CN110312518A - 糖蛋白抗生物素构建体 - Google Patents

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M·哈桑
W·佩特桑
M·库珀
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Abstract

本发明提供了构建体，其包含：(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒和(iii)连接(i)和(ii)的第一接头。该构建体可以进一步包含位于第一接头和(ii)之间的第二接头。该纳米颗粒可以是分离纳米颗粒，例如磁性分离纳米颗粒。该糖肽抗生素可以选自：万古霉素、替考拉宁、奥利万星、替拉万星、氯雷莫霉菌素和巴尔希霉素。本发明还提供了生产和使用该构建体的相关方法，例如通过将细菌与构建体结合从样品中分离细菌的方法。

Description

糖蛋白抗生物素构建体
技术领域
本发明涉及具有微生物结合活性的构建体。在一些形式中，本发明涉及用于革兰氏阳性细菌的生物分离的构建体，以及细菌分析和/或疾病诊断的相关方法。本发明还涉及具有抗微生物活性的构建体，以及这样的构建体在微生物防治中的用途。
背景
诸如细菌的微生物引起包括植物和诸如人的动物的生物体的广泛疾病或病况。自上世纪中叶以来，抗生素已被有效地用于防治细菌性疾病。然而，细菌具有发展出对抗生素抗性的实质能力，并且由抗生素抗性细菌引起的疾病目前被认为是主要的全球危机。
菌血症和脓毒症(或败血病)是血液中存在微生物(通常是细菌)的相关病况。在菌血症中，微生物进入血液，例如，通过伤口、感染或外科手术。在脓毒症中，微生物进入血液并复制。脓毒症通常被认为是非常严重的病况，并且经常危及生命。脓毒症通常由革兰氏阳性球菌葡萄球菌属(Staphylococcus)的种引起，特别是金黄色葡萄球菌(S.aureus)。然而，包括链球菌属(Streptococcus)和肠球菌属(Enterococcus)的种在内的其他革兰氏阳性细菌可引起脓毒症，某些革兰氏阴性细菌(例如埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)的种)以及真菌例如念珠菌属(Candida)的种也可引起脓毒症。
对于呈现出脓毒症的患者，确定致病性病原体并开始施用正确抗生素所需的时间至关重要。目前检测血液中微生物(例如菌血症)的方法通常是基于培养的。然而，这些方法可能受到高假阳性率和相对长的诊断时间的影响。此外，在脓毒症和其他感染的情况下，医院面临由医院获得性感染和多重药物抗性细菌(例如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；MRSA)引起的实质性问题，这些患者需要更长时间的住院、更多的照管和使用昂贵的最后一线抗生素。
考虑到上述情况，非常需要适用于诊断菌血症和/或脓毒症的新的微生物检测方法。此外，增强抗生素抗微生物活性的策略将是非常有益的。
概述
在一个宽泛形式中，本发明涉及包含连接至纳米颗粒的任选衍生化的糖肽抗生素的构建体。
在该第一宽泛形式的第一方面，提供了构建体，其包含：
(i)任选衍生化的糖肽抗生素；
(ii)纳米颗粒；和
(iii)连接(i)和(ii)的第一接头。
这方面的构建体可以具有以下一般结构：
A-L1-N；
其中：
A是任选衍生化的糖肽抗生素；
L1是第一接头；和
N是纳米颗粒。
A、L1和N之间的连接可以是直接连接或间接连接。
在第一方面的优选的实施方案中，构建体包含：
(i)任选衍生化的糖肽抗生素；
(ii)纳米颗粒；
(iii)连接至(i)的第一接头；和
(iv)连接至(ii)的第二接头，
其中(iii)连接至(iv)，并且(i)连接至(ii)。
该实施方案的构建体可以具有以下一般结构：
A-L1-L2-N
其中：
A是任选衍生化的糖肽抗生素；
L1是第一接头；
L2是第二接头；和
N是纳米颗粒。
A和L1、L1和L2、L2和N之间的连接可以是直接或间接连接。在优选的实施方案中，A和L1之间的连接是直接连接。在优选的实施方案中，L1和L2之间的连接是直接连接。在优选的实施方案中，L2和N之间的连接是间接连接。
合适地，第一方面的构建体用于结合微生物或其组分，其中任选衍生化的糖肽抗生素结合微生物或其组分。
优选地，微生物是革兰氏阳性细菌。
在一些优选的实施方案中，纳米颗粒是分离纳米颗粒。优选地，分离纳米颗粒是磁性纳米颗粒。
在某些优选的实施方案中，任选取代的糖肽抗生素选自：万古霉素、替考拉宁、奥利万星、替拉万星、氯雷莫霉菌素(chloroeremomycin)和巴尔希霉素。在一个特别优选的实施方案中，糖肽抗生素是万古霉素。
在一些实施方案中，构建体的第一接头是至少部分亲水的。
在其中第一接头是至少部分亲水的优选的实施方案中，其包含聚乙二醇(PEG)部分。优选地，PEG部分至少包含PEG3。在一些特别优选的实施方案中，PEG部分是PEG3或PEG4。
在一些实施方案中，构建体的第一接头是疏水的。
在其中第一接头是疏水的一些实施方案中，第一接头包含大于4个碳的线性碳链。优选地，线性碳链是C4-C12。在一个特别优选的实施方案中，线性碳链是C8。在另一个特别优选的实施方案中，线性碳链是C11。
在优选的实施方案中，第一接头包含一个或多个含氮部分。优选地，一个或多个含氮部分包括胺衍生的部分和/或叠氮化物衍生的部分。
优选地，第一接头在接头的第一末端包含含氮部分。优选地，该部分是胺衍生的部分。优选地，该部分将接头连接至糖肽抗生素。含氮部分可以是在从前体的第一末端至第一接头的胺基与来自糖肽抗生素的C-末端羧基部分之间形成的酰胺键。
在优选的实施方案中，第一接头通过如上所述的第二接头连接至纳米颗粒。优选地，第二接头是有机分子。在这些实施方案中，优选地，第一接头在第一接头的第二末端包含含氮部分。在优选的实施方案中，该部分是叠氮化物衍生的部分。优选地，第一接头通过第一接头的叠氮化物衍生的部分连接至第二接头。优选地，第一接头和第二接头之间的连接包含三唑部分。合适地，三唑部分形成在从前体的第二末端至第一接头的叠氮基团与前体至第二接头的炔基之间。
在一些优选的实施方案中，第二接头包含PEG基团。优选地，PEG基团至少是PEG3。在一些特别优选的实施方案中，PEG基团是PEG3或PEG4。
优选地，构建体的纳米颗粒进行钝化。在实施方案中，纳米颗粒通过涂层进行钝化。优选地，涂层是蛋白质或聚合物涂层。
在一个实施方案中，分离纳米颗粒通过人血清白蛋白(HSA)进行钝化。在一个实施方案中，分离纳米颗粒通过用羧甲基-PDEC-葡聚糖(CMD)的涂层进行钝化。在一个实施方案中，分离纳米颗粒通过具有PDEC-葡聚糖的涂层进行钝化。在一个实施方案中，分离纳米颗粒通过具有PDEA-葡聚糖的涂层进行钝化。
优选地，在其中分离纳米颗粒通过涂层进行钝化的实施方案中，第一接头通过涂层连接至纳米颗粒。在其中构建体包含第二接头的优选的实施方案中，第二接头附着至涂层，并且第一接头附着至如所述的第二接头。
优选地，该方面的构建体包含多个糖肽抗生素分子。
优选地，该方面的构建体具有中等或高局部密度的糖肽抗生素分子。
在第二方面，提供了生产构建体的方法，该方法包括获得(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒和(iii)第一接头，并使用(iii)连接(i)和(ii)的步骤。
在第二方面的优选的实施方案中，该方法包括以下步骤：
(a)获得(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒、(iii)第一接头和(iv)第二接头；
(b)连接(i)至(iii)；
(c)连接(ii)至(iv)；和
(d)连接(iii)至(iv)。
优选地，根据该方面的方法生产的构建体是第一方面的构建体。
在第三方面，提供了将构建体与微生物或其组分结合的方法，该构建体包含(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒和(iii)连接(i)和(ii)的第一接头，该方法包括以下步骤：
(a)将构建体与微生物或其组分组合；和
(b)将构建体的糖肽抗生素与微生物或其组分选择性地结合，
从而将构建体与微生物或其组分结合。
优选地，构建体是第一或第二方面的构建体。
在第四方面，提供了使用构建体从样品中分离微生物或其组分的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将构建体与含有微生物或其组分的样品组合，该构建体包含(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒和(iii)连接(i)和(ii)的第一接头；
(b)将微生物或其组分与构建体的糖肽抗生素选择性地结合；和
(c)使用纳米颗粒从样品中选择性地获得与微生物或其组分结合的构建体，
从而使用构建体从样品中分离微生物或其组分。
优选地，步骤(a)的样品是从生物学受试者获得的样品。优选地，受试者是人或动物。在一些实施方案中，步骤(a)的样品选自尿液、血液或包括血小板、血浆和血清的血液产品。
在优选的实施方案中，步骤(a)的样品是血液样品。优选地，血液样品包含聚集的红细胞，或者是通过红细胞聚集获得的样品。优选地，血液样品是人血液。
优选地，步骤(a)的构建体是第一或第二方面的构建体。
在优选的实施方案中，步骤(a)的微生物是革兰氏阳性细菌。在一些优选的实施方案中，微生物是致病性微生物。
优选地，使用是磁性纳米颗粒的分离纳米颗粒的磁捕获进行步骤(c)。
在第五方面，提供了分析从样品中获得的微生物或其组分的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将构建体与含有微生物或其组分的样品组合，该构建体包含(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒和(iii)连接(i)和(ii)的第一接头；
(b)将微生物或其组分与构建体的糖肽抗生素选择性地结合；和
(c)使用纳米颗粒从样品中选择性地获得与微生物或其组分结合的构建体，从而从样品中获得微生物或其组分；和
(d)分析微生物或其组分。
在优选的实施方案中，步骤(a)-(c)如第四方面所述。
根据该方面的方法，微生物或组分的分析优选地包括微生物的鉴定。
可以通过任何合适的策略进行根据该方面的方法的分析。在一些优选的实施方案中，分析选自基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱分析、基于荧光的分析和核酸分析。在一个实施方案中，分析包括确定微生物的抗性谱。
在一些优选的实施方案中，在分析之前从构建体中去除微生物。
在第六方面，提供了针对目的微生物或其组分的存在来筛选样品的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将构建体与样品组合，该构建体包含(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒和(iii)连接(i)和(ii)的第一接头和，
(b)使用纳米颗粒从样品中选择性地获得构建体；和
(c)进行分析以确定目的微生物或其组分是否或曾经与构建体结合，
其中确定目的微生物或其组分与构建体结合或曾经结合表明样品含有目的微生物或其组分，并且确定目的微生物或其组分没有或不曾与构建体结合表明样品不含有目的微生物或其组分。
优选地，步骤(a)的构建体是第一或第二方面的构建体。
在一个优选的实施方案中，根据该方面的样品是血液产品，例如血浆或血小板。在另一个优选的实施方案中，根据该方面的样品是尿液样品。
在第七方面，提供了诊断生物学受试者中的疾病、病症或病况的方法，该方法包括根据第五方面的方法鉴定从受试者获得的生物样品中的微生物，以及基于微生物的身份来诊断受试者中的疾病或病况的步骤。
优选地，疾病或病况由革兰氏阳性细菌引起。在一个优选的实施方案中，疾病或病况是革兰氏阳性细菌感染。在特别优选的实施方案中，疾病或病况选自脓毒症或尿路感染。
在第八方面，提供了治疗疾病、病症或病况的方法，该方法包括根据第七方面的方法诊断疾病、病症或病况，并基于诊断来治疗疾病或病况的步骤。
在第九方面，提供了抑制、控制或杀死微生物的方法，该方法包括使第一方面的构建体与微生物接触，从而抑制、控制或杀死微生物的步骤。
优选地，使构建体与微生物接触的步骤包括选择性地将构建体的糖肽抗生素与微生物结合的步骤。
优选地，微生物是革兰氏阳性细菌。
在某些实施方案中，革兰氏阳性细菌是抗生素抗性细菌。在某些实施方案中，当构建体作为游离抗生素存在时，微生物对构建体的糖肽抗生素显示出至少部分抗性。
在第十方面，提供了用于治疗或预防受试者的疾病、病症或病况的组合物，该组合物包含第一方面的构建体。
在第十一方面，提供了治疗或预防受试者的疾病、病症或病况的方法，该方法包括给受试者施用有效量的第一方面的构建体或第十方面的组合物，从而治疗或预防受试者的疾病、病症或病况的步骤。
在第十二方面，本发明提供了第一方面的构建体在制备用于治疗或预防受试者的疾病、病症或病况的组合物中的用途。
优选地，根据第十至第十二方面的疾病、病症或病况是由革兰氏阳性细菌引起的疾病。在一些特别优选的实施方案中，疾病是细菌性脓毒症。在另一个特别优选的实施方案中，疾病是尿路感染。
在第十三方面，本发明涉及增加糖肽抗生素的活性或功效的方法，该方法包括通过第一接头将糖肽抗生素连接至纳米颗粒的步骤。在优选的实施方案中，糖肽抗生素、纳米颗粒和第一接头如第一方面所述。
优选地，方法包括通过多个接头将多个糖肽抗生素分子连接至纳米颗粒的步骤。在这些实施方案中，优选地，糖肽抗生素以中等或高局部密度连接至纳米颗粒。
在第二宽泛形式的第一方面，本发明涉及包含与第一接头结合的任选衍生化的糖肽抗生素的化合物。这种宽泛形式的化合物适合于连接至纳米颗粒，以形成第一宽泛形式的第一方面的构建体。
优选地，第二宽泛形式的糖肽抗生素选自万古霉素、替考拉宁、奥利万星、替拉万星、氯雷莫霉菌素和巴尔希霉素。优选地，糖肽抗生素是万古霉素。
在一些优选的实施方案中，第二宽泛形式的第一接头包含PEG基团，优选地至少包含PEG3。
在一些优选的实施方案中，第一接头包含线性碳链，其中线性碳链是C4-C12。优选地，线性碳链是C8。
在优选的实施方案中，第一接头包含胺衍生的部分。优选地，胺衍生的部分位于第一接头的第一末端。优选地，胺衍生的部分将接头连接至糖肽抗生素。连接可以是酰胺键。
在一个优选的实施方案中，第一接头包含叠氮化物或叠氮化物衍生的叠氮化物衍生的部分。优选地，叠氮化物或叠氮化物衍生的部分位于与糖肽抗生素相对的接头的第二末端。
在一些实施方案中，化合物包含第二接头。优选地，第二接头如第一方面所述。
在第二宽泛形式的第二方面，提供了二聚体化合物，其包含第二宽泛形式的第一方面的化合物，其中糖肽抗生素是万古霉素，通过第一接头连接至另外的万古霉素部分。
在优选的实施方案中，第二宽泛形式的该方面的二聚体化合物包含第二宽泛形式的第一方面的两种连接的化合物，其中各化合物的糖肽抗生素是万古霉素。在某些实施方案中，两个连接的化合物通过包含线性碳链和/或PEG部分的部分连接。
在一些实施方案中，第二宽泛形式的第一或第二方面的化合物相对于糖肽抗生素具有增加的活性或功效。
第二宽泛形式的另一方面提供了增加糖肽抗生素的活性或功效的方法，该方法包括将糖肽抗生素连接至第一接头的步骤。相关方面提供了增加万古霉素的活性或功效的方法，包括通过第一接头连接一种万古霉素和另一种万古霉素的步骤。
可以理解，不定冠词“a”和“an”在此不应理解为单数不定冠词或以其他方式排除不定冠词所涉及的单个主题以外的一种或多种。例如，“一种”抗生素包括一种抗生素、一种或多种抗生素或多种抗生素。
如本文所使用的，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise、comprises和comprising)”将被理解为包括所述整数或整数组但不排除任何其他整数或整数组。
附图简要说明
为了使本发明易于理解并付诸实践，现在将参考附图以举例的方式描述优选的实施方案。
图1给出了根据本发明的优选构建体的合成的示意图。
图2给出了促进向万古霉素添加第一接头的潜在位点。
图3给出了N3-PEG3-Van(标记的‘N3-万古霉素’)的NMR表征。1H NMR(600MHz，DMSO-d6)和13C NMR(125MHz，DMSO-d6)。1缩写br＝宽、d＝双峰、m＝多重峰、non＝九重峰、o＝模糊、quin＝五重峰、s＝单峰、t＝三重峰、v br＝非常宽、q＝四重峰。
图4给出了N3-PEG3-Van的LC和-MS。
图5给出了通过动态光散射测定的聚集的和分散的构建体(NP)的级分。
图6给出了A)Ac-Kaa结构。B)N3-NBD结构。C)Fam-Kaa结构。
图7给出了A)Fam-Kaa的定量标准曲线。B)洗脱的Ac-Kaa的LCMS的定量标准曲线。C)洗脱的Ac-Kaa的LC和-MS。
图8给出了A)通过N3-NBD染料的荧光信号测量的DBCO层形成的定量。B)基于Fam-Kaa结合的缀合的N3-PEG3-Van的定量、通过N3-NBD荧光检测的计算的反应的环辛炔或通过LCMS测量的结合然后洗脱Ac-Kaa的比较。
图9给出了使用本发明构建体进行细菌生物分离的方法的示意图。步骤1—血液采集和随后的RBC聚集。步骤2—使用本发明的革兰氏阳性特异性生物分离构建体的细菌磁性捕获，随后洗涤和去除干扰细胞。对于某些应用，该方法可另外包括：步骤3—细菌洗脱；步骤4—完全细菌裂解(以及任选地使用二氧化硅纳米颗粒来捕获DNA)和/或步骤5—DNA纯化、浓缩和洗脱。
