CN110302436A - 一种水凝胶血管微支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种水凝胶血管微支架及其制备方法，所述制备方法，包括以下步骤：a)将GelMA水凝胶和光引发剂的混合溶液进行3D打印，得到GelMA水凝胶片；b)将步骤a)得到的GelMA水凝胶片进行仿苹果皮自卷曲，得到水凝胶血管微支架。与现有技术相比，本发明提供的制备方法通过仿苹果皮自卷曲的方式构建水凝胶血管微支架，不同于以往的3D打印，可以构建更加精细的微型中空管(200μm以下)，并且本发明可以先构建不同形状大小的凝胶片，再得到相应形式的凝胶管，具有更高的精度和可控性；并且，采用本发明提供的制备方法得到的水凝胶血管微支架的细胞亲和性好、生物相容性好，且形式丰富，基本可以满足所有形式的血管支架的仿生需要，具有巨大的开发前景。

Description

一种水凝胶血管微支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及微血管支架技术领域，更具体地说，是涉及一种水凝胶血管微支架及其制备方法。
背景技术
复杂的血管网络对于组织的存活和修复至关重要，通过大血管到微型血管网，血液将养分和代谢产物不断地循环运输；否则便会导致一些棘手问题如皮瓣坏死、冠心病、骨坏死。在血管化的进程中，各种血管形成细胞例如内皮细胞迁移形成初级的毛细血管，进一步发育成微动脉和微静脉。基于此，很多研究都致力于通过功能细胞(e.g.,mesenchymalstem cells)、细胞因子(e.g.,VEGF)、药物(e.g.,aminoguanidine)等方式改善组织血供、加速组织再生、减少炎症反应。但效果往往不尽如人意，并且，在实际使用中也会存在下列一些问题：1)移植细胞在局部缺乏正常组织结构，存活率和分化率低；2)细胞因子局部分布不均匀，易破坏正常的组织结构；3)药物的释放和清除难以很好预测和控制；4)微血管从新生到成熟至少需要7天，微循环的改建需要一定时间。因此，如何更加可控地、定向地、快速地控制局部组织微血管化进程是研究的难点。
而在体外构建替代性的微型三维仿生血管支架给血管化的实践提供了新的着眼点。目前，构建三维中空管的方法主要有以下三种：1)通过减材制造的雕刻技术构建毫米级别的血管支架；2)通过纤维束编织构建微米级别人工管道；3)通过增材制造3D打印技术打印毫米管子。
但是，现有的方法精度难以使管径低于600μm，结构不能完全模拟中空管道，例如，骨结构中哈弗氏管(60～90μm diameter)，皮瓣微血管(20～500μm diameter)、眼底血管(20～200μm diameter)等都难以通过现有手段模拟重塑；同时工艺繁琐可控性不佳，因此限制了对微血管再生早期阶段的探索。因此，突破现有技术实现微血管的可控化构建非常重要，这也是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水凝胶血管微支架及其制备方法，本发明提供的制备方法通过仿苹果皮自卷曲的方式构建水凝胶血管微支架，具有更高的精度和可控性；制备得到的水凝胶血管微支架的细胞亲和性好、生物相容性好，且形式丰富，基本可以满足所有形式的血管支架的仿生需要，具有巨大的开发前景。
本发明提供了一种水凝胶血管微支架的制备方法，包括以下步骤：
a)将GelMA水凝胶和光引发剂的混合溶液进行3D打印，得到GelMA水凝胶片；
b)将步骤a)得到的GelMA水凝胶片进行仿苹果皮自卷曲，得到水凝胶血管微支架。
优选的，步骤a)中所述GelMA水凝胶的制备方法具体为：
将明胶溶于PBS中，50℃～90℃下持续加热搅拌，同时加入甲基丙烯酸酐进行反应；终止反应后，将得到的混合物倒入透析袋中，浸泡蒸馏水5d～10d，得到凝胶，再经冷冻干燥后使用。
优选的，步骤a)中所述光引发剂选自Irgacure 2959、4-苯基二苯甲酮和1-羟基-环己基-苯基甲酮中的一种或多种。
