CN110305900A - 一种稳定表达vp1融合egfp的单克隆细胞株的制备方法 - Google Patents

一种稳定表达vp1融合egfp的单克隆细胞株的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种稳定表达VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法，属于疫苗技术领域。本发明解决技术问题的技术方案包括以下步骤：培养细胞PK15、G418的适用浓度应为500μg/mL、将LipofectamineTM2000与pEGFP‑N1‑VP1质粒以1:1的比例转染至PK15细胞、G418筛选、弱酸洗脱得到SLA‑I类呈递肽。

Description

一种稳定表达VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种稳定表达VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法。
背景技术
口蹄疫(FMD)是一种高度传染性、毁灭性的家畜传染病。以前，口蹄疫在非洲、南美和亚洲地区广泛传播，导致牲畜产量显著下降，对畜牧业造成严重的经济影响。目前，口蹄疫每年都在养猪业蔓延，对猪养殖业造成了严重的影响。根据血清学试验，FMDV一共可分为7种血清型：A、O、C(欧洲类型)；Asia 1(亚洲1类型)；SAT1,SAT2和SAT3(南非类型)。FMDV由60个颗粒组成，每个颗粒主要由4个衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成。FMDV结构蛋白VP1是主要的抗原片段，在诱导动物免疫方面起着至关重要的作用。因此，研究FMDV结构蛋白VP1对于开发疫苗具有重要意义。
目前，在口蹄疫流行地区用来防治口蹄疫的措施是注射传统的口蹄疫灭活疫苗，这些灭活疫苗是通过将活的病毒经过化学方法灭活的，可能存在化合物残留及灭活不彻底的现象。以前也曾使用过传统的减毒活疫苗，但后来人们发现它具有严重的生物安全风险，有时FMD可以在接种期间发生毒力增强的现象。另外，通过血清学检查很难区分动物是否属于病毒感染还是接种疫苗。因此，在一些西欧国家，口蹄疫的灭活和减毒疫苗都禁止使用。目前，研究人员已经在尝试一种新的疫苗来替代传统疫苗，这种疫苗由许多位于抗原免疫决定区的短肽组成，且不携带任何病毒基因，是一种安全性更高的多表位疫苗。病毒表位由B细胞表位、辅助性T细胞(Th)表位和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位组成。以前对FMDV抗原的研究主要集中在B细胞和Th表位的研究，而对CTL表位的研究较少。最近的研究表明,细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位与主要相容性复合体(MHC)I类重链的多肽结合槽结合，同时与轻链β2微球蛋白(β2m)以非共价键结合。研究表明，一旦这些表位被递呈到细胞表面，就会在体内引起细胞免疫，从而在抵抗口蹄疫病毒方面起重要作用。
为了筛选口蹄疫病毒VP1蛋白的CTL表位，人们已经尝试了多种措施，包括构建猪主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)I类分子，亦即猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)I类分子重链和轻链的共价复合体筛选口蹄疫病毒的抗原肽；以及将分别表达的重链、轻链和口蹄疫多肽进行复性的方法。然而，这些措施均属于在体外筛选SLA-I类分子结合的多肽，筛选的多肽不属于在体内经SLA-I类分子自然递呈的多肽，也就是说，这些方法筛选到CTL表位的效率较低。此前，研究人员曾尝试从人或小鼠MHC I类阳性表达细胞株表面采用温和酸洗脱法提取多肽，并且证明分离的抗原肽是由MHC I类分子自然表达的，属于功能性多肽，可以用于疫苗研制。迄今为止，还没有建立猪细胞系筛选和分离源自FMDV的抗原肽。
发明内容
针对上述不足，本发明提供一种VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法，该方法可以有效分离出自然递呈抗原肽。
本发明解决技术问题采用的技术方案包括以下步骤：
