CN110294786B - 一种海南九节茎提取物的制备方法 - Google Patents

一种海南九节茎提取物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海南九节茎提取物的制备方法，是在海南九节茎的干燥粉末中加入石油醚溶剂提取；提取液经过滤、减压浓缩得到石油醚溶解提取物，石油醚溶解提取物经硅胶柱色谱，采用纯净石油醚作为溶剂，洗脱除掉提取物中的长链油脂蜡成分后，再用乙酸乙酯洗脱冲柱，流出液真空浓缩，得到具有广泛抗菌活性的石油醚提取精华物；石油醚提取精华物再经反复柱层析，得到7个三萜类化合物、1个甾醇类化合物和2个黄酮类化合物。本发明制得的提取物得率高，工艺流程简单，成本低廉，适合较大规模的制备，提取物具有很好的抗菌活性，可以应用于辅助抗菌消炎药物中。

Description

一种海南九节茎提取物的制备方法
技术领域
本发明属于天然植物有效成分的提取分离技术领域，涉及一种海南九节茎提取物的制备方法，具体涉及一种具有很好抗菌活性，可以广泛用于消炎药物中的海南九节茎提取物的制备方法。
背景技术
茜草科(Rubiaceae)九节属(Psychotria)植物全世界约800～1500余种，分布于热带和亚热带区，美洲尤盛。该属植物在中国民间为传统药材，主要用于治疗骨折、毒蛇咬伤以及跌打损伤，药用史由来已久。九节属植物作为清热解毒，消肿拔毒的传统治疗药物，对其开展抗菌活性研究具有极大的开发潜力。
虽然九节属植物作为传统抗菌消炎的药物由来已久，但目前国内外对该属植物进行抗菌方面的相关研究报道较少。海南九节(Psychotria hainanensis)为海南特有植物，分布于海南省的保亭、万宁、陵水等地，为海南黎族民间常用药材。海南九节具有广泛清热解毒，祛风除湿的功效。且在黎族民间广泛用于治疗骨折、毒蛇咬伤以及跌打损伤。但目前鲜见相关药用物质基础及药理活性研究。
目前，有一篇文献报道海南九节叶的化学成分研究，从中分离出β-谷甾醇、十八碳酸、槲皮素、芦丁、山奈酚-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷和β-胡萝卜苷等7个化合物(李洪福、黄剑、刘明生，张小坡，中国实验方剂学杂志，2011，17(19):125-127)。同时还报道了海南九节叶中总黄酮的提取工艺(李洪福，刘明生，张小坡，黄剑，正交试验法优选海南九节叶中总黄酮成分提取工艺，海南医学院学报，2011，17(8):1012-1014)。但目前鲜见海南九节相关药用物质基础及药理活性研究。
发明内容
本发明的目的是提供了一种海南九节茎提取物的制备方法，利用简单的提取分离方法对海南九节茎不同极性部位进行抗菌活性筛选，找到活性部位，经多次柱层析，阐明活性部位的化学成分。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种海南九节茎提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)在海南九节茎干燥粉末中加入溶剂为60～90℃石油醚进行提取，提取时间为60分钟至7天，得到海南九节茎提取液；
(2)将海南九节茎提取液经过滤、减压浓缩得到石油醚溶解提取物；
(3)石油醚溶解提取物经硅胶柱色谱，采用纯净石油醚作为溶剂，洗脱除掉提取物中的长链油脂蜡成分后，再用乙酸乙酯洗脱冲柱，流出液真空浓缩，得到具有广泛抗菌活性的石油醚提取精华物；
(4)石油醚提取精华物再经反复柱层析，固定相选用填料为正相硅胶或葡聚糖凝胶Sephadex LH-20，得到7个三萜类化合物，结构特征为3-表齐墩果酸、刺囊酸、齐墩果酸、熊果醇、3-羰基熊果酸、桦木酮酸、羽扇豆醇；1个甾醇类化合物，结构特征为麦角甾-6,22-二烯-3β,5α,8α-三醇；2个黄酮类化合物，结构特征为山柰酚、3-甲氧基槲皮素。具体为：