图10给出了通过培养评估的金黄色葡萄球菌菌株(ATCC 25923)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)菌株(ATCC 12228)的血小板的细菌捕获效率。在没有任何预先处理的情况下从血小板捕获掺入的细菌细胞。捕获效率非常高，基本上所有细菌都渗入到捕获的样品中。计算的捕获效率超过100％是由于捕获步骤期间的细菌复制，其允许用本发明的生物分离构建体捕获新的子细菌细胞。数据代表平均值(n＝3)±SD。
图11给出了具有敏感性和抗性革兰氏阳性菌株的血液溶液中的捕获效率。评估的所有革兰氏阳性菌株的捕获效率都高。对于一些菌株计算的超过100％的捕获效率是由于捕获步骤期间的细菌复制，其允许用本发明的生物分离构建体捕获新的子细菌细胞。表皮葡萄球菌菌株的捕获效率略低于其他菌株，敏感性和抗性菌株的效率分别为93％和77％，具有高局部密度构建体。对于其他菌株，数据用于低局部密度构建体。所有数据代表平均值(n＝3)±SD。
图12给出了使用生物分离构建体捕获革兰氏阴性大肠杆菌。生物分离构建体的特异性高，只有～3-4％捕获大肠杆菌。所有数据代表平均值(n＝3)±SD。
图13给出了A)通过血细胞计数器和细菌培养物测量的全血诱导的RBC聚集分析。方形：RBC聚集对渗入的全血样品中细菌计数的影响(n＝3)。圆圈：使用血细胞计数器测量的全血样中总RBC和WBC计数随时间的减少(n＝4)。数据显示为平均值±SD，一些误差条太小而无法在图中显示。B)细菌的生物分离和随后的细菌裂解、DNA捕获和DNA纯化后获得的DNA纯度。从掺入103(cfu/mL)金黄色葡萄球菌的人血样中获得的DNA的纳米滴测量。
图14给出了A)使用本发明的构建体，如实施例2中所述，通过Qiagen试剂盒(Square)提取的1μL的109cfu/mL肺炎链球菌提取的DNA的qPCR CT值和生物分离以及随后的DNA提取，其被称为‘Bac-ID’(圆圈)。B)使用Qiagen DNeasy Blood and Tissue商业试剂盒(通过纳米滴)和Bac-ID方法(通过qPCR)比较全血中的人DNA含量(n＝4)。C)血液中Qiagen DNeasy Blood and Tissue试剂盒提取效率的比较以及PBS缓冲液中的检测限(DNeasy Blood and Tissue试剂盒和Bac-ID样品的最终洗脱体积分别为200和20μL)(n＝3)。仅通过Qiagen试剂盒评估109cfu/mL的金黄色葡萄球菌的样品以评估用血液样品对试剂盒的抑制。高浓度样品(109cfu/mL的金黄色葡萄球菌)未通过Bac-ID方法评估，因为该方法是开发以确保低细菌计数的高灵敏度。数据显示为平均值±SD；一些误差条太小而无法在图中看到。
图15给出了A)对Bac-ID提取的细菌DNA(左Y轴)和人类DNA含量(右Y轴)在107、105、103(cfu/mL)细菌和无细菌(n＝3)的qPCR分析)。B)使用Bac-ID对从渗入的血液中提取的细菌DNA的敏感性和抗性革兰氏阳性qPCR检测(n＝3)。C)金黄色葡萄球菌qPCR检测限CT值与通过从渗入的血液提取的培养物的细菌细胞数(n＝6-8)。D)金黄色葡萄球菌的6个重复样品的qPCR CT值≤5cfu/mL(n＝8)。数据显示为平均值±SD；一些误差条太小而无法在图中看到。
图16给出了来自1和10mL血液的Bac-ID提取的细菌DNA的qPCR分析。将102cfu金黄色葡萄球菌渗入并从1mL(圆形)和10mL(三角形)中提取，平行于从10mL样品(正方形)中提取102(cfu/mL)(n＝4)。图中的星形表示平均值(n＝4)。显示的误差条表示平均值±SD。
图17给出了使用Bac-ID从1和10mL血液样品提取的增加的孵育时间的人DNA含量比较。
图18细菌膜损伤假说，显示脂质II末端D-丙氨酰-D-丙氨酸残基与一个分子的结合比：A)未缀合的万古霉素，B)低密度Van-NP和C)高密度Van-NP。该图示例显示了与不同局部密度的Van-NP相比，1分子未缀合的万古霉素的结合潜力差异的原因。
图19给出了本发明的低、中等和高局部密度构建体中缀合的万古霉素的估计值，基于与偶联的N3-PEG3-Van结合的Fam-Kaa的荧光，与未反应的DBCO结合的N3-NBD的荧光或结合缀合的N3-PEG3-Van然后洗脱并通过LCMS测量的Ac-Kaa的浓度。
图20给出了游离万古霉素、N3-PEG3-Van(标记的‘N3-万古霉素’)和如实施例1中所述的构建体(标记的‘Van-NP’)针对万古霉素敏感性和抗性菌株的MIC值的比较(n＝3)。考虑到万古霉素密度和纳米颗粒的数量，构建体的MIC值基于计算的缀合的万古霉素含量。
图21给出了以四种不同的Van-NP加载密度，实现针对敏感性和抗性金黄色葡萄球菌的抑制所需的NP浓度之间的关系。
图22给出了对于具有不同万古霉素加载密度的构建体，针对敏感性和抗性金黄色葡萄球菌的MIC值之间的关系。
图23给出了游离万古霉素、N3-PEG3-Van(标记的‘N3-万古霉素’)、如实施例1中所述的具有低、中等和高密度万古霉素的构建体(标记的‘Van-NP’)与细菌配体的结合亲和力，通过在添加的合成Ac-Kaa存在下阻止抑制活性来测量(n＝3)。
图24给出了在具有不同加载密度的万古霉素和构建体(标记的‘Van-NP’)存在下碘化丙啶对细菌的膜渗透性(n＝3)。
图25给出了孵育30分钟(A)和90分钟(B)后，不同局部密度的Van-NP、万古霉素和N3-万古霉素的DiSC3(5)膜透化荧光值。在MIC浓度使用Van-NP和万古霉素。在相同条件下孵育HSA-NP、0.1％Triton-X和无菌水的对照。(C)DiSC3(5)染料的归一化荧光值，在具有不同局部密度的万古霉素、N3-万古霉素和Van-NP存在下(以1X MIC)评估膜渗透性。数据(n＝2)显示为平均值±SD，一些误差条太小而无法在图中显示。
图26给出了用高密度Van-NP(0.05μg/mL，低于MIC)(箭头)处理后破裂的细菌膜的透射电子显微镜成像(JEOL 1011)(比例尺为1μm)。
图27给出了在具有不同密度的万古霉素和Van-NP存在下(1X MIC)的总细胞ATP渗漏浓度。所有数据(n＝2)均显示为平均值±SD，一些误差条太小而无法在图中显示。
图28给出了根据本发明实施方案的包含糖肽抗生素和第一接头的某些优选化合物的结构。A)N3-C8-Van，B)N3-PEG3-Van。
图29给出了使用两组本发明的磁性纳米颗粒和单独的荧光纳米颗粒进行革兰氏阳性荧光检测的示意图。
图30给出了来自血液样品的不同浓度的金黄色葡萄球菌菌株的荧光检测(n＝3)。
图31给出了本发明的万古霉素-接头-万古霉素二聚体化合物。
图32给出了本发明的万古霉素-接头-万古霉素二聚体化合物的合成的示意图。
图33给出了多种革兰氏阳性细菌菌株对于N3-PEG3-Van二聚体(21a；标记为‘Vanco-PEG-3-Tz-6C二聚体’)和N3-C8-Van二聚体(21b；标记为‘Vanco-8C-Tz-6C’二聚体)的MIC值的比较，以及与游离万古霉素相比较。
图34给出了PCT/AU2015/050564中描述的缀合方法的示意图。
图35给出了PDEA葡聚糖聚合物与磁性纳米颗粒和纳米金反应形成聚合物多层的示意图。
图36给出了使用Fam-Kaa结合在纳米颗粒上的万古霉素表面浓度的估计，其中已经进行了使用PDEA葡聚糖聚合物的缀合。(A)线性刻度。(B)对数刻度。
图37给出了使用A)使用PDEA葡聚糖聚合物的功能化和B)使用HSA的功能化的万古霉素纳米颗粒的金黄色葡萄球菌(ATCC25923)的捕获。使用这两种方法功能化的MNP成功地选择性富集金黄色葡萄球菌。
图38给出了Fam-Kaa荧光，作为具有分别包含PEG3、C3或C8的第一接头的构建体的万古霉素表面浓度的量度。
图39给出了使用具有分别包含PEG3(A)、C8(B)或C3(C)的第一接头的构建体的革兰氏阳性细菌捕获。
图40给出了万古霉素和万古霉素加合物N3-PEG3-Van、N3-C3-Van和N3-C8-Van对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、屎肠球菌和粪肠球菌的最小抑制浓度(MIC)。
图41给出了使用PDEA葡聚糖聚合物方法缀合至磁性纳米颗粒的N3-PEG3-Van的示意图。
图42给出了通过Ellman反应对磁性纳米颗粒表面上的巯基估算。使用盐酸胱胺成功地将MNP巯基化，随后添加PDEA聚合物以在纳米颗粒表面上构建单层聚合物。
图43给出了使用纳米金的吸光度谱在多层聚合物形成期间金并入的定性估计。用于多层生成的纳米金在520nm处具有最大吸收。上清液的OD降低表明纳米金被并入在聚合物层上，因此间接地确保在磁性纳米颗粒的表面上形成多层聚合物，用于有效阻断和随后的缀合。
详述
本发明涉及包含糖肽抗生素和纳米颗粒的构建体的设计和生产。此类构建体包括用于生物分离的构建体和具有抗微生物活性的构建体。本发明还涉及化合物或“加合物”，其包含与第一接头和/或第二接头结合的任选衍生化的糖肽抗生素，其适于连接至纳米颗粒以形成此类构建体。
本发明至少部分地基于以下认识：这种构建体可为生物样品中微生物的分离和/或检测提供重要优势。此外，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：与相应的抗生素本身相比，包含糖肽抗生素和纳米颗粒的此类构建体可以具有显著增加的活性或功效。
本发明还至少部分地基于设计参数的发现，其出乎意料地具有使用如本文所述的构建体结合革兰氏阳性细菌的益处。特别地，出乎意料地发现，使用某些接头将糖肽抗生素连接至纳米颗粒上对于这种构建体针对革兰氏阳性细菌的结合效率具有特别的优势。结合效率的这些优点可以导致使用本发明的构建体从样品中分离革兰氏阳性细菌和/或本发明的构建体针对革兰氏阳性细菌的抗微生物活性的优点。
构建体
本发明的构建体将包含连接至纳米颗粒的任选衍生化的糖肽抗生素。如本文所使用的，除非上下文另有要求，否则术语“连接(connect、connection、connected)”等将被理解为涵盖直接连接(例如，直接结合)或间接连接(例如，经由一个或多个其他分子或部分的连接)。
本发明的一个方面涉及构建体，其包含：(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒和(iii)连接(i)和(ii)的第一接头。
如本文所用，“衍生化的”糖肽抗生素广泛地涵盖糖肽抗生素，其包含一种或多种修饰或改变，例如现有官能团的转化和临时保护基团的引入等。该术语也被认为包括所有盐形式。优选地，衍生化的糖肽抗生素是生物活性衍生物，其保留相应的非衍生化或未修饰的糖肽抗生素的一种或多种生物活性的至少一部分。糖肽抗生素的生物活性可以包括革兰氏阳性细菌结合和/或抗微生物活性，但不限于此。
在一些优选的实施方案中，衍生化的糖肽抗生素保留至少：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的一种或多种生物活性。对于可能产生生物活性衍生物的糖肽抗生素的修饰的实例，本领域技术人员参考Malabarba et al.(1997)MedicinalResearch Reviews，17(1)69-137，在此引入作为参考。
该方面的构建体可以具有以下一般结构：
A-L1-N
其中：
A是任选衍生化的糖肽抗生素；
L1是第一接头；和
N是纳米颗粒。
可以理解，A和L1以及L1和N之间的相应连接可以是直接或间接连接，如上所述。在优选的实施方案中，A和L1之间的连接是直接连接。在优选的实施方案中，L1和N之间的连接是间接连接。
在该方面的一个优选的实施方案中，构建体包含：
(i)任选衍生化的糖肽抗生素；
(ii)纳米颗粒；
(iii)连接至(i)的第一接头；和
(iv)连接至(ii)的第二接头，
其中(iii)连接至(iv)，(i)连接至(ii)。
该实施方案的构建体可以具有以下一般结构：
A-L1-L2-N
其中：
A是任选衍生化的糖肽抗生素；
L1是第一接头；
L2是第二接头；和
N是纳米颗粒。
可以理解，A和L1、L1和L2、以及L2和N之间的相应连接可以是直接或间接连接，如上所述。在优选的实施方案中，A和L1之间的连接是直接连接。在优选的实施方案中，L1和L2之间的连接是直接连接。在优选的实施方案中，L2和N之间的连接是间接连接。
在其中构建体的纳米颗粒用涂层进行钝化的本发明的实施方案中，第一方面的构建体可描绘如下：
A-V-L1-W-L2-X-P-Z-N
其中：
A是任选衍生化的糖肽抗生素；
V是连接L1至A的第一接头(L1)的官能团；
W是连接L1至L1的第二接头(L2)的官能团；
X是连接L2至P的L2的官能团；
P是钝化涂层；
Z是连接P至N的官能团；和
N是纳米颗粒。
优选地：
V包含酰胺键；
W包含三唑；
X包含酰胺或二硫键；
P包含人血清白蛋白(HSA)或聚合物涂层；和
Z包含酰胺和/或二硫键。
备选地，在某些实施方案中，本发明的构建体可描绘如下：
A-V-R1-W-R2-X-N
其中：
A是任选衍生化的糖肽抗生素；
V-R1-W是分别在第一和第二末端包含官能团V和W的第一接头，和内部部分R1；
R2-X是包含部分R2和官能团X的第二接头；和
N是纳米颗粒。
优选地：
V包含连接第一接头至A的酰胺键；
R1包含PEGN部分(如下所述)和/或线性碳链；
W包含连接第一接头和第二接头的R2的三唑；
R2包含PEGN部分和/或线性碳链；
X包含连接第二接头至纳米颗粒的酰胺和/或二硫键。
本发明特别优选的构建体的结构可描述如下：
A-V-PEG3-W-DBCO-Y-PEG4-X-P-Z-N
其中：
A、V、W、X和N与前面的实施方式相同；
V-PEG3-W是第一接头，其分别在第一和第二末端包含V(酰胺键)和W(三唑)和内部PEG3部分；
DBCO-Y-PEG4-X是第二接头，其分别在第一和第二末端包含二苯并环辛基(DBCO)衍生物(在本文中称为DBCO)和官能团X(酰胺键)，内部PEG4部分以及位于DBCO和PEG4之间的部分Y；和
P-Z-N是钝化的纳米颗粒(N)，其中P是钝化涂层，并且Z是连接P至N的官能团。
优选地：
酰胺键X直接连接第二接头至钝化的纳米颗粒的钝化涂层；
Y包含连接DBCO和PEG4的酰胺键；
P是人血清白蛋白(HSA)；和
Z包含直接连接N至P的酰胺键。
如上所述的形式A-V-PEG3-W-DBCO-Y-PEG4-X-P-Z-N的构建体的示例性实施方案提供于图1D中。
在落入该方面范围内的另一备选的构建体中，第一接头可以直接连接至钝化的纳米颗粒和糖肽抗生素。在该备选的构建体的优选实施方案中，第一接头通过二硫化物基团与钝化的纳米颗粒结合。在一些实施方案中，第一接头通过硫醚键与钝化的纳米颗粒结合。在一些这样的实施方案中，可以通过聚合物涂层的硫醇基团与从前体的第二末端至第一接头的马来酰亚胺部分的反应形成硫醚键。可以理解，该备选的构建体的优选实施方案不一定包含第二接头。
一些这样的备选的构建体可以具有以下的一般结构：
A-V-L1-U-P-Z-N
其中：
A是任选衍生化的糖肽抗生素；
V是连接第一接头(L1)至A的L1的官能团；
P是聚合物涂层；
N是纳米颗粒；
U包含连接L1至P的二硫化物和/或硫醚键；
Z包含连接N至P的酰胺和/或二硫键；
落入该构建体范围内的某些实施方案包括：
A-CONH-L1-U-P-SS-CH2CH2-NHCO-N；
A-CONH-L1-U-P-SS-PEG3-NHCO-N；和
A-CONH-L1-U-P-SS-N。
可以理解，连接该方面的构建体的各个组分(例如，如上所述的L1、L2、A和N)的官能团(例如如上所述的V、W和X)在本文中可描述为是或属于构建体的特定组分的官能团。可以理解，该名称对于可用于形成构建体的前体组分没有限制，例如在本文所述的优选实施方案中。也就是说，将官能团描述为属于给定组分并不意味着官能团与该组分的前体的任何特定关系。
生物分离
本发明的一些优选构建体被优化用于从样品中分离微生物，例如革兰氏阳性细菌，并且在本文中可称为“生物分离构建体”。在一些优选的实施方案中，生物分离构建体被优化用于从人血液样品中分离革兰氏阳性细菌病原体，血液样品将被理解为包括血液制品，例如血小板和血浆样品。在一些优选的实施方案中，生物分离构建体被优化用于从尿液样品中分离革兰氏阳性细菌病原体。
然而，可以理解，本发明的这种生物分离构建体可以用于从任何合适的样品中分离致病性和非致病性革兰氏阳性细菌。这些样品可以包括实验室样品，例如人工培养物和环境样品例如土壤和水样品。此类样品还可包括任何合适的生物样品，包括来自植物和动物的样品。
特别是对于动物样品，除人类样品外，样品可以来自另一种灵长类动物(例如猿和猴)、犬、猫、有蹄类动物(例如马、牛和猪)、或禽类，但不限于此。动物可以是牲畜(例如马、牛和羊)、伴侣动物(例如狗和猫)、实验动物(例如小鼠、大鼠和豚鼠)或表演动物(例如赛马、灰狗和骆驼)，但不限于此。动物样品可以是哺乳动物或非哺乳动物物种。
还可以理解，除血液和尿液样品外，动物样品可以是任何合适的样品。例如，样品可以是动物组织样品，包括肌肉、上皮细胞、结缔组织或神经组织样品。
另外，尽管如本文所述的生物分离构建体主要用于分离革兰氏阳性细菌，但可以理解，与糖肽抗生素结合的其他微生物的分离也在本发明的范围内。作为非限制性实例，可以理解，已经显示某些糖肽抗生素抑制真菌生长，尽管抑制机制(特别是，这是否涉及与真菌组分结合)目前至少在许多情况下尚不清楚。