(1)培养细胞PK15；
(2)配制浓度为500μg/mL的G418溶液；
(3)确定LipofectamineTM2000与pEGFP-N1-VP1质粒以1:1的比例转染至PK15细胞；
(4)G418筛选；
(5)弱酸洗脱得到SLA-I类呈递肽。
有益效果：
现技术的优点是发明了一种在细胞水平上直接分离和鉴定口蹄疫病毒自然递呈的细胞表位的方法，相比较于体外结合方法筛选细胞表位，该方法获得的病毒表位在细胞内经过了与SLA-I类分子结合、细胞自然递呈等作用，保持了细胞表位的天然活性，可作为口蹄疫表位疫苗及抗原递呈研究的候选成分。另外，本发明相比较于体外结合方法筛选表位，在细胞水平上操作更方便、快捷，获得表位多，效率高。
附图说明
图1为实施例1步骤2中G418致死浓度曲线图。
图2为实施例1步骤3中PK15细胞转染效率图。
图3为实施例1步骤4中pEGFP-N1-VP1转染后不同时间段转染图。
图4为实施例1步骤4中稳定转染细胞中绿色荧光蛋白的表达图。
图5为实施例1步骤5中验证VP1基因表达的电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
各原料来源说明：质粒pEGFP-N1-VP1(瞬时表达载体)由中国农业大学惠赠。PK15细胞系购自中国兽医微生物培养物收集中心(CVCC)。DMEM和胎牛血清购自Gibco公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG单克隆抗体，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自生工生物(上海)有限公司。逆转录试剂盒，T4DNA Ligase和Taq聚合酶购自宝生物(大连)生物有限公司。LipofectamineTM 2000购自美国的Invitrogen Corporation。G418购自美国的Sigma公司。鼠抗GFP单克隆抗体购自Beyotime公司。乙腈(HPLC级)购自Kermel公司。超敏发光液购自北京的索莱宝公司。设计一对引物以检测VP1基因表达，包括上游引物VP1-F，5'-ACCACCTCCACAGGTGAGTCG-3'和下游引物VP1-R，5'-CAAAAGCTGTTTCACAGGCG-3'。引物由生工生物(上海)有限公司合成。
实施例1
(1)细胞培养。从液氮中取出细胞，在37℃，5％CO2条件下，使用含10％FBS的DMEM培养基培养12-18小时，直至细胞状态恢复，然后换液处理。细胞生长并铺满到整个培养瓶底部后，用0.25％胰蛋白酶在37℃下消化约5分钟。然后，将消化的细胞以每孔7-8×104个细胞接种至24孔板中，37℃，5％CO2培养24小时，至细胞密度达到70％-80％。
(2)G418致死浓度曲线测量。将4×105个PK15细胞接种至24孔板中，在37℃，5％CO2条件下培养。当细胞密度达到70％-80％时，将G418用DMEM培养基稀释，浓度梯度为0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000μg/mL，并添加到24孔板中在37℃，5％CO2培养箱进行作用，每个处理重复3次。每48小时，用含有梯度浓度G418的新鲜DMEM培养基换液处理。在7天内杀死所有细胞的最低G418浓度判定为筛选稳定转染外源质粒的最佳浓度。在通过一系列G418梯度浓度对PK15细胞进行致死测定7天时，绘制用于评估活细胞数和G418浓度之间关系的曲线，如图1所示。结果显示当G418浓度达到500μg/mL时，细胞全部被杀死。因此，用于筛选稳定转染子的G418的适用浓度应为500μg/mL。
(3)PK15细胞转染效率测定。将4×105个PK15细胞接种到24孔板中，在37℃，5％CO2下培养。当24孔板中PK15细胞的密度达到每孔70％-80％时进行转染实验，将LipofectamineTM2000与pEGFP-N1-VP1质粒以1:1-1:3的比例转染至PK15细胞，每个比例重复三次，然后通过流式细胞术检测转染效率。同时，以没有加任何脂质体和质粒的PK15细胞作为对照。如图2，流式细胞术测定PK15细胞的转染效率。(A)对于未加任何转染子的PK15对照细胞的一个代表性的检测结果，在X轴上的0代表未加任何转染子，0.5代表对照背景值。(B–D)分别代表当脂质体与重组质粒的比例为1:1，1:2和1:3时代表性的转染效率检测结果，分别为13.5％,9.83％和7.45％。(E)统计学分析不同脂质体和重组质粒转染比例转染PK15细胞后的结果，**,p<0.01。
