CN110317866A - 精神分裂症小鼠模型海马circRNA测序分析及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及精神分裂症神经发育小鼠模型海马生物标记物、检测方法及试剂盒。本发明提供：①一种精神分裂症神经发育小鼠模型海马生物标记物，为circRNA2，上述标记物的检测方法及其标记物含量的试剂盒；②还提供一种精神分裂症神经发育小鼠模型海马干预的生物标记物，为circRNA2，上述标记物的检测方法及试剂盒；③提供circRNA2的circRNA‑信号通路‑靶基因网络图及海马中差异circRNA2的GO/KEGG富集分析结果。本发明的有益效果在于佐证了小鼠孕期神经损害、出生后应激刺激可致精神分裂样模型；并首次发现其海马circRNA具有表达水平差异性，该变化可被奥氮平干预所逆转。这对精神分裂症发病与表观遗传学的关系及寻找其新药具有重要意义。

Description

精神分裂症小鼠模型海马circRNA测序分析及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及精神分裂症神经发育小鼠模型海马生物标记物、检测方法及试剂盒技术领域，尤其是一种精神分裂症神经发育小鼠模型海马生物标记物及检测方法。
背景技术
精神分裂症(schizophrenia,SZ)是一种严重的精神疾病,具有复发率高、致残率高、慢性迁延的特点，给个人、家庭和社会带来严重影响。2008年，McGrath等以非常保守的诊断标准统计全世界精神分裂症流行病学资料，显示其终身患病率(lifetimeprevalence)、年平均发病率及终生病态率(lifetime morbid risk)分别为0.46％、0.015％和0.72％,且有逐年递增的趋势。倘若诊断标准放宽，这一发生率将增加1-2倍。患者的失业率惊人高达80-90％,预期寿命减少了10-20年，给全球各个国家造成了严重的经济和社会负担。而且，最棘手的问题是精神分裂症的发病机制不明确和早期诊断较困难。
最近，cirRNA与疾病关系的研究受到关注，circRNA是一类由特殊的选择性剪切产生的非编码RNA，是新近确认的一类特殊的非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)分子，具有闭合环状结构，大量存在于真核转录组中，是继微小RNA(microRNA，miRNA)后RNA家族的一颗极具发展潜力的正在升起的新星，也是RNA领域最新的研究热点。研究表明，有些circRNA分子富含miRNA结合位点，在细胞中起到miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平。环状RNAciRS-7在人脑组织中丰富表达，与脑特异性microRNA miR-7相互作用；而ciRS-7含有多个串联的miR-7结合位点，因此可以作为内源性的miRNA海绵，抑制miR-7活性。考虑到miR-7是各种不同癌症相关通路的重要调节因子，同时也因能直接调节a-突触核蛋白和泛素蛋白连接酶A(UBE2A)的表达而可能与帕金森和阿兹海默疾病的发生相关，所以ciRS-7有可能作为神经性系统疾病发生的重要调节因子。
精神分裂症是神经系统功能性疾病，对大脑组织circRNA表达水平及干预效果评估有利于进一步揭示circRNA在精神分裂症中的调控机制及治疗靶点。但是，受制于生命伦理学的限制，基于人类精神分裂症活体脑组织的采集难以开展，最近，进行精神分裂症神经发育小鼠模型受到研究者重视，目前已有建模标准、建模程序和检测指标，。因此，本发明意在探讨精神分裂症神经发育小鼠模型海马circRNA表达水平、检测方法及试剂盒。
发明内容
为了克服现有的技术存在的不足，本发明提供了一种精神分裂症神经发育小鼠模型海马生物标记物及检测方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种精神分裂症神经发育小鼠模型海马生物标记物，，所述标记物为circRNA2。
一种精神分裂症神经发育小鼠模型海马生物标记物的检测方法，包括以下步骤：
脑组织采集，对照组(NC)、精神分裂症模型组(SZ)、治疗组(Treated)三组小鼠均于100天断头处死并剥离全脑；