优选的，步骤a)中所述混合溶液中GelMA水凝胶的质量百分比为10％～15％，光引发剂的质量百分比为0.5％～1.5％。
优选的，步骤a)中所述3D打印的气动打印喷头为150μm～250μm，打印头温度为15℃～25℃，打印平台玻片温度为5℃～15℃，打印速度为5mm/s～15mm/s。
优选的，步骤b)中所述仿苹果皮自卷曲的过程具体为：
b1)将步骤a)得到的GelMA水凝胶片进行紫外光交联后干燥，再浸入水中从玻片上剥离后，自滚得到凝胶管；
b2)将步骤b1)得到的凝胶管再浸入水中，冻干后得到水凝胶血管微支架。
优选的，步骤b1)中所述紫外光交联的紫外光波长为360nm～370nm，时间为0.4min～0.6min。
优选的，步骤b1)中所述干燥的温度为20℃～30℃，时间为1s以内。
优选的，步骤b2)中所述再浸入水中的时间为1.5h～2.5h。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的制备方法得到的水凝胶血管微支架，所述水凝胶血管微支架的形式包括卷饼、双轴、分叉、环状吻合或三通。
本发明提供了一种水凝胶血管微支架及其制备方法，所述制备方法，包括以下步骤：a)将GelMA水凝胶和光引发剂的混合溶液进行3D打印，得到GelMA水凝胶片；b)将步骤a)得到的GelMA水凝胶片进行仿苹果皮自卷曲，得到水凝胶血管微支架。与现有技术相比，本发明提供的制备方法通过仿苹果皮自卷曲的方式构建水凝胶血管微支架，不同于以往的3D打印，可以构建更加精细的微型中空管(200μm以下)，并且由于不同形状大小的苹果皮卷曲结果不同，类似的，本发明可以先构建不同形状大小的凝胶片，再得到相应形式的凝胶管，具有更高的精度和可控性；并且，采用本发明提供的制备方法得到的水凝胶血管微支架的细胞亲和性好、生物相容性好，且形式丰富，基本可以满足所有形式的血管支架的仿生需要，具有巨大的开发前景。实验结果表明，采用本发明提供的制备方法能够构建直径更细的凝胶管(50μm～600μm)，并且其作为支架在体外构建出仿生的微血管，细胞存活和细胞功能完全不受影响，细胞亲和性好、生物相容性好。
附图说明
图1为苹果皮干燥卷曲的自然现象(过程)的示意图；
图2为凝胶薄片发生自发的卷曲变形的过程及实验结果验证的示意图；
图3为本发明提供的水凝胶血管微支架的整体制备过程的示意图；
图4为所述水凝胶血管微支架的卷曲结构的微观性质的示意图；
图5为本发明模拟具有相同几何形状的水凝胶复合材料薄片的形态变化过程的示意图；
图6为本发明实施例1提供的制备方法得到的水凝胶血管微支架的荧光显微镜照片；
图7为本发明实施例1提供的制备方法得到的水凝胶血管微支架的UV激发下肉眼照片；
图8为本发明实施例4细胞粘附体外构建血管的过程示意图；
图9为本发明实施例4体外细胞共培养构建的仿生血管的共聚焦显微镜观察及三维重建的表征图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种水凝胶血管微支架的制备方法，包括以下步骤：
a)将GelMA水凝胶和光引发剂的混合溶液进行3D打印，得到GelMA水凝胶片；
b)将步骤a)得到的GelMA水凝胶片进行仿苹果皮自卷曲，得到水凝胶血管微支架。
本发明首先将GelMA水凝胶和光引发剂的混合溶液进行3D打印，得到GelMA水凝胶片。在本发明中，所述GelMA水凝胶采用市售商品或实验室自制品均可。在本发明优选的实施例中，所述GelMA水凝胶为实验室自制品。在本发明中，所述GelMA水凝胶的制备方法优选具体为：
将明胶溶于PBS中，50℃～90℃下持续加热搅拌，同时加入甲基丙烯酸酐进行反应；终止反应后，将得到的混合物倒入透析袋中，浸泡蒸馏水5d～10d，得到凝胶，再经冷冻干燥后使用；
更优选为：