(4)PK15细胞转染和G418筛选。将4×105个PK15细胞接种到24孔板中，在37℃，5％CO2条件下培养。当转染的PK15细胞的密度达到每孔70％-80％时，将脂质体和质粒LipofectamineTM2000/pEGFP-N1-VP1以1:1的比例转染到细胞中。转染24小时后，用PBS洗涤转染的细胞两次，然后加入10％FBS，500μg/mL G418的DMEM培养基进行细胞杀伤，以后每48小时更换一次新的培养基。7天后，观察细胞孔中是否有发出清晰绿色荧光的细胞团，标记细胞团的位置，用微量移液管轻轻吸取2μL的0.25％胰蛋白酶消化标记位置的细胞，并将其移至新的96孔板中培养。使用荧光倒置显微镜观察96孔板中的细胞，直到可以清楚地看到它们数量增加且铺满培养皿底部。将96孔板中的细胞转移到24孔板中，并用含有10％FBS，500μg/mL G418的培养基维持细胞生长。在细胞生长至完全覆盖孔后，将它们转移到6孔板中并用含有10％FBS，500μg/mL G418的培养基培养，然后转移至直径为6cm培养皿。最后，细胞转移到10cm培养皿中继续培养，将部分细胞储存在-80℃冰箱保存。在转染后的3,6,12,24,48,72,168,336和480小时，用一部分转染细胞进行检测，以评估转染的PK15细胞的转染和筛选效果。简而言之，将转染的细胞用4％多聚甲醛固定，在室温下孵育30分钟，PBS洗涤三次。用终浓度为0.2％的Triton X-100将细胞透膜10分钟，PBS洗涤三次。使用终浓度为1μg/mL的4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核10分钟，PBS洗涤三次。通过ImageXpress MicroXLS宽场高内涵分析系统(美谷分子，美国)在20倍物镜下观察细胞，并使用DAPI和FITC通道拍照，通过Thermo ScientificTM HCS StudioTM 2.0分析数据。
(5)鉴定pEGFP-N1-VP1/PK15细胞中VP1基因的稳定表达。为了确认靶质粒是否成功转染到PK15细胞中并鉴定pEGFP-N1-VP1基因在细胞中的表达，使用TRizol Reagents试剂盒(Invitrogen Inc.美国)按照文献提供的方法提取转染细胞总RNA，将样品保存在-80°备用。根据制造商的推荐，使用禽成纤维细胞病毒(AMV)逆转录酶(TaKaRa，日本)和oligo(dT)引物将提取的总RNA逆转录为cDNA。以1μg的cDNA作为模板，利用VP1-F/VP1-R引物对扩增VP1基因。PCR反应如下：94℃，5min预变性；94℃30s，56℃45s，72℃1min，30个循环；最后，72℃，10min终止反应，将PCR产物储存在-20℃用于基因克隆。通过胶回收试剂盒回收PCR产物并连接至pMD 18-T载体，然后测序。
为了鉴定pEGFP-N1-VP1/PK15细胞中VP1蛋白的表达，收集2×106个稳定转染的细胞，通过RIPA裂解缓冲液提取细胞内蛋白质。然后用BCA方法测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE测定20μg变性蛋白质样品，然后转移至0.45μmPVDF膜。将膜在室温下用含有5％BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)封闭1小时，VP1抗体(1:1000，鼠源，由中国农业大学惠赠)和内参的GAPDH小鼠单克隆抗体(Proteintech，美国芝加哥)在4℃孵育，孵育完成后用含有0.3％吐温20的TBS洗涤三次，每次10分钟。将膜在室温下用山羊抗小鼠IgG单克隆抗体(1:5000)标记的辣根过氧化物酶(HRP)孵育1小时，最后用超敏显色液(Solarbia，北京)对PVDF膜进行显色处理。