RNA抽提、建库提取样品总RNA，并使用试剂盒ribo-zero消化核糖体RNA后；加入打断试剂将RNA打断成短片段，以打断后的RNA为模板,用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA，在cDNA二链合成时以dUTP代替dTTP,然后连接不同接头，再利用UNG酶法将含有dUTP的一条链进行消化，只保留连接链不同接头的cDNA一链；使用试剂盒纯化cDNA一链；纯化的cDNA一链再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增；
构建好的文库用Agilent 2100 Bioanalyzer质检合格后，使用Illumina HiSeqTM2500或其他测序仪测序；Real-Time PCR(RT-PCR)验证，根据测序结果及标准RNA序列，设计circRNA探针及引物；依据差异倍数FC≥2、聚类分析结果中处于不同簇、每个样本均能检测出三个条件分别挑选小鼠海马10个差异circRNA进行RT-RCR检测，每个circRNA样本平行重复3次；比较NC组和SZ组的表达差异是否显著，选取有显著差异的circRNA再在SZ组和Treated组样本中进行RT-PCR检测。
一种精神分裂症神经发育小鼠模型海马生物标记物的试剂盒，其能够测定circRNA2表达水平。
一种精神分裂症神经发育小鼠模型转归的生物标记物，所述标记物为circRNA2。
一种精神分裂症神经发育小鼠模型转归的生物标记物的检测方法，包括以下步骤：
取适量抗精神病药(奥氮平)治疗后精神分裂症神经发育小鼠模型的海马组织，从中提取总RNA，并进行正太化校正后进行逆转录反应；反应完成后进行实时荧光定量PCR，得到circRNA2表达水平；
以选择经过测试在所有样本中可以稳定检测到的β-Actin作为RT-PCR实验内参，以ΔCt值(ΔCt＝Cttarget-Ctβ-actin)表示目标RNA的相对表达水平；使用FPKM法(Fragments Per kb Per Million Reads)统计目标RNA表达量；采用NB(负二项分布检验)检验目标RNA差异显著性；
通过建立circRNA2表达水平的常模，得到标准化值。
一种精神分裂症神经发育小鼠模型转归的生物标记物的测试剂盒，其能够测定海马组织中circRNA2的含量。
一种提供circRNA2靶基因网络图及海马中差异表达circRNA2的GO/KEGG富集分析结果。
本发明的有益效果是：
1、首次对精神分裂症神经发育小鼠模型的circRNA进行检测，以提高精神分裂症神经发育小鼠模型的准确性、标准化和成功率；
2、有望通过circRNA模拟物和拮抗物(修饰寡核苷酸)改变特定circRNA表达水平能够使异常的基因调控网络和信号通路恢复正常，进而治疗精神分裂症；
3、有望通过检测特定circRNA表达水平对用药进行疗效预测；
4、有望通过检测特定circRNA表达水平对精神分裂症患者转归及预后情况进行预测；
5、有望通过circRNA模拟物和拮抗物对特定精神分裂症某种特定症状进行精准化治疗。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1A表示模型组海马差异circRNA全转录组分析的聚类图；图1B表示用药组海马差异circRNA全转录组分析验证的聚类图(筛选条件:P<0.05且差异倍数>2)，红色代表相对高表达，绿色代表相对低表达。
图2A为各组小鼠海马中差异表达circRNA表达水平的PCR验证；图2B为用药组小鼠海马中差异表达circRNA的PCR验证。
图3为KEGG富集对应通路图。
具体实施方式
一种精神分裂症神经发育小鼠模型海马生物标记物，，所述标记物为circRNA2。
一种精神分裂症神经发育小鼠模型海马生物标记物的检测方法，包括以下步骤：
脑组织采集，对照组(NC)、精神分裂症模型组(SZ)、治疗组(Treated)三组小鼠均于100天断头处死并剥离全脑；
RNA抽提、建库提取样品总RNA，并使用试剂盒ribo-zero消化核糖体RNA后；加入打断试剂将RNA打断成短片段，以打断后的RNA为模板,用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA，在cDNA二链合成时以dUTP代替dTTP,然后连接不同接头，再利用UNG酶法将含有dUTP的一条链进行消化，只保留连接链不同接头的cDNA一链；使用试剂盒纯化cDNA一链；纯化的cDNA一链再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增；