将明胶溶于PBS中，60℃～70℃下持续加热搅拌，同时加入甲基丙烯酸酐进行反应；终止反应后，将得到的混合物倒入透析袋中，浸泡蒸馏水7d，得到凝胶，再经冷冻干燥后使用。本发明对所述明胶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的市售猪皮明胶即可。
在本发明中，所述明胶、PBS和甲基丙烯酸酐的用量比优选为1g：(8mL～12mL)：(0.7mL～0.9mL)，更优选为1g：10mL：0.8mL。
在本发明中，所述加入甲基丙烯酸酐的速度优选为0.4mL/min～0.6mL/min，更优选为0.5mL/min。
在本发明中，所述终止反应的方式优选具体为加入原PBS用量4倍～6倍的PBS终止反应，更优选为加入原PBS用量5倍的PBS终止反应。
在本发明中，所述将得到的混合物倒入透析袋的目的是去除透析中的杂质，采用本领域技术人员熟知的透析袋即可，本发明对此没有特殊限制。
在本发明中，所述光引发剂优选选自Irgacure 2959、4-苯基二苯甲酮和1-羟基-环己基-苯基甲酮中的一种或多种，更优选为细胞毒性较小的Irgacure 2959。在本发明优选的实施例中，所述光引发剂为Irgacure 2959，由于其良好的水溶性和自由基的有效形成，可以在很低的浓度下诱导光交联。
在本发明中，所述混合溶液中GelMA水凝胶的质量百分比优选为10％～15％，更优选为12％～13％；所述混合溶液中光引发剂的质量百分比优选为0.5％～1.5％，更优选为1％。
本发明将GelMA水凝胶和光引发剂的混合溶液进行3D打印；本发明对所述3D打印的设备没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的3D打印机即可。在本发明中，所述3D打印的气动打印喷头优选为150μm～250μm，更优选为200μm；所述3D打印的打印头温度优选为15℃～25℃，更优选为20℃；所述3D打印的打印平台玻片温度优选为5℃～15℃，更优选为10℃；所述3D打印的打印速度优选为5mm/s～15mm/s，更优选为10mm/s。
得到所述GelMA水凝胶片后，本发明将得到的GelMA水凝胶片进行仿苹果皮自卷曲，得到水凝胶血管微支架。本发明通过苹果皮卷曲的自然现象(参见图1所示，苹果皮卷曲的过程：苹果皮在剥离后，因两面干燥速度不同，导致干燥收缩卷曲成中空管)获得卷曲凝胶管的制作灵感，创造性地提出“仿苹果皮自卷曲”的概念，根据苹果皮的尺寸和形状可以卷曲成不同管径和结构的管子，以此自然现象衍生出的3D自成形工艺正好可实现本领域技术人员目前无法解决的微血管支架的构建难题。
在本发明中，所述仿苹果皮自卷曲的过程优选具体为：
b1)将步骤a)得到的GelMA水凝胶片进行紫外光交联后干燥，再浸入水中从玻片上剥离后，自滚得到凝胶管；
b2)将步骤b1)得到的凝胶管再浸入水中，冻干后得到水凝胶血管微支架。
本发明将得到的GelMA水凝胶片进行紫外光交联后干燥，再浸入水中从玻片上剥离后，自滚得到凝胶管。在本发明中，所述紫外光交联的紫外光波长优选为360nm～370nm，更优选为365nm；所述紫外光交联的时间优选为0.4min～0.6min，更优选为0.5min。
在本发明中，所述干燥的温度为优选20℃～30℃，更优选为25℃；所述干燥的时间优选为1s以内；即卷曲现象即刻发生。本发明采用上述干燥的过程，能够保证干燥完全。
在本发明中，一方面，所述GelMA水凝胶片在紫外光交联过程中，顶层分子因吸收UV能量较多而聚合较紧密，使得顶层部分的溶胀率小于底层；另一方面，因干燥过程的先后顺序，水凝胶顶层部分收缩程度大，水凝胶内部产生了向心性卷曲的动力趋势；最终，凝胶薄片在向心性的收缩力以及凝胶底部较大的溶胀率的共同作用下，发生自发的卷曲变形；并且，本发明通过对通过此种方式加工的水凝胶进行冻干后电镜扫描，观察到水凝胶内部存在孔径的差异，且靠近UV的顶层具有更小的孔径，具体参见图2所示；其中，(H)和(I)为原理图，水凝胶经过UV和干燥，造成上下密度不均，吸水溶胀时内部应力具有各向异性而发生卷曲；(J)为统计比较图(K)和(M)中的水凝胶孔径，水凝胶上层孔径176±23.3μm，n＝6，下层孔径291.5±16.62μm，n＝6，**P<0.01；(L)为将经过交联、干燥、溶胀后的GelMA水凝胶冻干后电镜扫描；(K)为图(L)中上部的放大图；(M)为图(L)中下部的放大图。
