CN110317845A - 一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法 - Google Patents

一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法。该方法为：将桉木浆板经过打浆和润涨等预处理后，通过高浓纤维素酶和木聚糖酶的复合酶解，酶解温度30‑55℃、时间5‑10h、酶活总浓度200‑500u/mL,得到粗球形纳米纤维素。加稀酸,絮凝，离心，使还原性糖和可溶性蛋白质与球形纳米纤维素分离。将离心后的沉淀，加酸絮凝、超声、离心。最后将纳米纤维素和不可溶蛋白质再分散到蒸馏水中，超声、离心，上清即为纯净的球形纳米纤维素。本发明制得的球形纤维素纯度在99.99%以上，直径范围为15‑40nm，热稳定性较好。采用复合酶解和稀酸絮凝、洗涤的纯化方法，时间短，高效，工艺绿色环保。

Description

一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法
技术领域
本发明属于纤维素技术领域，具体涉及一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法。
背景技术
随着人类对绿色、环保和可持续发展的追求，生物质材料及衍生物的制备与应用得到了极大的关注。纤维素作为地球上最丰富的可再生资源，每年预估产量可达到7.5×1010吨，但大多数被浪费或用于低附加值产品。纳米纤维素作为最为重要的衍生物，有着高的拉伸强度、良好的生物相容性、高比表面积、生物可降解性和低热膨胀系数等优点，在药物靶向传递、3D印刷、生态友好粘合、酶固定、环境修复等方面有着更突出的优势。
酶解法是近些年来出现的最有前景纳米纤维素制备方法，可以在温和的条件下实现，并且生物催化酶本身也是一种可再生物质。同时，纳米材料的纯度在市场价格、应用前景等有着至关重要的地位，因此分离提纯是酶解球形纳米纤维素生产的关键环节之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法，包括如下步骤：
（1）打浆处理：取绝干30g桉木绝干浆板，浸泡4小时以上，疏解，撕成小块，平衡水分，加水配成300g浆，用PFI磨打浆；
（2）润涨处理：称取少量步骤（1）所得的桉木纤维浆，并加入溶胀剂,其中浆料绝干量与溶胀剂比例为1:50-1:100，对桉木纤维浆进行润胀预处理，然后采用3500-5000rpm转速离心5-10min，并弃去上清液，再加蒸馏水洗涤沉降的浆料，离心洗涤，洗涤过程重复2-3次，最后将沉降的纤维加入到烧杯中；
（3）复合酶解：将步骤（2）所得的纤维置于恒温振荡器，加入200-400mL总浓度为200u/mL-500u/mL的复合酶溶液，在恒定温度、恒定振荡速率下酶解一定时间；
（4）絮凝：将步骤（3）所得样品加入稀盐酸，调节pH，使溶液体系pH为 2-5,静置30-60min，然后在3500-5000rpm下离心5-10min。
（5）纯化：将步骤（4）离心后的沉淀，加pH 2-5的稀酸、超声、然后离心，此过程重复2-5次。最后将所得沉淀分散到蒸馏水中，超声、离心，上清即为纯净的球形纳米纤维素。
上述方法中，步骤(1)中，所述桉木纤维浆是以PFI磨浆制得，打浆度70-90°SR。
上述方法中，步骤(2)中，所用桉木纤维绝干量2.0-4.0g；所述溶胀剂为丙三醇，总用量200-400mL。
上述方法中，步骤(2)中，所述润胀预处理的具体步骤为：在反应温度30-40℃，速率150-180rpm条件下振荡3.5-4.5h，此条件下预处理所得到的桉木纤维浆料溶胀率增加70-90%。
上述方法中，步骤(3)中，所述的复合酶溶液是纤维素酶和木聚糖酶，总酶活浓度在200-500u/mL，其中纤维素酶酶活占总酶活70%-90%。
上述方法中，步骤(3)中，所述酶解的温度是30-55℃，振荡速率为125-155rpm，反应时间5-10h，此条件下得到粗球形纳米纤维素。
上述方法中，步骤(5)中，离心时间为5-10min,转速为3500-5000rpm.超声时间为5-10min.
上述方法中，步骤(5)中，所述的加稀酸、超声和离心的方法，是使还原性糖和可溶性蛋白质与球形纳米纤维素分离，并通过重复2-5次，不断去除球形纳米纤维素中的可溶性杂质。最后加蒸馏水、超声和离心，取上清即为纯净的纳米纤维素，是除去纳米纤维素中不可溶蛋白质。此条件下得到的纯净球形纤维素直径范围为15-40nm，纯度在99.99%以上，热稳定性较好。
本发明相对于现有技术，具有如下优点：
（1）采用复合酶解法，通过控制原料和酶解条件，制备的球形纳米纤维素样品粒径较小且集中，在15-40nm。
（2）相对于之前的抽滤、透析等方法，稀酸絮凝和洗涤的纯化方法周期短，效率高。
（3）所得纳米纤维素的纯度高。
附图说明
