CN110343604A - 一种微流控农残检测芯片及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微流控农残检测芯片、检测系统和方法，包括底板以及透明盖板，所述底板上设有流道，按照物料流向，所述流道中设有第一微混合器、抑制反应区、第二微混合器以及显色区；所述流道入口处设有供驱动油进入所述流道的进液池；在所述进液池与第一微混合器之间的流道上，设有用于滴加含有农药的检测样液的样液池和用于滴加含有胆碱酯酶的溶液的酶液池；在所述抑制反应区与第二微混合器之间的流道上，设有用于滴加底物和显色剂的底物池。本发明使用微流控芯片作为反应载体。装置轻巧便携，用微量试剂即可完成检测分析；具有广阔的功能拓展前景，可耦合多项检测，例如重金属含量分析；且采用自动分析，精度高。

Description

一种微流控农残检测芯片及应用

技术领域

本发明属于农药检测技术领域，具体是涉及一种微流控农残检测芯片 及应用。

背景技术

农药作为现代农业的重要组成部分，其对于作物产量的提升作用意义 巨大；但是滥用农药也引发了严重的农残问题，对人体健康威胁巨大：85％ 以上的癌症、80余种疾病与农药残留有关。有效的农残检测方法是保障食 品安全的必须手段。

目前广泛使用的农残检测方法包括农残速测卡检测法与质谱、色谱检 测法。

农残速测卡是一种快速检测试纸。农残速测卡是基于酶抑制反应实现 对农药的检测。酶抑制反应检测农药残留基于有机磷和氨基甲酸酯类农药 与乙酰胆碱酯酶特异性结合使其失活，影响酶正常催化分解作用的原理， 通过检测乙酰胆碱酯酶的抑制率从而判断农药的浓度。反应过程如下：底 物硫代乙酰胆碱(ATCh)在乙酰胆碱酯酶(AchE)的催化作用下被水解 为胆碱和乙酸。随后生成的胆碱与显色剂二硫代二硝基苯甲酸(DTNB) 反应形成黄色化合物。通过检测反应显色的深浅可以得到农药浓度信息。 化学反应机理如图1所示。其操作简便、携带方便，无需专业培训；但由 于使用中完全手动操作，缺乏严格的控制条件，且完全由裸眼比色判断结 果，因此该法检测精度较极为有限(约0.5mg/L)。

气相色谱法精度极高且适用范围广，但检测时间长(超过一天)；需 要专业人员操作；仪器体积庞大、价格昂贵，成本至少数万元。

微流控芯片(microfluidic chip)，又称芯片实验室(lab-on-a-chip)。 通过微型反应区及流道设计，最大限度的实现分析设备的微型化、集成化。 该技术能够将多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合和大规模 集成，大幅度缩短样品的处理时间，以极少量的样品获得极大的信息量。

发明内容

针对现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种微流控农残检测芯 片，利用该微流控农残检测芯片可以快速、高精度的实现读农药残留的检 测。

本发明同时提供了一种微流控农残检测系统，利用该系统可以方便快 捷的实现对农药残留量的检测，且操作简单，精度高，

本发明还提供了一种微流控农残检测检测方法。

一种微流控农残检测芯片，包括底板以及透明盖板，所述底板上设有 流道，按照物料流向，所述流道中设有第一微混合器、抑制反应区、第二 微混合器以及显色区；

所述流道入口处设有供驱动油进入所述流道的进液池；

在所述进液池与第一微混合器之间的流道上，设有用于滴加含有农药 的检测样液的样液池和用于滴加含有胆碱酯酶的溶液的酶液池；

在所述抑制反应区与第二微混合器之间的流道上，设有用于滴加底物 和显色剂的底物池。

为保证料液的混合，作为优选，所述第一微混合器和第二微混合器为 迂回设置的流道结构。

通过第一微混合器主要实现对含有农药的检测样液和胆碱酯酶的充 分混合。通过第二微混合器主要实现对抑制酶液与底物之间的混合。通过 抑制反应区主要实现含有农药的检测样液和胆碱酯酶的反应。

