CN110282759B - 一种利用蜡状芽孢杆菌与李氏禾交互作用净化水体中铬的方法 - Google Patents

一种利用蜡状芽孢杆菌与李氏禾交互作用净化水体中铬的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用蜡状芽孢杆菌与李氏禾交互作用净化水体中铬的方法，属于水污染处理技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将李氏禾置于培养液中培养12～18d后，向培养液中加入终浓度为8～12mg/L的六价铬进行胁迫培养8～12d获得预培养后的李氏禾；2)将所述预培养后的李氏禾置于六价铬初始浓度为8～12mg/L的含铬废水中，并向其中接入对数生长期的蜡状芽孢杆菌，形成联合处理体系，处理含铬废水。所述方法通过控制关键生理和生态因子，充分发挥蜡状芽孢杆菌与李氏禾二者的协同作用，为提高Cr(Ⅵ)污染水体的植物‑微生物修复效率提供重要的理论参考和实践指导。

Description

一种利用蜡状芽孢杆菌与李氏禾交互作用净化水体中铬的 方法
技术领域
本发明属于水污染处理技术领域，尤其涉及一种利用蜡状芽孢杆菌与李氏禾交互作用净化水体中铬的方法。
背景技术
铬污染是一种较为常见的水体重金属污染，具有隐蔽性、长期性和不可逆性等特点。铬及其化合物的广泛应用使大量含铬废水排放到水体中，对环境造成污染，工业生产迅速发展，伴随着生产过程中产生大量铬渣，更是对土壤和水体造成了大面积的污染，使生态环境和人类健康受到严重影响。因此，如何有效的治理含铬废水和铬渣，减少污染，已成为环保领域中亟待解决的问题。
水体中不同形态的重金属污染物会对水体环境会产生不同程度的危害。铬原本是人体生长必不可缺少的微量元素之一，具有调节人体内糖和胆固醇代谢的作用，但是当其含量超过一定的界限时就会对生命体产生毒害作用。重金属的毒性和稳定性取决于它的存在形态，随水环境条件改变，各种存在形态之间可相互转化，具有形态多变性，物理化学行为多具有可逆性，如沉降与悬浮等，但在一定条件下，又具有相对稳定性，重金属多为非降解型有毒污染物，被人类带入自然环境后，会不断地积累在水体、植物和土壤中，沿大气、水体或食物链被生物体吸收、富集，最终在动植物体内逐渐积累，出现慢性中毒现象。
含铬废水与其他含重金属废水一样，在环境中不能自行分解，且可因食物链的作用在生物体内积累，最终在高级的生物体内富集并产生毒害作用。鉴于铬的危害性，世界各国对铬的排放形态和排放量都进行了严格的限制。例如日本的最高排放总铬含量为2.0mg/L；加拿大为2.5mg/L；我国对铬排放标准为六价铬离子的浓度上限规定为0.5mg/L，总铬含量不得超过1.5mg/L。严格的排放标准无疑增大了处理难度，如何高效合理地处理含铬废水是当今的研究热点。目前对于含铬废水的处理技术主要有物理控制、化学和生物修复等方法。
近年来，很多实验研究利用一些农业上的废料进行改性或者制备新型的纳米材料，例如：花生壳、木屑、玉米芯、柚子皮、秸秆等，其组成成分中大多含有多种活性基团，重金属离子可以通过与其表面的自由活性基团络合而发挥它的吸附性能，在细胞壁中进行积累，但其影响条件和后续无毒无害化处理有待研究。这种方法具有处理容量大、对复合污染治理效果明显等优点。
电解法则是利用阳极铁在电流的作用下产生大量的亚铁离子，同时阴极板上生成氢气，在酸性条件下，亚铁离子能够将六价铬还原成三价铬。该工艺对电镀含铬废水治理彻底，处理后清水可回用，节省水资源，但是耗电量大，需要大量的铁板，同时也会产生了大量的沉淀污泥，大量堆置的沉淀污泥对环境也构成了潜在的威胁，可能会引起二次污染。
化学法处理主要用于工业含铬废水的处理，通过一系列化学反应使含铬废水中的铬离子从水体中沉淀分离。在酸性条件下向废水中加入还原剂，将Cr6+还原成Cr3+，再加入石灰或氢氧化钠，使其在碱性条件下生成氢氧化铬沉淀，从而去除铬离子，以下是几种常见的化学处理法工艺比较。
