CN110305864A - 一种用于干扰DNALI1基因表达的siRNA及其在抑制细胞增殖和迁移中的应用 - Google Patents

一种用于干扰DNALI1基因表达的siRNA及其在抑制细胞增殖和迁移中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于干扰DNALI1基因表达的siRNA及其在抑制细胞增殖和迁移中的应用。本发明通过设计合成靶向抑制DNALI1基因表达的三对siRNA，它们分别为DNALI1‑siRNA‑66、DNALI1‑siRNA‑426和DNALI1‑siRNA‑777，并成功构建了它们在HEK‑293细胞内的表达载体。本发明所提供的siRNA进入到细胞时，可以有效、特异地干扰DNALI1基因的表达，从而有效地抑制细胞的增殖和迁移。本发明填补了目前没有针对干扰DNALI1基因表达的siRNA序列的空白，且该siRNA能对靶基因DNALI1的表达进行有效干扰，从而达到治疗或预防由DNALI1基因表达可能引起的疾病的作用，并为研究DNALI1基因在细胞增殖和迁移中的作用机制和未来的应用研究奠定了基础。

Description

一种用于干扰DNALI1基因表达的siRNA及其在抑制细胞增殖 和迁移中的应用
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种用于干扰DNALI1基因表达的siRNA及其在抑制细胞增殖和迁移中的应用。
背景技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA介导的同源靶基因转录后沉默的过程，它可以通过人为的引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA，诱导内源靶基因mRNA降解，从而达到减少基因表达的目的。RNAi现象也是一种在进化上保守抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。虽然RNAi技术的研究时间比较短，但它作为一种新兴的基因阻断技术，具有特异性高、干扰效率高、操作简单等优点，并被广泛应用于病毒感染、癌症、显性遗传病等医学研究中，还可以高通量地筛选药物靶基因，促进基因治疗、新药开发等，所以小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)也被称作是“治病药物”。近年来，科学家利用RNAi技术，选择特异性的靶基因合成有效的siRNA，并通过转染将siRNA转导至特定的细胞内，使其在宿主细胞中高效作用，沉默相关基因的表达，该种手段可以从基因组水平分析哺乳动物体内基因的功能，还可以更迅速地鉴定出许多与疾病相关的基因，使我们可以更好地研究生物体内基因调控的网络系统。因此RNAi技术已经成为了研究基因功能最有效的手段，也成为了靶向基因治疗最具吸引力的方法。目前siRNA在哺乳动物细胞、器官及活体的病变中的治愈功能，预示着不久的将来，RNAi也会广泛用于人类疾病的治疗，所以有关siRNA的研究与应用具有极其重要的理论和实际意义，将对医学生物学的发展产生深远的影响。
细胞的增殖、迁移和侵袭是多因素参与、多步骤完成的分子生物学变化过程。某些具有很强的迁移能力的细胞会使得其自身能克服细胞之间以及细胞和基质间的粘附作用而侵入周围组织；侵袭性强的细胞通常也会通过很多细胞突触来减弱细胞间粘附作用以及切断细胞间的通讯连接等。因此，关于细胞增殖、迁移和侵袭的研究对疾病、细胞应用等具有非常重要的意义。
DNALI1基因位于4号染色体上，由6个外显子组成，它主要在睾丸内表达，但迄今为止，对该基因的研究很少，因此该基因的作用功能还不十分清楚。有研究发现DNALI1基因可能在鞭毛运动中起到动态作用，其表达也可能与肝细胞癌术后复发相关，也有研究者发现在不同的小鼠组织(纤毛和骨骼肌)中观察到较低水平的DNALI1转录物。但至现在，还没有针对干扰DNALI1基因表达的siRNA序列以及相关研究或专利的公开。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于干扰DNALI1基因表达的siRNA及其在抑制细胞增殖和迁移中的应用。本发明通过设计合成靶向抑制DNALI1基因表达的三对siRNA，并成功构建了它们在HEK-293细胞内的表达载体，同时运用这些siRNA可以有效、特异地干扰DNALI1的表达，从而能够有效的抑制细胞的增殖和迁移。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供的一种用于干扰DNALI1基因表达的DNALI1-siRNA-66，所述用于干扰DNALI1基因表达的DNALI1-siRNA-66的核苷酸序列为：
正义链：5’-CCGCAGACTCTTTGCTCAATT-3’，
反义链：5’-TTGAGCAAAGAGTCTGCGGTT-3’。
本发明提供的一种用于干扰DNALI1基因表达的DNALI1-siRNA-426，所述用于干扰DNALI1基因表达的DNALI1-siRNA-426的核苷酸序列为：
正义链：5’-GCAGGGAACTCTACTCACATT-3’，
反义链：5’-TGTGAGTAGAGTTCCCTGCTT-3’。
本发明提供的一种用于干扰DNALI1基因表达的DNALI1-siRNA-777，所述用于干扰DNALI1基因表达的DNALI1-siRNA-777的核苷酸序列为：
正义链：5’-GAACAAATCAGCAGCTGAATT-3’，
反义链：5’-TTCAGCTGCTGATTTGTTCTT-3’。
本发明还提供了所述的用于干扰DNALI1基因表达的siRNA在用于制备抑制细胞增殖和迁移的制剂中的应用。
进一步的，所述应用包括以下操作步骤：
(1)将所述DNALI1-siRNA-66、DNALI1-siRNA-426或DNALI1-siRNA-777转染进细胞后裂解获取总RNA；
(2)以步骤(1)中的总RNA为模板反转录合成第一链cDNA；
(3)以步骤(2)中的cDNA为模板进行RT-PCR检测DNALI1-siRNA对DNALI1表达的抑制效率；
(4)将步骤(3)中的抑制效率最高的DNALI1-siRNA转染进细胞，制备抑制细胞增殖和迁移的制剂。
进一步的，所述步骤(1)中DNALI1-siRNA的浓度为20pmol。
进一步的，所述步骤(2)中总RNA的用量为10ng-2μg
进一步的，所述步骤(3)中RT-PCR反应体系为20μl，包括：cDNA模板20-100ng，正向引物1μl，反向引物1μl，SuperReal PreMix Plus 10μl，RNase-free ddH2O补足到20μl。
进一步的，所述步骤(3)中RT-PCR反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
(1)本发明通过设计合成靶向DNALI1表达的三对siRNA，它们可以有效、特异地干扰DNALI1的表达，填补了目前没有干扰DNALI1基因表达的siRNA序列的空白；
(2)本发明在细胞水平通过RNA干扰特异性抑制DNALI1基因来抑制细胞的增殖和迁移，从而可以抑制、减轻或预防由DNALI1基因可能引发的疾病，也为研究DNALI1基因在细胞增殖和迁移中的作用机制和未来的应用研究奠定了基础。
附图说明
图1为本发明不同DNALI1-siRNA转染组细胞中DNALI1基因表达情况的比较。
图2为本发明不同DNALI1-siRNA转染组细胞中siRNA干扰DNALI1基因表达的24小时效果比较。
图3为本发明不同DNALI1-siRNA转染组细胞中siRNA干扰DNALI1基因表达的48小时效果比较。