如下文所述，该方面的优选构建体结合脂质II和/或肽聚糖，其中任选衍生化的糖肽抗生素与脂质II和/或肽聚糖结合。虽然结合脂质II和/或肽聚糖的该方面的这种构建体通常适用于如上所述的革兰氏阳性微生物的生物分离，但是很容易理解这种构建体通常也适合于脂质II和/或肽聚糖本身的生物分离，无论来源如何，条件是构建体的任选衍生化的糖肽抗生素可以接近并结合脂质II和/或肽聚糖。可以理解，脂质II和/或肽聚糖可以在通过任何合适的方法获得或生产(例如从微生物中提取，或通过合成生产)后进行生物分离。
抗微生物活性
与单独构建体的糖肽相比，本发明的一些优选构建体针对增加或增强的抗微生物活性或功效进行了优化。此类构建体在本文中可称为“抗微生物构建体”。优选的这种抗微生物构建体被优化用于抑制、控制或杀死革兰氏阳性细菌。然而，可以理解，针对受糖肽抗生素影响的任何其他微生物(例如某些真菌)的增加或增强的活性也在本发明的范围内。
可以理解，本发明的一些构建体可以是生物分离构建体和抗微生物构建体两者。
糖肽类抗生素
如本文所用，“糖肽抗生素”应理解为是具有至少一些能力的糖基化肽，以(i)结合和/或(ii)抑制微生物的生长、增殖或生存力。如本文所用，抑制微生物的生长、增殖和/或生存力的能力通常可称为“抗微生物”活性。
通常，糖肽抗生素包含环肽或多环肽。糖肽抗生素通常具有与微生物，非核糖体来源一致的性质。然而，应该理解所有合适的化合物，无论其来源如何，例如，本文所用的术语糖肽抗生素涵盖分离的天然化合物和合成产生的或重组的化合物两者。出于本发明的目的，“分离的”是指已从其天然状态取出或以其他方式经受人为操作的材料。分离的材料可以实质上或基本上不含在其天然状态下通常伴随它的组分，或者可以被操纵以便与通常在其天然状态下伴随它的组分一起处于人工状态。
本发明构建体的糖肽抗生素优选地具有结合革兰氏阳性细菌的能力。本领域技术人员可以理解，糖肽抗生素通常与细菌细胞壁中的肽聚糖和肽聚糖的脂质II前体结合。通常，糖肽抗生素选择性地结合革兰氏阳性细菌，对革兰氏阴性细菌的结合活性有限或缺乏。
构建体的糖肽抗生素可以是任何合适的糖肽抗生素。在实施方案中，糖肽抗生素选自：万古霉素、替考拉宁、奥利万星、替拉万星、达巴万星、氯雷莫霉菌素和巴尔希霉素。在一个特别优选的实施方案中，糖肽抗生素是万古霉素。
可以理解，通常，糖肽抗生素对革兰氏阳性细菌细胞壁的肽聚糖的结合以基本上非物种或菌株特异性的方式发生。也就是说，糖肽抗生素通常对革兰氏阳性细菌作为一组具有广泛的结合活性。还可以理解，无论细菌是否对抗生素敏感或具有抗性，糖肽抗生素通常都与革兰氏阳性细菌结合。
如下文所述，在某些实施方案中，设计本发明的构建体(有时称为生物分离构建体)以从样品中获得革兰氏阳性细菌，其中糖肽抗生素将革兰氏阳性细菌与构建体结合。可以理解，在这样的实施方案中，糖肽抗生素的结合可以抑制或不抑制结合的革兰氏阳性细菌的生长、增殖或生存力。
如下文所述，使用本发明的生物分离构建体获得的微生物可以用于任何合适的下游应用。可以理解，对于一些下游应用(例如核苷酸测序)，使用生物分离构建体获得的微生物的生存力对于下游应用可能是有限的或没有意义。对于其他下游应用，活的或非活的微生物可能是优选的。因此，对于这些实施方案，可以选择经优化以维持或破坏目的微生物的生存力的合适抗生素。
还可以理解，根据本发明某些实施方案的构建体(有时称为抗微生物构建体)被设计成抑制或杀死构建体的糖肽抗生素所结合的微生物，通常是革兰氏阳性细菌。因此，对于这些实施方案，可以选择经优化以对目的微生物具有至少部分抗微生物活性的合适抗生素。
纳米颗粒
本发明的构建体的纳米颗粒可以采用一系列合适的形式。
在其中构建体是生物分离构建体的实施方案中，纳米颗粒将被设计为促进构建体与样品的分离。这种纳米颗粒可称为“分离纳米颗粒”。如本文所用，术语“分离纳米颗粒”应理解为是指具有合适性质以允许从样品中选择性地去除的任何纳米级颗粒。分离纳米颗粒的合适性质将至少部分地取决于从中选择性去除的样品的性质。合适地，分离颗粒将具有与样品的其他组分不同的结构和/或化学性质。
优选地，分离纳米颗粒是磁性纳米颗粒。磁性纳米颗粒可以采用任何合适的形式，并且将被理解为包括含有磁性组分的纳米颗粒，例如“磁性粒”。这种磁性纳米颗粒可以由多种合适的材料形成。用于磁性纳米颗粒的一些优选材料包括铁、镍和钴，但不限于此。“超顺磁性”纳米颗粒对于本发明是特别优选的。这种纳米颗粒包含载体液体中的小的热搅拌磁体(称为“铁磁流体”)。本领域技术人员参考Neuberger et al.(2005)Journal ofMagnetism and Magnetic Materials293(1)483-496(在此引入作为参考)关于超顺磁性纳米颗粒的综述。
通常，本发明的磁性纳米颗粒的直径范围为约1nm至约500nm。在一些优选的实施方案中，构建体的磁性纳米颗粒的直径为约50nm至约300nm，包括约：75nm、100nm、125nm；150nm、175nm、200nm、225nm、250nm和275nm。
在其中构建体是抗微生物构建体的本发明的实施方案中，纳米颗粒可以是分离纳米颗粒，例如如上所述的磁性纳米颗粒。
在其中构建体是抗微生物构建体的优选实施方案中，纳米颗粒是适于治疗递送的纳米颗粒。在这些实施方案中，纳米颗粒可以是可生物降解的纳米颗粒，例如由一种或多种蛋白质形成的可生物降解的纳米颗粒、多糖和合成的可生物降解的聚合物。对于用于治疗递送的纳米颗粒的概述，本领域技术人员参考Nanoscale Materials in Targeted DrugDelivery,Theragnosis and Tissue Regeneration(Springer 2016，Sudesh Kumar YadavEd.)和其中的‘Biodegradable Nanoparticles and Their In Vivo Fate’(其中在此引入作为参考)。
本发明的构建体的纳米颗粒的表面将适当地包含一个或多个允许纳米颗粒附着至构建体的另一组分的官能团。在一个特别优选的实施方案中，官能团是羧基。
在一些实施方案中，官能团可以促进分离纳米颗粒直接附着至第一接头。在其他实施方案中，官能团可以促进分离纳米颗粒附着至第二接头。
在特别优选的实施方案中，分离纳米颗粒是钝化的。在这些实施方案中，优选地，分离纳米颗粒表面的官能团促进纳米颗粒的钝化(参见例如图1)。可以理解，在本发明的优选实施方案中，其中分离纳米颗粒的表面被钝化，钝化可以减少与纳米颗粒表面的非特异性结合。特别地，本发明构建体的分离纳米颗粒表面的钝化可以减少非革兰氏阳性细菌组分的非特异性结合。还可以理解，钝化涂层可包括多个层。
钝化通常是通过涂覆分离纳米颗粒的表面。适当地，通过与分离纳米颗粒表面上的官能团反应，将涂层附着至分离纳米颗粒的表面。合适地，涂层上的官能团促进分离纳米颗粒附着至第一或第二接头。合适的官能团可以包括羧酸酯基团、胺基团、硫醇基团和马来酰亚胺基团。
在一些实施方案中，涂层是蛋白质涂层。在一个特别优选的实施方案中，蛋白质涂层是人血清白蛋白(HSA)。在该实施方案中，优选地，HSA通过酰胺部分附着至纳米颗粒(参见，例如，图1)。
在一些实施方案中，涂层是聚合物涂层。在实施方案中，聚合物涂层是或包含羧甲基-PDEC-葡聚糖(CMD)。在实施方案中，聚合物涂层是或包含PDEC-葡聚糖。在实施方案中，聚合物涂层是或包含2-(吡啶基二硫代)乙胺(PDEA)-葡聚糖。在实施方案中，聚合物涂层可以包含纳米金属组分，其可以起到结合多个聚合物层的作用。聚合物涂层可以通过酰胺和/或二硫化物部分附着至纳米颗粒。
在实施例7中描述了一种特别优选的实施方案，其中聚合物涂层含有多层PDEA-葡聚糖，其与纳米金颗粒形式的纳米金属组分结合。
第一接头
本发明构建体的第一接头促进糖肽抗生素和纳米颗粒之间的连接。
出乎意料地发现，对于本发明，包含某些第一接头的构建体有利于结合革兰氏阳性细菌。不希望受理论束缚，基于实验观察，认为至少部分亲水的分子对于使用本发明的构建体的捕获可能特别有效。特别是，部分亲水的或亲水的接头，例如，包含PEG的那些可以为糖肽抗生素提供延长的系链，在水性环境中发生有限的卷曲或缺乏卷曲。
在其中第一接头至少部分亲水的特别优选的实施方案中，接头包含聚乙二醇(PEG)基团。如本领域技术人员将容易理解的，当如在本发明的构建体中那样内部地位于较大分子内时，PEG分子可以以Ra-(O-CH2-CH2)n-的形式表达，其中‘n’是PEG单体的数量和Ra是连接PEG的碳链。如本文所用，PEG分子可以以‘PEGN’的形式表达，其中‘N’是PEG单体的数目。
特别优选Ra包含C2-C4，或更优选地C2线性碳链。这种含PEG的部分可以采取以下形式-(CH2)m(O-CH2-CH2)n-，其中'm'是2至4个碳原子，例如-CH2CH2-(O-CH2-CH2)3-。可以理解，线性碳链(例如C2链)与其相邻的PEG部分的特定侧面或末端的确定可取决于组合的PEG-线性碳链分子的末端，被认为是PEG-线性碳链分子的“起点”或“第一末端”。
优选地，PEG基团至少是PEG3。优选地，PEG基团在PEG3至PEG10的范围内，包括PEG4、PEG5、PEG6、PEG7、PEG 8和PEG9。在一些特别优选的实施方案中，PEG基团是PEG3或PEG4。
可以理解，部分亲水的第一接头可以包含其他组分。在一些实施方案中，部分亲水的第一接头可以包含疏水组分。在一些实施方案中，疏水组分可以是线性碳链。线性碳链可以是C2-C15链，包括C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13和C14，但不限于此。
根据本发明的构建体，某些疏水性接头也可以是合适的或期望的。已经认识到，在使用疏水性接头的情况下，包含至少特定线性链长的分子对于使用本发明的构建体捕获可能更有效。
在某些实施方案中，接头是疏水分子，其包含至少4个碳的线性碳链。优选地，线性碳链是C4-C20，包括C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18和C19，或优选地C6-C10。
在一些实施方案中，线性碳链可以是C6-C16、C6-C14、C8-C14、C8-12、C8-10或C10-12。在一个特别优选的实施方案中，线性碳链是C8。在另一个特别优选的实施方案中，线性碳链是C11。可以理解，线性碳链可以是烷烃、烯烃或炔烃，但不限于此。
不希望受理论束缚，认为延长的线性链长度如C8和C11在纳米颗粒和万古霉素结构之间提供更大的距离。假设这可以降低附着的部分破坏万古霉素活性的机会，和/或万古霉素将影响纳米颗粒的性质。
根据本发明优选的是第一接头直接连接或直接结合至糖肽抗生素(参见例如图1)。
在本发明构建体的一些实施方案中，第一接头可以通过与选自以下的部分反应而连接至糖肽抗生素：C-末端羧基部分、伯或仲N末端部分、羟基部分、酚部分和胺部分。优选地，第一接头通过酰胺基团连接至糖肽抗生素。
在优选的实施方案中，第一接头包含一个或多个含氮部分。含氮部分可以是任何合适的部分。含氮部分可以含有一个或多个氮。在一些优选的实施方案中，含氮部分含有1至6个氮，或优选地1至3个氮。含氮部分可以是线性或环状部分，包括杂环部分。
在特别优选的实施方案中，一个或多个含氮部分包括胺衍生的部分和/或叠氮化物衍生的部分。由胺衍生的部分和叠氮化物衍生的部分意指，无论构建体中相关连接键或部分的实际功能如何，它至少部分地由胺或叠氮化物与互补反应性官能团的一起衍生而得。例如，构建体中的酰胺键可以称为胺衍生的部分，因为它可以由胺与羧基的反应形成。该术语涵盖其中胺或其他相关基团在反应形成最终构建体之前存在于接头、糖肽抗生素或纳米颗粒的前体上的情况。
优选地，第一接头在接头的第一末端包含含氮部分。优选地，部分是胺衍生的部分。优选地，部分连接接头至糖肽抗生素。优选地，连接是直接连接。
可以理解，胺衍生的部分在与形成构建体的一部分的另一组分结合时衍生自胺。还可以理解，胺衍生部分的特定特性通常取决于与胺衍生的部分结合的构建体的组分。
在其中胺衍生的部分通过糖肽抗生素的C-末端羧基部分与糖肽抗生素结合的优选实施方案中，胺衍生的部分将为酰胺(参见例如图1)。
在其中胺衍生的部分通过伯胺或仲胺基团与糖肽抗生素结合的一些实施方案中，胺衍生的部分将为脲。
在其中胺衍生的部分通过羟基或酚基与糖肽抗生素结合的一些实施方案中，胺衍生的部分将为氨基甲酸酯。
优选地，第一接头在接头的第二末端包含含氮部分。在优选的实施方案中，所述部分是叠氮化物衍生的部分。在这些实施方案中，优选地，叠氮化物衍生的部分连接至构建体的第二接头，如下文所述。优选地，连接是直接连接。
可以理解，叠氮化物衍生的部分在与构建体的另一组分结合后衍生自叠氮化物。还可以理解，叠氮化物衍生的部分的特定鉴定通常取决于与叠氮化物衍生的部分结合的构建体的组分。
在一些优选的实施方案中，叠氮化物衍生的部分是三唑部分。优选地，三唑部分直接连接至构建体的第二接头(参见例如图1)。参考图1，本领域技术人员将容易理解，第一接头的三唑分子可以通过第一接头前体的叠氮基团(图1B)和第二接头前体的二苯并环辛基部分的炔基团的反应形成(图1C)。
还可以容易地理解，可以备选地形成三唑部分，例如在第一接头的第二末端的炔基和第二接头的前体的叠氮基之间。优选地，由第一和第二接头的前体形成三唑可通过快速或“点击”反应化学实现(参见例如实施例)。对于点击化学的概述，包括在三唑形成的背景下，本领域技术人员参考Kolb et al(2003)Drug Discovery Today,8(24)1128-1137，其通过引用并入本文。
在备选的实施方案中，第一接头可在第一末端和/或第二末端包含硫化物和/或马来酰亚胺部分。在一些这样的实施方案中，第一接头通过硫化物和/或马来酰亚胺连接至第二接头。在一些这样的实施方案中，第一接头通过硫化物和/或马来酰亚胺连接至纳米颗粒。
第二接头
在构建体的特别优选的实施方案中，第一接头通过第二接头连接至纳米颗粒，如上所述。优选地，第二接头是有机分子。
在一些优选的实施方案中，如上所述，第二接头可以由包含炔部分的前体形成。在一个特别优选的此类实施方案中，炔部分是应变的环炔。优选地，环炔是环辛炔。优选地，环辛炔是二苯并环辛炔(DBCO)(参见例如图1)。如上所述，将容易理解的是，第一接头前体的叠氮基团可以与第二接头前体的炔基(例如二苯并环辛炔的炔基)反应以形成第一接头的三唑部分，在这种情况下将连接第一接头和第二接头(参见例如图1D)。
在一些优选的实施方案中，第二接头包含PEG部分。优选地，PEG部分至少是PEG3。优选地，PEG基团在PEG3至PEG10的范围内，包括PEG4、PEG 5、PEG6、PEG7、PEG 8和PEG9。在一些特别优选的实施方案中，PEG基团是PEG3或PEG4。
在其中第二接头包含炔衍生的部分(例如DBCO)和PEG部分(例如PEG4)的特别优选的实施方案中，炔烃衍生的部分通过含酰胺的线性有机分子连接至PEG部分(参见例如，图1C和1D)。优选地，第一酰胺键连接线性有机分子的第一末端至炔烃衍生的部分。优选地，第二酰胺键连接线性有机分子的第二末端至PEG部分。
优选地，第二接头的PEG部分与构建体的纳米颗粒的涂层结合。在优选的实施方案中，PEG部分通过酰胺键与纳米颗粒的HSA涂层结合(参见例如图1)。
糖肽抗生素局部密度
不受其限制，可以理解，该方面的构建体通常包括与单个纳米颗粒结合的多个糖肽抗生素分子。在其中第一接头连接糖肽抗生素连接至与纳米颗粒(或优选地其涂层)附着的第二接头的实施方案中，通常构建体将包含附着至纳米颗粒的多个第二接头，并且多个糖肽抗生素通过相应的第一和第二接头附着至纳米颗粒。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体具有与纳米颗粒结合的最小密度的糖肽，或最小的“局部密度”。在本文中，“局部密度”定义为纳米颗粒每单位表面积的功能活性糖肽抗生素分子的数量(分子/μm2)。
在某些实施方案中，本发明的构建体可以具有约10至约100000个分子/μm2的局部密度，包括约：20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000和90000。
在一些实施方案中，本发明的构建体具有100或更低，至约4000个分子/μm2的局部密度。该范围内的局部密度定义为“低”局部密度。
在一些实施方案中，本发明的构建体具有大于4000至小于9000个分子/μm2的局部密度。该范围内的局部密度称为“中等”局部密度。
在一些实施方案中，本发明的构建体具有大于9000至约20000个分子/μm2的局部密度，或甚至更大。该范围内的局部密度称为“高”局部密度。
在一些特别优选的实施方案中，本发明的构建体具有中等局部密度。在一些特别优选的实施方案中，本发明的构建体具有高局部密度。
如实施例3中所述，参考图20-25，具有中等或高局部密度的构建体在结合和/或抑制革兰氏阳性细菌方面可具有特别期望的特征。
生物分离方法
本发明的另一方面涉及使用本发明的构建体从样品中获得微生物的生物分离方法。该方法将包括以下步骤：
(a)将构建体与含有微生物或其组分的样品组合，该构建体包含(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒和(iii)连接(i)和(ii)的第一接头；
(b)通过糖肽抗生素选择性地将构建体与微生物或其组分结合；和
(c)通过纳米颗粒从样品中选择性地获得与微生物或其组分结合的构建体，从而从样品中获得微生物或其组分。
构建体优选地是如上所述的生物分离构建体。
如上所述，本发明的某些特别优选的实施方案涉及从人血液样品的生物分离。然而，可以理解，该方面的方法不限于此，并且可以与任何合适的样品一起使用，包括实验室或环境样品(例如污染的水样品)，以及包括植物和动物的生物样品，如上所述。
优选地，步骤(a)的样品是从生物体获得的样品。优选地，受试者是如上所述的人或动物。在一个优选的实施方案中，样品是尿液。在另一个优选的实施方案中，样品是血液或血液制品，包括血小板、血浆和血清。优选地，血液或血液产品是人血液。