表1常见化学处理法的优缺点
Figure BDA0002167910240000021
Figure BDA0002167910240000031
生物修复法泛指利用微生物或植物来治理受污染水体，通过微生物或植物的代谢活动，改变水体中重金属的存在形态或将其去除，降低重金属活性和生物有效性。根据修复主体不同，可分为微生物修复技术和植物修复技术。相比于物理法和化学法，生物法的优势在于操作简单、费用低、不产生二次污染等。近年来，微生物-植物联合修复技术作为一种新的生物修复途径受到关注，具有良好的应用前景。
铬污染水体的修复是一项艰巨的工程，以往的物理及化学修复不仅投资较大而且效果不甚理想、容易产生二次污染。植物修复重金属污染水体具有投资小、针对性强、效果好、节能环保等优点，被认为是一种极具前景的绿色技术。大量研究表明，植物修复技术能有效去除水中的氮、磷、COD、BOD和重金属等多种污染物。因此，利用植物修复水体铬污染可能是一条廉价而有效的途径，这是利用生态工程治理环境的一种有效方法，而且具有较高的环境生态效益，是生物技术处理废水的延伸。
李氏禾(Leersia hexandra Swartz)是一种禾本科的湿生植物，也是我国首次发现和唯一报道的湿生的铬超富集植物。该植物对Cr(Ⅵ)有很强的耐受和富集能力，且具备适应能力强、生长迅速、易于人工繁殖等特征，研究发现李氏禾对水体中的Cr(Ⅵ)有很强的净化功能。因此，李氏禾在铬污染水体的植物修复方面表现出巨大的潜力和良好的应用前景。同时，李氏禾人工湿地对Cr(Ⅵ)超标150倍(7.50mg/L)以上的水体有很好的净化效果，尽管如此，但是李氏禾直接吸收去除铬的贡献率不到10％，同时修复时间较长，这些使李氏禾人工湿地净化Cr(VI)的工程应用受到一定限制，如何提高李氏禾的吸收效果，缩短修复周期是亟待解决的关键问题。
微生物修复是指在人为强化的条件下，利用自然环境中的土著微生物或人为投加的外源促进微生物的代谢活动，对环境中的污染物进行转化、降解与去除的方法。用微生物修复重金属污染主要是通过微生物的吸附、代谢达到对重金属消减、净化作用和固定作用；或者微生物作用下改变重金属的化学形态，使重金属固定或生物可利用性降低，减少重金属的危害。与物理、化学修复技术相比，微生物修复技术安全性、非破坏性和经济性较强，具有良好发展潜力。但是土著微生物对六价铬还原能力有限，外界影响因素较复杂，如pH值、温度、碳源、溶解氧、细胞浓度、初始六价络浓度以及其他无机物质或有机物的添加等对微生物作用都有一定影响作用；而且在无外源营养物质添加的情况下微生物还原速度缓慢，短期内很难达到预期修复效果。因此，仅靠微生物达到铬污染水修复效果可行性不大，可以考虑通过微生物-植物协同作用，充分发挥土著微生物自身优势，促进铬污染水体的修复。
植物与微生物联合修复技术因其吸取了植物修复的优点(廉价、绿色、环保、清洁)，在一定程度上提高了植物富集效率，缩短修复周期，逐步成为新的研究热点，植物根际附近的微生物能将土壤中的有机质、植物根系分泌物转化成自身可吸收的小分子物质，同时通过分泌有机酸、铁载体等物质改变环境中有机污染物的存在状态或氧化还原状态，降低有机物的毒性，减少有机污染物对植物本身的毒害，提高植物的耐受性，促进植物对有机污染物的吸收、转移、富集，与此同时，植物也可以促进环境中微生物的生物活性，提高微生物修复污染水体的能力。如Kumar等人将具有ACC脱氨酶、铁载体、分泌吲哚乙酸(IAA)和溶磷作用的菌株Enterobacter aerogentes和Rahnella aquatilis接种印度芥菜后显著促进了植物的生长和对Ni、Cr的吸收；Chatterjee等发现菌株Cellulosimicrobium cellulans能将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)，同时通过分泌IAA和溶解磷，能够缓解重金属对辣椒的毒害，有效地提高了植物修复效率，因此，植物-微生物联合修复技术成为研究热点。