本发明中，所述样液池、酶液池的顺序可以改变。

本发明中，作为优选，利用所述透明盖板将流道密封在底板上，为了 方便驱动，作为优选，所述透明盖板上设有与所述进液池对应的进液孔。 同时，作为优选，所述透明盖板上设有排气孔。作为进一步优选，所述透 明盖板设有正对所述进液池的进液嘴，该进液嘴上设有所述的进液孔。

作为优选，所述进液池、样液池、酶液池为直径为3～5mm的圆柱孔； 进一步优选为直径为4mm的圆柱孔；深度为0.5～1.5mm；进一步优选为1mm。所述底物池为直径为4～6mm的圆柱孔，进一步优选为5mm；深度 为0.5～1.5mm；进一步优选为1mm。所述流道宽度为0.5～1.5mm，进一步 优选为1mm。作为优选，所述抑制反应区为直径为4～6mm的圆柱孔，进 一步优选为5mm；深度为0.5～1.5mm。

作为优选，所述第一微混合器和第二微混合器为S型迂回设置的流道 结构，流道宽度为0.5～1.5mm，进一步优选为1mm。流道深度为0.5～1.5mm； 进一步优选为1mm。

本发明中，所述微流控农残检测芯片的宽度为5～15mm，长度为 50～100mm。

针对酶抑制反应的过程及原理，我们设计了农残检测微流控芯片。芯 片由白色底板和透明盖板组成：底板设计有微型反应池和微流道，用于分 步实现农药检测；盖板上设计有进样口和排气口。底板和盖板键合组成检 测芯片，保证流道内部密封。

一种微流控农残检测系统，包括：

实现农药对乙酰胆碱酶的抑制与显色反应的微流控芯片，其为上述任 一技术方案所述的微流控芯片；

控制所述驱动油流速的驱动机构；

检测显色结果的检测分析单元；

用于控制微流控芯片在恒温下反应的温控单元。

作为优选，所述驱动机构为微型蠕动泵。

作为优选，所述检测分析单元包括：

采集图像的摄像机；

对图像进行处理和计算的计算机。

本发明采用机器视觉识别方法对显色反应结果进行分析从而得到农 药浓度信息。在稳光源下通过树莓派控制摄像头采集显色区图像。得到图 像后首先判断采集到的图像是否符合标准：主要判断依据为显色区是否位 于图像正中心，面积是否处于设定的标准内等；如果不符合要求，则调整 摄像头的焦距后重新拍摄，直到图像符合要求。

随后分析所得图像，首先将图片进行裁剪。通过边缘检测原理，找到 颜色突变的边缘，从而将只有反应后的混合试剂的图片部分裁剪出来。随 后对裁剪出来的图片进行处理，为保证检测的准确性，逐点计算图像的 RGB，将图像中所有点的红色，绿色，蓝色分量分别求平均值，得到图片 的RGB，随后按照相应公式计算显色值，从而量化判断农药残留量的多 少。

作为优选，所述温控单元可采用现有的温度控制机构(比如可以采用 设置在芯片底面的电加热板)。为最大幅度地缩短检测时间，需维持反应 物处于较高的反应活性、提高反应速度。在较低温度范围内，该化学反应 会随温度升高而加速；但由于乙酰胆碱酯酶的主要成分为蛋白质，温度过 高会导致蛋白质变性，酶活性减弱。发明人发现乙酰胆碱酯酶在30～40℃ 时表现出最大活力(37℃时最佳)，即30～40℃为反应最适温度。将检测 区温度控制在该范围内可以有效提高检测效率。作为优选，所述温控单元 控制微流控芯片在30～40℃。