构建好的文库用Agilent 2100 Bioanalyzer质检合格后，使用Illumina HiSeqTM2500或其他测序仪测序；Real-Time PCR(RT-PCR)验证，根据测序结果及标准RNA序列，设计circRNA探针及引物；依据差异倍数FC≥2、聚类分析结果中处于不同簇、每个样本均能检测出三个条件分别挑选小鼠海马10个差异circRNA进行RT-RCR检测，每个circRNA样本平行重复3次；比较NC组和SZ组的表达差异是否显著，选取有显著差异的circRNA再在SZ组和Treated组样本中进行RT-PCR检测。
一种精神分裂症神经发育小鼠模型海马生物标记物的试剂盒，其能够测定circRNA2表达水平。
一种精神分裂症神经发育小鼠模型转归的生物标记物，所述标记物为circRNA2。
一种精神分裂症神经发育小鼠模型转归的生物标记物的检测方法，包括以下步骤：
取适量抗精神病药(奥氮平)治疗后精神分裂症神经发育小鼠模型的海马组织，从中提取总RNA，并进行正太化校正后进行逆转录反应；反应完成后进行实时荧光定量PCR，得到circRNA2表达水平；
以选择经过测试在所有样本中可以稳定检测到的β-Actin作为RT-PCR实验内参，以ΔCt值(ΔCt＝Cttarget-Ctβ-actin)表示目标RNA的相对表达水平；使用FPKM法(Fragments Per kb Per Million Reads)统计目标RNA表达量；采用NB(负二项分布检验)检验目标RNA差异显著性；
通过建立circRNA2表达水平的常模，得到标准化值。
一种精神分裂症神经发育小鼠模型转归的生物标记物的测试剂盒，其能够测定海马组织中circRNA2的含量。
一种提供circRNA2靶基因网络图及海马中差异表达circRNA2的GO/KEGG富集分析结果。
1、研究对象
本研究使用C57BL/6小鼠，其常被认为是“标准”的近交系小鼠，具有高度的遗传背景稳定性，是继人类之后第一个完成基因组测序的哺乳动物。亲代7～8周龄C57BL/6小鼠，自江苏大学实验动物中心(实验动物生产许可证编号：SCXK(苏)2013-0011)购入，SPF级，雄性20只，雌性45只，按雌雄、同性别每4～5只分笼饲养，在新动物饲养房内继续饲养2周后开始子代鼠繁育。动物饲养房温度21±1℃，光照昼夜颠倒(关灯：08:00～20:00，开灯20:00～08:00)，除特殊说明外，所有动物均有充足食物和水供其自由取食。
子代鼠繁育：为使雌性小鼠发情期一致以便获得受孕期一致的孕鼠，依据Meyer等的报道，在交配前3天按每2～3只雌鼠与1只雄鼠铁丝网隔开合笼饲养，于第4天08:00去除铁丝网，每4～5h检查一次交配情况，查到阴道栓记为孕0天(GD0)。超过5天末受孕雌鼠即予排除。
本研究获得解放军第904医院动物实验伦理委员会批准。
2、研究方法
①母体孕期免疫刺激：免疫刺激组(P+)小鼠在雌鼠GD9时按6mg/kg剂量尾静脉注射(i.v.)Poly(I:C)，Poly(I:C)溶液均用无菌生理盐水配制，并稀释至1.2mg/ml，最终以5ml/kg的体积进行注射，非免疫刺激组(P-)则注射无菌生理盐水。所有注射溶液均现配现用。
②子代鼠青春期应激：经Poly(I:C)或生理盐水注射处理后的雌鼠所产子代鼠于出生后第21天(PND21)进行断奶和分笼(饲养笼规格：28cm×18cm×14cm)，为减少窝别效应的影响，同窝小鼠按性别平均分配到青春期应激组(S+)和无应激组(S-)中。子代鼠按性别及处理因素，同性别同处理因素按每3-4只/笼饲养。青春期应激组在PND31～40天进行慢性不可知应激干预，无应激组则正常饲养不予其他任何干预处理。参考Ducottet和Sandra的设计，青春期慢性不可知应激按如下方法依次给予：浸湿锯末垫料(Day1)、饲养笼倾斜45°(Day2)、足底电击(Day3)、食物剥夺(Day4)、无垫料(Day5)、束缚应激(Day6)、水剥夺(Day7)、夜间相照明(Day8)、强迫游泳(Day9)、社交应激(Day10)。
③药物干预本研究所用奥氮平(Olanzapine,OLZ)标准品由中国仪器药品检定研究院(ID：V4V2069GU，编号：100948-200801)提供。将接受双重应激的小鼠分为用药组(Treated)和模型组(SZ)，接受OLZ干预的用药组小鼠，均通过小鼠日常饮水给予，给药剂量1.5mg/(kg·d)，饮水瓶经过避光处理，避免药液因光照分解。给药当天测得小鼠体重和前4天的饮水消耗量，计算首次给药的饮水浓度。OLZ以少量冰醋酸溶解后，用蒸馏水稀释至1mg/ml，用NaHCO3调节PH至6.0±0.2，根据每笼小鼠体重和饮水消耗量计算饮水给药浓度，将配制好的药液稀释至目标浓度。用药组小鼠每笼每4天重新测量一次体重及饮水消耗量，校正饮水药物浓度，并更换饮水药液。模型组则正常饮水。