但是目前对于水体中Cr(Ⅵ)的净化处理效率低，净化效果差。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用蜡状芽孢杆菌与李氏禾交互作用净化水体中铬的方法；所述方法通过改变李氏禾与蜡状芽孢杆菌体系根际环境变化确定影响铬富集的关键生理和生态因子，进而通过控制关键生理和生态因子，充分发挥蜡状芽孢杆菌与李氏禾二者的协同作用，为提高Cr(Ⅵ)污染水体的植物-微生物修复效率提供重要的理论参考和实践指导。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种利用蜡状芽孢杆菌与李氏禾交互作用净化水体中铬的方法，包括以下步骤：
1)将李氏禾置于培养液中培养12～18d后，向培养液中加入终浓度为8～12mg/L的六价铬进行胁迫培养8～12d获得预培养后的李氏禾；
2)将所述预培养后的李氏禾置于六价铬初始浓度为8～12mg/L的含铬废水中，并向其中接入对数生长期的蜡状芽孢杆菌，形成联合处理体系，处理含铬废水；
所述蜡状芽孢杆菌在联合处理体系中菌体的初始浓度为0.05～0.15g/L；
所述联合处理的温度为32～42℃；
所述联合处理体系的初始pH值为5～8；
所述联合处理体系的溶解氧为2～6mg/L；
所述联合处理含铬废水的时间≥8h。
优选的，所述联合处理体系中还包括氮肥、磷肥和钾肥中的一种或几种。
优选的，所述氮肥为(NH4)2SO4、CO(NH2)2或Ca(NO3)2。
优选的，所述氮肥(NH4)2SO4在所述联合处理体系中的浓度为15～25mg/L。
优选的，所述磷肥包括(NH4)2HPO4、Ca(H2PO4)2和KH2PO4中的一种或几种。
优选的，所述磷肥在所述联合处理体系中的浓度为8～12mg/L。
优选的，步骤1)中所述的培养液为1/2的Hoagland营养液，所述培养液中添加80～120kU/L的青霉素和80～120mg/L的链霉素。
优选的，所述联合处理过程中李氏禾的根部避光，环境相对湿度为70％～80％。
优选的，所述联合处理过程中对李氏禾的光照周期为10～14h/d，光照强度为6500～7500Lx。
优选的，所述蜡状芽孢杆菌在联合处理体系中菌体的初始浓度为0.08～0.12g/L；所述联合处理的温度为33～37℃；所述联合处理体系的初始pH值为6～7；所述联合处理体系的溶解氧为3.5～4.5mg/L；所述联合处理含铬废水的时间≤12h。
本发明的有益效果：本发明提供的利用蜡状芽孢杆菌与李氏禾交互作用净化水体中铬的方法，通过改变李氏禾与蜡状芽孢杆菌体系根际环境变化确定影响铬富集的关键生理和生态因子，进而通过控制关键生理和生态因子，充分发挥蜡状芽孢杆菌与李氏禾二者的协同作用。本发明所述方法利用蜡状芽孢杆菌与李氏禾的根际交互作用，充分发挥蜡状芽孢杆菌和李氏禾对于铬的协同处理效果，对于含铬废水中铬的还原率高，时间短。
附图说明
图1为本发明提供的优化条件对体系作用还原Cr(VI)的影响；
图2为实施例2中初期不同氮肥对体系还原Cr(Ⅵ)的影响；
图3为实施例2中中期不同氮肥对体系还原Cr(Ⅵ)的影响；
图4为实施例2中后期不同氮肥对体系还原Cr(Ⅵ)的影响；
图5为实施例2中浓度氮肥形态蜡状芽孢杆菌生长情况；
图6为实施例2中初期不同磷肥对体系还原Cr(Ⅵ)的影响；
图7为实施例2中中期不同磷肥对体系还原Cr(Ⅵ)的影响；
图8为实施例2中后期不同磷肥对体系还原Cr(Ⅵ)的影响；
图9为实施例2中低浓度磷肥形态蜡状芽孢杆菌生长；
图10为实施例2中初期不同钾肥对体系还原Cr(Ⅵ)的影响；
图11为实施例2中中期不同钾肥对体系还原Cr(Ⅵ)的影响；
图12为实施例2中后期不同钾肥对体系还原Cr(Ⅵ)的影响；
图13为实施例2中高浓度钾肥形态蜡状芽孢杆菌生长；