(6)通过LC-MS/MS检测用弱酸洗脱的SLA-I类递呈肽。将pEGFP-N1-VP1/PK15细胞在含有10％FBS，300μg/mL G418，37℃，5％CO2的DMEM培养基中培养至对数期，然后收集1×108个细胞并以1500rpm在室温下离心5分钟，用PBS洗涤细胞两次，离心。然后根据Storkus等报道的方法，用磷酸盐缓冲液(0.131mol/L柠檬酸，Na2HPO4 0.066mol/L，pH3.3)在室温下洗脱细胞30秒。将洗脱混合物以1500rpm离心5分钟以除去细胞及碎片。通过Amicon Ultra-15蛋白离心过滤器(3000)将洗脱样品在4500×g下离心5分钟以除去蛋白质或其他大分子的大片段。根据文献报道并稍微修改，使用Stage-tip C18(EmporeTM Octadecyl C18,47mmExtraction Disks，PA，USA)将滤液脱盐处理。首先，在Stage-tip C18的膜上加入100μL乙腈，500×g离心，直至乙腈完全流过膜。将C18柱用100μL的0.1％TFA/H2O平衡，然后以500×g离心直至溶液完全流过膜，重复三次。将柱子转移到新的2mL EP管中，然后将肽样品上样到膜上，在室温下培养5分钟，然后以500×g离心，直到样品全部流过。将滤液重新加载到膜上再次重复过滤。如上所述，将柱用100μL的0.1％TFA/H2O洗涤三次，同时以500×g离心三次。将柱子转移到另一个新的2mL EP管中。使用100μL含有0.1％TFA和50％乙腈的洗脱缓冲液洗脱吸附到膜上的肽样品，同时以400×g离心直至缓冲液完全流过，洗脱重复两次。将两个洗脱液合并收集到500μL EP管中，在Speedvac浓缩器(ZLS-2Origin：中国湖南)中冻干。
将冻干的肽用20μL的0.1％甲酸/水溶液溶解，将4μL样品注入C18(3μm，75μm×15cm)中，并在高效液相色谱仪(HPLC，Thermo ScientificTM Easy nLC 1200，美国)中通过色谱梯度分离90分钟，其余为平衡移动A相0.1％甲酸水溶液和0.1％甲酸移动B相，80％乙腈/H2O，流速350nL/min。通过Orbitrap Fusion Lumos超高分辨率质谱仪(ThermoScientific Orbitrap Fusion Lumos，USA)检测质谱数据，具有以下参数：喷雾电压，2.0kV；毛细管温度，320℃；RF镜头，40。对于主要MS数据，分辨率设置为120,000@m/z 200，而对于MS/MS数据，分辨率设置为30,000@m/z 200。母离子m/z扫描范围为350至1550，而子离子m/z扫描从110开始。离子筛选窗口设定为1.6m/z。碎片模式设置为HCD。能量选择NCE32。数据搜库首先将数据相关的MS/MS设置为前20，然后人工分析。动态排除时间设置为60秒。数据由Proteome Discoverer 2.1(Thermo Fisher，MA，USA)分析。
各步骤检测结果如下：
由于pEGFP-N1质粒将外源基因与EGFP融合表达，因此通过检测EGFP表达的荧光可间接判断VP1的表达情况。使用ImageXpress Micro XLS Widefield High-ContentAnalysis System检测，结果发现脂质体与重组质粒转染比例为1:1的pEGFP-N1-VP1成功转染到PK15细胞中，在不同时间段，呈现不同程度荧光，如图3所示。在G418浓度为500μg/mL条件下筛选，发现在转染后3h在PK15细胞中可检测到绿色荧光，但在6h内不再增殖，表明在此期间许多瞬时表达的细胞被杀死。从12h开始，呈现绿色荧光细胞的数量逐渐增多，并且荧光变得越来越强(3A-F和a-f)。在第7天(168小时)，出现聚集的、呈绿色荧光的细胞团(图3G和g)。然后，将标记的细胞团转移到96孔板中，用含有500μg/mL G418的DMEM培养基进行进一步的杀伤筛选。10天后，选择仍显示稳定绿色荧光的孔作为阳性细胞，在与上述相同的条件下，从96孔到24孔扩大培养阳性细胞，接着是6孔板，6cm培养皿和10cm培养皿。结果显示，在第14天(336小时)，超过90％的细胞发出荧光(图3H和h)。继续筛选和培养，转染后第20天(480小时)，显示接近100％转染的细胞均发出绿色荧光，表明所有的PK15转染细胞表达VP1融合的EGFP蛋白，也说明稳定表达VP1的EGFP-N1-VP1/PK15细胞构建成功(图4)。