得到所述凝胶管后，本发明将得到的凝胶管再浸入水中，冻干后得到水凝胶血管微支架。在本发明中，所述再浸入水中的时间优选为1.5h～2.5h，更优选为1h。
参见图3所示，图3为本发明提供的水凝胶血管微支架的整体制备过程的示意图。本发明提供的制备方法通过仿苹果皮自卷曲的方式构建水凝胶血管微支架，不同于以往的3D打印，可以构建更加精细的微型中空管(200μm以下)，并且由于不同形状大小的苹果皮卷曲结果不同，类似的，本发明可以先构建不同形状大小的凝胶片，再得到相应形式的凝胶管，具有更高的精度和可控性。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的制备方法得到的水凝胶血管微支架，所述水凝胶血管微支架的形式包括卷饼、双轴、分叉、环状吻合或三通。本发明提供的水凝胶血管微支架为以水凝胶为材料构建中空的管道，方便细胞在其上按一定方向生长出新生血管。
在本发明中，所述水凝胶血管微支架的卷曲结构的微观性质和有限元模拟如下：
将小管冻干后，通过扫描电镜检测，在更加微观尺度上研究小管的特性，具体参见图4所示(其中(A)、(E)展示小管的正面形态，(B)、(F)展示小管断端形态)；其中，(A)和(B)为卷饼(wraps)形式小管的电镜表征；(E)和(F)为双轴画卷(biaxial handscroll)形式小管的电镜表征；(C)、(D)、(G)和(H)为两种形式小管的有限元模型，红色部分代表交联更紧密的上层，绿色代表较松散的下层；其中(C)、(D)卷饼(wraps)形式，通过控制两端厚度差异得到；(G)和(H)双轴画卷(biaxial handscroll)形式，通过增加中轴区域厚度得到。。在卷曲过程中，在微观尺度上会出现两种卷曲的效果：(1)如(A)和(B)所示，围绕一条轴线，卷曲方向从一边至另一边缘，形成类似卷饼的模式；(2)如(E)和(F)所示，凝胶薄片的两侧边缘分别围绕两条轴线卷曲，形成双轴画卷的模式。这与成形过程中，对凝胶片中心和边缘厚度的控制有关，从(B)和(F)的小管断面图可以看出管壁厚度是非均一的。那么，为了从理论上说明这一点，本发明通过有限元分析，建立了两种卷曲方式的数学模型；并且验证了这一可能性，即在局部厚度上的参数调节可以改变最终的小管形态，参见(C)、(D)、(G)和(H)。综上，通过对厚度上的简单调节，就可以构建出单管道或者并联管道，考虑到生物体内动静脉伴行的特点，这极大丰富了血管支架构建的方式。
具体有限元分析过程：
采用水凝胶热力学理论，并采用连续有限元法该方法的核心是构建水凝胶复合材料的自由能密度，采用Flory-Rehner模型，参考体积自由能可表示为：
其中，N是每参考体积中聚合物链的个数，kT是能量单位中的绝对温度，F是变形梯度张量，v是每个溶剂分子的体积，C是溶剂的浓度，χ是混合焓。
为了将Flory-Rehner模型应用到有限元方法中，可以采用勒让德变换引入另一个自由能函数：
其中，μ是环境中的化学势能。
将公式(1)和(2)组合得到所需的自由能函数：
其中，I＝FiKFiK和J＝detF是变形梯度的不变量。
公式(3)可编码为有限元软件ABAQUS中的超弹性材料(UHYPER)的用户子程序。
公式(3)还表明，该系统有了两个独立的无量纲材料参数：Nv和χ。本发明的实验中Nv＝0.00167，χ＝0.1。当具有初始化学势μ的凝胶浸入具有环境化学势μ0的溶剂中时，胶会溶胀(μ0＜μ)或缩水(whenμ0＞μ)到平衡状态。在本发明的模拟中，本发明固定了初始化学势并调整了环境化学势来模拟活性凝胶的体积变化。为了研究实验中观察到的形态变化过程，本发明模拟了具有相同几何形状的水凝胶复合材料薄片，参见图5所示。顶层(红色)为线性弹性材料，杨氏模量为0.005(由kT/v标准化)，泊松比为0.49；底层为“UHYPER”模拟的环境敏感水凝胶(绿色)。得到的模型结果如下：平面状态的干燥水凝胶片吸水溶胀后，因上下方向上溶胀能力不同而发生卷曲；且若改变厚度会发生上面结果中的两种卷曲方式：卷饼和卷轴状。
