物之一。

本发明通过原位检测方法对中国月季植株进行无损检测，使用GC-MS对十二烷醇进行测定，从而实现对中国月季植株是否感染了白粉菌进行早期诊断。

本发明确定十二烷醇可用于对中国月季植株是否感染了白粉菌进行早期诊断。经过对健康和感病中国月季植株挥发性成分、以及白粉菌自身的挥发性成分进行鉴定，筛选出该化合物。在正常情况下健康植株不会合成所述的十二烷醇，只有在白粉菌的诱导作用下该标记化合物才会被植株合成出来，该化合物不是来自白粉菌，因此可作为感病标记化合物。

附图说明

图1为健康中国月季植株(HRP)挥发性成分的总离子流图；

图2为感染白粉菌后中国月季植株(IRP)挥发性成分的总离子流图；

图3为白粉菌(RPM)挥发性成分的总离子流图；

图4为病级对十二烷醇含量的影响；

图5为感病时间对十二烷醇含量的影响。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。例如，使用便携式离子迁移谱检测仪(ion mobility spectrometer, IMS)也可代替GC-MS用于本发明的检测，因此落入本发明保护范围。

本发明所述的十二烷醇在制备植株感病标记检测物中的应用。

所述的植株为中国月季。

所述的植株感病标记检测物的检测病原为白粉菌。

所述的植株感病标记检测物可在植株感病早期、无感病症状时即对植株是否感病进行准确诊断。

所述的植株感病标记检测物的检测方法为原位检测。

所述的植株感病标记检测物的检测方法为无损检测。

检测的仪器采用GC-MS。

检测方法是检测到十二烷醇的存在即记为阳性检出。

采用十二烷醇作为感病标记化合物对中国月季植株进行检测，可实现原位检测、无损检测，同时实现了对中国月季植株是否感染了白粉菌进行早期诊断。提早发现、及时用药，可显著减少农药使用量，不仅节约成本，还减少了农药对植株的伤害、有效控制“3R”问题、减少对环境的污染等。

如果检测在感病4天时(或之后)进行，尽管此时还远未显现出感病症状，但本发明的诊断正确率可达100%。

截止目前，化学农药是控制植物病害的主要手段之一，然而化学农药，尤其是化学灭菌剂在消灭植物病害的同时，会对环境带来污染，以及出现众所周知的农药3R效应（residue残留、resistance抗性、resurgence再猖獗），因此需要尽量减少农药的使用量。只有在作物感病初期、越早越好、甚至在感病症状还远未显现之前，就采取措施杀灭植物病原菌，这样才能有效减少农药使用量并达到理想的防效。为此，本发明拟公开一种方法以解决植物感病早期诊断的问题。

中国月季Rosa chinensis Jacq.感染了月季白粉菌Sphaerotheca pannosa(Wallr.: Ex Fr.) Lév.之后，在白粉菌的诱导作用下，一些新的挥发性化合物就会被植株合成出来。把这种能够标记植株是否感病的化合物称为感病标记化合物(biomarker ofinfection)。本发明的研究结果表明，十二烷醇(1-dodecanol)是中国月季植株感染白粉菌的一种重要的感病标记化合物。本发明所述的感病标记化合物不能来自健康植株、也不能来自于白粉菌自身，这样的感病标记化合物才可用于对中国月季植株是否感染了白粉菌进行早期诊断。

下面以具体实施例对本发明做进一步说明：

实施例1

感病标记化合物的发现

（1）健康和感病中国月季植株挥发性成分收集

采用顶空动态吸附(headspace dynamic absorption)法收集健康无病虫害的中国月季植株挥发性成分，同法收集仅感染了白粉菌的中国月季植株挥发性成分。实验在中国月季切花实际生产所用的温室大棚中进行，温度18~42℃、70~100% RH、光周期约14 h。

收集过程中入口空气流速800 ml/min，出口流速500 ml/min，多余的气流经不可避免的漏气口流出，从而保证收集袋内为高压状态，以防止外界空气进入收集系统。收集袋采用透明烤箱袋，使用前先180℃预处理1小时，将可能挥发的物质去净。将一枝中国月季枝条封入收集袋中，并通入空气作为载气。空气先经活性炭净化，再经去离子水润湿，进入第一个Tenax TA吸附管，再用聚四氟乙烯管导入收集袋内，通过收集袋后同样用聚四氟乙烯管导出至第二个Tenax TA吸附管。空气将中国月季植株产生的挥发性成分带入第二个吸附管并且挥发性成分被吸附剂吸附。将第二个吸附管中的挥发性成分用1 ml正己烷洗下，冰浴、氮气顶吹至约0.1 ml，将收集到的挥发性成分在-20℃冰箱中保存至GC-MS分析。收集时间为24小时，以消除日节率变化对挥发性成分种类和含量的影响。