图14为对比实验中不同条件对Cr(Ⅵ)还原率的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种利用蜡状芽孢杆菌与李氏禾交互作用净化水体中铬的方法，包括以下步骤：1)将李氏禾置于培养液中培养12～18d后，向培养液中加入终浓度为8～12mg/L的六价铬进行胁迫培养8～12d获得预培养后的李氏禾；2)将所述预培养后的李氏禾置于六价铬初始浓度为8～12mg/L的含铬废水中，并向其中接入对数生长期的蜡状芽孢杆菌，形成联合处理体系，处理含铬废水；所述蜡状芽孢杆菌在联合处理体系中菌体的初始浓度为0.05～0.15g/L；所述联合处理的温度为32～42℃；所述联合处理体系的初始pH值为5～8；所述联合处理体系的溶解氧为2～6mg/L；所述联合处理含铬废水的时间≥8h。
本发明将李氏禾置于培养液中培养12～18d后，向培养液中加入终浓度为8～12mg/L的六价铬进行胁迫培养8～12d获得预培养后的李氏禾。本发明对所述李氏禾的来源没有特殊限定，在本发明具体实施过程中，所述李氏禾优选的采自雁山镇雁山园鱼塘周边和田地，所述李氏禾优选为健康、无污染的李氏禾幼苗。本发明在采集所述李氏禾后，优选的用自来水反复冲洗所述李氏禾幼苗，去掉李氏禾根部淤泥和杂质，然后用超纯水冲洗所述李氏禾。本发明将所述李氏禾幼苗置于培养液中培养12～18d，优选地培养14～16d，更优选地培养15d。在本发明中，所述培养液为1/2的Hoagland营养液，所述培养液中优选的添加80～120kU/L的青霉素和80～120mg/L的链霉素，更优选地添加100kU/L的青霉素和100mg/L的链霉素。在本发明中，所述1/2的Hoagland营养液的配方优选的见表2。在本发明中，所述李氏禾优选的置于人工气候箱(LRH-550-GSI)中进行培养，所述李氏禾的培养过程中的光照周期优选为10～14h/d，更优选为12h/d；所述李氏禾的培养过程中的温度控制优选为：25℃白天/20℃晚上；所述李氏禾的培养过程中的相对湿度优选为70％～80％，更优选为75％；所述李氏禾的培养过程中的光照强度优选为6500～7500Lx，更优选为7000Lx；所述李氏禾培养过程中，每天早上9:00、晚17:00各加1次超纯水以维持营养液体积恒定，每3d更换1次培养液，用浓度为0.1mmol/L的NaOH和0.1mmol/L的HCl将营养液的pH控制在5.5±0.3。
表2 Hoagland营养液配方
Figure BDA0002167910240000081
本发明在对所述李氏禾培养12～18d后，向培养液中加入终浓度为8～12mg/L的六价铬进行胁迫培养获得预培养后的李氏禾。所述胁迫培养的时间为8～12d，优选为10d。本发明对加入的六价铬优选为重铬酸钾，所述六价铬的浓度优选为10mg/L。在本发明中向所述培养液中加入六价铬的作用为胁迫李氏禾适应含有六价铬的水体环境。
本发明在获得所述预培养后的李氏禾后，将所述预培养后的李氏禾置于六价铬初始浓度为8～12mg/L的含铬废水中，并向其中接入对数生长期的蜡状芽孢杆菌，形成联合处理体系，处理含铬废水。在本发明中，所述蜡状芽孢杆菌在联合处理体系中菌体的初始浓度为0.05～0.15g/L，优选为0.08～0.12g/L，更优选为0.1g/L。在本发明中，所述蜡状芽孢杆菌优选的购自中国典型培养物菌种保藏中心(CCTCC)，编号为CCTCCAB2011085。在本发明中，所述联合处理的温度为32～42℃，优选为33～37℃；所述联合处理体系的初始pH值为5～8，优选为6～7；所述联合处理体系的溶解氧为2～6mg/L，优选为4mg/L；所述联合处理含铬废水的时间≥8h，优选的为8～12h。