作为优选，所述检测分析单元还包括照明电源。所述摄像机固定在所 述控制微流控芯片显色区正上方。

一种上述任一技术方案所述的微流控农残检测系统对农药进行检测 的方法，包括：

(1)将设定量的对应试剂或者样品分别加入到样液池、酶液池、底 物池；即：将含有农药的检测样液(比如10微升)加入到样液池；将含 有胆碱酯酶的溶液(比如10微升)加入到酶液池；将底物和显色剂(比 如各10微升)加入到底物池中；

(2)驱动机构控制驱动油推动检测样液与胆碱酯酶的溶液混合(主 要在第一微混合器内实现混合)，并将混合液推进至抑制反应区后暂停设 定时间，然后继续讲反应液推进至底物池中与底物及显色剂接触，充分混 合(主要在第二微混合器内完成混合)后进入显色区实现显色反应；

(3)检测分析单元采集显色区图像，根据图像的显色值，得出农药 残留量。

作为优选，步骤(3)中：

采集得到显色区图像首先判断显色区是否位于图像正中心，面积是否 处于设定的标准内，如为否，则调整摄像头后重新拍摄；

得到符合要求的图像后，提取感兴趣区域，计算感兴趣区域的显色值， 利用显色值与农药残留量之间的关系，得出农药残留量。

作为优选，所有样品(含有农药的检测样液、含有胆碱酯酶的溶液、 底物和显色剂)的加入量分别为5～15微升，进一步优选为10微升。

在检测之前，可以预先对显色值与农药残留量之间的关系进行标定， 并将标定值预存在计算机内，在检测时，得到显色图像的显色值后，即可 直接得到待检测农药样品的农药残留量。

本发明先将定量的反应试剂加入对应反应池内，而后用油推动酶与农 药接触并在流道内充分混合，将酶与农药的混合液推进至抑制反应区后暂 停推动；待抑制反应充分进行(10min)后继续推进反应液与底物及显色 剂接触，并在流道内充分混合后进入显色区实现显色反应。

由于酶抑制反应需要定量控制，因此试剂提前加入对应反应池内，反 应过程中由油推进试剂进行分步混合与反应。为保证油的推进效果，避免 出现水相分散问题，可选择对芯片流道进行疏水处理。比如可以采用 Aquapel疏水处理试剂(主要成分为一种硅烷)，对流道进行10min处理后 用氮气或空气吹去多余试剂，此时流道表面形成疏水膜，实现疏水处理。

反应过程中，酶、农药、底物、显色剂需要充分混合以保证反应的有 效性。由于微流控芯片流道狭窄，本发明中流道的设计宽度仅为0.5～1.5mm， 因此液体在流道中通常处于层流状态，实现充分混合较为困难，需要通过 “微混合器”(第一微混合器、第二微混合器)实现。为避免采用电、磁、 声等外界能量输入，实现装置的简洁性与节能性，我们采用特殊的流道设 计以实现较短流道长度内试剂的充分混合。我们利用流体的惯性效应设计 了圆弧曲线结构(即在第一微混合器、第二微混合器的迂回设置的流道结 构中，增加圆弧曲线结构)，加工便捷且混合效果较好。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1)轻巧便携，潜力巨大