本发明提供的水凝胶血管微支架的细胞亲和性好、生物相容性好，且形式丰富，基本可以满足所有形式的血管支架的仿生需要，具有巨大的开发前景。
本发明提供了一种水凝胶血管微支架及其制备方法，所述制备方法，包括以下步骤：a)将GelMA水凝胶和光引发剂的混合溶液进行3D打印，得到GelMA水凝胶片；b)将步骤a)得到的GelMA水凝胶片进行仿苹果皮自卷曲，得到水凝胶血管微支架。与现有技术相比，本发明提供的制备方法通过仿苹果皮自卷曲的方式构建水凝胶血管微支架，不同于以往的3D打印，可以构建更加精细的微型中空管(200μm以下)，并且由于不同形状大小的苹果皮卷曲结果不同，类似的，本发明可以先构建不同形状大小的凝胶片，再得到相应形式的凝胶管，具有更高的精度和可控性；并且，采用本发明提供的制备方法得到的水凝胶血管微支架的细胞亲和性好、生物相容性好，且形式丰富，基本可以满足所有形式的血管支架的仿生需要，具有巨大的开发前景。实验结果表明，采用本发明提供的制备方法能够构建直径更细的凝胶管(50μm～600μm)，并且其作为支架在体外构建出仿生的微血管，细胞存活和细胞功能完全不受影响，细胞亲和性好、生物相容性好。
为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。本发明以下实施例所用的GelMA水凝胶的制备方法如下：
取10g猪皮明胶(A型，Sigma-Aldrich)溶于100mL PBS中，60℃持续加热搅拌，同时以0.5mL/min的速度将8.0mL的甲基丙烯酸酐(Sigma-Aldrich)添加入反应体系中；随后加入500mL PBS终止反应；为了去除透析中的杂质，将混合物倒入透析袋(MWCO 12-14000,Fisher Scientific)中，浸泡蒸馏水1周，得到凝胶；所述凝胶经冷冻干燥后使用。
实施例1
(1)选用15wt％的凝胶、1wt％的光引发剂(Irgacure 2959,Sigma-Aldrich)混合使用，得到GelMA-Irgacure 2959溶液，借助3D打印机(CELLINK AB，瑞典)在玻片上打印出长方形的GelMA水凝胶片(尺寸为30mm×2mm×0.20mm)；
所述3D打印机的参数为：气动打印喷头为200μm，打印头温度为20℃，打印平台玻片温度为10℃，打印速度为10mm/s。
(2)将步骤(1)得到的GelMA水凝胶片采用365nm紫外光(XL-1000A)交联2min后，再在25℃下完全干燥；之后将玻片浸入水中，所述GelMA水凝胶片从玻片上剥离，可观察到自滚现象；最后将卷曲成功的凝胶管浸入水中2h去除多余的光引发剂，冻干，得到水凝胶血管微支架。
对本发明实施例1提供的水凝胶血管微支架进行表征，具体为：
于GelMA中添加罗丹明染料，由荧光显微镜观察，结果参见图6所示；其中，(A)、(B)为单根小管的形态；(C)为小管的断端形态；(D)为分叉小管的形态(本发明能够构建分叉的管型，初始的水凝胶片我们做成Y形；各单独分支宽度0.4mm，合拢后的宽度超过0.4mm×2＝0.8mm，则合拢之后的水凝胶可以包绕两个分支)。
由UV激发下肉眼观察，结果参见图7所示；其中，(E)为单根形态，(F)为环状形态，(G)为三通管形态；(F)和(G)的构建可通过进一步将两个Y分支形组合构建吻合形式的水凝胶片，可以构建很多形式，类似于复杂的血管网和吻合；构建方式同样要遵循分支汇合处的凝胶片宽度要大于两分支的宽度和，否则易出现卷曲不紧的裂隙。
实施例2