图1是本发明一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法工艺流程图。
图2是本发明一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法SEM图。
图3是本发明一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法粒径分布图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步具体说明，但本发明的实施方式不限于此。
本发明流程如图1所示。
实施例1
（1）取绝干量2.0g，打浆度70°SR的桉木纤维浆料放入烧杯，加入200mL丙三醇溶液。
（2）将烧杯置于恒温振荡器，在水温30℃，速率150rpm条件下振荡3.5h；取出润胀后样品，3500转离心5min，弃去上清液，加入蒸馏水洗涤沉降样品，重复2次。
（3）将上述所得样品置于1L烧杯中，加入400mL，总酶活200u/mL的复合酶溶液，该复合酶溶液由纤维素酶（黑曲霉）和木聚糖酶（绿色木霉菌G）组成，其中纤维素酶活占90%（纤维素酶（黑曲霉）和木聚糖酶（绿色木霉菌G）都购自宁夏夏盛实业集团），在水温48℃，125rpm振荡速率条件下反应5h。
（4）将上述所得样品加入稀盐酸，调节pH，使溶液体系pH为3,静置30min，然后在4000rpm下离心。
（5）将上述所得离心后的沉淀，加pH 2的稀酸、超声10min、然后4000rpm离心10min，此过程重复3次。最后将所得沉淀分散到200mL蒸馏水中，超声10min、4000rpm离心10min，上清即为纯净的球形纳米纤维素。将样品稀释后超声分散，通过SEM观察，由图2可以得到较为均匀分散的球形纳米纤维素，直径主要在直径范围为15-40nm，结合图3的马尔文粒径分析仪，发现只有一个峰，说明粒径均匀，并且主要集中在30nm。
实施例2
（1）取绝干量4g，打浆度90°SR的桉木纤维浆料放入烧杯，加入400mL丙三醇溶液。
（2）将烧杯置于恒温振荡器，在水温40℃，速率180rpm条件下振荡4.5h；取出润胀后样品，5000转离心10min，弃去上清液，加入蒸馏水洗涤沉降样品，重复3次。
（3）将所得样品置于1L烧杯中，加入450mL，总酶活浓度300u/mL的复合酶溶液，该复合酶溶液由纤维素酶（黑曲霉）和木聚糖酶（绿色木霉菌G）组成，其中纤维素酶活占80%（纤维素酶和木聚糖酶都购自宁夏夏盛实业集团），在水温52℃，155rpm振荡速率条件下反应6h。
（4）将上述所得样品加入稀盐酸，调节pH，使溶液体系pH为2,静置40min，然后在3500rpm下离心。
（5）将上述所得离心后的沉淀，加pH3的稀酸、超声5min、然后3500rpm离心5min，此过程重复2次。最后将所得沉淀分散到200mL蒸馏水中，超声5min、3500rpm离心5min，上清即为纯净的球形纳米纤维素。
实施例3
（1）取绝干量2.8g，打浆度82°SR的桉木纤维浆料放入烧杯，加入300mL的丙三醇溶液。
（2）将烧杯置于恒温振荡器，在水温37℃，速率170rpm条件下振荡4.5h；取出润胀后样品，4000转离心10min，弃去上清液，加入蒸馏水洗涤沉降样品，重复2次。
（3）将所得样品置于1L烧杯中，加入400mL，总酶活浓度350u/ml的复合酶溶液，该复合酶溶液由纤维素酶（黑曲霉）和木聚糖酶（绿色木霉菌G）组成，其中纤维素酶活占85%（纤维素酶和木聚糖酶都购自宁夏夏盛实业集团），在水温50℃，145rpm振荡速率条件下反应5.5h。
（4）将上述所得样品加入稀盐酸，调节pH，使溶液体系pH为4, 静置50min，然后在4500rpm下离心。
（5）将上述所得离心后的沉淀，加pH4的稀酸、超声8min、然后4500rpm离心8min，此过程重复3次。最后将所得沉淀分散到200mL蒸馏水中，超声8min、4500rpm离心8min，上清即为纯净的球形纳米纤维素。
实施例4
（1）取绝干量3g，打浆度75°SR的桉木纤维浆料放入烧杯，加入300mL的丙三醇溶液。
（2）将烧杯置于恒温振荡器，在水温35℃，速率155rpm条件下振荡3.5h；取出润胀后样品，4000转离心10min，弃去上清液，加入蒸馏水洗涤沉降样品，重复2次。
（3）将所得样品置于1L烧杯中，加入370ml，总酶活浓度400u/mL的复合酶溶液，该复合酶溶液由纤维素酶和木聚糖酶组成，其中纤维素酶活占70%（纤维素酶和木聚糖酶都购自宁夏夏盛实业集团），在水温48℃，155rpm振荡速率条件下反应4h。
（4）将上述所得样品加入稀盐酸，调节pH，使溶液体系pH为2, 静置60min，然后在5000rpm下离心。
（5）将上述所得离心后的沉淀，加pH2的稀酸、超声6min、然后5000rpm离心6min，此过程重复4次。最后将所得沉淀分散到200mL蒸馏水中，超声6min、5000rpm离心6min，上清即为纯净的球形纳米纤维素。