可以理解，可以在步骤(a)中将额外的试剂如缓冲液添加到样品中以促进选择性细菌捕获。
在其中步骤(a)的样品是血液样品的一些优选实施方案中，血液样品包含聚集的红细胞(RBC)和/或白细胞(WBC)。在这些实施方案中，该方法将优选地进一步包括在将构建体与样品组合之前聚集血液样品中的血细胞的步骤(ai)。
已经确定，通常需要血液样品中血细胞的聚集，以使用本发明的构建体实现革兰氏阳性细菌的最佳生物分离。在优选的实施方案中，聚集红细胞和/或白细胞的步骤(ai)包括化学聚集。优选地，化学聚集包括添加葡聚糖聚合物。在一些优选的实施方案中，化学聚集包括添加葡萄糖。
在某些实施方案中，步骤(ai)中的化学聚集包括添加补充有0.1％D-葡萄糖的约10:1至约1:10的葡聚糖聚合物溶液。优选地，溶液是约1:1的溶液。在一些实施方案中，溶液可以包含其他组分，例如血小板添加剂溶液(SSP+)。
在一些优选的实施方案中，化学聚集包括在室温(～22℃)孵育。优选地，孵育持续至少：5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟或60分钟。在一些实施方案中，孵育持续至少2小时、3小时、4个小时或5个小时。
在一些优选的实施方案中，化学聚集使血液样品中溶液中存在的总RBC(即非聚集的RBC)减少至少70％、80％、90％、95％或99％。在一些优选的实施方案中，化学聚集使血液样品中溶液中的总WBC(即非聚集的WBC)减少至少70％、80％、90％、95％或99％。在一些特别优选的实施方案中，化学聚集使血液样品中溶液中的RBC和WBC减少至少90％、95％或98％。
如实施例中所述，已显示化学聚集在使用本发明的构建体进行生物分离之前对血细胞的聚集非常有效。还可以理解，尽管也可以使用物理聚集步骤(例如离心)，但是这些步骤不是优选的，因为它们通常需要手工劳动并且可能难以自动化。此外，离心步骤可导致细菌细胞的高水平聚集。
如上所述，本发明的优选实施方案涉及革兰氏阳性细菌的生物分离。优选地，根据该方面的方法的步骤(b)选择性结合的微生物是革兰氏阳性细菌。革兰氏阳性细菌可以是致病性细菌或非致病性细菌。
可以理解，在该方面的方法的步骤(b)的上下文中，“选择性结合”或“选择性结合的”等是指与其他样品组分和/或微生物相比，微生物以至少部分特异性而结合。还可以理解，如上所述，糖肽抗生素通常与革兰氏阳性细菌作为组选择性地结合(例如，与革兰氏阴性细菌，或非革兰氏染色细菌或哺乳动物细胞相比)。因此，除非上下文另有要求，否则在与革兰氏阳性细菌结合的情况下，“选择性结合”等将指与革兰氏阳性细菌作为组结合，具有至少部分特异性(而不是与特定革兰氏阳性细菌物种或菌株结合)。
在优选的实施方案中，根据步骤(b)结合的微生物是致病性革兰氏阳性细菌。优选地，致病性革兰氏阳性病原菌选自：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、李斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和链球菌属(Streptococcus)。优选地，革兰氏阳性细菌是球菌，例如葡萄球菌属(Staphylococcus)、或链球菌属(Streptococcus)。
在一些优选的实施方案中，葡萄球菌是金黄色葡萄球菌(S.aureus)。金黄色葡萄球菌可以是但不限于糖肽敏感性菌株(例如ATCC 25923)、MRSA菌株(如ATCC 43300)、糖肽中间体(GISA)菌株(如ATCC 700698)或万古霉素抗性(VRSA)菌株(如NARSA VRS4)。
在一些实施方案中，葡萄球菌是表皮葡萄球菌(S.epidermis)。表皮葡萄球菌可以是但不限于糖肽敏感性菌株(例如ATCC 12228)或糖肽中间体(GISE)菌株(如NARSANRS60)。
在一些优选的实施方案中，其中链球菌是肺炎链球菌(S.pneumoniae)。肺炎链球菌可以是但不限于糖肽敏感性菌株(例如ATCC 33400)或糖肽抗性菌株(如ATCC 700677)。
在一些实施方案中，肠球菌是屎肠球菌(E.faecium)。屎肠球菌可以是但不限于万古霉素A(Van A)抗性菌株(例如ATCC 51559)或万古霉素B(Van B)抗性菌株(例如ATCC51299)。
优选地，使用磁场来执行该方面的方法的步骤(c)，以磁性捕获在与微生物结合的构建体中的磁性分离纳米颗粒。用于从样品中捕获磁性纳米颗粒的技术已在本领域中广泛描述。本领域技术人员参考‘Ex-Vivo Application of MNPs’in MagneticNanoparticles:From Fabrication to Clinical Applications(CRC Press，2012，NguyenTK Thanh Ed.)，其通过引用并入本文。通常，对于磁性捕获，将对磁性纳米颗粒有吸引力的外部磁场施加到含有磁性纳米颗粒的样品上。因此外部磁场吸引磁性纳米颗粒，针对磁场稳定化纳米颗粒。然后可以通常通过物理方法例如倾倒(tipping)、抽吸或洗涤(例如用合适的缓冲液)去除样品的其他组分。
可以理解，根据该方面的步骤(c)分离分离纳米颗粒有助于从样品(例如人血液或血浆样品)中分离微生物(例如致病性革兰氏阳性细菌)。一旦根据该方面的方法分离，微生物可以潜在地用于任何合适的下游应用。合适的应用包括但不限于如下所述的分析和/或实验室培养以繁殖微生物，其中这是期望的。
分析微生物的方法
在另一方面，本发明提供了分析样品中微生物或其组分的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将构建体与含有微生物或其组分的样品组合，该构建体包含(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒和(iii)连接(i)和(ii)的第一接头；
(b)通过糖肽抗生素选择性地将构建体与微生物或其组分结合；
(c)通过纳米颗粒从样品中选择性地获得与微生物或其组分结合的构建体，从而从样品中获得微生物或其组分；和
(d)分析微生物或其组分。
合适地，根据该方面的方法的步骤(a)至(c)是如上文关于根据本发明的生物分离方法所述。如上所述，微生物优选地是革兰氏阳性细菌，优选地致病性革兰氏阳性细菌，但不限于此。样品优选地是人血液或血浆样品，但不限于此。
可以理解，根据该方面的方法进行的分析可以是任何期望的分析。作为非限制性实例，分析可以是生化分析(例如确定微生物的组成)、视觉分析(例如微生物的电子显微镜检查)或遗传分析(例如微生物的核酸序列或基因表达分析)。
根据该方面的方法，特别优选分析包括微生物的鉴定。
通常，尽管不限于此，该方面的方法包括在分析之前从生物分离构建体中去除微生物或其组分的其他步骤。
在一些优选的实施方案中，根据该方面从构建体中分离微生物或其组分涉及降低pH和/或热处理构建体。在一些优选的实施方案中，通过加入弱酸来进行降低pH，弱酸例如醋酸、草酸、磷酸、亚硝酸、氢氟酸和甲酸，但不限于此。优选地，酸是乙酸。在优选的实施方案中，pH降低约1至约3个pH单位，包括约2个。在一个特别优选的实施方案中，pH降低约7至约4或约5。
在一些优选的实施方案中，热处理的温度是约50℃至约80℃，包括约：55℃、60℃、65℃、70℃和75℃。优选地，热处理是约65℃。
在一些优选的实施方案中，热处理的持续时间是约5分钟至约30分钟，包括约10分钟、15分钟、20分钟和25分钟。优选地，热处理是约20分钟。
另外或备选地，如本领域所熟知的，从构建体中分离微生物或其组分可涉及超声处理。
在一些实施方案中，该方面的方法可以包括在分析之前裂解微生物以释放内部组分的其他步骤。如下所述，核酸分析通常需要在分析之前裂解微生物。
可以理解，在通过核酸分析来分析微生物的实施方案中，方法可以包括DNA捕获和/或DNA纯化的其他步骤，如下文所述。在通过核酸分析来分析微生物的特别优选的形式中，方法可以包括完全细菌裂解(例如，使用在65℃加热20分钟)、细菌蛋白质变性(例如使用盐酸胍)和使用磁性纳米颗粒和/或磁性DNA纯化的DNA捕获的其他步骤。
在一个特别优选的实施方案中，根据该方面的方法的分析通过质谱法进行。用于根据该方面分析微生物的质谱法的优选形式是使用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱技术。通常，MALDI技术将是MALDI-飞行时间(TOF)技术，但不限于此。如本领域技术人员所理解的，在MALDI分析期间，样品沉积在表面上，并入共沉积基质的晶体中，并且通过与脉冲激光束的相互作用将离子直接解吸到气相中。然后使用合适的质谱仪分析离子。对于MALDI和MALDI-TOF的概述，本领域技术人员参考Karas et al.(2003)Chemical Reviews.103(2)427-440，其通过引用并入本文。
MALDI质谱法通常用于蛋白质鉴定和表征。“蛋白质”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然或非天然氨基酸，D-或L-氨基酸，如本领域所熟知的。在一些实施方案中，通过MALDI或MALDI-TOF质谱法对微生物的蛋白质表征用于鉴定微生物。已经开发了使用MALDI鉴定诸如革兰氏阳性细菌的微生物的多种方法。可以理解，方法可涉及完整的微生物细胞或微生物细胞提取物。对于这些方法的综述，本领域技术人员涉及Singhal et al.(2015)Frontiers in Microbiology.6 791，其通过引用并入本文。MALDI质谱法也可以用于鉴定根据该方面分析的微生物的抗性谱。
在另一个特别优选的实施方案中，根据该方面的方法的分析是核酸分析。如本文所用的术语“核酸”表示单链或双链DNA和RNA。DNA包括基因组DNA和cDNA。RNA包括mRNA、RNA、RNAi、siRNA、cRNA和自催化RNA。核酸也可以是DNA-RNA杂合体。核酸包含核苷酸序列，其通常包括包含A、G、C、T或U碱基的核苷酸。然而，核苷酸序列可以包括其他碱基，例如肌苷、甲基胞嘧啶、甲基肌苷、甲基腺苷和/或硫尿苷，但不限于此。
核酸分析可以是核苷酸测序，或基因表达分析，如本领域所熟知的。根据该方面的方法，核酸测序对于微生物鉴定是特别理想的。
如本领域技术人员将容易理解的，存在多种用于核酸测序的技术。这些包括Sanger测序(Sanger et al.(1977)Proceedings of the National Academy ofSciences.74(12)5463-5467)及其自动化版本，以及通常被称为“下一代”测序技术的新技术(Mardis(2013)Annual Review of Analytical Chemistry.6 287-303)。最近，纳米孔序列，特别是Oxford Nanopore系统(包括‘MinION’)已经看到对核苷酸测序的实质性评估和优化。本领域技术人员涉及Lu et al.(2016)Genomics,Proteomics&Bioinformatics.14(5)265-279概述了使用Oxford Nanopore MinION系统进行测序。
根据该方法的实施方案，特别优选使用核苷酸测序鉴定微生物，使用下一代技术(例如纳米孔测序)对核苷酸测序进行测序。
纳米孔测序的特征，特别是MinION系统(包括相对小的尺寸和快速测序和‘实时’分析的能力)可能使其特别适用于诊断分析，例如鉴定人血样中的革兰氏阳性细菌。(本领域技术人员参考Pennisi(2016)Science.351(6275)800-801(其通过引用并入本文)用于此方面的概述)。因此，在一个特别优选的实施方案中，核苷酸测序是纳米孔测序。优选地，使用便携式纳米孔测序仪(例如MinION系统)对纳米孔测序进行测序，但不限于此。
可以理解，根据该方面的方法，DNA和RNA分析都是合适的。通常，RNA序列分析(有时称为“RNA-seq”)通过对从RNA模板产生的cDNA进行测序来进行。可以理解，除核苷酸鉴定外，RNA或cDNA测序可以用于基因表达分析，其中这是期望的。
还可以理解，根据该方法的核酸分析可以涉及核酸序列扩增。如本文所用，“核酸序列扩增”包括但不限于诸如聚合酶链式反应(PCR)的技术，例如在CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY Eds.Ausubel et al.(John Wiley&Sons NY USA 1995-2001)链置换扩增(SDA)的第15章中所述；滚环复制(RCR)，例如在国际申请WO 92/01813和国际申请WO97/19193中描述的；基于核酸序列的扩增(NASBA)，例如Sooknanan et al.1994，Biotechniques 17 1077描述的；连接酶链式反应(LCR)，例如国际申请WO89/09385和上文分子生物学中CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY的第15章中所述；Q-β复制酶扩增，例如由Tyagi et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93 5395描述的以及例如解旋酶依赖性扩增，在国际公开WO 2004/02025中描述的。
某些下一代测序技术涉及核酸测序之前的核酸序列扩增。适用于多种下一代测序方法的特定样品制备技术是已知的并且已被广泛描述，例如可用于Illumina的专有测序技术的样品制备试剂盒的制造商说明书(参见http://www.illumina.com/techniques/sequencing/ngs-library-prep.html)、Pacific Biosystems(http://www.pacb.com/products-and-services/consumables/pacbio-rs-ii-consumables/sample-and-template-preparation-kits/)和Applied Biosystems(https://www.neb.com/applications/library-preparation-for-next-generation-sequencing/ion-tor rent-dna-library-preparation)。
还可以理解，尽管下一代测序技术通常优选地用于根据本发明的核酸序列分析，但用于核酸分析的其他技术也可能是合适的。这些技术包括用靶向目的微生物的引物进行诊断PCR和RT-PCR(包括实时RT-PCR或qPCR，其可用于核酸定量和/或基因表达分析)，如本领域众所周知的。
在另一个实施方案中，根据该方面的分析可以是基于荧光的分析。
优选地，在这些实施方案中，方法包括将荧光标签或探针与微生物或其组分结合的其他步骤。荧光标签或探针优选包括连接至微生物特异性配体的荧光分子或荧光纳米颗粒。
在一个实施方案中，荧光纳米颗粒包含荧光染料。在特别优选的实施方案中，荧光纳米颗粒是或包含量子点。关于量子点在生物材料的荧光检测中的应用的综述，本领域技术人员参考Medintz et al(2005)Nature Materials,4 435-446，其通过引用并入本文。
微生物特异性配体可以是任何合适的配体。在优选的实施方案中，微生物特异性配体是抗体。
通常，在这些实施方案中，除了结合本发明的构建体之外，合适的微生物或组分的存在导致荧光标签或探针与微生物或其组分的结合。因此，来自标签或探针的荧光信号可以用于分析(例如鉴定)微生物或其组分。
可以理解，根据这些实施方案，荧光标签或探针可以在任何合适的阶段与微生物或其组分和本发明的构建体组合，例如，在步骤(a)-(c)中的任何步骤期间或之前，或在步骤(c)之后。
图29中提供了结合与荧光标签的革兰氏阳性细菌结合的本发明构建体的示意图。
还可以理解，根据该方面的分析可涉及鉴定微生物的抗性谱，以促进适当的处理(例如抗生素处理)。用于确定抗生素抗性谱的技术是本领域熟知的。举例来说，本领域技术人员参考Reller et al(2009)Clinical Infectious Disease,49(11)1749-1755，其通过引用并入本文。
在Hassan et al(2018)Biosensors and Bioelectronics，99(2018)150-155中描述了落入本发明该方面范围内的微生物捕获和分析的某些示例性实施方案，其通过引用并入本文。
筛选样品或产品的方法
在另一方面，本发明提供了针对目的微生物或其组分的存在来筛选样品的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将构建体与样品组合，该构建体包含(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒和(iii)连接(i)和(ii)的第一接头和，
(b)使用纳米颗粒从样品中选择性地获得构建体；和
(c)进行分析以确定目的微生物或其组分与构建体结合，
其中确定目的微生物或其组分与构建体结合表明样品含有目标微生物或其组分，并且确定目的微生物或其组分不与构建体结合表明样品不含有目的微生物或其组分。
根据该方面的样品可以是如上所述的任何合适的样品。在某些优选的实施方案中，根据该方面的筛选是为了评估待施用于受试者(例如人或动物受试者)的产品的微生物污染。这些产品可以是多种产品中的任何一种，包括例如食品、化妆品和药品或医疗产品。在某些实施方案中，可以在筛选之前处理样品以去除干扰细菌与构建体的糖肽抗生素结合的组分。