在本发明中，所述联合处理体系中优选的还包括氮肥、磷肥和钾肥中的一种或几种。在本发明中，所述氮肥优选为(NH4)2SO4、CO(NH2)2或Ca(NO3)2；当所述氮肥为(NH4)2SO4时，所述氮肥(NH4)2SO4在所述联合处理体系中的浓度优选为15～25mg/L，更优选为20mg/L；当所述氮肥为CO(NH2)2时，所述氮肥CO(NH2)2在所述联合处理体系中的浓度优选为55～65mg/L，更优选为60mg/L；当所述氮肥为Ca(NO3)2时，所述氮肥Ca(NO3)2在所述联合处理体系中的浓度优选为55～65mg/L，更优选为60mg/L。在本发明中，所述联合处理体系中添加(NH4)2SO4氮肥对六价铬的还原效果最好。在本发明中，所述磷肥包括(NH4)2HPO4、Ca(H2PO4)2和KH2PO4中的一种或几种。在本发明中，所述磷肥在所述联合处理体系中的浓度优选为8～12mg/L，更优选为10mg/L；所述磷肥在相对较低的浓度(8～12mg/L)的情况下，对所述联合处理体系的促进效果更好。在本发明中，所述钾肥优选为K2SO4、KCl或K2CO3；在本发明中，所述磷肥在所述联合处理体系中的浓度优选为10～30mg/L。本发明在所述联合处理体系中添加氮肥、磷肥和钾肥能够促进蜡状芽孢杆菌和李氏禾的生长，进而促进联合处理体系对铬的还原。
本发明中，李氏禾的植物组织能超富集Cr(VI)和Cr(Ⅲ)使其固定于植物体内，受到外界重金属胁迫时，植物根际分泌物中的烯烃、酸、醇、酚、醛也能够促进还原Cr(VI)，同时，蜡状芽孢杆菌不但能够依靠自身的胞外分泌物还原Cr(VI)，蜡状芽孢杆菌的细胞壁也可以还原Cr(VI)，并固定于自身。根系分泌物会作为根际微生物生长和繁殖过程中重要的碳源、能源物质，对微生物的种类、数量及其在植物根际的分布有巨大影响。
本发明中李氏禾与蜡状芽孢杆菌的生长需要适宜的温度、pH、溶解氧范围，这与体系还原Cr(VI)效率密切相关。在适宜的温度环境下，会加快细胞的生物化学反应和生长速率，体系作用加快，对Cr(VI)的还原效率较高。反之，如若持续高温或低温，会对细胞内敏感组成部分(如蛋白质、核酸等)遭受不可逆的破坏，植物会出现萎蔫枯黄或冻伤的迹象，直接影响根系的生长发育，而李氏禾根系又是吸收富集铬的重要途径，因此植物-微生物体系只有保持在适宜生长的温度范围内，才会提高其修复速率。
本发明所用李氏禾采自雁山镇雁山园周边，土壤pH为6.5，偏中性。不同初始pH值对体系作用效果也有所差异，但是溶液的pH值都有偏向于中性环境的趋势，这可能是细菌的代谢活动主要作用引起的环境中pH值迅速改变，其一，溶液中的含氮有机物被微生物降解后产生氨等碱性物质，分解过程产生的有机酸，都会影响pH的改变；再者，细胞选择性吸收离子性物质而引起pH值的改变，例如水培营养液中的硝酸钾作为氮源时，硝酸根被吸收进细胞，会导致pH值增加；而以硝酸铵作为氮源时，铵根离子被吸收，会降低体系pH值，最终调整为适宜细菌生长的中性环境。同时体系中pH值的改变也从另一方面说明了细菌对环境的适应能力。总体来讲，蜡状芽孢杆菌与李氏禾共同作用生长最适pH值为中性，并在该值下可达到较理想的六价铬还原效果。
本发明中，所述蜡状芽孢杆菌在有氧气存在的情况下才能进行生长代谢活动，但是在氧气过量的条件下，氧气会作为电子受体与Cr(VI)进行竞争，细菌会在消耗氧气之后，再对Cr(VI)慢慢还原；同时过量的氧气会分解溶液中有机物质，就此降低了整体对Cr(VI)的还原效果。保持根际环境在适宜的溶液氧浓度会提高李氏禾-蜡状芽孢杆菌体系对Cr(VI)的还原效率，产生一定的积极作用。
本发明中的氮、磷、钾肥是植物生长过程中活跃的营养因素，通过施肥的方式可有效改善根际环境养分状况，促进植物对养分的吸收，以达到高产、优产，促进植物生长，提高植株生物量，进而提高植物富集重金属的浓度。
通过施加有机肥中化合物和重金属的相互作用，可以影响体系对重金属的吸附解吸，改变介质中的重金属形态，进而改变重金属的活性。水培溶液中添加的氮肥—(NH4)2SO4对六价铬还原作用性最好，可能是硫酸铵中的阴离子起到吸附作用，导致溶液中颗粒表面负电性增加，占据相当数量的表面活性位置所致，同时这些阴离子与金属络合形成可溶性金属—配位体络合物，降低水体对铬离子的吸附，从而影响植物的吸收、累积。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