图4为本发明不同DNALI1-siRNA转染组中细胞增殖能力情况的比较。
图5为本发明不同DNALI1-siRNA转染组中细胞迁移能力情况的比较。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1：干扰RNA(siRNA)靶序列的设计合成
从GenBank上获得DNALI1基因序列，按照siRNA设计原则，针对DNALI1基因序列保守区域筛选设计并合成3条干扰靶序列，分别命名为DNALI1-siRNA-66、DNALI1-siRNA-426、DNALI1-siRNA-777，同时设计不针对任何基因无意义序列做为阴性对照(siFAM)，序列如表1所示。
表1 siRNA序列设计及合成
实施例2：细胞培养和转染
HEK-293细胞用含有FBS和抗生素的DMEM细胞培养基，于37℃条件下在含5％CO2的恒温培养箱中培养，待细胞生长速度达到70-90％时，用0.25％胰蛋白酶消化传代。转染前一天，按4-5×104个/孔将细胞接种在24孔板上，每孔加入0.5ml DMEM培养基。转染时，在50μl的无血清DMEM培养基加入20pmol的DNALI1-siRNA，柔和混匀；同时用50μl无血清DMEM培养基稀释1μl的Lipofectamin 2000试剂，轻轻混匀后室温放置5min。然后将稀释好的DNALI1-siRNAs和转染试剂混合后轻柔混匀，室温放置20min，以便形成siRNA/Lipofectamin 2000复合物。将100μl的复合物加到含有细胞的24孔板中，来回轻柔摇晃细胞培养板，细胞在含5％CO2恒温培养箱中37℃温育24h-48h后，收集细胞进行转染后的其它检测。如果细胞株比较敏感，则在孵育4h-6h后，除去复合物并更换培养基。
实施例3：siRNA的抑制效率检测
(1)总RNA提取
直接在培养板中加入1ml/孔TRNzol试剂裂解细胞，用取样器吹打几次，将匀浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。每使用1ml的TRNzol加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min后，放置在4℃离心机中使用12,000rpm离心10-15min，此时样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(约600μl)转移到新的离心管中。在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30min后4℃12,000rpm离心10min，去上清。加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀，并于4℃5,000rpm离心3min，去上清。将沉淀室温放置晾干后，加入30-100μl RNase-Free ddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。
(2)反转录合成第一链cDNA
将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RTBuffer和RNase-Free ddH2O分别在室温解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。按照表2的基因组DNA去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃孵育3min，然后于冰上放置。
表2 gDNA去除反应体系
按照表3的反转录反应体系配制混合液。将反转录反应中的混合液加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。于42℃孵育15min后，再于95℃孵育3min之后得到cDNA，并放于低温保存。
表3反转录反应体系
(3)荧光定量PCR实验
按照表4的RT-PCR反应体系在冰上配置反应液，将所有试剂在室温下混合并彻底混匀。
表4 RT-PCR反应体系
将反应体系置于荧光定量PCR仪中，按照表5的RT-PCR反应程序进行设置，开始反应。
表5 RT-PCR反应程序
RT-PCR检测siRNA干扰DNALI1基因表达的效果结果如图1-3。结果显示与对照组相比较，三个DNALI1-siRNA转染组中24h和48h的DNALI1基因mRNA表达量均低于对照组，其中DNALI1-siRNA-66组在48h时DNALI1基因表达水平减少的最多，其次是DNALI1-siRNA-777，由此说明DNALI1-siRNA-66在48h对DNALI1基因的干扰效率最高，效果最好。
实施例4：细胞增殖实验
取转染DNALI1-siRNA-66完毕的细胞，在96孔板每孔中加100μl细胞悬液，其中设6个复孔，在含5％CO2的恒温培养箱中37℃培养过夜；培养1-7天后，每孔加10μl CCK8染液，在含5％CO2的恒温培养箱中37℃培养2h；用酶标仪检测450nm波长下每孔的吸光度值(OD450)；以吸光度值对时间(天数)作图，绘制细胞增殖曲线。
CCK-8检测细胞增殖的结果如图4所示，与对照组相比较，DNALI1表达沉默后细胞的增殖能力随着时间的推移逐渐地减弱，说明siRNA干扰DNALI1基因表达能够抑制细胞增殖能力。
实施例5：细胞迁移试验
选择siRNA有效干扰靶点DNALI1-siRNA-66转染细胞和对照组细胞进行培养，取对数期的转染DNALI1-siRNA的细胞，常规消化、离心弃上清后，加入无血清DMEM培养基重悬细胞，制备单细胞悬液，将密度调整为5×105个细胞/ml。向每个Transwell小室的上层中加入200μl细胞悬液，沿着下层内壁加入700μl含10％FBS的DMEM培养基，避免产生气泡，在含5％CO2的恒温培养箱中37℃孵育16h。取出Transwell小室，用棉签小心擦去小室滤膜上表面的细胞，再将小室放入甲醇中固定15min，用PBS清洗3次以去掉残留的甲醇，放入0.2％的结晶紫染液中染色20min，再用PBS清洗3次以去掉多余的染色液，然后放置在显微镜下观察拍照。
Transwell试验检测细胞迁移的结果如图5所示，与对照组相比较，siRNA干扰DNALI1基因表达后细胞的迁移能力减弱。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 山东省寄生虫病防治研究所
<120> 一种用于干扰DNALI1基因表达的siRNA及其在抑制细胞增殖和迁移中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgcagactc tttgctcaat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgagcaaag agtctgcggt t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcagggaact ctactcacat t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtgagtaga gttccctgct t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaacaaatca gcagctgaat t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttcagctgct gatttgttct t 21