在一个特别优选的实施方案中，根据该方面的样品是血液或血液制品。在一个优选的实施方案中，根据该方面的样品是血浆产品。在一个优选的实施方案中，根据该方面的样品是血小板产品。
在其中样品是血液或含有红细胞和/或白细胞的血液制品的实施方案中，优选地在步骤(a)之前聚集红细胞和/或白细胞。
诊断疾病或病况的方法
本发明的另一方面涉及诊断疾病或病况的方法。该方法将包括以下步骤：分析受试者样品中的微生物以鉴定病原体，如直接前面的方面所述，并且基于微生物的特性诊断疾病或病况。
优选地，疾病或病况是革兰氏阳性细菌的感染。优选地，致病性革兰氏阳性病原菌选自：芽孢杆菌属、梭菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、李斯特菌属、葡萄球菌属和链球菌属。优选地，革兰氏阳性细菌是球菌，例如葡萄球菌属或链球菌属。
在一些优选的实施方案中，葡萄球菌是金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌可以是但不限于糖肽敏感性菌株(例如ATCC 25923)、MRSA菌株(如ATCC 43300)、糖肽中间体(GISA)菌株(如ATCC 700698)或万古霉素抗性(VRSA)菌株(如NARSA VRS4)。
在一些实施方案中，葡萄球菌是表皮葡萄球菌。表皮葡萄球菌可以是但不限于糖肽敏感性菌株(例如ATCC 12228)或糖肽中间体(GISE)菌株(如NARSA NRS60)。
在一些优选的实施方案中，其中链球菌是肺炎链球菌。肺炎链球菌可以是但不限于糖肽敏感性菌株(例如ATCC 33400)或糖肽抗性菌株(如ATCC 700677)。
在一些实施方案中，肠球菌是屎肠球菌。屎肠球菌可以是但不限于万古霉素A(VanA)抗性菌株(例如ATCC 51559)或万古霉素B(Van B)抗性菌株(例如ATCC 51299)。
在某些实施方案中，所述疾病或病况可以选自如下的细菌感染：呼吸系统(例如肺炎)、消化道(例如肠胃炎)、窦(例如鼻窦炎)、耳朵(例如中耳炎)、神经系统(例如脑膜炎)、皮肤(例如蜂窝织炎)或内分泌系统(例如细菌性胰腺炎)。
在一个特别优选的实施方案中，疾病或病况是菌血症。在另一个特别优选的实施方案中，疾病或病况是细菌脓毒症。在一个优选的实施方案中，疾病或病况是由金黄色葡萄球菌引起的细菌性脓毒症。
在另一个特别优选的实施方案中，疾病或病况是尿路感染。
优选地，受试者是如上所述的人或动物受试者。在特别优选的实施方案中，受试者是人。
如上所述，用于诊断菌血症和/或细菌性脓毒症(以及许多其他细菌性疾病)的现有方法通常依赖于细菌培养。涉及细菌培养的方法可以具有显著的缺点，包括培养和诊断的大量时间，例如10-24小时，以及相对高的假阳性率。
就鉴定样品中的微生物或其组分和/或基于该鉴定诊断疾病或病况的时间而言，本发明的实施方案可以具有特别的优点。
在一些优选的实施方案中，根据本发明的直接前面的方面鉴定微生物或其组分可以在少于10小时、少于9个小时、少于8小时、少于7个小时、少于6个小时、少于5个小时、少于4个小时、少于3个小时、少于2个小时或少于1小时内进行。
在一些特别优选的实施方案中，根据该方面的方法诊断疾病或病况可以在少于10小时、少于9个小时、少于8小时、少于7个小时、少于6个小时、少于5个小时、少于4个小时、少于3个小时、少于2个小时或少于1小时内进行。
本发明的实施方案在鉴定样品中微生物的假阳性率和/或基于该鉴定的疾病或病况的诊断方面可以具有特别的优点。
在一些优选的实施方案中，根据直接前面的方面鉴定微生物的假阳性率小于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％。
在一些优选的实施方案中，根据该方面的方法诊断疾病或病况的假阳性率小于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％。
本发明的相关方面提供治疗疾病或病况的方法，该方法包括诊断如上所述的疾病或病况，以及基于诊断来治疗疾病或病况的步骤。
可以理解，根据该方面的方法适合的特定治疗形式将与诊断的特定疾病或病况相关。特定形式的治疗还可以涉及负责疾病或病况的微生物的抗生素抗性谱相关，其中对其进行确定(例如通过本文所述的分析，或任何其他合适的方法)。
通常，在其中疾病是革兰氏阳性细菌感染的优选实施方案中，治疗将包括施用抗生素。在一些优选的实施方案中，抗生素选自氯唑西林、双氯青霉素、甲氧西林(methlocillin)、夫西林、苯唑西林、头孢唑啉、头孢西丁、头孢呋辛、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟、头孢曲松、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑、阿莫西林、克拉维酸、青霉素、青霉素G、链霉素、阿莫西林、克林霉素、多西环素、甲硝唑(etronidazole)、利福平、利奈唑胺、达托霉素、达巴万星、奥利万星、替拉万星、泰地唑利、头孢洛林和万古霉素，或其组合。在一些特别优选的实施方案中，抗生素是万古霉素。
在其中疾病或病况是金黄色葡萄球菌感染的某些优选实施方案中，抗生素选自甲氧苄氨嘧啶、磺胺甲恶唑、克林霉素、万古霉素、多西环素、米诺环素、利奈唑胺、利福平、达托霉素、达巴万星、奥利万星、替拉万星、泰地唑利、头孢洛林或其组合。
该方面的方法在诊断和初始治疗所需的时间方面可以具有特别的优点，例如，初始施用抗生素。在一些优选的实施方案中，根据该方面的方法的诊断和初始治疗可以在少于10小时、少于9个小时、少于8小时、少于7个小时、少于6个小时、少于5个小时、少于4个小时、少于3个小时、少于2个小时或少于1小时内进行。
糖肽抗生素-接头化合物
本发明还提供了包含与第一接头结合的任选衍生化的糖肽抗生素的化合物或“加合物”。本发明的这些加合物适合于连接至纳米颗粒，以形成如上所述的构建体。
优选地，这种加合物的糖肽抗生素选自万古霉素、替考拉宁、奥利万星、替拉万星、氯雷莫霉菌素和巴尔希霉素。优选地，糖肽抗生素是万古霉素。
第一接头优选地是如上所述的第一接头。
优选地，本发明的这种形式的第一接头包含PEG部分，优选地至少PEG3。优选地，PEG基团在PEG3至PEG-10的范围内，包括PEG4、PEG 5、PEG6、PEG7、PEG 8和PEG9。在一些特别优选的实施方案中，PEG基团是PEG3或PEG4。
在一些实施方案中，接头包含线性碳链，优选地其中线性碳链是C4-C15，例如C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13和C14。在特别优选的实施方案中，线性碳链是C8。在其他特别优选的实施方案中，线性碳链是C11。
在一些实施方案中，接头可以通过选自以下的部分连接至糖肽抗生素：C-末端羧基部分、伯或仲N末端部分、羟基部分、酚部分和万古糖胺(vancosamine)部分。
优选地，接头通过酰胺键连接至糖肽抗生素。
在优选的实施方案中，接头包含一个或多个含氮部分。优选地，一个或多个含氮部分包括选自以下的部分：胺衍生部分、叠氮部分、叠氮化物衍生的部分和三唑部分。
优选地，接头在分子的第一末端包含含氮部分。优选地，部分是胺衍生的部分。优选地，部分将接头连接至糖肽抗生素。
优选地，接头在分子的第二末端包含含氮部分。在一些实施方案中，部分是叠氮化物或叠氮化物衍生的部分。
在一些优选的实施方案中，该方面的加合物还包含如上所述的第二连接体。
万古霉素-接头-万古霉素化合物
本发明进一步提供二聚体化合物，其中第一任选衍生化的万古霉素通过接头连接至第二任选衍生化的万古霉素。
更具体地，本发明提供直接前面的方面的加合物，其中化合物的糖肽抗生素是万古霉素，其连接至另外的万古霉素部分。在优选的实施方案中，本发明该方面的二聚体化合物包含直接前面的方面的两种连接的加合物，其中各化合物的糖肽抗生素是万古霉素。
在某些实施方案中，两个连接的化合物通过包含线性碳链和/或PEG部分的部分连接。在某些实施方案中，部分是线性碳链，其在各个末端包含酰胺键。
该方面的一个特别优选的实施方案在图31中给出。
提高糖肽抗生素活性的方法
另一方面，本发明提供增加或增强糖肽抗生素活性或功效的方法，该方法包括将糖肽抗生素连接至第一接头的步骤。该方法可以任选地包括通过第一接头将糖肽抗生素连接至纳米颗粒的其他步骤。在优选的实施方案中，糖肽抗生素、纳米颗粒和第一接头如上文关于本发明的构建体所述。
适当地，将糖肽抗生素连接至第一接头形成如上所述的加合物。适当地，将糖肽抗生素连接至纳米颗粒形成如上所述的构建体。
在优选的实施方案中，糖肽抗生素选自万古霉素、替考拉宁、奥利万星、替拉万星、氯雷莫霉菌素和巴尔希霉素。在一个特别优选的实施方案中，糖肽抗生素是万古霉素。
优选地，糖肽抗生素的活性或功效是针对革兰氏阳性细菌。优选地，细菌是致病性革兰氏阳性细菌。根据该方面的特别优选的革兰氏阳性细菌如上文关于诊断根据本发明的疾病或病况的方法所述。
在某些实施方案中，革兰氏阳性细菌是万古霉素敏感性或抗性细菌。万古霉素抗性细菌可以是Van A、Van B、Van C、Van D或Van E抗性细菌。优选地，万古霉素抗性细菌选自金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌(E.faecalis)。在某些实施方案中，微生物显示出对游离或未连接的糖肽抗生素的至少部分抗性。
如下所述，出乎意料地发现，将糖肽与接头连接，或通过接头将糖肽与纳米颗粒连接，可导致抗生素的最小抑制浓度(MIC)的显著降低，和/或与细菌膜和细菌膜通透性的亲合力或强度结合的增加。
在一些优选的方面，抗生素的活性或功效的增加或增强是抗生素对特定微生物(例如如上所述的革兰氏阳性微生物)的MIC的降低。
在一些优选的实施方案中，相对于游离或未连接的抗生素，MIC的降低是至少2至约50的倍数降低，包括至少5、10、15、20、25、30、35、40或45的倍数降低。
在优选的实施方案中，其中方法不包括通过接头将糖肽抗生素连接至纳米颗粒的任选步骤，接头包含C8线性碳链。
在优选的实施方案中，其中方法包括通过接头将糖肽抗生素连接至纳米颗粒的任选步骤，接头包含C8直链碳链或PEG3部分。
抑制微生物的方法
本发明的另一方面提供了抑制、控制或杀死微生物的方法，该方法包括使微生物与如上所述的本发明的构建体、加合物或二聚体接触，从而抑制、控制或杀死微生物的步骤。
优选地，微生物是革兰氏阳性细菌。优选地，革兰氏阳性细菌是致病性革兰氏阳性细菌。根据该方面的特别优选的革兰氏阳性细菌如上文关于诊断根据本发明的疾病或病况的方法所述。
在某些实施方案中，革兰氏阳性细菌是万古霉素抗性细菌。万古霉素抗性细菌可以是Van A、Van B或Van C、Van D或Van E抗性细菌。优选地，万古霉素抗性细菌选自金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌。在某些实施方案中，微生物显示出对游离或未连接的糖肽抗生素的至少部分抗性。
用于治疗或预防疾病的组合物和方法
在另一方面，本发明提供用于治疗或预防受试者的疾病、病症或病况的组合物，组合物包含如上所述的本发明的构建体、加合物或二聚体。
组合物可适当地含有一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”是指可以安全地用于全身施用的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。
根据具体的施用途径，可以使用本领域熟知的各种载体。这些载体可选自包括以下的组：糖，淀粉，纤维素及其衍生物，麦芽，明胶，滑石，硫酸钙，植物油，合成油，多元醇，海藻酸，磷酸盐缓冲溶液，乳化剂，等渗盐水和盐例如矿物酸盐包括盐酸盐、溴化物和硫酸盐，有机酸例如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐和无热原水。描述药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的有用参考文献是Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack PublishingCo.N.J.USA，1991)，其通过引用并入本文。
根据该方面的组合物的剂型包括片剂、分散剂、悬浮液、注射剂、溶液、油、糖浆、锭剂、胶囊、栓剂、气雾剂、透皮贴剂等。这些剂型还可包括专门为此目的设计的注射或植入受控释放装置或经修改以另外以这种方式起作用的其他形式的植入物。治疗剂的控制释放可以通过用例如丙烯酸树脂，蜡，高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸和某些纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素的疏水聚合物涂覆来实现。另外，控释可以通过使用其他聚合物基质、脂质体和/或微球来实现。
适于肠内、口服或肠胃外施用的本发明组合物可以作为离散单元存在，例如胶囊、小药囊或片剂，每个含有预定量的一种或多种本发明的治疗剂，作为粉末或颗粒或者在水性液体、非水性液体、水包油型乳液或油包水型液体乳液中的溶液或悬浮液。此类组合物可通过任何药学方法制备，但所有方法包括使一种或多种如上所述的试剂与构成一种或多种必需成分的载体结合的步骤。通常，通过将本发明的试剂与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地混合来制备组合物，然后，如果需要，将产品成型为所需的形式。
还提供了治疗或预防有此需要的受试者的疾病、病症或病况的方法，该方法包括给受试者施用有效量的本发明的构建体、加合物、二聚体或组合物的步骤，如以上描述过。
可以采用任何安全的施用途径为患者提供本发明的构建体或组合物。例如，可以使用肠内、口服、直肠、肠胃外、舌下、口腔、静脉内、关节内、肌肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、透皮等。
构建体或组合物可以以与剂量制剂相容的方式施用，并且以药学上有效的量施用。在本发明的上下文中，施用给患者的剂量应足以在适当的时间段内在患者中实现有益的应答。待施用的试剂的量可取决于待治疗的受试者，包括其年龄、性别、体重和一般健康状况，这些因素将取决于从业者的判断。
还可以理解，治疗方法和药物组合物可适用于哺乳动物的预防性或治疗性处理，包括人和非人类哺乳动物，例如家畜(例如马、牛和羊)，伴侣动物(例如狗和猫)，实验动物(例如小鼠、大鼠和豚鼠)和表演动物(例如赛马、灰狗和骆驼)，但不限于此。
优选地，根据这些实施方案的疾病或病况由革兰氏阳性细菌引起。根据该方面的特别优选的革兰氏阳性细菌如上文关于诊断根据本发明的疾病或病症的方法所述。
在某些实施方案中，疾病或病况可以选自如下的细菌感染：呼吸系统(例如肺炎)、消化道(例如肠胃炎)、窦(例如鼻窦炎)、耳朵(例如中耳炎)、神经系统(例如脑膜炎)、皮肤(例如蜂窝织炎)、内分泌系统(例如细菌性胰腺炎)或泌尿道(例如尿路感染)。
在一个特别优选的实施方案中，疾病或病况是菌血症。在另一个特别优选的实施方案中，疾病或病况是细菌脓毒症。在这些实施方案中，优选地，疾病或病况是由金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌引起的细菌性脓毒症。
在另一个特别优选的实施方案中，疾病或病况是尿路感染。在优选的实施方案中，疾病或病况是由金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌引起的细菌性脓毒症。在这些实施方案中，优选地，疾病或病况是由金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌引起的尿路感染。
实施例
实施例1.构建体的生产
如图1所示生产根据本发明的构建体。通过在万古霉素的C-末端羧酸盐和叠氮基-PEG3-胺的胺之间形成酰胺键合成附着至叠氮基-PEG3-胺(N3-PEG3-NH2)第一接头的万古霉素，其中加合物以下称为N3-PEG3-Van。然后通过如下所述的第二接头将N3-PEG3-Van偶联至磁性纳米颗粒。仔细表征分子结构的每个步骤以确保万古霉素与纳米颗粒的一致偶联，如下所述。
N3-PEG3-Van的合成
万古霉素的配体结合区位于七肽骨架中；因此，认识到可能将第一接头添加到该区域外的许多区以促进偶联到纳米颗粒上而基本上不损害万古霉素结合的效力(图2)。具有可接近的官能团的位点包括C-末端羧基、万古糖胺和N-末端Leu伯和仲胺基团，以及羟基和酚基团，所有这些位点先前用于产生万古霉素衍生物。
对于该实施例，通过N3-PEG3-NH2与万古霉素C-末端羧基之间的酰胺偶联合成N3-PEG3-Van，使盐酸万古霉素与N3-PEG3-NH2在苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)和DMF中的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)存在下反应。具体地，将盐酸万古霉素(567mg，3.82×10-4mol)，PyBOP(219mg，4.20×10-4mol)和N3-PEG3-NH2(N3(CH2CH2O)3CH2CH2NH2，100mg，4.58×10-4mol)在二甲基甲酰胺(DMF)(30mL)中搅拌至溶解。将N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(532μL，3.05×10-3mol)缓慢加入到反应混合物中。将反应在室温下搅拌2小时，然后在减压下去除溶剂。也可以使用其他标准的酰胺键偶联条件(参见图1)