我们使用微流控芯片作为反应载体。装置轻巧便携，用微量试剂即可 完成检测分析；具有广阔的功能拓展前景，可耦合多项检测，例如重金属 含量分析；

2)自动分析，精度提升

我们采用机器视觉识别分析检测结果，在酶抑制显色反应的基础上用 摄像与分析代替裸眼观测比色，有效提升检测灵敏度与自动化程度，兼顾 检测快捷性与精准性；

3)操作简便，体验良好

我们为装置搭配了7英寸的彩色液晶触摸屏，使用者可直接通过操作 屏幕来控制检测的开始，同时从屏幕上实时看到反应的进行过程和反应的 结果，具有良好的人机交互体验

附图说明

图1为农残速测卡测试原理图；

图2为本发明的微流控农残检测系统的结构试图(图中编号1、3、4、 5、20、80为尺寸大小，单位为mm)；

图3为底板的俯视结构示意图；

图4为顶板的俯视结构示意图；

图5为微流控检测过程示意图；

图6为检测例中辛硫磷浓度及对应的RGB、显色值结果图；

图7为对农残速测卡、酶抑制率法、气相色谱法和本发明“E-BOX” 检测平台的各项指标进行初步对比图。

具体实施方式

下面参照附图对本发明做进一步说明：

如图2～3所示，一种微流控农残检测芯片，包括底板200以及透明盖 板100，所述底板上设有流道，按照物料流向，所述流道201中依次设有 进液池202、样液池203、酶液池204、第一微混合器205、抑制反应区206、 底物池207、第二微混合器208以及显色区209。

其中，进液池202设置在所述流道201的入口处，用于供驱动油进入 所述流道。样液池203用于滴加含有农药的检测样液。酶液池204用于滴 加含有胆碱酯酶的溶液。抑制反应区206用于保证农药与胆碱酯酶反应彻 底。底物池207用于滴加底物和显色剂。显色区209用于提供最终的显色。 第一微混合器205主要用于实现农药溶液与胆碱酯酶溶液的混合。第二微 混合器208主要用于保证底物与抑制酶反应液的充分混合。

第一微混合器205和第二微混合器208为S型迂回设置的流道结构， 保证较短的板宽，即可实现充分的混合。

如图4所示，透明盖板100上设有与所述进液池202对应的进液孔101。 所述透明盖板上同时设有排气孔102。

参考图2，流道宽度为1mm，深度为1mm。进液池、样液池、酶液 池均为直径为3～5mm的圆柱孔，本实施例中，进液池、样液池、酶液池 均为直径为4mm的圆柱孔，孔深1mm；底物池为直径为5mm，深度为 1mm的的圆柱孔。底板200总长度为80mm，宽度为20mm，体积小，携 带和操作方便。

本发明中，芯片由白色底板和透明盖板组成：底板设计有微型反应池 和微流道，用于分步实现农药检测；弯曲流道部分组成的微混合器用于实 现试剂充分混合。盖板上设计有进样口和排气口。底板和盖板用胶键合组 成检测芯片，保证流道内部密封。

一种微流控农残检测系统，包括：

实现农药对乙酰胆碱酶的抑制与显色反应的微流控芯片，微流控芯片 的结构参见上述内容和图2～4；

控制所述驱动油流速的微型蠕动泵；

检测显色结果的检测分析单元；

用于控制微流控芯片在恒温下反应的温控单元。

所述检测分析单元包括：采集图像的摄像机；对图像进行处理和计算 的计算机。温控单元可以采用加热板。

微流控芯片作为化学反应的载体，为系统的核心部件；加热板置于微 流控芯片下方，在显色区附近设置照明光源。摄像机镜头正对显色区。此 外有储存驱动油的储油罐及微型蠕动泵提供动力驱动，推进微流控芯片内 的试剂混合；微流控芯片、加热板、摄像机以及检测分析单元均设置一箱 体内。在箱体上方盖板上安装有7英寸的彩色液晶触摸屏实现检测控制与 结果显示。

本发明以微流控芯片为载体，实现农药对乙酰胆碱酶的抑制与显色反 应；通过控制微型蠕动泵的启停实现反应物的分步骤混合；在固定光源下 用微型摄像头拍摄显色结果并分析农药浓度；通过控制恒温反应保证酶活 性，同时控制反应条件可减小测量误差。

本实验中为便于进行芯片选型的修改与确定，因此采用光固化3D打 印法制作微流控芯片。为保证油的推进效果，避免出现水相分散问题，需 对芯片流道进行疏水处理。我们采用Aquapel疏水处理试剂(主要成分为 一种硅烷)，对流道进行10min处理后用氮气吹去多余试剂，此时流道表 面形成疏水膜。

