CN110295217A - 一种掺杂量子点比率荧光探针用于microRNA体外检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种掺杂量子点比率荧光探针用于microRNA体外检测的方法，具体步骤如下：（1）制备掺杂量子点纳米荧光探针；（2）发卡DNA与总RNA中microRNA触发等温扩增反应，生成等温扩增反应产物；（3）将生成的掺杂量子点纳米荧光探针加入至等温扩增反应产物中，实现靶标microRNA比率荧光检测；本发明制备了掺杂量子点比率荧光探针，发展等温扩增—纳米探针一体化方法用于microRNA高灵敏度、高特异性的比率荧光检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种掺杂量子点比率荧光探针用于microRNA体外检测的方法，属于生物医学领域。
背景技术
微小RNA（microRNA）是约22个核苷酸的单链小非编码RNA，主要在转录后水平发挥靶基因的调控作用。microRNA参与众多的生理病理过程，特别是在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的调节作用。伴随着癌症的发生发展，microRNA水平在外周体液（特别是血清）中的异常波动或为癌症早期诊断的重要指标。然而，microRNA序列短，在体液中丰度低，且同一家族内不同microRNA的核酸序列相似度高，因而实现microRNA高灵敏、高特异性的检测存在着巨大的挑战。
目前，核酸扩增、微阵列和第二代测序技术是主要的microRNA检测手段。其中，DNA微阵列和第二代测序技术在高通量检测上有优势，但在检测的特异性或灵敏度方面有待提高；聚合酶链式反应（qRT-PCR）是目前miRNA定量检测的金标准方法，具有高的检测灵敏度，但是该方法需要额外的逆转录反应，并且引物设计的难度较高，操作过程较为繁琐。等温扩增反应如链式杂交反应（HCR）是一种新的核酸扩增方法，能够在靶标microRNA的作用下顺序打开DNA发卡分子，形成长序列的双链核酸，反应过程中无酶参与，且反应条件温和，能够显著提高microRNA检测的灵敏度和准确度。
荧光探针作为一种新的microRNA检测方法，具有操作简单和检测灵敏的优点。相比于单色荧光探针，比率荧光探针通过内部校正，提供更高的信噪比，能够显著提高检测的灵敏度和准确度。掺杂量子点通过引入掺杂态离子可以实现量子点的双光发射，不仅保留了单色量子点几乎所有的优点，而且还可以避免自身斯托克斯位移小而导致的自淬灭现象。更为重要的是，掺杂量子点（尤其是Mn:ZnS和Cu:InP）具有更长的掺杂剂发射寿命和更低的细胞毒性。基于掺杂量子点构筑比率荧光探针，具有制备简单、小尺寸、稳定性好等优点，因而在生物传感和生物成像领域得到广泛关注。
针对以上问题，有必要提出一种简单易行、高灵敏、高特异性的对待测样品中microRNA进行定量检测的方法。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种掺杂量子点比率荧光探针用于microRNA体外检测的方法，以解决现有技术中存在的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种掺杂量子点比率荧光探针用于microRNA体外检测的方法，具体步骤如下：
（1）制备掺杂量子点纳米荧光探针；
（2）发卡DNA与总RNA中microRNA触发等温扩增反应，生成等温扩增反应产物；
（3）将生成的掺杂量子点纳米荧光探针加入到等温扩增反应产物中，通过荧光光谱仪检测，实现靶标microRNA高灵敏度、高特异性的比率荧光分析。
作为本发明的一种改进，所述步骤（1）的具体步骤如下：将双发射掺杂量子点经过聚乙二醇功能化处理，在超声辅助的作用下，静电组装大环配体分子，构建掺杂量子点纳米荧光探针。
作为本发明的一种改进，步骤（1）中所述的掺杂量子点纳米荧光探针的制备采用两步法，第一步将油溶性的Cu:InP量子点通过配体交换，表面偶联上二氢硫辛酸（DHLA）及二氢硫辛酸-聚乙二醇（DHLA-PEG）分子；第二步通过超声方法，在Cu:InP表面组装上5,10,15,20-四(1-甲基-4-吡啶基)卟啉（TMPyP），构筑了Cu:InP@TMPyP-PEG结构的纳米荧光探针。
掺杂量子点纳米荧光探针具有双光发射的性质，在单一波长的光源激发下，掺杂量子点纳米荧光探针能够发射出两个波长荧光。纳米探针对双链核酸有着特异性的比率荧光响应，随着双链核酸浓度的增高，纳米探针一个荧光强度基本不变，另一个荧光强度增强。
掺杂量子点纳米荧光探针是一种双荧光发射荧光探针，在单一波长的光源激发下，量子点能够发出绿、红两种荧光，两种荧光强度的比值为2:1。由于TMPyP分子为双链DNA配体，该纳米探针对双链核酸有着选择性的比率荧光响应。