实验所用蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)购自中国典型培养物菌种保藏中心(CCTCC)，编号为CCTCCAB2011085，菌种形式为冻干粉。
试验前期将蜡状芽孢杆菌接种至斜管LB培养基上，待菌株活化复苏后进行扩大培养(控制摇床条件为：30℃、160r/min)，培养12h时锥形瓶中细菌生长浑浊，瓶壁有菌膜，呈淡乳白色，静置沉淀分层，细菌光密度值OD600为0.8，处于对数生长期。接种至第三代，菌种代谢稳定后，进行实验。
将扩大培养的蜡状芽孢杆菌，分装在10mL的离心管中，置于高速冷冻离心机8000r/min离心，去掉上层悬浮营养液，蜡状芽孢杆菌在下层沉淀，将离心管管口塞上灭菌棉花，放入冷冻干燥机干燥72h，直到蜡状芽孢杆菌呈冻干粉状，取出放于天平称重，测得扩大培养12h后10mL的菌液中蜡状芽孢杆菌的干重，约为0.1g，则100mL溶液里的细菌溶度约为1g/L。添加扩大培养12h的液体溶液直接投加至李氏禾的营养液中(扩大培养的溶液中存在LB培养基，能维持细菌的生长)。例：取30mL 1g/L的扩培菌溶液加入到总体积300mL的锥形瓶，总溶液细菌浓度为0.1g/L。
实验中所用李氏禾幼苗均采自雁山镇雁山园鱼塘周边和田地间，无污染，采集到的李氏禾用自来水反复冲洗，去掉根部淤泥和杂质，后用实验室制备的超纯水冲洗三次，再将李氏禾放入黑色塑料小桶，添加50％强度的改良Hoagland营养液+抗生素(青霉素、链霉素)进行水培培养(具体配方见表2)，每组20～30株李氏禾幼苗，保证根部避光(为防止根系生成藻类物质对实验结果造成影响)，置于人工气候箱(LRH-550-GSI)中进行培养，生长条件为：光照周期12h/d；温度控制：25℃白天/20℃晚上；相对湿度75％；光照强度7000Lx，每天早上9:00、晚17:00各加1次超纯水以维持营养液体积恒定，每3d更换1次培养液，用浓度为0.1mmol/L的NaOH和0.1mmol/L的HCl将营养液的pH控制在5.5±0.3，李氏禾幼苗预培养两周时间。
李氏禾预培养结束后，添加对数生长期的蜡状芽孢杆菌条件下，Cr(Ⅵ)初始浓度为10mg/L，菌体初始浓度0.1g/L；无菌环境下，添加抗生素为青霉素和链霉素混合液抗菌，从商家购买后100倍稀释分装待用，每500mL培养液里加入5mL青链霉素混合液，用于预防细菌污染，青霉素含量为10kU/mL，链霉素的含量为10mg/mL，直接添加到植物培养液中。
最后调整最优环境进行综合实验对比发现，将预培养后的李氏禾移入Cr(VI)初始浓度为10mg/L，菌体初始浓度为0.1g/L的塑料烧杯中，蜡状芽孢杆菌在液体LB培养基中扩大培养至对数生长期，李氏禾根部避光，通过控制实验条件在最佳溶解氧为4.0mg/L、温度为32℃和初始pH＝7.0的实验条件，与空白组相比较可以发现，同一时间情况下，李氏禾-蜡状芽孢杆菌体系对溶液中六价铬还原率普遍高于空白处理组(如图1所示)，第10h时水中六价铬的还原率增加至81％，是空白条件下还原率的1.76倍，14h时其还原率达到90％以上。六价铬还原率＝(初始六价铬浓度－某时刻六价铬浓度)/初始六价铬浓度×100％)。同时，优化条件下的蜡状芽孢杆菌生长情况较好，实验过程中肉眼可见细菌密度明显增大。
实施例2
选取不同形态氮肥、磷肥和钾肥，分别以低、中、高浓度投加到预培养后的李氏禾中，控制环境温度32℃，用浓度为0.1mmol/LNaOH或0.1mmol/L HCl将营养液的pH控制在7.3、溶液溶解氧DO为4mg/L，将预培养后的李氏禾移入Cr(VI)初始浓度为10mg/L，菌体初始浓度为0.1g/L的塑料烧杯中，蜡状芽孢杆菌在液体LB培养基中扩大培养至对数生长期，李氏禾根部避光，三组重复，检验外源营养物质对体系的影响，每个重复放置20株的李氏禾，确保实验过程中其他条件均一致。外源物质投加形态及浓度如下表所示：