如图5所示，检测时，先将定量的反应试剂加入对应反应池内，而后 用油推动酶与农药接触并在流道内充分混合，将酶与农药的混合液推进至 抑制反应区后暂停推动；待抑制反应充分进行(10min)后继续推进反应 液与底物及显色剂接触，并在流道内充分混合后进入显色区实现显色反应。 5min后启动程序检测显色结果。

显色完成后，进行图像的采集。我们采用机器视觉识别方法对显色反 应结果进行分析从而得到农药浓度信息。在稳光源下通过树莓派控制摄像 头采集显色区图像。得到图像后首先判断采集到的图像是否符合标准：主 要判断依据为显色区是否位于图像正中心，面积是否处于设定的标准内等； 如果不符合要求，则调整摄像头的焦距后重新拍摄，直到图像符合要求。

随后分析所得图像，首先将图片进行裁剪。通过边缘检测原理，找到 颜色突变的边缘，从而将只有反应后的混合试剂的图片部分裁剪出来。随 后对裁剪出来的图片进行处理，为保证检测的准确性，逐点计算图像的 RGB，将图像中所有点的红色，绿色，蓝色分量分别求平均值，得到图片 的RGB，随后按照相应公式计算显色值，从而量化判断农药残留量的多 少。

为最大幅度地缩短检测时间，需维持反应物处于较高的反应活性、提 高反应速度。在较低温度范围内，该化学反应会随温度升高而加速；但由 于乙酰胆碱酯酶的主要成分为蛋白质，温度过高会导致蛋白质变性，酶活 性减弱。乙酰胆碱酯酶在37℃时表现出最大活力，即37℃为反应最适温 度。所以，我们采用将检测区温度控制在该范围内可以有效提高检测效率。

其中反应时间和反应温度均通过核心单片机(也可以利用计算机代替) 进行控制。温度控制模块由核心单片机设定目标温度，控制电热模块加热， 温度传感器采集实时温度反馈到核心控制单片机，实时温度值和设定值的 误差控制调节输出的PWM，不同的PWM即可改变电热模块上的电压、 流有效值，改变电热模块的发热功率，从而达到控制温度恒定的目的。反 应时间则通过预先编写的程序进行控制。

避免裸眼观测的不稳定性和较大偏差，我们使用机器视觉识别原理进 行图像分析。本装置采用的显色反应为黄色，为提高黄色区分度，采用冷 色光源进行照明；通过分析黄色的RGB值，我们发现其中起主要决定因 素的元素是B元素，其次是G元素，最后是R元素，通过多次试验，我 们采用的方式为R比例为0.1，G元素为0.2，B元素为0.7，即：

显色值＝0.1×R+0.2×G+0.7×B

为实现装置的便携性，需控制装置体积较小、重量较轻，每个功能模 块都应当尽量轻量化、便携化。在化学反应部分，我们采用了微流控芯片 作为反应载体，芯片尺寸仅为8×1×0.25cm。在供电部分，我们采用移动 电源供电。我们以2200mah、12.6V的可充电锂电池作为电源，经过5V 的稳压后向各部分提供电力。在图像采集部分，我们选用兼具图像质量与 较小体积的微型300万像素摄像头，并使用8个小型LED照明以保证环 境光强恒定。在恒温控制方面，我们选用薄片型加热模块并将其固定在检 测平台内部，几乎不占用额外的体积。配套的感温模块也仅有4×2×2cm。 在程序控制方面，我们选用树莓派控制核心单片机，兼顾了较强的图像处 理能力和较小的体积。

检测例：

我们选取了现在市场上常见的有机磷类农药“辛硫磷”作为检测样本， 分别配制了浓度为0.5,0.2,0.1,0.05mg/L的标准浓度样液以及清水作为空白 对照组，经过反应与检测得到如下实验结果：