图3为检测pEGFP-N1-VP1转染后不同时间段的转染结果。(A–G)通过ImageXpressMicro XLS Widefield High-Content Analysis System检测转染的PK15细胞中VP1融合EGFP蛋白的表达，阳性细胞发出亮绿色的荧光。检测的时间段分别在转染后3,6,12,24,48,72,和168小时。(a–g)对应于图A-H，经4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染定位后同时检测细胞表达的绿色荧光。阴性细胞细胞核染成蓝色，而表达VP1融合EGFP蛋白的阳性细胞质染成深绿色，细胞核染成青色。(H)从一个发绿色荧光的细胞团开始扩大培养到336小时进行的与(A–G)类似的检测。(h)对应于图(H)，进行的与(a–g)类似的检测。
图4为转染后480小时在稳定转染的pEGFP-N1-VP1/PK15细胞中检测VP1融合EGFP蛋白的表达。(B)相应于A图，检测细胞经DAPI核染后的情况。(C)相应于(A)和(B)图，同时检测细胞质绿色荧光蛋白的表达和细胞核染色情况。阴性细胞只有细胞核被染成蓝色，而EGFP-VP1表达的阳性细胞细胞质被染成深绿色，而细胞被染成青色。
为了鉴定VP1在pEGFP-N1-VP1/PK15细胞中是否在mRNA水平稳定表达，RT-PCR用以检测VP1的转录产物。结果显示，特异性扩增片段约为600bp，这与在pEGFP-N1-VP1/PK15细胞中稳定转录的VP1长度的理论值639一致(图5A)。通过胶回收试剂盒回收PCR产物，连接到pMD 18-T载体中，然后转移至TOP10感受态细胞。选择阳性克隆进行测序，结果显示，VP1克隆的序列与pEGFP-N1-VP1质粒中的VP1序列完全一致。以抗VP1单克隆抗体经Western-blotting检测VP1融合蛋白的表达，结果显示VP1融合蛋白在转染的PK15细胞系中稳定表达，大小约50kDa，根据EGFP蛋白28.0kDa和VP1蛋白23.1kDa大小，可计算出融合蛋白大小为51.1kDa，理论值与实际值一致。而对照PK15细胞和转染空载体pEGFP-N1的PK15没有表达VP1融合蛋白。如图5B所示。
通过高效液相色谱仪和Orbitrap Fusion Lumos超高分辨率质谱仪检测洗脱的肽样品。Proteome Discoverer 2.1分析了主要数据。在自主构建的O-VP1.fasta数据库中搜索肽，通过PSM验证器筛选，筛选标准使用Medium。经过分析，至少有37条来自O-VP1.fasta的8-11个氨基酸的多肽被鉴定，这些多肽恰好符合SLA-I类分子多肽结合槽容纳8-11个氨基酸的大小，见表1所示。大多数多肽在递呈后被修饰，例如氧化或脱酰胺。具有XCorrSequest HT值(肽的丰度值)超过1的肽有12条。
表1.LS–MS/MS测定pEGFP-N1-VP1/PK15细胞系洗脱的多肽
注：*代表多肽经过了脱氨基、氧化等修饰；a表示多肽的丰度值；b表示两个序列相同的多肽经过了不同的修饰，分子量不同。
如今，多表位疫苗因其抵抗不同血清型病毒的安全性和有效性，可能成为传统口蹄疫灭活疫苗或减毒活疫苗的替代之一。设计口蹄疫多表位疫苗，其关键任务是鉴定新的表位，尤其是CTL表位。此前，人们认为FMDV感染引起细胞免疫不明显，尤其是CD8+T淋巴细胞免疫。事实上，许多研究者开始研究CTL表位，这些表位可诱导CD8+T淋巴细胞为主的细胞免疫。设计CTL表位通常是通过计算机预测工具，然而，计算机预测不能准确模拟体内抗原加工机制。
本研究成功构建了一个转染VP1基因的PK15细胞系，稳定表达O型口蹄疫病毒VP1基因，并进一步采用RT-PCR，Western-Blotting检测证实融合EGFP的VP1基因在PK15细胞中稳定表达。由于VP1与EGFP融合表达，所以稳定表达VP1基因的细胞同时表达EGFP，通过ImageXpress Micro XLS Widefield高内涵分析系统检测阳性细胞发出绿色荧光。按照抗原递呈的机理，作为内源性抗原表达的VP1蛋白经蛋白酶体消化后可加工成多肽，一些肽将被转运至内质网与MHC I类分子的重链结合，重链同时与轻链(β2m)以非共价结合，三者形成复合体。该复合体在高尔基体中重折叠，然后被递呈到细胞膜表面以结合CD8+T淋巴细胞诱导细胞免疫。如果将与MHC I类分子结合的肽洗脱并分离提取，即可鉴定出细胞自然递呈的CTL表位。在本研究中，关键工作是筛选稳定表达VP1的PK15阳性细胞株。经过长时间的筛选，发现当G418的浓度为500μg/mL，且脂质体与质粒的比例为1:1时，可筛选并分离出稳定表达融合EGFP的VP1基因的PK15细胞系，再经逐渐扩大培养获得。然而，当建立起稳定表达绿色荧光的细胞系后，随后的细胞培养G418的浓度变为300μg/mL，这样可以保证与EGFP基因融合的VP1在PK15细胞中稳定表达。