④前脉冲抑制(PPI)实验本研究通过声惊跳反射PPI测试系统(SR-LAB,San DiegoInstruments,San Diego,CA,USA)对PPI功能进行检查。整个测试过程由4种刺激类型组成：单个Pulse(120dBA、时长40ms的白噪音)、单个Prepulse(包含69、73、77、81及85dBA5种不同声压级的白噪音，即分别高于背景噪音4、8、12、16和20dBA，持续20ms)、Prepulse+Pulse(Prepulse与Pusle开始输出的时间间隔为100ms)和Background(仅背景噪音65dBA)。整个刺激序列包含最初的6个Pulse、中间的12个Block(Pulse×1，Prepulse×5、Prepulse+Pulse×5及Background×1，伪随机化排列处理)和结尾的6个Pulse。声音刺激序列相邻两个刺激的间隔为15±5s(即为10～20s)。评价指标：对应于每个不同强度Prepulse+Pulse，PPI功能以前脉冲抑制率(PPI％)表示，公式为：PPI％＝[(Pulse平均反应强度－Prepulse+Pulse平均反应强度)/Pulse平均反应强度]×100％。其中，开始和结尾各6个Pulse不纳入计算。
⑤脑组织采集对照组(NC)、精神分裂症模型组(SZ)、治疗组(Treated)三组小鼠均于100天断头处死并剥离全脑，将小鼠脑腹面朝上放入冰袋预冷的小鼠脑冠状切片模具(037-001,HuaYueYang Biotechnology,Beijing,China)，用双面刀片将小鼠全脑切成1mm厚的冠状切片，将粘附有脑冠装片的刀片平铺于冰袋上。对照小鼠脑解剖图谱，参照Bregma位置找到AP(-1.3～-3.3)(包含海马)，用直径1mm平口针头戳取脑冠状片目标区域脑组织，浸入装有10ul RNA组织保存液RNA guarder(ZH0103-A,HuaYueYang Biotechnology,Beijing,China)的1.5ml离心管中，后移入-80℃冰箱冻存备用。
⑥RNA抽提、建库提取样品总RNA，并使用试剂盒ribo-zero消化核糖体RNA后；加入打断试剂将RNA打断成短片段，以打断后的RNA为模板,用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA，在cDNA二链合成时以dUTP代替dTTP,然后连接不同接头，再利用UNG酶法将含有dUTP的一条链进行消化，只保留连接链不同接头的cDNA一链；使用试剂盒纯化cDNA一链；纯化的cDNA一链再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增；构建好的文库用Agilent 2100 Bioanalyzer质检合格后，使用Illumina HiSeqTM 2500或其他测序仪测序。
⑦Real-Time PCR(RT-PCR)验证根据测序结果及标准RNA序列，设计circRNA探针及引物。依据差异倍数FC≥2、聚类分析结果中处于不同簇、每个样本均能检测出三个条件分别挑选小鼠海马10个差异circRNA进行RT-RCR检测。每个circRNA样本平行重复3次。比较NC组和SZ组的表达差异是否显著，选取有显著差异的circRNA再在SZ组和Treated组样本中进行RT-PCR检测。
全部数据使用Graph Pad Prism7.0和StatView Version5.0软件进行统计分析。选择经过测试在所有样本中可以稳定检测到的β-Actin作为RT-PCR实验内参。以ΔCt值(ΔCt＝Cttarget-Ctβ-actin)表示目标RNA的相对表达水平。使用FPKM法(Fragments Per kbPer Million Reads)统计目标RNA表达量。采用NB(负二项分布检验)检验目标RNA差异显著性。使用独立样本T检验、单因素方差分析、非参数检验Kruscal-Wallis Test分析组间目标RNAΔCt值差异。差异转录组合集采用GO功能分析与KEGG通路分析。使用Pearson法进行差异RNA间相关性分析。所有统计分析均为双侧显著性检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
3、研究结果
①各组小鼠海马中差异表达circRNA的分析
与对照组相比，模型组存在106种差异表达的circRNA，其中55种上调，51种下调。见附图1 A。