Claims (9)

1.一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）打浆处理：取绝干30g桉木绝干浆板，浸泡4小时以上，疏解，撕成小块，平衡水分，加水配成300g浆，用PFI磨打浆，得到桉木纤维浆；
（2）润涨处理：称取少量步骤（1）所得的桉木纤维浆，并加入溶胀剂,其中浆料绝干量与溶胀剂比例为1:50-1:100，对桉木纤维浆进行润胀预处理，然后采用3500-5000rpm转速离心5-10min，并弃去上清液，再加蒸馏水洗涤沉降的浆料，离心洗涤，洗涤过程重复2-3次，最后将沉降的纤维加入到烧杯中；
（3）复合酶解：将步骤（2）所得的纤维置于恒温振荡器，加入200-400mL总浓度为200u/mL-500u/mL的复合酶溶液，在恒定温度、恒定振荡速率下酶解；
（4）絮凝：将步骤（3）所得样品加入稀盐酸，调节pH，使溶液体系pH为 2-5,静置30-60min，然后在3500-5000rpm下离心5-10min；
（5）纯化：将步骤（4）离心后的沉淀，加pH 2-5的稀酸、超声、然后离心，此过程重复2-5次，最后将所得沉淀分散到蒸馏水中，超声、离心，上清即为纯净的球形纳米纤维素。
2.根据权利要求1所述分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述桉木纤维浆是以PFI磨制得，打浆度70-90°SR。
3.根据权利要求1所述分离提纯酶解球形纳米纤维素方法，其特征在于，步骤(2)中，所用桉木纤维绝干量2.0-4.0g；所述溶胀剂为丙三醇，总用量200-400mL。
4.根据权利要求1所述分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述润胀预处理的具体步骤为：在反应温度30-40℃，速率150-180rpm条件下振荡3.5-4.5h，此条件下预处理所得到的桉木纤维浆料溶胀率增加70-90%。
5.根据权利要求1所述分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述复合酶溶液是纤维素酶和木聚糖酶，总酶活浓度在200-500u/mL，其中纤维素酶酶活占总酶活70%-90%。
6.根据权利要求1所述分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述酶解的温度是30-55℃，振荡速率为125-155rpm，反应时间5-10h，此条件下得到粗球形纳米纤维素。
7.根据权利要求1所述分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法，其特征在于，步骤(5)中，离心时间为5-10min,转速为3500-5000rpm.超声时间为5-10min。
8.根据权利要求1所述分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的加稀酸、超声和离心的方法，是使还原性糖和可溶性蛋白质与球形纳米纤维素分离，并通过重复2-5次，不断去除这些可溶性杂质，最后加蒸馏水、超声和离心，是除去不可溶蛋白质，取上清即得纯净的纳米纤维素，此条件下得到的纯净球形纤维素直径范围为15-40nm，纯度在99.99%以上，热稳定性较好。
9.根据权利要求5所述分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法，其特征在于，所述纤维素酶为：黑曲霉；所述木聚糖酶为：绿色木霉菌G。
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