表3外源营养物质形态及浓度
Figure BDA0002167910240000121
Figure BDA0002167910240000131
实验过程中每隔2h取样，对不同浓度和形态的氮、磷、钾肥进行前、中、后期的对比分析，这样能更好地比较氮磷钾肥的影响效果，选取最适宜浓度和最有助于体系还原Cr(Ⅵ)的化合物形态。
结果如图2～13所示，对李氏禾-蜡状芽孢杆菌体系投加不同浓度、不同形态的氮肥，分别在第4h(初期)、12h(中期)和20h(后期)测溶液中Cr(Ⅵ)浓度，其中，20mg/L的(NH4)2SO4处理效果最佳，初期还原率达到53.2％，第12h时就能将溶液中的Cr(Ⅵ)全部还原；其次是CO(NH2)2、Ca(NO3)2处理浓度保持在60mg/l的情况下，12h时的处理率分别达到87％和85％。三种不同磷肥都是在低浓度(10mg/L)情况下，对李氏禾-蜡状芽胞杆菌体系的促进效果更强，其中10mg/L的(NH4)2HPO4的作用效果高于其他两种磷肥，初期还原率达到65.4％，后期率先将Cr(Ⅵ)完全还原，各阶段还原率明显高于其他对照组，Ca(H2PO4)2和KH2PO4的作用程度相近，高浓度情况下反而不利于植物生长和六价铬还原。在植物-微生物作用体系还原Cr(Ⅵ)的过程中，投加K2SO4、KCl、K2CO3三种形态不同浓度的钾肥的还原效果相近，50mg/l的K2CO3作用时各阶段还原率略高于其他对照组，可见，对于水培处理李氏禾-蜡状芽孢杆菌体系来说，添加钾肥对体系还原六价铬的影响效果不明显。总的来说，李氏禾-蜡状芽孢杆菌共同作用还原水体中Cr(Ⅵ)时，单独添加20mg/l的(NH4)2SO4、10mg/l的(NH4)2HPO4、50mg/l的K2CO3分别作用时，还原效率高于同种有机肥的其他形态和浓度，过量有机肥及不合理使用，易导致添加营养物质的利用率降低，植物修复效率下降，致使修复成本增加；投加有机肥的溶液中蜡状芽孢杆菌的细菌光密度值普遍偏低，但是与空白组相比，投加氮磷钾肥仍然对细菌本身产生了促进作用，只是与其他环境影响因子相比，添加不同形态、浓度的肥料对蜡状芽孢杆菌的生长影响甚微
对比试验
选取生长一致的李氏禾，根部灭菌后用Hoagland完全营养液+抗生素(青霉素、链霉素混合液)中温室培养15d后，再以浓度为10mg/L的Cr(Ⅵ)胁迫处理，继续培养10天后将李氏禾从基质中取出，为保证实验过程中根系分泌物成分不变，取培养李氏禾的原水培液(作为根系分泌物)，置于锥形瓶中进行实验。设五组对照处理：空白对照、活菌、根分泌物、根分泌物+活菌、根分泌物+灭活菌，细菌浓度0.1g/L，灭活菌采用扩大培养后的蜡状芽胞杆菌经高压蒸汽120℃，灭活20min；溶液总体积300mL，放入摇床培养，控制培养条件为30℃、160rmp，对锥形瓶中溶液不同时段(2、4、6、8……36h)取样。测定铬还原率。
不同时间段溶液中Cr(Ⅵ)的浓度采用二苯碳酰二肼分光光度法测，使溶液保持酸性，Cr(Ⅵ)与二苯碳酰二肼反应生成紫红色化合物，于波长540nm处进行分光光度测定得到Cr(Ⅵ)的浓度，绘Cr(Ⅵ)还原率柱状图。实验中含有蜡状芽胞杆菌作用的的三组(活菌、根分泌物+活菌、根分泌物+灭活菌)同时测细菌溶液在波长600nm处的吸光度，利用细菌的吸光值来反应细菌菌体细胞密度，从而了解细菌的生长情况，绘制细菌生长曲线。六价铬还原率＝(初始六价铬浓度－某时刻六价铬浓度)/初始六价铬浓度×100％，实验数据用SPSS软件进行统计分析。