作为本发明的一种改进，所述步骤（2）的具体步骤如下：在发卡DNA存在时，总RNA中的靶标microRNA触发等温扩增反应，产生长序列的双链核酸。
作为本发明的一种改进，所述步骤（2）中总RNA中的microRNA在三种发卡结构核酸分子（H0，H1，H2）存在时，能够特异性的打开H0，进一步顺序打开H1，H2分子，室温条件下触发链式杂交反应（HCR），扩增产物为“锯齿”状的双链DNA。
作为本发明的一种改进，所述步骤（3）的具体步骤如下：等温扩增产物中加入纳米探针，以探针的荧光作为输出信号，通过荧光光谱的测量和标准曲线的建立，实现靶标microRNA比率荧光检测。
作为本发明的一种改进，所述步骤（3）中向扩增产物中加入纳米荧光探针，纳米探针的红色荧光恢复，绿色荧光保持不变。对反应溶液进行荧光光谱测量，实现总RNA中的microRNA定量检测。
由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：
本发明制备了掺杂量子点比率荧光探针，发展等温扩增—纳米探针一体化方法用于microRNA高灵敏度、高特异性的比率荧光检测。
附图说明
图1为掺杂量子点纳米荧光探针的制备工艺流程图；
图2为掺杂量子点纳米荧光探针的红外光谱表征；
图3为掺杂量子点纳米荧光探针的荧光光谱；
图4为掺杂量子点纳米探针对核酸响应的选择性；
图5为掺杂量子点纳米探针对双链DNA的比率荧光响应；
图6为等温扩增—纳米探针方法用于microRNA的体外检测；
图7为链式杂交反应凝胶电泳图；
图8为microRNA检测的荧光光谱图；
图9为microRNA检测的拟合曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。
实施例1：
掺杂量子点纳米荧光探针的制备
如图1、图2所示，掺杂量子点纳米荧光探针的制备主要分为两步。第一步为量子点的PEG功能化，通过配体交换方式在量子点表面偶联上DHLA及DHLA-PEG配体，第二步取0.5 mL浓度为0.2 μM的量子点溶液分别与0.5 mL浓度为0.6 μM的TMPyP溶液混合，并在超声作用下组装30分钟。红外光谱图中，C-O-C和C=O特征振动峰的出现，表明DHLA和DHLA-PEG分子成功偶联，C=N特征振动峰的出现表明TMPyP分子成功组装到量子点表面。因此，通过两步的可控制备，组装构建了Cu:InP@TMPyP-PEG纳米荧光探针。
实施例2：
掺杂量子点纳米荧光探针对双链核酸的比率荧光响应
如图3所示，此时纳米探针在530 nm处的绿色峰与650 nm处红色峰荧光强度的比例为2:1，探针的整体颜色为绿色。将掺杂量子点纳米荧光探针与不同种类的核酸反应，如：双链DNA、发卡DNA、信使RNA，单链DNA、microRNA反应。如图4所示，纳米探针只对双链DNA有响应，探针在650 nm处的荧光显著增强，而对其它类型的核酸无明显响应。与传统的双链DNA染料GelRed相比，纳米荧光探针对双链DNA的响应选择性更高。将0.1 μM的掺杂量子点纳米探针分别与0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/L的小牛胸腺DNA混合于缓冲液中（100 μL，20mM Tris-HCl，pH=7.4）。如图5所示，随着双链DNA浓度的增高，量子点在650 nm处的荧光逐渐增强，而530 nm处的荧光强度则保持不变，产生比率荧光响应。进一步，对纳米荧光探针的响应时间进行了优化，该探针在与不同浓度（0.5 mg/L，1.0 mg/L，2.5 mg/L）的双链DNA反应时，比率荧光响应均能够在35 min内完成。
实施例3：
microRNA触发的链式杂交反应
选择2%琼脂糖凝胶和0.5×TBE缓冲液(4.5 mM Tris-HCl, 4.5 mM 硼酸, 0.1 mMEDTA, pH=7.9)进行凝胶电泳。GelRed作为荧光插入剂。电泳条件为电压80 V，电泳45 min，每个泳道加入5 µL样品。如图6所示，M1为20bpladder，第1泳道为发卡DNA（H0，0.1 μM），第2泳道为发卡DNA （H1，3 μM），第3泳道为发卡DNA （H1，3 μM），第4泳道为三种发卡DNA的混合物（H0，0.1 μM、H1，3 μM、H2，3 μM），第5泳道为靶标microRNA（T，0.1μM）与三种发卡DNA的扩增产物（H0，0.1 μM、H1，3 μM 、H2，3 μM），扩增时间为70 min，M2为10000 bpMarke，microRNA（T）、H0、H1、H2的序列结构如表1所示。只有靶标microRNA能打开H0，并触发H1，H2的链式杂交反应，扩增出长的双链核酸（~2000bp），凝胶电泳的条带出现明显的滞后（第5泳道）。
表1
| Name | Sequence (5’ to 3’) |