通过制备型HPLC纯化化合物，得到N3-PEG3-Van(168mg，23％产率)，为白色固体。制备型HPLC在Agilent Technologies(1260Infinity)仪器上使用制备柱(AgilentEclipse XDB-Phenyl，30x100mm，5μm粒径)进行梯度洗脱(流速20mL/min，室温使用水中0.05％甲酸和在乙腈中0.05％甲酸作为洗脱液，梯度时间表：5至50％B，20分钟，洗涤)。通过NMR和LCMS表征得到的N3-PEG3-Van(图3-4)分离纳米颗粒的制备
对于该实施例，将羧化的超顺磁性170nm纳米颗粒(EMD Millipore，M1-020/50)用于构建体。通过碳二亚胺羧基活化将单层人血清白蛋白(HSA)结合到纳米颗粒的表面上，以便当在生物流体中展开时(即钝化纳米颗粒)减轻非特异性相互作用。
具体而言，根据制造商，使用碳二亚胺EDC(EDAC)和磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)反应，用人血清白蛋白(HSA)涂覆超顺磁性羧化的纳米颗粒。HSA的量根据[1]确定。简而言之，对于500uL的羧化纳米颗粒，将6.25mg的磺基-NHS(Thermo Scientific)和碳二亚胺EDC(Chem-Impex International Inc)溶解在冰冷的MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐)缓冲液pH5.0(Sigma Aldrich)中。15分钟后，在PBSP(磷酸盐缓冲盐水，0.1％pluronic F-127(Sigma Aldrich))缓冲液中快速洗涤MP，然后加入溶解在PBSP中的50mg人血清白蛋白(HSA)(Sigma Aldrich)并在室温下孵育2小时混合。然后洗涤纳米颗粒并悬浮在PBSP缓冲液中。
使用BCA试剂盒(Thermo Scientific)通过二辛可宁酸测定法(BCA)评估纳米颗粒上HSA层的产生，并用标准HSA蛋白的稀释系列进行定量(约2×106个HSA分子/μm2)。
第二接头与分离纳米颗粒的偶联
使用钝化的磁性纳米颗粒表面上的HSA分子将以N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的二苯并环辛炔(DBCO)亲水性PEG形式的第二接头前体偶联到构建体的纳米颗粒上。具体而言，通过在室温使500μL的HSA-MP(50mg/mL)与溶解于DMSO中12.5μL的NHS-PEG4-NH-CO-CH2-CH2-CO-DBCO接头(100mg/mL)反应2小时，将钝化的HSA涂覆的纳米颗粒与(NHS)活化的NHS-PEG4-NH-CO-CH2-CH2-CO-DBCO(Click Chemistry tools)偶联，然后洗涤。与第二接头偶联的磁性纳米颗粒在下文中称为DBCO-PEG4-纳米颗粒。
通过使5μL的DBCO-PEG4-纳米颗粒与1μL的N3-NBD荧光染料(0.1mg/mL，内部)在1％DMSO中通过无铜点击化学反应通过在磷酸盐缓冲液中在37℃孵育1小时来量化DBCO层。然后将荧光团偶联的纳米颗粒用PBSP洗涤3次并重悬于100μL中作为最终体积，使用未缀合的纳米颗粒的阴性对照，在Tecan M 1000Pro读板仪上在460的激发和540nm的发射下测量荧光。
N3-PEG3-Van与DBCO-PEG4-纳米颗粒的偶联
为了形成最终构建体(在本文中也称为Van-NP)，将N3-PEG3-Van与DBCO-PEG4-纳米颗粒连接(参见图1)。N3-PEG3-Van的叠氮基团与DBCO-PEG4-纳米颗粒的DBCO(炔烃)基团反应，使得两种组分通过由叠氮化物和炔基的环加成形成三唑基团而连接。具体而言，将经洗涤的与NHS-PEG4-DBCO(即DBCO-PEG4-纳米颗粒)偶联的磁性纳米颗粒通过无铜点击化学，通过将在37℃一起孵育4小时，与PBSP中不同浓度的N3-PEG3-Van(最终浓度0.125-3mg/mL)缀合。因此，如本文所述，磁性纳米颗粒通过第一接头和第二接头连接至万古霉素。
可以理解，预期DBCO-PEG4-纳米颗粒含有多个附着至其表面的含NHS-PEG4-DBCO的第二接头。还可以理解，预期多个单独的N3-PEG3-Van第一接头通过相应的第二接头与DBCO-PEG4-纳米颗粒结合，使得最终的生物分离构建体通常包含与多个万古霉素分子偶联的单个纳米颗粒。
对于该实施例，生物分离构建体用三种不同的局部密度的万古霉素分子产生：高、中等和低密度。如上所述，在本文中，“局部密度”定义为每单位表面积的功能活性分子的数量(例如万古霉素分子/μm2)。对于该实施例，每个珠的表面积为～0.1μm2，假设珠是球形的，其表面粗糙度可忽略)。
为了改变局部密度，N3-PEG3-Van在不同批次中变化，同时保持DBCO-PEG4-纳米颗粒的量恒定。可以理解，还可以通过改变初始与纳米颗粒反应的NHS-PEG4-DBCO的量来改变密度。在这些实验期间，在高万古霉素负载浓度下观察到可逆纳米颗粒聚集，通过暴露于超声波容易消散聚集。动态光散射(DLS)用于监测流体动力学体积的演变以逐渐增加万古霉素载量并发现平均粒度的相应增加(图5)。据推测，这两种观察结果可能是由于万古霉素在高浓度(～745mol/dm3)下形成纳米颗粒内和纳米颗粒间二聚体的趋势。
为了评估局部密度，通过定量N3-NBD与未反应的DBCO分子(即DBCO-PEG4-纳米颗粒)结合的量来间接地测量N3-PEG3-Van与DBCO-PEG4-纳米颗粒的结合效率(图6)。另外，使用两种方法对活性缀合的万古霉素进行功能性定量：1)附着至万古霉素结合配体的荧光团(羧基荧光素，Fam)的荧光测量，Fam-Lys-D-Ala-D-Ala(Fam-Kaa；(由Mimotopes定制合成，在PBS中100μg/mL)和2)与生物分离构建体温育后洗脱的Ac-Kaa的LCMS分析(图6)。Ac-Kaa(N-乙酰基-L-Lys-D-Ala-D-Ala)是合成的万古霉素靶配体，其模拟参与糖肽结合的脂质II的肽组分。
对于万古霉素偶联效率的荧光间接定量，将1μL的生物分离构建体(纳米颗粒浓度＝25mg/mL)与200μL Fam-Kaa(100μg/mL)在37℃旋转孵育1小时。然后，将纳米颗粒用PBSP洗涤三次，并重悬于100μL PBSP中作为最终体积，在Tecan M 1000Pro读板仪上以500的激发和520nm的发射测量荧光。这允许定量万古霉素偶联的DBCO分子的量，减去未反应的DBCO分子的初始测量值，提供DBCO分子/μm2的估计量。
对于荧光Fam-Kaa直接测定，类似地，将来自所有Van-NP批次的恒定量与Fam-Kaa一起孵育。通过多次洗涤步骤除去未结合的染料，然后将洗涤的纳米颗粒的荧光强度与参考曲线进行比较，使得能够估计共价结合至纳米颗粒上的活性万古霉素的表面密度(图7)。
对于洗脱的Ac-Kaa的LCMS分析，将25μL制备的生物分离构建体批次(纳米颗粒浓度50mg/mL)与25μL过量浓度的Ac-Kaa(10mg/mL)在37℃旋转孵育1小时。然后，将纳米颗粒用PBSP洗涤3次，并重悬于50μL的100mM HCL中，并在室温孵育15分钟。然后，将上清液用PBSP1:1稀释，并在LCMS上测量Ac-Kaa的浓度(图7)。
通过所有三种方法的万古霉素局部密度定量给出相似的结果(图8)，尽管基于Fam-Kaa和N3-NBD荧光的测定法更敏感，分别比LCMS方法需要少50倍和10倍的NP。为了进一步讨论，参考基于Fam-Kaa测量的局部密度。
实施例2.使用构建体的生物分离和细菌鉴定
图9中提供了使用本发明构建体从样品进行生物分离和细菌鉴定的策略的示意图。该策略包括以下步骤：
(1)样品采集和制备；和
(2)使用本发明的生物分离构建体的细菌磁性捕获，随后洗涤和去除干扰细胞。
关于干扰细胞的去除，如下所述，关于血液样品，在步骤(1)期间去除大部分干扰细胞(红细胞和白细胞)，其包括聚集步骤。在步骤(2)中，然后去除少量剩余的干扰人细胞。
在步骤2之后，任选地，可以进行步骤(3)细菌洗脱。
在步骤(2)或(3)之后，可以使用任何合适的策略鉴定细菌，如上所述。
对于分析细菌DNA或其他细胞内容物的应用，例如使用生物分离构建体捕获的细菌的核苷酸序列，如图9所示。该策略可以进一步包括步骤4和/或5；
(4)细菌裂解和细胞内容物的提取；
(5)细胞内容物的纯化。
在该实施例中提供了使用本发明的生物分离构建体来生物分离革兰氏阳性细菌的代表性方法和结果的细节。
细菌菌株
评估以下革兰氏阳性细菌菌株的生物分离：敏感性金黄色葡萄球菌(菌株ATCC25923)、金黄色葡萄球菌MRSA(菌株ATCC 43300)、金黄色葡萄球菌GISA(菌株ATCC700698)、金黄色葡萄球菌VRSA(菌株NARSA VRS4)、敏感性表皮葡萄球菌(菌株ATCC12228)、表皮葡萄球菌GISE(菌株NARSA NRS60)、敏感性肺炎链球菌(菌株ATCC 33400)、抗性肺炎链球菌(菌株ATCC 700677)。
将细菌菌株在37℃在营养肉汤上培养，并基于OD600计算而稀释至所需浓度。假设OD600＝0.5对应于109cfu/mL。为了制备用于使用本发明的构建体评估生物分离的样品，根据所进行的实验，向样品中渗入限定量的细菌。在营养琼脂上培养细菌细胞的子样品(约100CFU)以验证细菌负荷水平(输入)。
从血小板样品中生物分离细菌
在含有金黄色葡萄球菌敏感性和表皮葡萄球菌敏感性的血小板样品中评估使用实施例1中所述的构建体的细菌生物分离效率(在本文中称为“细菌捕获”或“细菌细胞捕获”)。
向每个渗入细菌的血小板样品中加入2μL的170nm生物分离构建体，并将样品在37℃旋转/振荡孵育1小时以防止沉淀。通过将管置于磁性架上2-5分钟，从1mL样品体积中提取与生物分离构建体结合的细菌细胞。然后，用无菌PBSP(磷酸盐缓冲盐水，0.1％pluronicF-127)磁力洗涤生物分离构建体结合的细菌3次。然后将生物分离构建体重悬于100μL的无菌PBS缓冲液中。然后将获得的细菌在营养琼脂上培养，并在37℃孵育24小时。
基于计算的输出板的计数菌落数与输入平板相比来计算生物分离效率(cfu/mL)。如图10所示，对于评估的两种细菌菌株，生物分离效率极高。
从血液样本中生物分离细菌
在含有如下的血液样品中评估使用实施例1中所述的构建体的细菌生物分离效率：敏感性金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌MRSA、金黄色葡萄球菌GISA、金黄色葡萄球菌VRSA、敏感性表皮葡萄球菌、表皮葡萄球菌GISE、敏感性肺炎链球菌和抗性肺炎链球菌。
为了制备用于掺入这些细菌的血液样品，用1:1比例的RBC聚集溶液(2％(w/v)葡聚糖-T500、0.2％(w/v)D-葡萄糖溶解在SSP+溶液中)处理无菌全血样品溶液并在室温沉降。然后，将1mL的上清液血液转移到干净的无菌Eppendorf管中并渗入，如上所述，培养细胞的子样品用于验证输入。
为了使用该方法确定由于聚集引起的干扰血细胞减少的程度，使用血细胞计数器进行聚集对不同时间点的血细胞含量计数的影响。观察到在10和20分钟时总RBC和WBC计数/mL分别降低80％和98％。此外，干扰细胞的减少高达99％细胞/mL，孵育时间更长(30-40分钟)。对于当前实例，使用20分钟的聚合时间。然而，对于较大的样品体积(例如10或20mL)，可以增加聚集时间多至5小时。
聚集后，然后将生物分离构建体加入到渗入细菌的样品中，并进行捕获处理，如上文对血小板样品所述。对于血小板样品，基于计算的输出平板的计数菌落数与输入平板相比来计算生物分离效率(CFU/mL)。与血小板样品类似，如图11所示，对于评估的所有细菌菌株，生物分离效率极高。
另外，为了评估使用构建体的革兰氏阳性细菌的生物分离的特异性，将掺有革兰氏阴性的大肠杆菌(菌株ATCC 25922)的样品进行如上所述的尝试细菌捕获。如图12所示，革兰氏阴性大肠杆菌的非特异性捕获率低。
细菌洗脱
将来自上述样品的磁性分离的构建体结合细菌重悬于100μL乙酸(100mM，pH 4)中并在65℃孵育20分钟。溶液pH的降低导致细菌从构建体中洗脱。孵育20分钟后，将Eppendorf保持在磁性架上以在磁场下进行磁性分离，并将上清液转移到新的无菌Eppendorf中。
将磁性捕获的细菌细胞的重复悬浮于无菌PBSP中，并在LB琼脂平板上进行传代培养，并在37℃孵育24小时，作为细菌计数的对照。细菌裂解、DNA捕获和qPCR检测
如上所述，对于一些下游应用(例如核苷酸测序)，需要细菌裂解和DNA捕获。对于该实施例，如上所述在捕获后进行细菌裂解，随后获得并纯化来自裂解细菌的DNA。
另外，在(A)根据本文所述方法的生物分离，使用本发明的构建体捕获以及随后的细菌裂解和DNA纯化；(B)使用市售的Qiagen‘DNeasy Blood and Tissue’试剂盒进行DNA提取；和(C)使用Qiagen试剂盒和PBS缓冲液进行DNA提取之间比较样品中从革兰氏阳性细菌获得的DNA的效率。
对于细菌裂解和DNA提取，将洗脱的细菌样品在65℃进一步孵育20分钟。然后，添加100μL含13M盐酸胍的溶液(终浓度：6.5M Gu HCl(Sigma Aldrich)，10mM Tris HCl pH8.0(Invitrogen)，1mM EDTApH 8.0(Invitrogen)，5mM Tris碱pH 10.7(AstralScientific))。混合后，加入6μL磁性二氧化硅颗粒( Silica HS，Merck)并通过涡旋混合并在37℃旋转孵育15分钟。用80％异丙醇(Merck)磁力洗涤DNA结合的磁性二氧化硅2次。然后，加入20μL的100mM Tris HCl(pH9.0)，通过在65℃孵育15分钟进行DNA洗脱。将20μL洗脱的DNA转移至无菌Eppendorf并储存在-20℃。
根据制造商的说明书使用Qiagen试剂盒(含或不含PBS缓冲液)进行DNA提取。
为了评估和比较根据本文所述方法捕获的细菌DNA的水平，并通过使用Qiagen试剂盒，使用对细菌DNA特异的引物进行qPCR。另外，定量了通过各自的方法从样品中捕获的人DNA水平。
具体而言，Sybr green( SelectMaster Mix，Life Technology)用于具有2μM引物浓度和1μL基因组DNA(100ng/μL，对照)或使用本文所述的方法、或者具有或不具有PBS缓冲液的Qiagen试剂盒获得的测试DNA样品的主混合物(1X)。qPCR循环如下：95℃10分钟，接着40个循环的95℃15秒、55℃20秒和72℃30秒，然后熔解循环95℃15秒、60℃1分钟和95℃15秒。
将所有结果定量至金黄色葡萄球菌和人DNA的基因组DNA的扩增连续稀释的标准曲线。为了检测细菌，通过以下引物扩增Gmk基因(F：5'-TCGTTTTATCAGGACCATCTGGAGTAGGTA-3'和R：5'-CATCTTTAATTAAAGCTTCAAACGCATCCC-3`)[2]。通过相同的方案但使用以下引物评估人DNA：EFTUD2_GH_FP：GGTCTTGCCAGACACCAAAG，EFTUD2_GH_RP：TGAGAGGACACACGCAAAAC[3]。
结果列于图13-17中。从图13中可以明显看出，通过生物分离和随后的裂解和DNA加工(其在图中和在该实施例中备选地称为'Bac-ID')获得高纯度和高浓度的DNA。从图14A和14C中可以明显看出，Bac-ID通常对于从渗入金黄色葡萄球菌的血液样品中获得革兰氏阳性细菌DNA比使用具有或不具有缓冲液的Qiagen试剂盒提取更敏感。此外，如所预期的，Bac-ID产生低得多的人DNA浓度(图14B和图17)。在图14C中，仅通过Qiagen试剂盒评估109金黄色葡萄球菌的样品(cfu/mL)以评估用血液样品对试剂盒的抑制。在该实施例中，未通过Bac-ID方法评估具有高浓度的样品(109金黄色葡萄球菌cfu/mL)。
另外，从图15B中可以明显看出，Bac-ID有效地获得来自该实施例所评估的所有物种和菌株的革兰氏阳性DNA(即金黄色葡萄球菌敏感性、金黄色葡萄球菌MRSA、金黄色葡萄球菌GISA、金黄色葡萄球菌VRSA、表皮葡萄球菌敏感性、表皮葡萄球菌GISE、链球菌肺炎链球菌敏感性和肺炎链球菌抗性)。另外，检测到的DNA量与掺入样品中的细菌的量和浓度相关(图15C和16)。此外，Bac-ID方法相对于获得的细菌DNA的量的可重复性高(图15D)。图16显示了该方法对具有相同提取效率的较大样品体积的适用性，图17表明增加聚集时间降低了某些应用中可能需要的人DNA含量。
实施例3.构建体的抗微生物和结合活性
评估如实施例1中所述生产的构建体对万古霉素敏感性和抗性金黄色葡萄球菌和万古霉素抗性肠球菌(VRE)的最小抑制浓度(MIC)、结合亲和力和细菌膜渗透性。如下面详细描述的，出乎意料地发现，中等和高局部密度构建体对敏感性和抗性菌株显示出显著较低的MIC，并且还显示出较高的结合亲合力和细菌膜渗透性。假设中等和高密度Van-NP允许在细菌细胞壁上发生多个更强烈定位的结合事件，而当药物在溶液中时，布朗扩散使结合事件随机化在更宽的表面区域上。因此，纳米载体上的高药物密度引起快速和局部的膜损伤(图18)。
在该实施例中，针对万古霉素敏感性和抗性菌株评估低、中等和高万古霉素局部密度构建体(图19)的最小抑制作用(MIC)，基于Fam-Kaa测定法计算MIC测定的万古霉素含量，如实施例1中所述。万古霉素含量在0.5-30μg/mL之间变化。如实施例1中所述的HSA涂覆的磁性纳米颗粒(HSA-纳米颗粒)用于MIC研究中作为阳性对照以证实涂覆的纳米颗粒本身不具有任何抗微生物活性。