（2）白粉菌挥发性成分的提取

由于感病标记化合物是中国月季植株感染白粉菌后在白粉菌的诱导作用下由寄主植物新合成的，它们不会来自于健康植株，也不能来自于白粉菌自身。在收集感病中国月季挥发性成分的过程中，植株上的白粉菌无法完全去除干净，所以白粉菌的化学成分必然会进入感病植株挥发性成分中而无法区分。因而只能同时鉴定白粉菌的挥发性成分。如果鉴定出的感病植株挥发性成分（A）不是来自于健康植株（B），同时也不是来自于白粉菌（C）自身，那么，可以确认该挥发性成分就是备选的感病标记化合物。简言之，从A中去掉B再去掉C剩下的就是备选的感病标记化合物。进一步，在备选的感病标记化合物中，如果含量较大，方便GC-MS进行准确定性定量，则为最终选择的感病标记化合物。另外，由于相比于顶空动态吸附法，溶剂提取法可以得到更多种类的物质，有利于从A中去掉C，所以采用溶剂提取法提取白粉菌的挥发性成分。

将白粉菌的菌丝或孢子从感病植株上扫下，用正己烷浸泡提取8小时，进行GC-MS分析鉴定。

（3）GC-MS分析条件

采用GC-MS法对健康中国月季植株(healthy rose plant, HRP)、感染白粉菌后中国月季植株挥发性成分(infected rose plant, IRP)和白粉菌挥发性成分(rose powderymildew, RPM)进行分析鉴定。气相色谱-质谱条件：仪器为美国Agilent Technologies公司HP6890GC/5973MS气相色谱－质谱联用仪。GC条件：HP-5 MS石英毛细管柱(30 m × 0.25mm × 0.25 μm)；柱温：起始温度40℃，程序升温3℃/min至80℃，再程序升温5℃/min至260℃；柱流量为1.0 ml/min；进样口温度250℃；柱前压100 kPa；进样量1.0 μl；对HRP和IRP，不分流进样，对RPM分流比10: 1，载气为高纯氦气。MS条件：电离方式EI；电子能量70 eV；传输线温度250℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；质量范围35~500 amu；采用wiley7n.l标准谱库检索定性。

（4）结果

对健康中国月季、感染白粉菌的中国月季和白粉菌三种样品的挥发性成分进行GC-MS分析鉴定，根据峰面积计算相对百分含量，结果如图1-3和表1所示。可以看出，表1中序号为47的化合物是十二烷醇，该化合物在健康中国月季和白粉菌的样品中的百分含量均为0，而在感病中国月季样品中相对百分含量较大，达到了1.42%，可保证后续的GC-MS分析容易获得更为准确的检测结果。并且该化合物的停留时间小于30 min，有效缩短了分析检测所需时间。结果表明十二烷醇是中国月季感染白粉菌后在白粉菌的诱导作用下由寄主植物新合成的，可以作为感病标记化合物，用于对中国月季植株是否感染了白粉菌进行诊断。

表1 HRP、IRP和RPM的挥发性成分的GC-MS分析

Table 1 GC-MS analysis for volatiles obtained from HRP, IRP and RPM

注：HRP、IRP和RPM分别表示从健康中国月季植株(healthy rose plant, HRP)、感染白粉菌后中国月季植株(infected rose plant, IRP)和白粉菌(rose powdery mildew,RPM)中鉴定出的挥发性成分。“－”表示未从该种材料中鉴定出。

HRP, IRP, and RPM represent that the volatiles are identified fromhealthy rose plant (HRP), infected rose plant (IRP), and rose powdery mildew(RPM) under the GC-MS method, respectively. A dash means that the compound isnot found in corresponding volatile extract.

实施例2

感病病级对十二烷醇含量的影响

实施例1已发现十二烷醇是重要的感病标记化合物，可用于指示中国月季植株是否感染了白粉菌。实施例2和实施例3对此进行进一步验证。如果十二烷醇确实是感病标记化合物，则其含量应随感病病级的增加而增加（实施例2中），随感病时间的延长而增加（实施例3中）。

在玫瑰种植大棚中，根据白粉菌覆盖叶片面积大小对感病程度进行分级。一枝枝条上所有叶片1/16的面积被白粉菌覆盖定为I级；1/8被覆盖定为II级；1/4被覆盖定为III级；而把完全未感染白粉菌的健康植株定为0级，作为对照。采用与实施例1中相同的方法收集挥发性成分并进行GC-MS分析，每病级重复3次。收集结束后，将枝条剪下称重，计算十二烷醇的含量(ng·(gfw·hr)^-1)。结果如附图4所示。