石油醚：乙酸乙酯(20：1)硅胶柱层析分别得到化合物3-表齐墩果酸(1)、刺囊酸(2)和3-羰基熊果酸(5)；石油醚：丙酮(15：1)接着是石油醚：乙酸乙酯(10：1)硅胶柱层析分离得到化合物齐墩果酸(3)和熊果醇(4)；氯仿：乙酸乙酯(20：1)硅胶柱层析接着是氯仿：甲醇(1：1)葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析分离得到化合物桦木酮酸(6)；石油醚：乙酸乙酯(8：1)和石油醚：丙酮(10：1)硅胶柱层析分离得到化合物羽扇豆醇(7)；氯仿：乙酸乙酯(8：1)以及石油醚：丙酮(5：1)硅胶柱层析得到化合物麦角甾-6,22-二烯-3β,5α,8α-三醇(8)；氯仿：丙酮(10：1)硅胶柱层析以及氯仿：甲醇(1：1)葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离得到化合物山柰酚(9)和3-甲氧基槲皮素(10)。
综合应用多种光谱波谱技术(包括IR、UV、MS、1D/2D NMR)结合相关文献参考，对纯化得到的单体化合物进行结构鉴定，分别为7个三萜类化合物、1个甾醇类化合物和2个黄酮类化合物，具体结构为3-表齐墩果酸(1)、刺囊酸(2)、齐墩果酸(3)、熊果醇(4)、3-羰基熊果酸(5)、桦木酮酸(6)、羽扇豆醇(7)、麦角甾-6,22-二烯-3β,5α,8α-三醇(8)、山柰酚(9)、3-甲氧基槲皮素(10)，测定结构可靠。
优选地，所述海南九节茎干燥粉末是将海南九节的茎经阴干后粉碎后过20～80目筛得到
优选地，所述提取包括室温浸泡、加热或超声提取。
优选地，所述海南九节茎干燥粉与石油醚溶剂的体积比为1：1～10。
优选地，所述柱层析用填料为柱层析用硅胶或葡聚糖凝胶。
本发明的提取物具有抗菌活性，可以广泛应用于消炎药物中。
本发明海南九节茎提取物的制备方法具有以下的有益效果：
1)利用简单的提取分离方法，对海南九节茎不同极性溶剂溶解部分进行抗菌活性筛选，找到活性部位，经多次柱层析，阐明活性部位的化学成分。
2)本发明所得提取物的化学成分明确。
3)所得提取物具有很好抗菌活性，可以广泛用于消炎药物中。
4)本发明制得的提取物得率高，工艺流程简单，成本低廉，适合较大规模的制备。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明。
实施例1海南九节茎有效部位的制备
海南九节茎(10Kg)阴干粉碎后，采用石油醚(60-90℃)室温下浸泡3次，7天/次，合并提取液，减压浓缩得石油醚溶解部分提取物(78g)；药材挥干残留石油醚后，采用乙酸乙酯室温下浸泡3次，7天/次，合并提取液，减压浓缩得乙酸乙酯溶解部分提取物(150g)；药材再次挥干残留乙酸乙酯后，采用乙醇水溶液(50-70％)室温下浸泡3次，7天/次，合并提取液，减压浓缩得乙醇溶解部分提取物(180g)。
石油醚溶解部分经过硅胶柱色谱，采用石油醚进行洗脱除去该部分中含有的长链油脂蜡等小极性混合物，剩余部分经乙酸乙酯冲柱洗脱，浓缩后即是海南九节茎抗菌的有效部位，该部位经反复硅胶、葡聚糖凝胶(Sephdex LH-20)柱层析，得到7个三萜类化合物、1个甾醇类化合物和2个黄酮类化合物，分别为石油醚：乙酸乙酯(20：1)硅胶柱层析分别得到3-表齐墩果酸(1)25mg、刺囊酸(2)15mg和3-羰基熊果酸(5)28mg；石油醚：丙酮(20：1)接着是石油醚：乙酸乙酯(10：1)硅胶柱层析分离得到齐墩果酸(3)17mg和熊果醇(4)10mg；氯仿：乙酸乙酯(20：1)硅胶柱层析接着是氯仿：甲醇(1：1)葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离得到桦木酮酸(6)26mg；石油醚：乙酸乙酯(8：1)和石油醚：丙酮(10：1)硅胶柱层析分离得到羽扇豆醇(7)5mg；氯仿：乙酸乙酯(8：1)以及石油醚：丙酮(5：1)硅胶柱层析得到麦角甾-6,22-二烯-3β,5α,8α-三醇(8)12mg；氯仿：丙酮(6：1)硅胶柱层析以及氯仿：甲醇(1：1)葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离得到山柰酚(11)26mg和3-甲氧基槲皮素(10)16mg。化学结构如下：