为了鉴定与EGFP基因融合的VP1是否稳定表达，我们通过RT-PCR和Western-blotting试验，成功证明与EGFP基因融合的VP1在核酸和蛋白水平均得到了表达。上述结果表明，我们成功构建了一个稳定表达O型口蹄疫病毒VP1基因的细胞系，该细胞株可以像之前报道的那样，用于肽段洗脱。然而，到目前为止，所有与酸洗脱的抗原肽相关的报道都是在人或鼠细胞系中进行的，而没有猪的相应细胞系，如PK15用于研究与猪源病毒相关的抗原肽递呈和肽洗脱。在本研究中，采用温和的酸洗脱方法，我们通过LC-MS/MS从构建的、稳定表达VP1的pEGFP-N1-VP1/PK15细胞系表面测定出了37个洗脱多肽，并均属于8-11个氨基酸范围的多肽，其中12个XCorr Sequest HT(丰度值)超过1应该是由SLA-I类分子结合并递呈的较优势抗原肽，如表1所示。因为SLA-I类分子的肽结合槽大多可以容纳8-11个氨基酸，所以与本试验中洗脱肽的长度一致。而且，这些结果表明来自于VP1蛋白的洗脱肽能够被加工、组装并被SLA-I分子递呈到pEGFP-N1-VP1/PK15细胞表面。因此，根据文献报道，本实验洗脱得到的肽应当是SLA-I类分子限制的CTL表位。本实验还证明构建的pEGFP-N1-VP1/PK15细胞系可用于筛选和研究体内SLA-I类分子限制性的自然递呈的CTL表位。
综上所述，我们构建了一种能够在PK15细胞中稳定表达VP1重组质粒的细胞系，可用于研究抗原肽的递呈和洗脱分离，并进一步鉴定与SLA-I类分子匹配的功能性CTL表位。该研究将为筛选CTL表位和研制口蹄疫多表位疫苗奠定基础。
上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。

Claims (4)

1.一种稳定表达VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1.培养细胞PK15；
S2.调节G418的浓度；
S3.将LipofectamineTM2000与pEGFP-N1-VP1质粒转染至PK15细胞；
S4.G418筛选；
S5.弱酸洗脱得到SLA I类呈递肽。
2.根据权利要求1所述的一种稳定表达VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法，其特征在于，步骤S2中G418的适用浓度应为500μg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种稳定表达VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法，其特征在于，步骤S3中LipofectamineTM2000与pEGFP-N1-VP1质粒以1:1的比例转染至PK15细胞。
4.根据权利要求1所述的一种稳定表达VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法，其特征在于，步骤S5得到的呈递肽为37条，氨基酸序列如下：VGALLRTA、KDQINVLDLM*、QINVLDLMQ、QINVLDLMQ*、EVAVKHEGNL*、VLTQKAARTLP、QINVLDLMQTP*b、LRTATYYFA、NVLDLMQTPA*、LTQKAARTL*、QINVLDLMQTP*b、PNGAPEAAL、KVTPKDQIN*、VAVKHEGNLT*、INVLDLMQTP、KDQINVLDLM*、QINVLDLMQT*、VTNPRGDL*、RGDLQVLTQ*、PNGAPEAAL*、LTWVPNGAPE、QKAARTLP*NLTWVPNGA、TPKDQINVLD*、GDLQVLTQ、ENYGGETQVQ、QINVLDLMQ*PRGDLQVLTQ、KAARTLPTSFN、INVLDLMQTP、INVLDLMQTP*、LQVLTQKA*、KAARTLPTSF、IKATRVTE、INVLDLMQ*、TQVQRRQH*、RGDLQVLTQ*。
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