用药组与模型组对比发现，circRNA有108个差异表达，其中51个上调，57个下调。见附图1 B。
②各组小鼠海马中差异circRNA的RT-PCR验证
模型组中circRNA2表达水平下调，均差异有统计学意义。，见附图2A。用药组中circRNA2表达水平上调，差异有统计学意义，见附图2B。
③模型组中circRNA的功能分析
海马中差异表达circRNA2的GO/KEGG富集分析，如表1所示：
表1海马中差异circRNAGO/KEGG富集分析
注：ID：编号；Fold Change：差异倍数；P value：P值；GO/KEGG description:GO/KEGG条目描述
④模型组circRNA的KEGG富集通路图
结果见图3，circRNA包含多个miRNA结合位点，可能形成ceRNA调控通路，因此可以使用miRNA靶基因预测的方法鉴定与miRNA结合的circRNA，根据miRNA靶基因的功能注释来阐明此部分circRNA的功能。对于动物，使用Miranda软件来预测。模型组和用药组中均呈明显差异表达的circRNA2与mmu-miR-1249-5p和mmu-miR-1956相关。
综上所述，我们认为circRNA能够作为反映精神分裂症神经发育小鼠模型生物标记物。
本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种精神分裂症神经发育小鼠模型海马生物标记物，其特征是，所述标记物为circRNA2。
2.一种根据权利要求1所述的一种精神分裂症神经发育小鼠模型海马生物标记物的检测方法，其特征是，包括以下步骤：
脑组织采集，对照组(NC)、精神分裂症模型组(SZ)、治疗组(Treated)三组小鼠均于100天断头处死并剥离全脑；
RNA抽提、建库提取样品总RNA，并使用试剂盒ribo-zero消化核糖体RNA后；加入打断试剂将RNA打断成短片段，以打断后的RNA为模板,用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA，在cDNA二链合成时以dUTP代替dTTP,然后连接不同接头，再利用UNG酶法将含有dUTP的一条链进行消化，只保留连接链不同接头的cDNA一链；使用试剂盒纯化cDNA一链；纯化的cDNA一链再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增；
构建好的文库用Agilent 2100 Bioanalyzer质检合格后，使用Illumina HiSeqTM2500或其他测序仪测序；Real-Time PCR(RT-PCR)验证，根据测序结果及标准RNA序列，设计circRNA探针及引物；依据差异倍数FC≥2、聚类分析结果中处于不同簇、每个样本均能检测出三个条件分别挑选小鼠海马10个差异circRNA进行RT-RCR检测，每个circRNA样本平行重复3次；比较NC组和SZ组的表达差异是否显著，选取有显著差异的circRNA再在SZ组和Treated组样本中进行RT-PCR检测。
3.一种根据权利要求1所述的一种精神分裂症神经发育小鼠模型海马生物标记物的试剂盒，其特征是，其能够测定circRNA2表达水平。
4.一种精神分裂症神经发育小鼠模型转归的生物标记物，其特征是，所述标记物为circRNA2。
5.一种根据权利要求4所述的一种精神分裂症神经发育小鼠模型转归的生物标记物的检测方法，其特征是，包括以下步骤：
取适量抗精神病药(奥氮平)治疗后精神分裂症神经发育小鼠模型的海马组织，从中提取总RNA，并进行正太化校正后进行逆转录反应；反应完成后进行实时荧光定量PCR，得到circRNA2表达水平；
以选择经过测试在所有样本中可以稳定检测到的β-Actin作为RT-PCR实验内参，以ΔCt值(ΔCt＝Cttarget-Ctβ-actin)表示目标RNA的相对表达水平；使用FPKM法(FragmentsPer kb Per Million Reads)统计目标RNA表达量；采用NB(负二项分布检验)检验目标RNA差异显著性；
通过建立circRNA2表达水平的常模，得到标准化值。
6.一种根据权利要求4所述的一种精神分裂症神经发育小鼠模型转归的生物标记物的测试剂盒，其特征是，其能够测定海马组织中circRNA2的含量。
7.一种提供circRNA2靶基因网络图及海马中差异表达circRNA2的GO/KEGG富集分析结果。
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