在中等和高万古霉素局部密度下，构建体对细菌生长的抑制分别针对抗性和敏感性菌株发生，而由于微生物生长，用HSA-纳米颗粒观察到浊度。值得注意的是，当针对敏感性和抗性金黄色葡萄球菌和VanA和VanB抗性肠球菌菌株进行测试时，我们观察到与N3-PEG3-Van和未修饰的万古霉素相比，构建体的MIC分别提高了14至>100倍和2至18倍(图20和21)。万古霉素效力的这种显著增强表明细菌抑制受局部密度的影响，与游离万古霉素针对菌株相比，活性的改善甚至更大。
为了进一步探索这种现象，对于给定的局部密度万古霉素，滴定构建体内纳米颗粒的浓度(200-5mg/mL)，以及计算对于给定局部密度的万古霉素实现抑制细菌生长所需的构建体浓度。结果显示万古霉素局部密度与抑制所需构建体数量之间的间接关系：对于万古霉素敏感性和抗性菌株，较高密度需要较少的构建体(图21)。
当基于缀合的万古霉素含量(基于万古霉素载量和抑制所需的构建体的数量)计算每个菌株的MIC值时，发现MIC随局部密度的增加而变化(图22和表1)。对于万古霉素敏感性金黄色葡萄球菌菌株(ATCC25923)，用低密度(2.18×102万古霉素/μm2)但高数量(25mg/mL纳米颗粒)的构建体检测到MIC是0.55μg/mL。将局部密度增加至2.41×103或3.94×103万古霉素/μm2需要减少数量的构建体(分别为15和12.5mg/mL)，导致MIC值分别对应于3.3和4.5μg/mL万古霉素。对于抗性金黄色葡萄球菌菌株(NARSAVRS-1)，用中等密度的Van-NP(6.28×103万古霉素/μm2以25mg/mL纳米颗粒)获得12.4μg/mL的MIC，而更高的局部密度(9.56×103万古霉素/μm2以17.5mg/mL纳米颗粒)获得更高的MIC为15.2μg/mL。
相反，即使使用非常高数量的纳米颗粒，低万古霉素密度构建体也不能抑制抗性菌株的生长。结果表明MIC值是纳米颗粒表面上万古霉素的局部密度和纳米颗粒数量(以及因此构建体的数量)两者的结果，它们一起代表在细菌膜上发生用于有效杀死的结合事件的数量。取决于菌株的抗性谱，需要特定的局部密度，高抗性菌株所需的局部密度更高。然而，对于给定的菌株，最低的可能局部密度给出最低的MIC值(基于计算的缀合的万古霉素含量)。
为了阐明万古霉素构建体与游离万古霉素相比增强药物效力背后的基本机制，通过使用配体置换测定法测试了万古霉素、N3-PEG3-Van和构建体(Van-NP)与细菌配体靶标的结合亲和力。这允许评估需要何种浓度的竞争性Ac-Kaa配体来消除抗菌活性。在宽范围的Ac-Kaa摩尔过量存在下，以10倍MIC评估测试化合物。Ac-Kaa的置换用于证明与脂质II的天然细菌Kaa靶标的亲和力的差异[4]-[5]。该实验的设计基于计算万古霉素分子促进与Ac-Kaa的结合而不是抑制细菌生长所需的Ac-Kaa浓度：所需的Ac-Kaa浓度越高，万古霉素细菌结合亲和力越高。
结果显示，万古霉素、N3-PEG3-Van和低万古霉素密度构建体具有与细菌配体相同的亲和力，具有>2倍摩尔过量的Ac-Kaa(基于万古霉素分子量)，导致细菌生长(图23)。然而，中等和高万古霉素密度构建体显示出与细菌结合的更强的亲和力，分别需要>4和64摩尔过量的Ac-Kaa来克服细菌抑制(图23)。这些发现表明增加糖肽抗生素构建体的局部密度和细菌结合亲和力之间存在直接关系。
为了确定细菌细胞壁损伤的程度，我们在碘化丙锭存在下培养金黄色葡萄球菌与万古霉素(20倍MIC)和不同局部密度(10倍MIC)的构建体，并测量荧光随时间的变化。碘化丙啶(PI)是一种荧光染料，通过在与细菌核酸内容物结合时增加其荧光来评估细菌生存力和膜完整性[6]。值得注意的是，万古霉素在10小时后没有显示出任何膜损伤，而所有局部密度的构建体在孵育1小时后显示PI的膜透化(图24)。
与低密度和中等密度Van-NP(2200)相比，高局部密度构建体显示出更高的荧光信号(2800)，表明更高的局部药物诱导了更多的膜渗漏。令人惊讶的是，低局部密度构建体引发了早期的膜损伤(在前5分钟看到的荧光增加与其他Van-NP密度的20-25分钟相比)，这可能是由于NP数量更高(NP浓度：25mg/mL)与中等密度和高密度Van-NP(NP浓度：10mg/mL)相比，导致结合事件和结合动力学速率增加。
这些结果支持高局部密度构建体的膜损伤假设，其中多个万古霉素分子引起更高的结合亲合力，这导致同时在浓缩表面区域中的局部和严重的膜损伤。高密度Van-NP的这种增加的膜损伤可能增加构建体针对厚壁细胞壁抗性细菌的亲和力，并补偿VanA和VanB抗性菌株中脂质II靶配体的修饰。
总之，该实施例出乎意料地揭示了如实施例1中所述的抗生素在构建体中的纳米颗粒上的受控缀合导致增强的抗生素功效，针对敏感性和抗性菌株的改善MIC(基于缀合的抗生素含量)，具有取决于细菌菌株的最佳局部密度。构建体显示出对细菌结合靶的亲和力增加，并且高局部密度构建体在2小时内诱导显著的细菌膜损伤，而10小时后游离抗生素没有损伤。因此，通过设计纳米技术以将易于获得的抗生素固定化在生物相容性纳米载体上，使用现有抗生素靶向超级细菌有了新的希望。这一发现对解决药物抗性具有潜在影响，并可能阻止新的抗性机制的发展。
实施例4.包含糖肽抗生素和接头的化合物
已经设计了包含万古霉素和接头的某些化合物，并且认为它们特别有益于用于产生如本文所述的构建体。
一种这样的化合物是如实施例1中所述的N3-PEG3-Van。N3-PEG3-Van的结构如图28B所示。
另一种这样的化合物是万古霉素，其与线性C8链形式的接头组合，在C8链的第一末端具有胺部分，在与第一末端相对的第二末端具有叠氮部分，其中胺部分通过C-末端羧基部分直接连接至万古霉素(图28A)。该化合物在本文中称为N3-C8-Van。
实施例5.使用构建体鉴定荧光细菌
在该实施例中，如前所述，用HSA涂覆荧光羧化纳米颗粒(0.2μm蓝色荧光颗粒(365/415)，Life technology)。然后通过使500μL HSA-MP(50mg/mL)与溶于DMSO中的12.5μL接头(100mg/mL)在室温反应2小时，将荧光NP与NHS-PEG4-叠氮化物接头(ClickChemistry tools)偶联，并然后洗涤。使用Zeba旋转脱盐柱(MWCO 7KDa，Thermo Fisher)按照制造商的说明将抗金黄色葡萄球菌抗体(Thermo Fisher)缓冲交换到PBS中。将20倍摩尔过量的NHS-PEG4-DBCO接头加入到缓冲交换的抗体中，并在室温孵育1小时。去除过量的接头，并使用Zeba旋转脱盐柱纯化抗体。然后将DBCO修饰的抗体与叠氮化物荧光纳米颗粒偶联，并在37℃孵育3小时。洗涤抗体缀合的荧光纳米颗粒。
如前所述将血液样品聚集并掺入金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)浓度范围102-105cfu/mL(n＝3)。将Van-NP(2μL)和抗金黄色葡萄球菌抗体-荧光NP(1μL)加入到渗入的血液样品中并孵育1.5小时以通过形成夹心来标记捕获细菌(图29)。然后洗涤结合纳米颗粒的细菌并重悬浮于100μL PBSP中，并使用未渗入的样品的阴性对照，在Tecan M 1000Pro读板仪上在365激发和416nm发射来测量荧光(图30)。通过以下等式计算LoD(检测限)：LoD＝N+(3×SD)。
实施例6.万古霉素二聚体的合成和评估
图32提供了本发明的万古霉素-接头-万古霉素二聚体的合成的示意图。N3-PEG3-Van(4)化合物(如上所述)被认为特别适用于制备万古霉素二聚体，因为与烷基接头相比，PEG接头可有助于改善亲水性。为了产生万古霉素二聚体，使用另外的双炔部分(20)将两个N3-PEG3-Van化合物连接在一起。为了生产双炔部分(20)，在HCTU和DIPEA存在下，在DMF中将己二酸(19)与炔丙胺偶联。然后使用CuSO4、NaASb和HOAc作为催化剂，在DMF/t-BuOH/H2O中，在50℃微波反应30-60分钟，使双炔接头(20)与过量的N3-PEG3-Van通过CuAAC反应，从而产生万古霉素二聚体(21a)。另外，如图32中进一步描绘的那样，使用类似的方法使用N3-C8-Van(3)化合物(如上所述)生产二聚体(21b)。
针对多种革兰氏阳性细菌物种和菌株评估二聚体21a和21b(和作为对照的游离万古霉素)的MIC，如图33所示。在图33中，N3-PEG3-Van二聚体(21a)标记为‘Vanco-3PEG-Tz-6C二聚体’，N3-C8-Van二聚体(21b)标记为Vanco-8C-Tz-6C二聚体。根据该实施例用于MIC评估的方案如下。将细菌菌株在Mueller Hinton肉汤(MHB)(Bacto laboratories，目录号211443)中于37℃培养过夜。然后将培养物在新鲜的MHB肉汤中稀释40倍，并在37℃孵育2-3小时。将化合物在NBS96孔微量滴定板(Corning 3461非结合表面)的孔中连续稀释两倍，浓度范围为0.06μg/mL至128μg/mL，一式两份铺板。将得到的对数中期培养物稀释至1×106CFU/mL，然后将50μL加入到含有化合物的96孔板的每个孔中，得到5×105CFU/mL的细胞密度，以及最终化合物浓度范围为0.03μg/mL至64μg/mL。盖上平板并在37℃孵育22小时。目测确定MIC，定义为显示无可见生长的最低浓度。所有每个重复评估都进行两次，使得总重复是一式四份。对于每个测试的平板，包括仅细菌的阳性对照和仅培养基的阴性对照。
观察到游离万古霉素和二聚体21a和21b之间活性的差异。值得注意的是，观察到二聚体21a(但不是二聚体21b)针对万古霉素抗性金黄色葡萄球菌VRS4NARSA的活性增加(即降低的MIC)(图33)。另外，二聚体21a和二聚体21b均显示出针对万古霉素敏感性的屎肠球菌(菌株ATCC 35667)和粪肠球菌(菌株ATCC 29212)的活性增加(MIC降低)(图33)。这表明本发明的二聚体在至少某些情况下可能对抗微生物剂使用具有特别的优势。
实施例7.使用聚合物缀合糖肽-接头加合物
除了实施例1中所述的基于HSA的缀合方法之外，还使用PCT/AU2015/050564中所述的方法进行N3-PEG3-Van与磁性纳米颗粒的缀合(图34中所示)。
如图35所示，PDEA葡聚糖聚合物与硫醇化磁性纳米颗粒反应以在纳米颗粒表面上形成单层。然后使纳米金(741957，Sigma Aldrich)和另外的PDEA葡聚糖聚合物反应以形成聚合物多层。随后，将N3-PEG3-Van与该聚合物涂覆的纳米颗粒缀合，类似于上文和[7]中所述。图41中提供了使用该聚合物方法与磁性纳米颗粒缀合的N3-PEG3-Van的示意图。
材料和方法
-所需材料
·MP：EMD Millipore，M1-020/50
·硫醇PEG胺(PG2-AMTH-5k，Nanocs)
·NHS-PEG-DBCO，ClickChemistryTools#AZ103
·缓冲液A：CHES，100mM，pH 9,0.1％Pluronic F127。
·缓冲液B：100mM MES pH 5，0.01％Pluronic F127
·缓冲液C：10mM PBS pH 7.4，0.1％Pluronic F127
·胱胺二盐酸盐，C121509ALDRICH
·金纳米颗粒(741957，Sigma Aldrich)
·EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，77149，ThermoFisherScientific
·磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)，24510，ThermoFisher Scientific
-方法
1.COOH MNP的硫醇化
-将50mg的胱胺溶于0.5mL的缓冲液C中
-将0.5mL的MP置于低蛋白质结合的eppendorf管中。在缓冲液B中洗涤两次。在声波浴中用力超声处理
-向每个eppendorf管中加入6.25mg的EDC和6.25mg的磺基-NHS。两种化合物都是湿度敏感的，因此在手套箱中等分并在冰箱/冰柜中保存。在使用前，将它们在100mg/mL的冷缓冲液B(冰上)中稀释，并向颗粒中加入62.5μL。重要提示：先放Sulfo-NHS，然后EDC。超声波处理至少2分钟
-在室温在轨道振荡器上孵育15分钟。
-在缓冲液A中快速洗涤×3
-加入500μL预先制备的胱胺，并在4℃孵育3小时
-在缓冲液A中洗涤三次，并以0.5mL的最终体积重悬
-通过Ellman的反应估算表面产生的巯基
1.1使用Ellman反应对MNP表面进行巯基估算的程序
-将5μL硫醇化的MNP加入到250μL的10mM Tris pH7.5和5μL的Ellman试剂(Tris缓冲液中10mM)中。
-在室温孵育30分钟，在磁力拉下MNP后读取在412nm的上清液的OD。
-通过与用半胱胺盐酸盐绘制的标准曲线比较来定量巯基。
2.多层聚合物的生成
-加入1μL的13mg/mL的PDEA聚合物
-孵育1小时，RT
-加入10μL金纳米颗粒(10nm；741957，Sigma Aldrich)
-在4℃孵育O/N。
-磁性下拉MNP并将上清液放在一边，以定性估算金纳米颗粒的并入(2.1，下文)
-在缓冲液C中洗涤三次，并以0.5mL的最终体积重悬
2.1用于该项目的金纳米颗粒在520nm处具有吸收峰
-从掺入步骤中取出50μL上清液，并将其与在多层生成期间添加的等体积纳米金进行比较。
-与输入相比，上清液中纳米金的消耗表示纳米金成功地并入聚合物上以在表面上形成多层(参见图43)。
3.PG2-AMTH-5k
-将PG2-AMTH-5k以100mg/mL等分在DMSO中并储存在-20℃
-向每个eppendorf管中加入12.5μL的PG2-AMTH-5k。在室温孵育1小时并在缓冲液C中洗涤三次。最终体积0.5mL
4.NHS-PEG-DBCO
-将AZ103以100mg/mL等分在DMSO中并储存在-20℃。
-向每个eppendorf管中加入12.5μL的AZ103。在室温孵育1小时并在缓冲液C中洗涤三次。最终体积0.5mL
5.无Cu点击的万古霉素PEGN3
-在100％DMSO中以10mg/mL制备的万古霉素PEG N3的储备溶液，并储存在-20℃
-将20μL万古霉素PEG N3加入到150μL的50mg/mL的MP中。在37℃反应4小时
-在缓冲液C中洗涤×3
结果
使用实施例1和[8]中描述的Fam-Kaa结合方法比较涂覆有HSA并使用聚合物方法的纳米颗粒表面上的万古霉素浓度。如图36所示，估计的表面浓度在每种情况下基本相同。然而，注意到对于使用聚合物方法产生的，背景(非特异性)与涂覆的微粒的结合较低(图36(B))。
另外，比较了使用聚合物和HSA方法产生的纳米颗粒的细菌捕获(金黄色葡萄球菌)。两种类型的颗粒都成功地选择性富集金黄色葡萄球菌，如图37所示。
实施例8.使用C3、C8和PEG接头的糖肽表面浓度和细菌捕获的比较
除了实施例1中描述的构建体之外，以类似方式产生其他构建体，但在第一接头中并入C3或C8代替PEG3。
如实施例1中所述，使用Fam-Kaa结合评估这些相应颗粒的万古霉素表面浓度。如图38所示，在相同条件下包括基本上相同的万古霉素浓度。含有PEG3的接头的使用导致万古霉素的表面浓度高于含C3和C8的接头的表面浓度。
此外，评估了使用PEG3、C8和C3构建体捕获如上所述的革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌GP01)。如图39所示，所有构建体均以103-107cfu/mL掺入细胞的浓度从缓冲液(PBSpH7.4)成功捕获细菌。然而，仅观察到PEG3构建体从较低浓度的细菌输入(10和102cfu/mL)捕获细菌。
另外，捕获后上清液中存在的细菌数量存在实质性差异。更具体地，在PEG3构建体(A)的上清液中鉴定出很少或没有细菌，而在C8(B)和C3(C)构建体的上清液中鉴定出大量细菌。
不受理论束缚，假设观察到的PEG3构建体的优良细菌捕获与这些构建体的万古霉素表面浓度增加有关。
实施例9.万古霉素加合物的抗微生物活性
除了N3-PEG3-Van加合物之外，如实施例1中所述类似地合成N3-C3-Van和N3-C8-Van加合物。然后如实施例3中所述类似地，评估并比较万古霉素和这些加合物的以最小抑制浓度形式的抗微生物活性。结果列于图40中。
如在图40中可以看到的那样，与万古霉素相比，N3-C8-Van加合物针对几种革兰氏阳性细菌菌株(包括金黄色葡萄球菌MRSA菌株和肺炎链球菌，粪肠球菌和屎肠球菌)的活性增加(以MIC降低的形式)株)。
在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限制于任何一个实施方案或特征的特定集合。在不脱离本发明的情况下，可以对所描述和示例说明的实施方案进行各种改变和修改。
本说明书中提及的每个专利和科学文献，计算机程序和算法的公开内容通过引用整体并入。
参考文献
1.Sanjaya,K.C.,Ranzoni,A.,Watterson,D.,Young,P.&Cooper,M.A.Evaluationof direct versus multi-layer passivation and capture chemistries fornanoparticle-based biosensor applications.Biosensors&bioelectronics 67,769-774(2015).