结果如图14所示，李氏禾根系分泌物与蜡状芽孢杆菌共同作用时，还原处理效果高于空白组和单一物质作用的情况，与此同时，蜡状芽孢杆菌生长情况也较好，说明李氏禾根系分泌物与蜡状芽孢杆菌的生长具有一定的相互促进作用。在30℃条件下，根分泌物与活菌共同作用对六价铬的还原效果最为明显，第12h还原率达到93％，在24h内几乎将溶液中的Cr(Ⅵ)全部还原；根分泌物与灭活菌共同作用，在第8h时，六价铬的还原率突然增加了40％，且作用效果明显，22h时趋于稳定，去除率达到88％；蜡状芽孢杆菌单独作用时相对于根分泌物与活菌共同作用情况下，还原效果明显降低，第10h还原率达到34％，最高还原率为58％；根分泌物单独作用情况下，Cr(Ⅵ)还原率维持在23％左右；空白对照组随时间变化几乎没有还原作用。第10h时，根分泌物与活菌共同作用时的还原率可达到蜡状芽胞杆菌单独作用的两倍。通过短期实验研究，加入适量浓度的蜡状芽孢杆菌，与李氏禾根际分泌物共同作用，对水体中Cr(Ⅵ)的还原作用效果明显增强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用蜡状芽孢杆菌与李氏禾交互作用净化水体中铬的方法，其特征在于，由以下步骤组成：
1)将李氏禾置于培养液中培养12～18d后，向培养液中加入终浓度为8～12mg/L的六价铬进行胁迫培养8～12d获得预培养后的李氏禾；
所述培养液中添加80～120kU/L的青霉素和80～120mg/L的链霉素；
2)将所述预培养后的李氏禾置于六价铬初始浓度为8～12mg/L的含铬废水中，并向其中接入对数生长期的蜡状芽孢杆菌，形成联合处理体系，处理含铬废水；
所述蜡状芽孢杆菌在联合处理体系中菌体的初始浓度为0.05～0.15g/L；
所述联合处理的温度为32～42℃；
所述联合处理体系的初始pH值为5～8；
所述联合处理体系的溶解氧为2～6mg/L；
所述联合处理含铬废水的时间8h～24h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述联合处理体系中还包括氮肥、磷肥和钾肥中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氮肥为(NH4)2SO4、CO(NH2)2或Ca(NO3)2。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氮肥(NH4)2SO4在所述联合处理体系中的浓度为15～25mg/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷肥包括(NH4)2HPO4、Ca(H2PO4)2和KH2PO4中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述磷肥在所述联合处理体系中的浓度为8～12mg/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的培养液为1/2的Hoagland营养液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述联合处理过程中李氏禾的根部避光，环境相对湿度为70％～80％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述联合处理过程中对李氏禾的光照周期为10～14h/d，光照强度为6500～7500Lx。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蜡状芽孢杆菌在联合处理体系中菌体的初始浓度为0.08～0.12g/L；
所述联合处理的温度为33～37℃；
所述联合处理体系的初始pH值为6～7；
所述联合处理体系的溶解氧为3.5～4.5mg/L；
所述联合处理含铬废水的时间≤12h。
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Denomination of invention: A Method for Purification of Chromium in Water by Interaction of Bacillus cereus and Poa Listeria

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