表1辛硫磷浓度及对应的RGB、显色值

将上述结果绘制图像如图6所示，可以发现具有较好的线性度与区分 度。近似得到显色值y与农药浓度x的关系式：y＝31.094x+107.33，且 R²值只有0.9868。因此我们基本可以认为在该范围内显色值和农药残留量 呈线性关系，并依据此公式，结合测量得到的显色值，反推出农药残留值。 同时可以观察到，“E-BOX”检测平台的检出限可达到0.05mg/L，与现有 农残速测卡0.5mg/L的检出限相比有大幅度提升。

我们调研了浙江省杭州市余杭区的农残检测中心2018年的农残检测 情况。根据统计结果，农残检测中心目前使用的检测方法主要是酶抑制率 法，辅以色谱法。酶抑制率法日均检测样本10500～12600个，色谱法年均 检测样本约2000个。

我们对农残速测卡、酶抑制率法、气相色谱法和“E-BOX”检测平台 的各项指标进行初步对比，结果如下图7所示。由图7可知，本发明的系 统进行检测时，样品量大大低于常规检测方法所需的样品量。另外，采用 被本发明的方法，检测灵敏度大大提交。且检测成本远远低于常规检测方 法。

Claims (10)

1.一种微流控农残检测芯片，包括底板以及透明盖板，所述底板上设有流道，其特征在于，按照物料流向，所述流道中设有第一微混合器、抑制反应区、第二微混合器以及显色区；

所述流道入口处设有供驱动油进入所述流道的进液池；

在所述进液池与第一微混合器之间的流道上，设有用于滴加含有农药的检测样液的样液池和用于滴加含有胆碱酯酶的溶液的酶液池；

在所述抑制反应区与第二微混合器之间的流道上，设有用于滴加底物和显色剂的底物池。

2.根据权利要求1所述的微流控农残检测芯片，其特征在于，所述第一微混合器和第二微混合器为迂回设置的流道结构。

3.根据权利要求1所述的微流控农残检测芯片，所述透明盖板上设有与所述进液池对应的进液孔。

4.根据权利要求1所述的微流控农残检测芯片，所述透明盖板上设有排气孔。

5.根据权利要求1所述的微流控农残检测芯片，其特征在于，所述进液池、样液池、酶液池为直径为3～5mm的圆柱孔；所述底物池为直径为4～6mm的圆柱孔；所述流道宽度为0.5～1.5mm。

6.一种微流控农残检测系统，其特征在于，包括：

实现农药对乙酰胆碱酶的抑制与显色反应的微流控芯片，其为权利要求1～5任一项所述的微流控芯片；

控制所述驱动油流速的驱动机构；

检测显色结果的检测分析单元；

用于控制微流控芯片在恒温下反应的温控单元。

7.根据权利要求6所述的微流控农残检测系统，其特征在于，所述驱动机构为微型蠕动泵。

8.根据权利要求6所述的微流控农残检测系统，其特征在于，所述检测分析单元包括：

采集图像的摄像机；

对图像进行处理和计算的计算机。

9.一种采用权利要求6所述的微流控农残检测系统对农药进行检测的方法，其特征在于，包括：

(1)将设定量的对应试剂或者样品分别加入到样液池、酶液池、底物池；

(2)驱动机构控制驱动油推动检测样液与胆碱酯酶的溶液混合，并将混合液推进至抑制反应区后暂停设定时间，然后继续讲反应液推进至底物池中与底物及显色剂接触，充分混合后进入显色区实现显色反应；

(3)检测分析单元采集显色区图像，根据图像的显色值，得出农药残留量。

10.根据权利要求9所述的对农药进行检测的方法，其特征在于，步骤(3)中：

采集得到显色区图像首先判断显色区是否位于图像正中心，面积是否处于设定的标准内，如为否，则调整摄像头后重新拍摄；

得到符合要求的图像后，提取感兴趣区域，计算感兴趣区域的显色值，利用显色值与农药残留量之间的关系，得出农药残留量。