(1)选用10wt％的凝胶、1wt％的光引发剂(Irgacure 2959,Sigma-Aldrich)混合使用，得到GelMA-Irgacure 2959溶液，借助3D打印机(CELLINK AB，瑞典)在玻片上打印出长方形的GelMA水凝胶片(尺寸为30mm×2mm×0.20mm)；
所述3D打印机的参数为：气动打印喷头为200μm，打印头温度为20℃，打印平台玻片温度为10℃，打印速度为10mm/s。
(2)将步骤(1)得到的GelMA水凝胶片采用365nm紫外光(XL-1000A)交联0.5min后，再在25℃下完全干燥；之后将玻片浸入水中，所述GelMA水凝胶片从玻片上剥离，可观察到自滚现象；最后将卷曲成功的凝胶管浸入水中2h去除多余的光引发剂，冻干，得到水凝胶血管微支架。
实施例3
(1)选用15wt％的凝胶、1wt％的光引发剂(Irgacure 2959,Sigma-Aldrich)混合使用，得到GelMA-Irgacure 2959溶液，借助3D打印机(CELLINK AB，瑞典)在玻片上打印出长方形的GelMA水凝胶片(尺寸为30mm×2mm×0.20mm)；
所述3D打印机的参数为：气动打印喷头为200μm，打印头温度为20℃，打印平台玻片温度为10℃，打印速度为10mm/s。
(2)将步骤(1)得到的GelMA水凝胶片采用365nm紫外光(XL-1000A)交联3min后，再在60℃下完全干燥；之后将玻片浸入水中，所述GelMA水凝胶片从玻片上剥离，可观察到自滚现象；最后将卷曲成功的凝胶管浸入水中2h去除多余的光引发剂，冻干，得到水凝胶血管微支架。
实施例4
细胞粘附体外构建血管：
将冻干的小管(实施例1提供的水凝胶血管微支架)置于超净台消毒48h；将HUVECs(人脐静脉内皮细胞)在60mm培养皿中培养至70％的浓度，胰酶消化1.5min，将细胞悬液重悬于1mL溶液中，置于1.5mL灭菌离心管中，将小管支架浸没于细胞悬液中，在标准条件下(37℃，5％CO2)培养1小时；取出吸附细胞的小管，置于40mm共聚焦培养皿中，10％完全培养基培养3天。
所有步骤都必须无菌操作，具体过程参见图8所示。
培养3天后体外血管，通过活死染色、ZO-1免疫荧光染色、鬼笔环肽染色观察细胞生长情况，如图9所示；其中，(A)、(B)、(C)和(D)为培养3d活死染色观察HUVEC在GelMA小管支架上的存活情况；(S)为小管支架上HUVEC的活细胞比例统计；(E)、(F)、(G)、(H)为培养3d，HUVEC的免疫荧光染色显示细胞膜上的ZO-1蛋白表达；(I)、(J)、(K)、(L)为培养3d，鬼笔环肽骨架染色显示HUVEC在小管支架上的延展形态；(M)、(N)为卷饼形式的小管培养HUVEC细胞3d后活死细胞情况；(O)、(P)双轴形式小管培养HUVEC细胞3d后活死细胞情况；(Q)、(R)为细胞培养3d后的小管，通过冰冻切片和鬼笔环肽/DAPI染色观察小管横截面。
活死染色的荧光成像以及统计结果提示细胞在小管支架上仍然具有较高的活性，参见(A)、(B)、(C)、(D)和(S)。在细胞种植的第一天细胞存活率88.91％，可能因为在制备过程中，冻干支架吸附了一些消化过程中死亡的细胞；随后几天活细胞比例逐渐上升至98.22％，符合本发明的预期。
对本发明上述技术方案中所述的两种卷曲形式的小管进行细胞吸附培养，参见(M)、(N)、(O)和(P)，同样可以得到相应形式的体外血管；说明通过细胞吸附的方法可以充分构建与支架相契合的体外人工前血管，并且拥有其他方式难以到达的精细度(50μm～500μm直径)。
通过Phalloidin/DAPI染色和共聚焦显微镜进一步观察HUVEC在小管支架上的生长情况，可以看到在具有高生物相容性的水凝胶小管支架上，HUVEC胞内微丝骨架可以充分延展，相互接触交流，在中空管架上形成完整的血管内皮形态，参见(I)、(J)、(K)和(L)。