结果表明，病级为0级时，3次重复样品中均没有检测到十二烷醇的存在。而当病级为I级或以上时，所有样品中均检测到了十二烷醇。并且，其含量随感病病级的增加而增加。当病级为II级时，其含量与实施例1中（所有叶片全部被白粉菌覆盖，病级为V级）所检测到的含量接近，可以看出，当1/8的叶片面积被白粉菌覆盖时，十二烷醇的含量就已基本达到最大值。该结果进一步表明十二烷醇可作为感病标记化合物。

实施例3

感病时间对十二烷醇含量的影响

选取叶数、株高、茎粗基本一致的中国月季枝条，其中3枝作为健康对照，其它接种白粉菌。分别于接种后的4、7、10、13、16天收集挥发性成分，收集方法和GC-MS鉴定方法同实施例2。每时间点重复3次。结果如附图5所示。

总体来看，中国月季植株接种白粉菌后，随着感病时间延长，十二烷醇含量增加，存在着明显的时间效应。而在健康对照中，3次重复均未发现十二烷醇存在。结合实施例1~3的结果可以确认，十二烷醇可以作为感病标记化合物。如果检测到该化合物的存在，则可以证明植株已被白粉菌侵染。白粉菌的生长发育诱导了中国月季植株生理生化代谢变化，也表现在次生代谢产物挥发性成分的种类和含量的变化。

另外，接种白粉菌后，一般2周左右表现出感病症状，并可通过目视检查发现白粉菌。但本实施例的结果表明，感病后的第4天，感病标记化合物十二烷醇就能被准确检测到。此时植株还远未表现出感病症状。因此，该诊断方法可用于感病早期诊断，可对白粉菌侵染实现早发现、早防治，由于此时孢子还未形成，因此可有效减少农药使用量并且达到理想防效，具有十分重要的意义。

该诊断方法在实际使用过程中，在目视检查未发现白粉菌的情况下，只要检测到十二烷醇存在即记为阳性检出，无需具体计算出其含量值，因此也无需将枝条剪下。但可按实施例1中的方法计算相对百分含量，从而进一步估计感病时间。

简言之，该诊断方法可实现原位检测、早期检测、无损检测。

实施例4

田间实验

在玫瑰种植大棚中随机选择45枝枝条，采用与实施例1中相同的方法收集挥发性成分并进行GC-MS分析，若感病标记化合物十二烷醇在接种后4天时为阳性检出，则将该枝条用透明烤箱袋封住，防止外界白粉菌侵染，继续进行正常水肥管理，16天后目视观察白粉菌侵染情况。同时将阴性枝条也同法处理，16天后统计被白粉菌侵染的枝条数量。结果如表2所示。

结果表明，在被调查的总计45枝中国月季枝条中，其中1枝因意外折断而未进入统计，其余44枝中有4枝枝条的感病标记化合物十二烷醇为阳性检出，并且在后续目视观察中全部发现被白粉菌侵染，实际发生率为100%。与此同时，阴性检出的40枝枝条则均未发现白粉菌。表明采用此法对中国月季植株是否感染了白粉菌进行早期诊断的成功率为100%。

综上所述，该诊断方法准确可靠、成功高效，可用于感病早期诊断，为灭菌剂的使用提供重要依据，可实现对中国月季上的白粉菌侵染进行原位检测、无损检测、早期检测，可实现早防早治，应用前景广阔。

表2 田间实验结果

Table 2 Result from field experiment to conform

总检测株数（株）	阴性株数（株）	阳性株数（株）	阳性率（%）	14天后实际发生株数（株）	14天后实际发生率（%）
						44	40	4	9.1	4	100

Claims

1.一种十二烷醇的应用，其特征在于所述的十二烷醇在制备植株感病标记检测物中的应用。

2.根据权利要求1所述的十二烷醇的应用，其特征在于所述的植株为中国月季。

3.根据权利要求1所述的十二烷醇的应用，其特征在于所述的植株感病标记检测物的检测病原为白粉菌。

4.根据权利要求1所述的十二烷醇的应用，其特征在于所述的植株感病标记检测物可在植株感病早期、无感病症状时即对植株是否感病进行准确诊断。

5.根据权利要求1所述的十二烷醇的应用，其特征在于所述的植株感病标记检测物的检测方法为原位检测。

6.根据权利要求1所述的十二烷醇的应用，其特征在于所述的植株感病标记检测物的检测方法为无损检测。

7.根据权利要求5或6所述的十二烷醇的应用，其特征在于检测的仪器采用GC-MS。

8.根据权利要求5或6所述的十二烷醇的应用，其特征在于检测方法是检测到十二烷醇的存在即记为阳性检出。