2.Eleaume,H.,Jabbouri,S.Comparison of two standardisation methods inreal-time quantitative RT-PCR to follow Staphylococcus aureus genesexpression during in vitro growth.Journal of microbiological methods 59,363-370(2004).
3.Gevensleben,H.,Garcia-Murillas,I.,Graeser,M.K.,Schiavon,G.,Osin,P.,Parton,M.,Smith,I.E.,Ashworth,A.,Turner,N.C.Noninvasive detection of HER2amplification with plasma DNA digital PCR.Clinical cancer research:anofficial journal of the American Association for Cancer Research 19,3276-3284(2013).
4.Cooper,M.,Williams,D.H.&Cho,R.Y.Surface plasmon resonance analysisof glycopeptide antibiotic activity at a model membrane surface.ChemicalCommunications,1625-1626(1997).
5.Williams,S.C.et al.Distinguishing between living and nonlivingbacteria:Evaluation of the vital stain propidium iodide and its combined usewith molecular probes in aquatic samples.Journal of Microbiological Methods32,225-236(1998).
6.Boulos,L.,Prévost,M.,Barbeau,B.,Coallier,J.&Desjardins,R. BacLightTM:application of a new rapid staining method for directenumeration of viable and total bacteria in drinking water.Journal ofMicrobiological Methods 37,77-86(1999).
7.Hassan,M.M.,Ranzoni,A.&Cooper M.A.A nanoparticle-based method forculture-free bacterial DNA enrichment from whole blood.Biosensors andBioelectronics 99,150-155(2018).
8.Hassan,M.M.,Ranzoni,A.,Phetsang,W.,Blaskovich,M.A.T.&Cooper,M.A.Surface Ligand Density of Antibiotic-Nanoparticle Conjugates EnhancesTarget Avidity and Membrane Permeabilization of Vancomycin-ResistantBacteria.Bioconjugate Chemistry 28,353-361(2017).
表
表1.金黄色葡萄球菌菌株的纳米颗粒浓度和万古霉素密度与MIC的比较。

Claims (54)

1.构建体，包含：
(i)任选衍生化的糖肽抗生素；
(ii)纳米颗粒；和
(iii)连接(i)和(ii)的第一接头。
2.根据权利要求1所述的构建体，还包含位于第一接头和(ii)之间的第二接头。
3.根据权利要求1或2所述的构建体，其中纳米颗粒是分离纳米颗粒，优选地其中分离纳米颗粒是磁性纳米颗粒。
4.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中糖肽抗生素选自：万古霉素、替考拉宁、奥利万星、替拉万星、氯雷莫霉菌素和巴尔希霉素。
5.根据权利要求4所述的构建体，其中糖肽抗生素是万古霉素。
6.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中第一接头是至少部分亲水的。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的构建体，其中第一接头是疏水的。
8.根据权利要求6所述的构建体，其中第一接头包含聚乙二醇(PEG)部分。
9.根据权利要求8所述的构建体，优选地其中PEG部分是PEG3。
10.根据权利要求6-8中任一项所述的构建体，其中第一接头包含大于4个碳的线性碳链。
11.根据权利要求10所述的构建体，其中线性碳链是C8。
12.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中第一接头通过选自以下的部分连接至糖肽抗生素：C-末端羧基部分、伯或仲N末端部分、羟基部分、酚部分和万古糖胺部分。
13.根据权利要求12所述的构建体，其中第一接头通过酰胺键连接至糖肽抗生素。
14.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中第一接头包含一个或多个含氮部分。
15.根据权利要求13所述的构建体，其中第一接头在分子的第一末端包含含氮部分，其中所述部分将接头连接至糖肽抗生素。
16.根据权利要求13或14所述的构建体，其中第一接头在分子的第二末端包含含氮部分。
17.根据权利要求13-15中任一项所述的构建体，其中一个或多个含氮部分包括胺衍生的部分和/或叠氮化物衍生的部分。
18.根据权利要求2-16中任一项所述的构建体，其中第二接头是有机分子。
19.根据权利要求2-14中任一项所述的构建体，其中第二接头包含PEG部分。
20.根据权利要求18所述的构建体，其中PEG部分是PEG3。
21.根据权利要求13-19中任一项所述的构建体，其中第一接头通过叠氮化物衍生的部分连接至第二接头。
22.根据权利要求20所述的构建体，其中第一接头通过第一接头的三唑部分连接至第二接头。
23.根据前述权利要求中任一项是的构建体，其中构建体的纳米颗粒用蛋白质或聚合物进行钝化。
24.根据权利要求22所述的构建体，其中钝化是通过选自HAS、CMD、PDEC-葡聚糖和PDEA-葡聚糖的涂层。
25.根据权利要求23所述的构建体，其中第一接头通过涂层连接至纳米颗粒。
26.根据权利要求24所述的构建体，其中第一接头通过第二接头连接至纳米颗粒，其中第二接头附着至涂层。
27.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中构建体包含多个糖肽抗生素分子。
28.根据权利要求26所述的构建体，其中构建体具有糖肽抗生素分子的中等或高局部密度。
29.生产构建体的方法，该方法包括获得(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒、(iii)第一接头，并使用(iii)连接(i)和(ii)的步骤。
30.生产构建体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)获得(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒、(iii)第一接头、(iv)第二接头；
(b)连接(i)至(iii)；
(c)连接(ii)至(iv)；和
(d)连接(iii)至(iv)。
31.将构建体与微生物或其组分结合的方法，该构建体包含(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒、(iii)连接(i)和(ii)的接头，该方法包括以下步骤：
(a)将构建体与微生物或其组分组合；和
(b)选择性地将构建体的糖肽抗生素与微生物或其组分结合，
从而将构建体与微生物或其组分结合。
32.使用构建体从样品中分离微生物或其组分的方法，该方法包括以下步骤：
(ai)任选地，其中样品是血液样品、聚集血细胞；
(a)将构建体与含有微生物或其组分的样品组合，该构建体包含(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒、(iii)连接(i)和(ii)的接头；
(b)将微生物或其组分与构建体的糖肽抗生素选择性地结合；和
(c)使用纳米颗粒从样品中选择性地获得与微生物或其组分结合的构建体，
从而使用构建体从样品中分离微生物或其组分。
33.根据权利要求31所述的方法，其中步骤(a)的样品是从生物学受试者获得的样品。
34.根据权利要求32所述的方法，其中样品是尿液、血液或血液制品。
35.根据权利要求32或33所述的方法，其中样品获自人。
36.根据权利要求30-34中任一项所述的方法，其中步骤(a)的微生物是革兰氏阳性细菌。
37.根据权利要求35所述的方法，其中微生物是致病性的。
38.根据权利要求30-36中任一项所述的方法，其中使用是磁性纳米颗粒的分离纳米颗粒的磁捕获进行步骤(c)。
39.针对目的微生物或其组分的存在来筛选样品的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将构建体与样品组合，该构建体包含(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒、(iii)连接(i)和(ii)的第一接头；
(b)使用纳米颗粒从样品中选择性地获得构建体；和
(c)确定目的微生物或其组分是否与构建体结合，
其中确定目的微生物或其组分与构建体结合表明样品含有目的微生物或其组分，并且确定目的微生物或其组分不与构建体结合表明样品不含有目的微生物或其组分。
40.分析从样品中获得的微生物或其组分的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将构建体与含有微生物或其组分的样品组合，该构建体包含(i)任选衍生化的糖肽抗生素、(ii)纳米颗粒、(iii)连接(i)和(ii)的接头；
(b)将微生物或其组分与构建体的糖肽抗生素选择性地结合；
(c)使用纳米颗粒从样品中选择性地获得与微生物或其组分结合的构建体，从而从样品中获得微生物或其组分；
(d)任选地，将微生物或其组分与构建体分离；和
(e)分析微生物。
41.根据权利要求39所述的方法，其中步骤(e)的分析包括MALDI质谱分析。
42.根据权利要求39所述的方法，其中步骤(e)的分析包括核酸分析。
43.根据权利要求39所述的方法，其中步骤(e)的分析包括荧光分析。
44.根据权利要求39-42中任一项所述的方法，其中分析包括鉴定微生物。
45.根据权利要求28-43中任一项所述的方法，其中步骤(a)的构建体是根据权利要求1-27中任一项所述的构建体。
46.诊断受试者的疾病、病症或病况的方法，该方法包括根据权利要求43所述鉴定从受试者获得的生物样品中的微生物，以及基于对微生物的鉴定来诊断受试者的疾病或病况的步骤。
47.治疗疾病、病症或病况的方法，该方法包括根据权利要求45所述的方法诊断疾病、病症或病况，以及基于诊断来治疗疾病或病况的步骤。
48.抑制、控制或杀死微生物的方法，该方法包括使根据权利要求1-27中任一项所述的构建体与微生物接触，从而抑制、控制或杀死微生物的步骤。
49.用于治疗或预防受试者的疾病、病症或病况的组合物，该组合物包含根据权利要求1-27中任一项所述的构建体。
50.治疗或预防受试者的疾病、病症或病况的方法，该方法包括给受试者施用有效量的根据权利要求1-27中任一项所述的构建体或根据权利要求48所述的组合物，从而治疗或预防受试者的疾病、病症或病况的步骤。
51.根据权利要求1-27中任一项所述的构建体在制备用于治疗或预防受试者的疾病、病症或病况的组合物中的用途。
52.增加糖肽抗生素的活性或功效的方法，该方法包括将糖肽抗生素连接至接头的步骤，任选地包括通过接头将糖肽抗生素连接至纳米颗粒的其他步骤。
53.根据权利要求51所述的方法，其中接头包含PEG3或C8。
54.化合物，其包含与接头结合的任选衍生化的糖肽抗生素，其中接头包含：(i)包含至少PEG3的PEG部分、或(ii)包含至少四个碳的线性碳链。
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WO (1) WO2018102889A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112798778A (zh) * 2021-03-17 2021-05-14 广州敏捷生物技术有限公司 同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的免疫荧光层析检测卡及方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220029317A (ko) * 2020-08-31 2022-03-08 영남대학교 산학협력단 마스크

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013187954A1 (en) * 2012-06-12 2013-12-19 The General Hospital Corporation Magnetic labeling of bacteria
WO2014151885A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Iris International, Inc. Conjugation of multiple vancomycin molecules on a polyvinyl alcohol backbone for the capture of microorganisms
WO2016041022A1 (en) * 2014-09-19 2016-03-24 The University Of Queensland Sensor scaffold

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6518242B1 (en) * 1998-02-20 2003-02-11 Theravance, Inc. Derivatives of glycopeptide antibacterial agents
WO2001081373A2 (en) * 2000-04-25 2001-11-01 Merck & Co., Inc. Glycopeptide antibacterial compounds and methods of using same
US20060105941A1 (en) * 2004-11-12 2006-05-18 Allergan, Inc. Mixed antibiotic codrugs
GB2449156B8 (en) * 2007-05-08 2010-06-02 Lead Therapeutics Inc Semi-synthetic glycopeptides with antibacterial activity.
CN106132980A (zh) * 2014-01-28 2016-11-16 中央研究院 肽可霉素类似物及其用途
GB201402267D0 (en) * 2014-02-10 2014-03-26 Cambridge Entpr Ltd Antibacterial agents
WO2017161296A1 (en) * 2016-03-17 2017-09-21 Northwestern University Antibiotic-coated nanoparticles
JP7084320B2 (ja) * 2016-06-15 2022-06-14 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 生体直交型反応を用いた生体材料の代謝標識及び分子増強

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013187954A1 (en) * 2012-06-12 2013-12-19 The General Hospital Corporation Magnetic labeling of bacteria
WO2014151885A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Iris International, Inc. Conjugation of multiple vancomycin molecules on a polyvinyl alcohol backbone for the capture of microorganisms
WO2016041022A1 (en) * 2014-09-19 2016-03-24 The University Of Queensland Sensor scaffold

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARNOLD J KELL等: "Vancomycin-modified nanoparticles for efficient targeting and preconcentration of Gram-positive and Gram-negative bacteria", 《ACS NANO》 *
ZHU M.等: "Construction of Fe3O4/Vancomycin/PEG Magnetic Nanocarrier for Highly Efficient Pathogen Enrichment and Gene Sensing", 《ACS APPL MATER INTERFACES》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112798778A (zh) * 2021-03-17 2021-05-14 广州敏捷生物技术有限公司 同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的免疫荧光层析检测卡及方法

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