Figure BDA0002105521820000041
实施例2海南九节茎不同溶剂溶解部位及单体化合物抗菌活性研究
1.实验方法：将培养好的5株人致病菌(四联球菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌)用培养液以1:500-1:1000的比例进行稀释，药品用DMSO溶解配成1mg/mL待用，96孔板第一行每孔加储备液10μL，用环丙沙星作为阳性对照单独放入一孔；接着取稀释菌种液190μL，加到96孔板第一行，混匀，然后从第一行取出100μL加入第二行，如此进行直至取出最后一行的100μL稀释菌液弃去；最后将每孔加100μL稀释菌液，每孔终体积为200μL；37℃恒温箱内培养8-10小时，取出后用肉眼观察孔内浊度。
MIC值测定：采用微量稀释法，将活化好的致病菌用相应的培养液进行稀释，稀释度为1:500-1:1000；将稀释后的含菌培养液分别定量加至96孔板的第一排各孔中，用二倍浓度递减稀释的方法对96孔板进行逐行稀释，然后将各样品分别加入至各列孔中。将96孔板置于恒温培养箱中37℃恒温培养8-10小时，后用肉眼观察各孔浊度。
2.实验结果(见表1)
由实施例1得到的海南九节茎不同溶解部分及单体化合物对所选5株致病菌均显示不同程度的增殖抑制活性，化合物5、9对金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌具有一定的活性，其MIC值分别为5.0,10.0和20.0,10.0μg/mL。其他化合物显示微弱或者不显活性。
表1海南九节茎不同溶解部分及单体化合物抗菌活性测试结果
Figure BDA0002105521820000051
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (3)

1.一种海南九节茎提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在海南九节茎干燥粉末中加入溶剂为60～90℃石油醚进行提取，室温下浸泡3次，7天/次，得到海南九节茎提取液；
(2)将海南九节茎提取液经过滤、减压浓缩得到石油醚溶解提取物；
(3)石油醚溶解提取物经硅胶柱色谱，采用纯净石油醚作为溶剂，洗脱除掉提取物中的长链油脂蜡成分后，再用乙酸乙酯洗脱冲柱，流出液真空浓缩，得到具有广泛抗菌活性的石油醚提取精华物；
(4)石油醚提取精华物再经反复柱层析，固定相选用填料为正相硅胶或葡聚糖凝胶，得到7个三萜类化合物，结构特征为3-表齐墩果酸、刺囊酸、齐墩果酸、熊果醇、3-羰基熊果酸、桦木酮酸、羽扇豆醇；1个甾醇类化合物，结构特征为麦角甾-6,22-二烯-3β,5α,8α-三醇；2个黄酮类化合物，结构特征为山柰酚、3-甲氧基槲皮素；具体为：
石油醚：乙酸乙酯20：1硅胶柱层析分别得到化合物3-表齐墩果酸、刺囊酸和3-羰基熊果酸；石油醚：丙酮15：1接着是石油醚：乙酸乙酯10：1硅胶柱层析分离得到化合物齐墩果酸和熊果醇；氯仿：乙酸乙酯20：1硅胶柱层析接着是氯仿：甲醇1：1葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离得到化合物桦木酮酸；石油醚：乙酸乙酯8：1和石油醚：丙酮10：1硅胶柱层析分离得到化合物羽扇豆醇；氯仿：乙酸乙酯8：1以及石油醚：丙酮5：1硅胶柱层析得到化合物麦角甾-6,22-二烯-3β,5α,8α-三醇；氯仿：丙酮10：1硅胶柱层析以及氯仿：甲醇1：1葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离得到化合物山柰酚和3-甲氧基槲皮素。
2.根据权利要求1所述的海南九节茎提取物的制备方法，其特征在于：所述海南九节茎干燥粉末是将海南九节的茎经阴干后粉碎后过20～80目筛得到。
3.根据权利要求1所述的海南九节茎提取物的制备方法，其特征在于：所述海南九节茎干燥粉与石油醚溶剂的体积比为1：1～10。
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