值得注意的是，血管化的过程不只是简单的细胞生长迁移，还有血管自身结构的改建成熟过程；因此，本发明将体外培养3d后的仿生血管进行冰冻切片，得到仿生血管的横截面，同样用Phalloidin/DAPI染色观察细胞对小管支架的改建情况。从图(Q)中的管腔横截面可以看到，红色荧光标记的细胞骨架形成完整且闭合的管腔结构，将水凝胶小管在卷曲形成过程中遗留下的部分裂隙进行了填补改建，这一点本发明在之前的叙述中已经论及；同时，细胞骨架在GelMA水凝胶中相互渗透建立连接，逐渐取代了原有的水凝胶管壁，改建为成熟的血管内皮壁层结构，参见图(R)。而组织学上微血管改建的时间恰好是3-5d，本发明观察到的细胞学结果与体内实际情况完全一致，联系之前对于GelMA降解特性的考察，此种方法构建的微血管支架符合血管化的需求。
另外，在血管化的进程中，内皮细胞的功能也是逐渐完善的。ZO-1(紧密连接蛋白)对于内皮行使正常功能具有重要作用。在day 3通过免疫荧光检测了仿生微血管上HUVEC的ZO-1蛋白表达情况，可以看到细胞膜上，特别是相邻细胞之间蛋白表达非常丰富，提示所种植的HUVEC细胞形成了有效的内皮结构和微环境，参见(E)、(F)、(G)和(H)；尤其从图(H)中可以很直观立体地看到基本成熟的仿生血管，且随着培养时间增加，仿生血管达到更加成熟的状态，形成由完整内皮拼成的无泄漏的血管结构。
所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种水凝胶血管微支架的制备方法，包括以下步骤：
a)将GelMA水凝胶和光引发剂的混合溶液进行3D打印，得到GelMA水凝胶片；
b)将步骤a)得到的GelMA水凝胶片进行仿苹果皮自卷曲，得到水凝胶血管微支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述GelMA水凝胶的制备方法具体为：
将明胶溶于PBS中，50℃～90℃下持续加热搅拌，同时加入甲基丙烯酸酐进行反应；终止反应后，将得到的混合物倒入透析袋中，浸泡蒸馏水5d～10d，得到凝胶，再经冷冻干燥后使用。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述光引发剂选自Irgacure2959、4-苯基二苯甲酮和1-羟基-环己基-苯基甲酮中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述混合溶液中GelMA水凝胶的质量百分比为10％～15％，光引发剂的质量百分比为0.5％～1.5％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述3D打印的气动打印喷头为150μm～250μm，打印头温度为15℃～25℃，打印平台玻片温度为5℃～15℃，打印速度为5mm/s～15mm/s。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述仿苹果皮自卷曲的过程具体为：
b1)将步骤a)得到的GelMA水凝胶片进行紫外光交联后干燥，再浸入水中从玻片上剥离后，自滚得到凝胶管；
b2)将步骤b1)得到的凝胶管再浸入水中，冻干后得到水凝胶血管微支架。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤b1)中所述紫外光交联的紫外光波长为360nm～370nm，时间为0.4min～0.6min。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤b1)中所述干燥的温度为20℃～30℃，时间为1s以内。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤b2)中所述再浸入水中的时间为1.5h～2.5h。
10.一种权利要求1～9任一项所述的制备方法得到的水凝胶血管微支架，所述水凝胶血管微支架的形式包括卷饼、双轴、分叉、环状吻合或三通。
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