| microRNA-21 | UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA |
| H0 | GACCCTTTTAGTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAACTAAAAGGGTCTGAGGGT |
| H1 | GCGTAGACTAAAAGGGTCTACCCTCAGACCCTTTTAGT |
| H2 | AGACCCTTTTAGTCTACGCACTAAAAGGGTCTGAGGGT |
实施例4：
掺杂量子点比率荧光探针用于microRNA的体外检测
利用链式杂交反应-纳米探针方法用于microRNA的体外检测，如图7所示，检测步骤分为三步，第一步加入待检测的总RNA；第二步加入发卡DNA混合物（H0，0.1 μM、H1，3 μM、H2，3μM），反应时间70 min；第三步加入20 nM的纳米探针。缓冲液为pH=7.4的20mMTris-HCl，反应体积为100 μL。对反应后的溶液进行荧光光谱测量。如图8所示，随着microRNA浓度从0增加到5000 fM时，纳米探针在650 nm处的红色荧光强度逐渐增加，在530 nm处的绿色荧光保持不变。图9给出纳米探针红/绿荧光比率随靶标浓度变化的标准曲线。计算得到纳米探针检测microRNA的检测限为2 fM（1200 copies/μL），检测线性范围为2 fM~2 pM（1200copies/μL ~ 1200000 copies/μL）。
microRNA（T）、H0、H1、H2的序列结构为：microRNA-21（T）为人工合成的RNA序列，H0，H1，H2为人工合成的DNA序列。其中microRNA-21序列是已知的，H0，H1，H2的序列结构由本发明设计。
本发明中microRNA-21的序列结构SEQ ID NO:1所示：
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
H0的序列结构SEQ ID NO:2所示：
GACCCTTTTAGTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAACTAAAAGGGTCTGAGGGT
H1的序列结构SEQ ID NO:3所示：
GCGTAGACTAAAAGGGTCTACCCTCAGACCCTTTTAGT
H2的序列结构SEQ ID NO:4所示：
AGACCCTTTTAGTCTACGCACTAAAAGGGTCTGAGGGT
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种掺杂量子点比率荧光探针用于microRNA体外检测的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaccctttta gttcaacatc agtctgataa gctaactaaa agggtctgag ggt 53
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgtagacta aaagggtcta ccctcagacc cttttagt 38
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agaccctttt agtctacgca ctaaaagggt ctgagggt 38
Claims (4)
1.一种掺杂量子点比率荧光探针用于microRNA体外检测的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）制备掺杂量子点纳米荧光探针；
（2）发卡DNA与总RNA中microRNA触发等温扩增反应，生成等温扩增反应产物；
（3）将生成的掺杂量子点纳米荧光探针加入到等温扩增反应产物中，实现靶标microRNA比率荧光检测。
2.根据权利要求1所述的一种掺杂量子点比率荧光探针用于microRNA体外检测的方法，其特征在于：所述步骤（1）的具体步骤如下：将双发射掺杂量子点经过聚乙二醇功能化处理，在超声辅助的作用下，静电组装大环配体分子，构建掺杂量子点纳米荧光探针。
3.根据权利要求1所述的一种掺杂量子点比率荧光探针用于microRNA体外检测的方法，其特征在于：所述步骤（2）的具体步骤如下：在发卡DNA存在时，总RNA中的靶标microRNA触发等温扩增反应，产生长序列的双链核酸。
4.根据权利要求1所述的一种掺杂量子点比率荧光探针用于microRNA体外检测的方法，其特征在于，所述步骤（3）的具体步骤如下：等温扩增产物中加入纳米探针，以探针的荧光作为输出信号，通过荧光光谱的测量和标准曲线的建立，实现靶标microRNA比率荧光检测。
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