Claims (9)

1.一种用于干扰DNALI1基因表达的DNALI1-siRNA-66，其特征在于，所述的用于干扰DNALI1基因表达的DNALI1-siRNA-66的核苷酸序列为：
正义链：5’-CCGCAGACTCTTTGCTCAATT-3’，
反义链：5’-TTGAGCAAAGAGTCTGCGGTT-3’。
2.一种用于干扰DNALI1基因表达的DNALI1-siRNA-426，其特征在于，所述的用于干扰DNALI1基因表达的DNALI1-siRNA-426的核苷酸序列为：
正义链：5’-GCAGGGAACTCTACTCACATT-3’，
反义链：5’-TGTGAGTAGAGTTCCCTGCTT-3’。
3.一种用于干扰DNALI1基因表达的DNALI1-siRNA-777，其特征在于，所述的用于干扰DNALI1基因表达的DNALI1-siRNA-777的核苷酸序列为：
正义链：5’-GAACAAATCAGCAGCTGAATT-3’，
反义链：5’-TTCAGCTGCTGATTTGTTCTT-3’。
4.权利要求1-3中任一项所述的用于干扰DNALI1基因表达的siRNA在用于制备抑制细胞增殖和迁移的制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下操作步骤：
（1）将所述DNALI1-siRNA-66、DNALI1-siRNA-426或DNALI1-siRNA-777转染进细胞后裂解获取总RNA；
（2）以步骤（1）中的总RNA为模板反转录合成第一链cDNA；
（3）以步骤（2）中的cDNA为模板进行RT-PCR检测DNALI1-siRNA对DNALI1表达的抑制效率；
（4）将步骤（3）中的抑制效率最高的DNALI1-siRNA转染进细胞，制备抑制细胞增殖和迁移的制剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中DNALI1-siRNA的浓度为20pmol。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中总RNA的用量为10 ng-2 μg。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中RT-PCR反应体系为20 μl，包括：cDNA模板20-100 ng，正向引物1μl，反向引物1μl，SuperReal PreMix Plus 10 μl，RNase-free ddH2O补足到20 μl。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中RT-PCR反应程序为：95℃预变性15 min；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。
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